一种基于非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的竞争性单克隆抗体、试剂盒及其应用的制作方法

一种基于非洲猪瘟病毒cd2v蛋白的竞争性单克隆抗体、试剂盒及其应用
技术领域
1.本公开涉及生物技术领域，具体涉及一种基于非洲猪瘟病毒cd2v蛋白的竞争性单克隆抗体、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.非洲猪瘟(african swine fever，asf)是猪的一种烈性传染病，死亡率可以高达100％，由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)感染引起。非洲猪瘟病毒是目前已知唯一的dna虫媒病毒，病毒有囊膜，多为血吸附阳性，能吸附猪红细胞形成特征性的红细胞花环，这与病毒编码的血吸附蛋白cd2v有关。
3.cd2v蛋白由ep402r基因编码，全长1083bp，它是由信号肽、跨膜区、胞内区和胞外两个免疫球蛋白样结构域组装而成的糖蛋白。其中，两个免疫球蛋白样结构域是红细胞的结合部位，与小鼠、大鼠和人的cd2分子具有一定的序列同源性。胞内区与细胞cd2分子无序列同源性，并且在不同asfv毒株之间高度保守。cd2v蛋白为asfv晚期表达蛋白，是asfv的毒力因子和免疫逃避蛋白，因此是研制基因缺失苗的常用靶基因。
4.近年来已有很多关于cd2v缺失疫苗研究的报道，但是基因缺失疫苗存在着较大的安全隐患，其在使用过程中有可能会发生基因突变或重组从而导致新毒株的流行，因此急需建立针对cd2v基因的鉴别诊断研究方法。虽然大多感染asfv康复猪的血吸附抑制抗体滴度都较低，但已有很多研究证明cd2v蛋白具有良好的免疫原性，可以用于asf免疫血清学诊断试剂的制备与研究。例如周晓慧等利用原核表达载体pet
‑
elp获得了具有强免疫原性的重组cd2v抗原，并通过试验证明该抗原具有良好的检测特异性。钟秋平等成功表达了asfv cd2vn
‑
fe蛋白，并证明了该蛋白具有良好的免疫原性。任肖等利用原核表达载体pet
‑
28a表达了cd2v蛋白，并制备了多克隆抗体，为进一步研究cd2v蛋白的生物学功能奠定基础。
5.然而，现有基于cd2v蛋白的抗体的灵敏度和特异性仍然较差。


技术实现要素：

6.本公开的目的是提供一种针对非洲猪瘟病毒cd2v蛋白的竞争性单克隆抗体，含所述单克隆抗体的竞争elisa检测试剂及其检测试剂盒，以及所述检测试剂或检测试剂盒在检测非洲猪瘟病毒中的应用，以解决现有检测技术的弊端。
7.第一方面，本公开提供一种特异性结合非洲猪瘟病毒cd2v蛋白的抗原结合蛋白，其中，所述抗原结合蛋白包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，所述重链可变区具有seq id no:2所示的氨基酸序列，或seq id no:2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；所述轻链可变区具有seq id no:3所示的氨基酸序列，或seq id no:3所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
8.其中，seq id no:2所示的氨基酸序列为：esgsligdlgslklsgqsglqlhvkpevmlcat
lvmapfyrasgrlewvatftsyfwkewslgsmvslrsevkgrfamyfgvrqtpegavptsdinakntlgisrslscateggdlqmsdfstgmstvsyqvgfkv。
9.seq id no:3所示的氨基酸序列为：qynaegkgdiqswgtpasflstislghqrsnkaglnimtlslkphaseikksasavegtqegvvtvtslcqmwgsscraalqnsepyislfsseylakslsyyasksvlggpcitfrsyqaiqtgttpytfggeylvtqfeqdfyk。
