一种含外泌体滴眼液及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及滴眼液制备方法领域，具体涉及一种含外泌体滴眼液及其制备方法和应用。


背景技术：

2.眼睛由于存在血眼屏障、缺乏淋巴引流系统等原因，常常被认为是免疫赦免器官。尽管如此，眼部仍可发生严重的免疫介导性眼病，如甲状腺相关眼病、自身免疫性葡萄膜炎及sjogren综合征等，轻则影响患者的日常生活，重则引起严重的视力损害，甚至失明。现阶段，临床上以糖皮质激素及免疫抑制剂为主的治疗方法疗效欠佳、且易复发，因而亟需开拓该类疾病的诊治思路与策略。外泌体是一种由细胞分泌的脂质双分子层囊泡，其中包含蛋白质、脂质及核酸等生物活性分子，在细胞间通讯起着重要的媒介作用。既往研究发现，外泌体具有重要的炎症及免疫调节作用。
3.角膜缘干细胞是一群位于角膜缘基底部vogt栅栏处的干细胞，维持角膜上皮的稳定与更新，角膜缘干细胞条件培养液中含有大量角膜缘干细胞分泌的细胞因子、生长因子以及外泌体。利用角膜缘干细胞条件培养液培养间充质干细胞，可以促进间充质干细胞的活性，并且可以诱导间充质干细胞获得角膜缘干细胞的特征，分泌出的外泌体，具有角膜缘干细胞外泌体的特性，促进角膜上皮的稳定与更新，同时可以调节重要的炎症及免疫调节作用。β
‑
葡聚糖能够活化巨噬细胞与嗜中性白血球等，因此能提高白细胞素、细胞分裂素和特殊抗体含量，全面刺激机体免疫系统，使受伤机体淋巴细胞产生细胞因子(il
‑
1)的能力迅速恢复正常，有效调节机体免疫机能。β
‑
葡聚糖能够帮助改善炎症和炎症疾病患者的免疫反应潜力。
4.目前外泌体只能在2
‑
8℃稳定保存3天，－20℃稳定保存1个月。长期保存需要－80℃低温，并且不能冻融，存储条件要求高，这些缺点影响了外泌体的深入研究。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供了一种含外泌体滴眼液及其制备方法和应用，通过将外泌体与β
‑
葡聚糖结合，利用葡聚糖的活性及特性，保护外泌体的稳定性同时，协同提升外泌体的功效，对眼部疾病具有很好的预防作用。
6.本发明的第一个目的是提供了一种含外泌体滴眼液，由以下质量分数的组分制成：
7.β
‑
葡聚糖0.1
‑
3％，渗透压调节剂0.19
‑
0.21％，ph调节剂0.019
‑
0.021％和营养补充剂0.01
‑
5％，余量为间充质干细胞外泌体/β
‑
葡聚糖水溶液；
8.所述β
‑
葡聚糖水溶液质量分数为0.1
‑
3％。
9.进一步地，所述的间充质干细胞外泌体为脐带间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
10.进一步地，所述的间充质干细胞外泌体是在人角膜缘基质细胞条件培养液中诱导
培养间充质干细胞分泌的外泌体。
11.进一步地，所述的β
‑
葡聚糖为β
‑
1，3葡聚糖。
12.进一步地，所述的β
‑
1，3葡聚糖的分子量为1
‑
2600kda。
13.进一步地，所述渗透压调节剂为葡聚糖、甘露糖醇、甘油和生理盐水中的任意一种或几种的混合。
14.本发明还提供了上述含外泌体滴眼液的制备方法，包括如下步骤：
15.s1，间充质干细胞外泌体的制备：
16.首先，收集人角膜缘基质细胞按照0.2
‑1ⅹ
105/cm2的密度接种于完全培养基中培养，待细胞生长至细胞密度为80
‑
85％时，收集上清，即得到人角膜缘基质细胞条件培养液，将其加入到间充质干细胞中诱导培养，待细胞培养至细胞密度为85％
‑
90％时，弃掉上清，清洗细胞，继续培养24
‑
48h，收集上清液，离心后获得间充质干细胞外泌体，备用；
17.s2，将β
‑
葡聚糖加入注射用水中，加热至80℃左右，搅拌溶解后，降温至室温，获得β
‑
葡聚糖水溶液，备用；
18.s3，将s1制得的间充质干细胞外泌体与s2中制得的β
‑
葡聚糖水溶液混合均匀，加入渗透压调节剂、ph调节剂和营养补充剂，搅拌溶解完全，过滤除菌，获得含外泌体滴眼液。