10.第二方面，本公开提供一种特异性结合非洲猪瘟病毒cd2v蛋白的抗体或活性片段，其中，所述抗体或活性片段包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，所述重链可变区具有seq id no:2所示的氨基酸序列，或seq id no:2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；所述轻链可变区具有seq id no:3所示的氨基酸序列，或seq id no:3所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
11.优选地，所述抗体或活性片段为单克隆抗体和/或基因工程抗体；所述基因工程抗体选自单链抗体、单链抗体片段、嵌合单克隆抗体、嵌合单克隆抗体片段、改形单克隆抗体、改形单克隆抗体片段中的一种。
12.进一步优选地，所述抗体为鼠单克隆抗体30h6，所述鼠单克隆抗体30h6的重链可变区如seq id no:2所示，所述鼠单克隆抗体30h6的轻链可变区如seq id no:3所示。
13.第三方面，本公开提供一种非洲猪瘟病毒竞争elisa检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括第一方面所述的抗原结合蛋白，或第二方面中任意一项所述的抗体或活性片段。
14.优选地，所述抗原结合蛋白、抗体或活性片段为经标记物标记的抗原结合蛋白、抗体或活性片段，优选地，所述标记物选自酶、荧光基团或化学发光基团中的至少一种。
15.优选地，其中，所述试剂盒包括包被asfv cd2v蛋白的微孔板、酶标的鼠单克隆抗体30h6；更优选地，所述cd2v蛋白的包被量为0.1
‑
8μg/ml；所述酶标的鼠单克隆抗体30h6使用时进行1:(2000
‑
40000)的体积稀释，优选地，所述cd2v蛋白经真核表达获得。
16.进一步地，本公开的试剂盒还可以包括样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液和asfv标准阳性血清、阴性血清。
17.第四方面，本公开提供第一方面所述的抗原结合蛋白，或第二方面中任意一项所述的抗体或活性片段，或第三方面中任意一项所述的试剂盒在检测样品中的非洲猪瘟病毒中的应用，优选地，所述样品为环境样品、食品样品、血清样品或血液样品。
18.第五方面，本公开提供利用第一方面所述的抗原结合蛋白，或第二方面中任意一项所述的抗体或活性片段，或第三方面中任意一项所述的试剂盒体外检测样品中的非洲猪瘟病毒的方法，优选地，所述样品为环境样品、食品样品、血清样品或血液样品。
19.优选地，所述方法可以包括以下步骤：(1)将所述样品加入到酶标微孔板中；(2)在酶标微孔板中加入经稀释液稀释后的经酶标的第一方面所述的抗原结合蛋白或第二方面中任意一项所述的抗体或活性片段，并孵育；(3)显色后测定od
450nm
值并计算pi值；(4)当pi值≥50％时，判定所述样品为阳性样品，当pi值≤40％时，判定所述样品为阴性样品，当40％＜pi值＜50％时，判定所述样品为可疑样品。
20.通过上述技术方案，本公开具有如下有益效果：
21.(1)本公开提供的针对非洲猪瘟病毒cd2v蛋白的单克隆抗体的效价高，性质稳定，可利用小鼠腹水制备，适于大量生产，并且可以与asfv阳性血清竞争性结合包被抗原；
30.附图说明
31.附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
32.图1为纯化的cd2v蛋白的sds
‑
page电泳检测鉴定图，其中，m为蛋白质相对分子质量，1为纯化后的cd2v重组蛋白；
33.图2为15c8杂交瘤细胞和30h6杂交瘤细胞上清的免疫荧光鉴定结果图。
具体实施方式
34.以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
35.实施例
36.1.材料及来源
37.pcr supermix、大肠杆菌dh5α感受态细胞、dh10bac感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。pcaggs载体、pfastbac1载体、293f细胞由中国检验检疫科学研究院动物检验与检疫实验室保存。胎牛血清、dmem、hat和ht均为美国gibco公司产品。猪圆环病毒2型灭活疫苗(lg株)灭活阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(hun4
‑
f122株)灭活阳性血清、塞内卡灭活阳性血清、猪伪狂犬病活疫苗(kartha
‑
k61株)灭活阳性血清和185份asfv阴性血清由本实验室保存。5份灭活非洲猪瘟阳性血清和40份待检灭活血清由波兰国家兽医研究所非洲猪瘟国家参考实验室保存。id
‑
vet asfv抗体检测试剂盒购自深圳市青珊瑚科技有限公司。骨髓瘤细胞sp2/0系为本实验室保存。trizol购自thermo公司，ecori、xhoi和rtaq购自takara公司，其他化学试剂均为分析纯。hrp conjugation kit购自abcam公司。cloning kit购自北京全式金生物技术有限公司。quickantibody
‑
mouse5w购自北京博奥龙生物技术有限公司。hrp标记的山羊抗小鼠igg、igg亚类鉴定试剂盒购自sigma公司。
38.spf级6～8周龄balb/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；spf仔猪购自北京市spf猪育种管理中心。
39.2.非洲猪瘟cd2v抗原的获得与纯化
40.2.1重组质粒构建
41.根据genbank公布的ba71v株(genbank：nc
‑
001659)cd2v基因序列，利用生物信息学技术expasy、sompa、psipred server、dnastar、phyre、abcpred prediction、scratch、netctle及iedb等对cd2v蛋白进行理化性质、二级结构、三级结构分析以及t、b淋巴细胞表位的预测，筛选出6个优势抗原表位区域并通过linker进行链接，并将c端236
‑
281和288
‑
378两个优势抗原表位区折叠形成2个重复序列，得到cd2v目的基因序列seq id no:1，具体序列如下：
42.tatgataataatcgtagtggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcgattccccaactattacatataattgtactaattctttaataacatgtaaaaataataatgggacaggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcgttaatgatactaatggagatatccttaattattattggaatggtaataataattttggcggcggcggcggcggcggcggcggcggctcattgaatgaaacagaaaatataaatggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcaaacatgttgaagaaatagaaagtccaccaccctctgaatctaatgaagaagatatttctcacgatgacaccacttccatacatgaaccatctcccagagaaccattacttcctaagccttacagtcgttatcagtatggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcatgcgtccctcaacacaaccactcaacccatttcccctacctaaaccatgcccgccacctaaaccatgtcctccacccaagccatgcccgccacccaaaccatgtcctccacctaaaccgtgttctccacccaaaccgtgtcgtccacctaaaccatgtcctccacctaaaccatgtcctccacctaaaccatgtcctccacctaaaccatgtcctccatccaaaccatgtccttcacctgaatcctattctccacccaaaccactacctagtggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcaaacatgttgaagaaatagaaagtccaccaccctctgaatctaatgaagaagatatttctcacgatgacaccacttccatacatgaaccatctcccagagaaccattacttcctaagccttacagtcgttatcagtatggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcatgcgtccctcaacacaaccactcaacccatttcccctacctaaaccatgcccgccacctaaaccatgtcctccacccaagccatgcccgccacccaaaccatgtcctccacctaaaccgtgttctccacccaaaccgtgtcgtccacctaaaccatgtcctccacctaaaccatgtcctccacctaaaccatgtcctccacctaaaccatgtcctccatccaaaccatgtccttcacctgaatcctattctccacccaaaccactacctagt。
43.上述序列由北京擎科生物科技有限公司合成，并在序列两端分别引入ecori酶切位点、xhoi酶切位点、his标签及信号肽区，通过上述两酶切位点将上述cd2v目的基因序列(后称his
‑
cd2v)插入到真核表达载体pcaggs中，构建pcaggs
‑
asfv
‑
cd2v重组质粒，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂板培养过夜。次日挑取阳性克隆进行测序，测序正确的阳性菌液加入甘油保菌后，
‑
80℃保存备用于真核表达。
44.以同样的方法将上述cd2v目的基因片段克隆到pfastbac1载体中，构建pfastbac1
‑
asfv
‑
cd2v重组质粒，将测序正确的阳性重组质粒pfastbac1
‑
asfv
‑
cd2v转化至大肠杆菌dh10bac感受态细胞，进行蓝白斑筛选，37℃培养48h后，挑选白色菌落用m13通用引物进行鉴定后扩大培养，随后使用质粒提取试剂盒提取重组质粒，命名为bacmid
‑
asfv
‑
cd2v，备用于重组杆状病毒。
45.2.2his
‑
cd2v蛋白在293f细胞中的表达与纯化
46.用293
‑
sim培养基(中国生物公司产品m293ii)和5％co2在37℃下悬浮培养hek
‑
293f细胞。配制每1l细胞培养基中含有2mg pcaggs
‑
asfv
‑
cd2v质粒与12mg pei的混合液，在细胞密度为2
×
106cells/ml时利用混合液转染细胞。转染完成48h后，将培养液于1000
×
g的离心条件下离心20min并收集转染细胞上清，并用0.22μm的滤器去除杂质，然后将所得上清加入到预处理好的ni
‑
nta beads中，按照试剂盒的操作说明进行纯化，收集目的蛋白的流出液以及蛋白洗脱液以10ku超滤管浓缩后，取10μl制样进行sds
‑
page检测，结果如图1所示，纯化的蛋白在35kda到80kda之间有一条弥散带，可能为his
‑
cd2v蛋白。同时以bca蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度为3.5mg/ml，分装后，
‑
80℃保存备用。
47.2.3his
‑
cd2v蛋白的抗原性鉴定
48.采用棋盘滴定法确定his
‑
cd2v蛋白的最佳包被浓度为1μg/ml，并以此包被条件来进行his
‑
cd2v蛋白包被。利用间接elisa检测非洲猪瘟灭活阳性血清样品(5份)与灭活阴性血清样品(185份)，蓝耳病(prrs)灭活阳性血清样品，塞内卡(sva)灭活阳性血清样品，伪狂犬(pr)灭活血清样品。