19.进一步地，s1中，所述人角膜缘基质细胞的培养条件为37℃、5％co2。
20.进一步地，s1中，离心的具体过程为：1000rpm离心10分钟，去除死细胞和细胞碎片，取上清，获得的上清10，000
×
g离心30分钟，取上清，100，000
×
g，在4℃下持续离心60
‑
120分钟，去掉上清，留下的沉淀pbs重悬，获得间充质干细胞外泌体。
21.本发明还提供了所述的β
‑
葡聚糖在含外泌体滴眼液制备中的用途，所述β
‑
葡聚糖用于保护外泌体的稳定性，提升外泌体的功效。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
23.1、本发明制备得到的外泌体滴眼液对眼部刺激小，稳定性高，外泌体活性稳定；
24.2、本发明制备得到的外泌体滴眼液中，葡聚糖协同外泌体能有效激活或抑制机体的免疫应答，对葡萄球膜炎、sjogren氏综合征、角膜伤口愈合、缓解角膜排斥具有显著作用；
25.3、本发明通过将外泌体与β
‑
葡聚糖结合，利用葡聚糖的活性及特性，保护外泌体的稳定性同时，协同提升外泌体的功效，对眼部疾病具有很好的预防作用。
具体实施方式
26.下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
27.实施例1：
28.本实施例1提供了一种含外泌体滴眼液，具体制备步骤如下：
29.s1，间充质干细胞外泌体的制备：
30.(1)将人角膜缘基质细胞按照0.5
ⅹ
105/cm2的密度接种于无菌细胞培养瓶中，加入
完全培养基(90％dmem(h) 10％fbs)，放置于37℃、5％co2培养箱中培养，待细胞生长至细胞密度为82.5％时，无菌收集细胞培养上清，即得到人角膜缘基质细胞条件培养液；
31.(2)实验室制备的间充质干细胞复苏培养后，按照1.5
ⅹ
104/cm2的密度接种于无菌细胞培养瓶中，加入间充质干细胞培养基(90％α
‑
mem 10％fbs)，置于37℃、5％co2培养箱中培养12.5h，弃掉间充质干细胞培养基，加入(1)中获得的人角膜缘基质细胞条件培养液诱导培养，待培养至细胞密度为87.5％时，弃掉上清，用提前预热至37℃的磷酸盐缓冲液清洗两遍细胞，弃掉磷酸盐缓冲液，加入无血清的间充质干细胞培养基(100％α
‑
mem)继续培养36h，收集上清液。
32.(3)外泌体的提取：将(2)中获得的上清液经过差速离心法获得间充质干细胞外泌体。具体离心操作为：1000rpm离心10分钟，去除死细胞和细胞碎片，取上清。获得的上清10，000
×
g离心30分钟，取上清。100，000
×
g，在4℃下持续离心90分钟，去掉上清，留下的沉淀pbs重悬，所述pbs为ph7.2
‑
7.4的pbs，pbs的浓度选择0.01m，即可获得间充质干细胞外泌体。bca检测试剂盒测定外泌体浓度。
33.s2，β
‑
葡聚糖水溶液制备：
34.将1.55gβ
‑
1，3葡聚糖加入98.45g注射用水中，加热至80℃左右，搅拌溶解后，降温至室温，获得质量分数为1.55％的β
‑
葡聚糖水溶液，待用；
35.所述β
‑
1，3葡聚糖的分子量为40kda；
36.s3，含外泌体滴眼液获得：
37.将s1中制得的的间充质干细胞外泌体50g加入到50g s2制得的β
‑
葡聚糖水溶液中，混合均匀，即获得质量分数为50％的间充质干细胞外泌体，然后加入0.2g渗透压调节剂(氯化钠)、0.02g ph调节剂(柠檬酸钠)和0.25g营养补充剂(牛磺酸)，搅拌溶解完全，渗透压调节剂调节渗透压至200
‑
500mosm/l范围内，ph控制在6
‑
7之间，然后用0.22微孔滤膜过滤除菌，获得含外泌体滴眼液，即可罐装。
38.实施例2
39.本实施例提供了一种含外泌体滴眼液，具体制备步骤与实施例1基本相同，区别在于：
40.s2中，所述β
‑
葡聚糖为β
‑
1，3葡聚糖，且分子量为2600kda。
41.实施例3
42.本实施例提供了一种含外泌体滴眼液，具体制备步骤与实施例1基本相同，区别在于：
43.s2中，所述β
‑
1，3葡聚糖的分子量为1kda。
44.实施例4
45.本实施例提供了一种含外泌体滴眼液，具体制备步骤与实施例1基本相同，区别在于：
46.s2中，所述β
‑
1，3葡聚糖的分子量为1300kda。
47.实施例5
48.本实施例提供了一种含外泌体滴眼液，具体制备步骤与实施例1基本相同，区别在于：
49.s1中，(1)中的人角膜缘基质细胞的密度接种为0.2
ⅹ
105/cm2，待细胞生长至细胞
密度为80％时，收集；
50.(2)中，间充质干细胞复苏培养后，接种密度为1
ⅹ
104/cm2，培养时间为10h，培养至细胞密度为85％，加入无血清的间充质干细胞培养基继续培养时间为24h；
51.(3)中，离心时间为60min；
52.s2中，制备得到β
‑
葡聚糖水溶液为质量分数为0.1％；
53.s3中，渗透压调节剂的质量分数为0.19％，ph调节剂的质量分数为0.019％，营养补充剂(透明质酸钠)的质量分数为0.01％，余量为制备得到间充质干细胞外泌体/β
‑
葡聚糖水溶液。
54.实施例6
55.本实施例提供了一种含外泌体滴眼液，具体制备步骤与实施例1基本相同，区别在于：
56.s1中，(1)中的人角膜缘基质细胞的密度接种为1
ⅹ
105/cm2，待细胞生长至细胞密度为85％时，收集；
57.(2)中，间充质干细胞复苏培养后，接种密度为2
ⅹ
104/cm2，培养时间为15h，培养至细胞密度为90％，加入无血清的间充质干细胞培养基继续培养时间为48h；
58.(3)中，离心时间为120min；
59.s2中，制备得到β
‑
葡聚糖水溶液为质量分数为0.3％；
60.s3中，渗透压调节剂的质量分数为0.21％，ph调节剂的质量分数为0.021％，营养补充剂(维生素c)的质量分数为5％，余量为制备得到间充质干细胞外泌体/β
‑
葡聚糖水溶液。
61.对比例1
62.对比例1提供了一种滴眼液，具体制备步骤与实施例1基本相同，区别在于：
63.不含β葡聚糖。
64.需要说明的是，本发明中的所述营养补充剂可以为牛磺酸、维生素b12、透明质酸钠、叶黄素、维生素c和维生素e中的任意一种。
65.以上实施例1
‑
6制备得到的滴眼液各性能相近，因此，本发明仅以实施例1为代表，进行以下检测实验。
66.一、本发明制备的含外泌体滴眼液对眼部刺激程度检测
67.以上述实施例1中制备得到的含外泌体滴眼液为代表，取眼部检查无损伤的健康新西兰兔27只，按照体重随机分为九组，三只/组,左眼给生理盐水作为对照，右眼给实施例1制备的滴眼液；将生理盐水和滴眼液分别滴于家兔眼结膜囊内，压迫鼻泪管，并使眼睛被动闭合，一天四次，每次一到两滴连续滴14天，观察角膜、虹膜、结膜、水肿、分泌物的刺激情况并记录，结果计分方法见表1。
68.表1角膜、虹膜、结膜、水肿、分泌物的刺激情况计分表
[0069][0070][0071]
眼部刺激分值标准：0
‑
3分，无刺激：4
‑
8分，轻微刺激：9
‑
12分，中度刺激。
[0072]
表2实施例1制备的含外泌体滴眼液对眼部刺激情况
[0073][0074]
二、本发明实施例1制备的含外泌体滴眼液的稳定性检测
[0075]
1、外泌体cd63蛋白免疫活性检测
[0076]
将鼠抗人cd63单克隆抗体(购自北京冬歌博业生物科技有限公司)用10mmol/l pbs缓冲液稀释到0.22mg/ml，通过微量蛋白打印仪gesim nano
‑
plotter tm 2.1打印到蛋白芯片基片上，每个点重复4次打印，最终获得直径约400um的圆形斑点，室温孵育12h即制得cd63抗体芯片。
[0077]
分别在第0月、第1月、第3月、第6月、第12月、第18月、第24月取出滴眼液，使用制得的cd63抗体芯片检测外泌体cd63蛋白免疫活性，具体步骤为：
[0078]
将保存的含外泌体滴眼液取出恢复到室温，每孔加入100ul滴眼液，摇动40分钟，芯片用pbs洗涤三次，随后加入100ul荧光素标记的鼠抗人cd63单克隆抗体(4nmol/l)，摇动40分钟，后依次用pbs洗涤三次、纯水清洗一次，晾干。
[0079]
用生物芯片阅读扫描仪扫描芯片，扫描后获得16位灰度图像，用midascan software软件分析该图像，每个点的荧光强度通过所选区域总荧光强度除以面积获得，图像上平行的4个点的平均荧光强度被定义为测试的荧光强度。cd63蛋白活性与所获图像上的荧光强度正相关。外泌体cd63蛋白的检测结果如表3所示。
[0080]
表3不同保存时间滴眼液cd63蛋白检测荧光强度
[0081][0082]
由表3可以看出，无论在哪个条件下，前六个月滴眼液中外泌体活性几乎没有影响，在25
‑
40℃的保存温度下，滴眼液中外泌体活性在第12个月及以后略有降低，但是降低程度较小，说明本技术实施例1中制备的含外泌体滴眼液对保存温度要求不高，且，其中外泌体活性基本能够保持两年。
[0083]
2、含外泌体滴眼液的稳定性试验
[0084]
(1)加速试验
[0085]
分别将本发明实施例1制得的外泌体滴眼液和对比例1制备得到的滴眼液，在市售包装条件下，放入恒温恒湿箱，在温度40℃
±
2℃、相对湿度25％
±
5％的条件下放置，分别于第1、2、3、6个月按时取样，照中国药典2015版相关要求进行测定，结果如表4所示。
[0086]
表4本发明制备的滴眼液的稳定性
[0087][0088]
由表4可以看出，实施例1中通过加入β
‑
葡聚糖保护了外泌体的稳定性，大大提高了滴眼液的稳定性。
[0089]
(2)长期试验
[0090]
以本发明实施例1为代表，与对比例1进行比较，在市售包装条件下，放入恒温恒湿箱，在温度25℃
±
2℃、相对湿度40％
±
5％的条件下放置，分别于第3、6、9、12个月按时取样，照《中国药典》2015版相关要求进行测定。测定结果与0月测定结果比较，结果如表5所示。
[0091]
表5本发明实施例1制备的滴眼液长期稳定性
[0092][0093]
由表1
‑
表5可以看到，本发明提供的含外泌体的滴眼液性状无变化，可见异物符合规定；有关物质检查中，有关物质含量无明显增长的趋势，未出现其他杂质，含量测定、ph值检查结果均无明显变化，无菌进行考察，均无菌生长，说明本发明提供的含外泌体的滴眼液稳定性好，而缺少β葡聚糖的对比利1的滴眼液杂质含量增加较快，稳定性较差。
[0094]
二、本发明实施例制备得到的含外泌体滴眼液对小鼠花粉过敏性结膜炎早期反应相的免疫抑制作用
[0095]
1、试验材料：
[0096]
选取6
‑
8周龄balb/c雌性小鼠40只，随机分为4组，每组10只。分别为正常对照组、模型对照组、实施例1方法制备的外泌体滴眼液、市售滴眼液组，进行小鼠花粉过敏性结膜炎试验。
[0097]
2、试验方法：
[0098]
(1)建立豚草花粉过敏性结膜炎模型：
[0099]
将含有50μg豚草花粉的pbs液与弗氏完全佐剂按1∶1的体积比例混合完全，除正常对照组外其余各组均分别于小鼠尾根部及左后足垫皮下注射进行初次致敏，每个部位150μl，于注射后第7d将等量的豚草花粉pbs液与弗氏不完全佐剂按1∶1的体积比例混合完全后腹腔注射进行增强致敏，第14d以同样的方法再次增强致敏。治疗过程在末次增强致敏后7d，第21
‑
27d，采用按本发明实施例1方法制备的外泌体滴眼液(记为本发明滴眼液组)，正常对照组及模型对照组大鼠用纯化水滴眼，一天3次，每次2滴。治疗结束后，各试验组每只小鼠给予300μg花粉蛋白粗浸液进行滴眼激发。激发后1h内，10％水合氯醛麻醉，采用眼球放血将小鼠处死，取下眼球用于制作病理切片行肥大细胞检测，收集的血清用于elisa检测豚草花粉特异性ige。
[0100]
(2)临床症状评估：
[0101]
所有试验组小鼠经过相应药物的治疗后，经豚草花粉变应原激发后，在30min内于显微镜下观察小鼠体征并进行临床评估。评估指标包括：结膜水肿、结膜充血、眼睑肿胀、流泪，按0
‑