49.利用间接elisa法检测5份灭活阳性血清样品与185份非疫区的灭活阴性血清样品，阴性对照为hyclone购买的猪阴性血清，p/n比值(≥2.1)作为阴阳性的判断标准。具体操作步骤为：用抗原包被液稀释cd2v蛋白，每孔加100μl，4℃包被过夜；pbst洗涤3次，每孔加入100μl封闭液，37℃封闭1h；pbs洗涤3次；所有样品均为1:100稀释检测，同时设购买的未免疫猪阴性血清为阴性对照，37℃孵育1h；pbst洗涤3次，pbs洗涤2次；每孔加入100μl稀释的兔抗猪hrp抗体(1:2000)，37℃孵育1h；pbst洗涤3次，pbs洗涤2次；每孔加入100μl的tmb底物溶液，室温反应15min，最后加入50μl 2mol/l的h2so4终止液终止反应，用酶标仪在450nm处测定od
450
值。
50.检测结果如表1所示：5份灭活阳性血清样品的检测结果均为阳性，185份灭活阴性血清样品中，183份的检测结果为阴性，2份的检测为假阳性。按照计算公式(表1)：dse＝a/(a c)和dsp＝d/(b d)计算，以cd2v蛋白作为包被抗原，dse为100％，dsp为98.9％。
51.此外，特异性实验结果表明，his
‑
cd2v蛋白与蓝耳病(prrs)灭活阳性血清样品，塞内卡(sva)灭活阳性血清样品，伪狂犬(pr)灭活血清样品无交叉反应。这些结果表明本实施例中表达的his
‑
cd2v蛋白具有非常好的抗原性。
52.表1cd2v蛋白的抗原性测定试验结果
[0053] 阳性样品阴性样品检测阳性(份)5(a)2(b)检测阴性(份)0(c)183(d)
[0054]
3.针对cd2v抗原的单克隆抗体的制备与测序
[0055]
3.1动物免疫与细胞融合
[0056]
以纯化后的his
‑
cd2v蛋白作为免疫原，按照佐剂说明书用生理盐水将his
‑
cd2v蛋白稀释到2倍最终浓度。充分混匀佐剂后，无菌条件下取出所需用量(按每针次50μl)，并与抗原按体积比1:1迅速混匀。通过后腿小腿肌肉注射、背部多点注射等两种方式免疫小鼠，每只小鼠注射100μl。第一次注射21天后按同样方式加强免疫1次。第35天颌下静脉采血，收集血清进行间接elisa检测。取效价最高的免疫小鼠脾细胞与生长状态良好的小鼠骨髓，瘤细胞sp2/0按照常规方法融合。
[0057]
3.2间接elisa检测方法的建立
[0058]
采用方阵滴定法确定间接elisa所用包被抗原和抗体的最适工作浓度。将纯化的his
‑
cd2v蛋白稀释至1mg/ml后，用包被缓冲液(0.05mol/l、ph9.6的碳酸盐缓冲液)分别作1:400、1:600、1:800、1:1000、1:1200和1:1400的稀释，然后每孔100μl抗原稀释液包被elisa板，4℃过夜，balb/c小鼠阳性血清和阴性血清均分别作1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600和1:3200倍比稀释，同时设立sp2/0细胞培养上清及空白对照，选择od
450nm
值在1.0左右，p/n比值最大的抗原稀释浓度为最适工作浓度。结果显示，抗原的最佳稀释度为1:1000(蛋白终浓度为1μg/ml)。
[0059]
3.3抗cd2v蛋白的单克隆抗体(m ab)杂交瘤细胞株的建立
[0060]
以真核表达的his
‑
cd2v蛋白为包被抗原，采用前述建立的间接elisa方法检测融合细胞上清中的特异性抗体。选择抗体效价高、呈单个克隆生长且细胞状态良好的细胞进行亚克隆培养，直至抗体分泌稳定，阳性孔的比例大于95％时，进行扩大培养。
[0061]
3.4腹水的制备及效价测定
[0062]
通过间接elisa方法共筛选得到3株杂交瘤细胞，选择其中效价较高的2株(15c8和30h6)进行扩大培养，并保留细胞上清备用，对细胞进行常规处理后，腹腔注射经不完全弗氏佐剂处理的balb/c小鼠以制备腹水，应用间接elisa方法对制备得到的腹水进行测定，结果显示所制备腹水的效价均可以达到1:106。采用辛酸
‑
硫酸铵法纯化腹水中的mab。
[0063]
3.5单克隆抗体的免疫荧光鉴定
[0064]
将bacmid
‑
asfv
‑
cd2v转染sf9细胞，包装出重组杆状病毒后，用p3代病毒侵染hi5细胞，根据细胞数目铺96孔板，继续培养48h后，吸弃培养基上清，pbs洗涤两次，用4％多聚甲醛室温固定细胞15min；pbs洗涤3次，每孔加入100μl羊血清，37℃封闭1h；吸弃封闭液，每孔加入100μl细胞上清进行孵育，同时设小鼠阴性血清为阴性对照，37℃孵育1h；pbs洗涤3次；每孔加入1:1000稀释的alexa fluor488标记的山羊抗小鼠igg在37℃避光孵育1h；pbs洗涤3次后进行dapi染色，在荧光显微镜下观察结果。如图2所示，15c8和30h6的细胞上清均可以明显的观察到绿色荧光，而阴性对照无绿色荧光，这表明两株单克隆抗体均能够特异性识别cd2v蛋白。
[0065]
3.6单克隆抗体的稳定性及亚型鉴定
[0066]
应用间接elisa法分别对筛选得到的15c8和30h6杂交瘤细胞第10代、第20代、第30
代、第40代和第50代培养上清的效价进行测定，确定杂交瘤细胞的稳定性。结果显示，两株杂交瘤细胞均能稳定分泌单抗，且效价基本保持在同一水平。
[0067]
应用sigma公司的亚类鉴定试剂盒鉴定单抗腹水的igg亚类，具体操作按照试剂盒说明书进行。经亚型鉴定，15c8单克隆抗体的亚类为igg2b/k型，30h6单克隆抗体的亚类为igg1/k型。
[0068]
4.asfv cd2v单抗竞争elisa方法的建立
[0069]
4.1试剂配制
[0070]
(1)包被液：0.05mol/l、ph 9.6的碳酸盐缓冲液；
[0071]
(2)洗涤液：ph7.4、0.1m的pbs，0.05％的tween
‑
20；
[0072]
(3)封闭液：以洗涤液配制的5％的bsa溶液；
[0073]
(4)稀释液：即为封闭液；
[0074]
(5)tmb：a液：0.02％h2o2，用ph5.0的0.1m柠檬酸
‑
0.2m磷酸氢二钠溶液稀释；
[0075]
b液：0.4
‰
tmb
‑
hcl，用50mm、ph2.8的柠檬酸钠溶液溶解；
[0076]
分别取50μl a液、b液混合避光保存，备用(也可以用商品化的tmb显色液)；
[0077]
(6)终止液：2m的h2so4溶液。
[0078]
4.2标准asfv阳性血清及标准asfv阴性血清的制备
[0079]
为减少elisa试剂盒在实际检测过程中由于不同操作人员和不同检测批次而造成的误差，本实施例制备了标准asfv抗体阳性对照血清和标准asfv抗体阴性对照血清，用于检测方法的优化和结果判定标准的确定。
[0080]
4.2.1标准阳性血清的制备
[0081]
选择6周龄spf仔猪，用碘酒消毒注射部位皮肤。第一次免疫，用注射器吸取弗氏完全佐剂(fca)5ml与等量的纯化后的真核表达his
‑
cd2v抗原(3.5mg/ml)进行乳化，采用肌肉注射的方式对仔猪进行多点免疫。间隔10
‑
14天后，进行第二次免疫，吸取8ml弗氏不完全佐剂与等量的纯化后的真核表达his
‑
cd2v抗原乳化后，以同样的方式多点肌肉注射免疫仔猪。间隔7
‑
10天后，前腔静脉采血，分离血清，采用elisa方法检测血清效价，抗体效价可达到1:10000以上时，心脏采血，分离到的血清即为阳性血清，加入万分之一的硫柳汞防腐，0.5ml分装后，
‑
20℃保存备用。
[0082]
4.2.2标准阴性血清的制备
[0083]
取经检验合格的spf猪，心脏采血，分离的血清即为阴性血清，加入万分之一的硫柳汞防腐。以0.5ml分装于无菌管中，
‑
20℃保存备用。
[0084]
4.3酶标抗体的制备及筛选
[0085]
采用abcam公司的hrp conjugation kit，按照试剂盒操作步骤对纯化后的cd2v单抗15c8和30h6进行hrp标记，获得所需酶标抗体15c8
‑
hrp和30h6
‑
hrp。
[0086]
将真核表达的his
‑
cd2v抗原以1μg/ml的包被浓度每孔100μl，4℃包被过夜；次日倒掉包被液，洗涤液洗涤3次，拍干，每孔加入200μl洗涤液配制的5％bsa溶液，37℃封闭1h，洗涤液洗涤3次；将标准阴、阳性血清用封闭液进行1:10稀释，每孔100μl，37℃孵育1h后，洗涤液洗涤3次；分别将hrp标记的15c8
‑