3分评分，制定评分标准：无：0分，轻度：1分，中度：2分，重度；3分。这四个类别各自得分的总和为总的评分：眼睛有严重的结膜充血、水肿、眼睑肿胀、流泪者最高评分为12分，中度者最高评分为8分，轻度者最高评分为4分。
[0102]
各组小鼠结束治疗后，用豚草花粉蛋白粗浸液进行滴眼激发，激发后30min内，对各试验组小鼠临床症状进行评分。
[0103]
结果如表6所示：模型对照组(模型眼用生理盐水)小鼠出现了明显的过敏症状，包括结膜充血、水肿、眼睑肿胀、流泪；本发明实施例1制备得到的滴眼液组能观察到轻度的过敏性结膜炎的临床症状，与模型对照组比较，差异有显著统计学意义(p＜0.01)；生理盐水对照组为正常小鼠眼用生理盐水处理。
[0104]
表6各组小鼠过敏原激发后眼部体征评分比较(n＝10)
[0105]
组别眼睑肿胀流泪结膜充血结膜水肿总分生理盐水对照0.50.60.40.72.2模型对照组2.32.11.92.58.8本发明滴眼液组1.00.91.20.83.9
[0106]
三、对泪腺注射阿托品制作干眼症家兔模型的影响
[0107]
1、试验材料：
[0108]
普通级新西兰兔40只(80眼)，雌雄各半，双眼滴用1％硫酸阿托品滴眼液，1％硫酸阿托品滴眼液每日分别于8、12、16、20时滴眼，每次1～2滴，诱导兔干眼模型眼。
[0109]
2、试验方法：
[0110]
随机选10只兔作为a组，使用实施例1所述滴眼液进行治疗，每天3次，每次2滴，连续使用14d，为试验组；
[0111]
随机选10只兔作为b组，使用对比例1中制备的滴眼液进行治疗，每天3次，每次2滴，连续使用14d，作为对照组1；
[0112]
随机选10只兔作为c组，使用市售0.1％玻璃酸钠滴眼液(爱丽，日本参天)，每天2次，每次2滴，为阳性对照，记为对照组2。试验组与对照组动物双眼每天给予2.5g
·
l
‑
1氯霉素眼药水抗感染治疗，每天1次，每次2滴，连续使用14d。
[0113]
将实施例1制备的滴眼液作为试验品；采用对比例1(对照组1)、市售0.1％玻璃酸钠滴眼液作为阳性对照品(对照组2)，观察实施例1所述含外泌体的滴眼液对兔干眼模型眼的治疗和改善作用。
[0114]
四、实验结果
[0115]
1、眼部观察
[0116]
试验组眼充血、水肿症状较对照组1和对照组2中的模型眼减轻，试验组兔眼出现结膜分泌物的动物数量较少，且程度减轻。
[0117]
2、角膜荧光素染色评分
[0118]
与滴用阿托品造模前比较，对照组1和对照组2滴药后各观察时间点较滴药前角膜荧光素染色评分显著性增加(p＜0.01)；试验组滴药后各时间点较滴药前无统计学差异(p＞0.05)。试验组与对照组1和对照组2比较，除滴药前及滴药后第14d外，其余观察时间点试验组明显低于对照组1和对照组2(p＜0.01)，见表7。
[0119]
表7实施例1制备的滴眼液对兔干眼的抑制作用
[0120] 对照组1(对比例1)对照组2试验组(实施例1)造模前1.041.231.201d1.261.47**1.38
△△
3d1.54**1.63**1.49
△△
5d1.74**1.82**1.73
△△
7d2.08**2.01**1.94
△△
11d2.52**2.31**2.25
△△
14d2.32**1.97**1.84
△△
[0121]
注：与本组造模前比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与对照组1同时点比较，
△△
p＜0.01。
[0122]
试验结果如表6显示，实施例1制备的滴眼液对于防治局部滴用阿托品的兔干眼有一定疗效，能抑制阿托品眼液诱导的兔干眼表现，促进兔泪液的分泌，分泌量显著增加，有望成为一种新型眼用制剂应用于临床。
[0123]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0124]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。