hrp和30h6
‑
hrp做1:10000倍和1:20000倍稀释，每孔加入100μl，37℃孵育1h，洗涤液洗涤3次，拍干；每孔加入100μl tmb显色液，室温显色15min；每孔加入50μl终止液终止反应，酶标仪在450nm读数。计算不同酶标抗体的n/p值。
[0087]
结果如表2所示，选择n/p值最高的作为最佳竞争酶标抗体。由表2可以看出，30h6
‑
hrp在1:10000倍稀释和1:20000倍稀释时的n/p值均高于15c8
‑
hrp，因此，选择30h6
‑
hrp进行cd2v竞争elisa检测方法的优化与建立。
[0088]
表2酶标抗体的筛选试验结果
[0089][0090]
4.4抗原最佳包被浓度和待检样品最佳稀释度的确定
[0091]
按照棋盘滴定法，将真核表达的his
‑
cd2v抗原分别以0.1μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml和8.0μg/ml的包被浓度，以每孔100μl抗原包被液，4℃过夜，次日倒掉包被液，洗涤液洗涤3次，拍干；每孔加入200μl洗涤液配制的5％bsa溶液，37℃封闭1h，洗涤液洗涤3次；将标准阴、阳性血清进行倍比稀释，从0、1:2稀释至1:32，自上而下分别加入96孔酶标微孔板中，每孔100μl，37℃孵育1h，洗涤液洗涤3次；然后每孔加入100μl、1:20000稀释的酶标抗体，37℃孵育1h，洗涤液洗涤3次，拍干；每孔加入100μl tmb显色液，室温显色15min；每孔加入50μl终止液终止反应，酶标仪在450nm读数。根据n/p值选择最佳抗原包被浓度和最佳酶标抗体稀释度。
[0092]
结果如表3所示，由表3可以看出，当抗原包被浓度为1μg/ml，血清稀释度为1:2时，n/p值最大，且在10以上，因此确定抗原最佳包被浓度为1μg/ml，样品的最佳稀释度为1:2。
[0093]
表3抗原包被浓度和样品稀释度的优化试验结果
[0094][0095][0096]
表3抗原包被浓度和样品稀释度的优化试验结果(续表)
[0097][0098]
4.5酶标抗体最佳稀释度的优化
[0099]
方法同4.4，将酶标抗体进行稀释1:2000、1:5000、1:10000、1:20000、1:30000、1:40000。以标准阴、阳性血清按照确定的最佳抗原包被浓度和最佳待检样品稀释度，在其他条件相同的情况下进行最佳酶标抗体稀释度的优化实验，反应完毕，利用酶标仪读取450nm的吸光值，计算n/p值，根据n/p值确定酶标抗体的最佳稀释度为1:30000。
[0100]
结果如表4所示，由表4可以看出，当酶标抗体的稀释度为1:30000时，n/p值最大，且在10以上，因此确定酶标抗体的最佳稀释度为1:30000。
[0101]
表4酶标抗体稀释度的优化试验结果
[0102][0103]
4.6最佳封闭液的确定
[0104]
方法同上，分别使用10％牛血清、5％bsa、5％脱脂奶粉、1％明胶作为封闭液于37℃封闭1h，其他条件按照已确定的最佳条件进行试验，检测标准阴、阳性血清样品，反应完毕，利用酶标仪读取450nm的吸光值，计算n/p值，将n/p值最高时的条件确定为最佳封闭条件。
[0105]
结果如表5所示，由表5可以看出，当封闭液为5％bsa时，n/p值最大，且在10以上，因此确定最佳封闭液为5％bsa。
[0106]
表5最佳封闭液的优化试验结果
[0107][0108]
4.7最佳显色时间的确定
[0109]
按照上述确定的最佳反应条件进行试验，加入tmb显色溶液后，室温分别避光显色5min、10min、15min和20min，其他条件不变的情况下，检测标准阴、阳性血清样品，反应完毕，利用酶标仪读取450nm的吸光值，计算n/p值，将n/p值最高时的反应条件确定为最佳显色时间。
[0110]
结果如表6所示，由表6可以看出，当显色时间为15min时，n/p值最大，且在10以上，因此确定tmb最佳作用时间为室温作用15min。
[0111]
表6tmb显色时间的优化试验结果
[0112][0113]
4.8竞争elisa方法阴、阳性血清判定标准的确定
[0114]
使用所建立的单抗c
‑
elisa方法对5份已知阳性血清和100份阴性血清分别检测3次，根据下述公式计算各已知背景血清样品的抑制率(pi)，来确定本公开c
‑
elisa的阴阳性血清界限。
[0115][0116]
检测结果显示，5份阳性血清的pi％值均大于50％，100份阴性血清的pi％值均小于40％。因此，确定本研究所建立的单抗c
‑
elisa阴阳性血清样品的判定标准为：血清pi≥
50％时，可判定为阳性；血清pi≤40％时，可判定为阴性；血清pi范围为40％＜pi＜50％时，可判定为可疑。
[0117]
4.9重复性检测
[0118]
根据批内和批间的变异系数来评价c
‑
elisa方法的稳定性。批内误差：使用同一批次包被的3块酶标板同时对2份阳性血清做检测，每份血清设置两个重复孔，计算其变异系数表示批内误差。批间误差：取3次不同时间包被的酶标板，同时对2份阳性血清进行检测，每块板上设置两个重复孔，计算其批间变异系数表示批间误差。检测结果如表7所示。
[0119]
表7重复性试验结果
[0120][0121]
批内重复实验结果显示，变异系数值分别为1.27％和1.19％；批间重复实验结果显示，变异系数为3.82％和3.66％。两份样品的批内变异系数及批间变异系数均小于10％，由此判断本实施例确定的单抗c
‑
elisa方法具有较好可重复性。
[0122]
4.10单抗c
‑
elisa的特异性评价
[0123]
按照前面确定的c
‑
elisa操作程序，分别检测asfv标准阳性血清、pcv2疫苗灭活阳性血清、prrsv疫苗灭活阳性血清、塞内卡灭活阳性血清、prv疫苗灭活阳性血清，根据显色结果和公式计算抑制率，由抑制率的高低来评价单抗c
‑
elisa的特异性。
[0124]
检测结果如表8所示，由表8可以看出，pcv2疫苗灭活阳性血清、prrsv疫苗灭活阳性血清、塞内卡灭活阳性血清、prv疫苗灭活阳性血清对应的pi％值均低于40％，asfv标准阳性血清对应的pi％高于50％，且远高于前述几种血清对应的pi％值，由此可以判定本实施例的30h6单抗竞争性elisa方法能够将猪的几种常见病与asfv相区分，因此具有较好的特异性。
[0125]
表8单抗c
‑
elisa特异性检测结果
[0126]
血清种类抑制率(pi％)asfv标准阳性血清91.35pcv2疫苗灭活阳性血清9.75prrsv疫苗灭活阳性血清10.22塞内卡灭活阳性血清10.31prv疫苗灭活阳性血清8.79asfv标准阴性血清0
[0127]
4.10单抗c
‑
elisa的灵敏度评价
[0128]
将asfv标准阳性血清和标准阴性血清分别做梯度倍比稀释1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280，使用优化后的c
‑
elisa进行检测。同时也采用id
‑
vet试剂盒对倍比稀释的血清进行检测，比较两种elisa试剂盒的敏感性。检测结果如表9所示，由表9可以看出，本实施例确定两种检测试剂盒的最低抗体识别浓度均为1:640倍稀释，可见本实施例的30h6单抗竞争性elisa方法具有较好的灵敏度。
[0129]
表9单抗c
‑
elisa敏感性试验结果
[0130][0131]
4.11临床样品的检测
[0132]
使用优化后的c
‑
elisa反应条件，对40份待检灭活猪血清进行检测，并与idvet公司的c
‑
elisa试剂盒检测结果进行比较。
[0133]
检测结果见表10。单抗c
‑
elisa检测出的阳性样本数为3份，阴性样品为37份，idvet公司的c
‑
elisa试剂盒检出阳性阳本3份，阴性阳本37份，两种检测方法的检测结果一致，符合率达到100％。由此可以看出，本实施例的cd2vc
‑
elisa试剂盒可以达到与已有的商品化试剂盒达到相同的检测效果。
[0134]
表10本公开c
‑
elisa与idvet试剂盒的样品检测结果
[0135][0136]
4.12酶标板的制备
[0137]
将真核表达的his
‑
cd2v抗原用包被液按最佳包被浓度(1μg/ml)稀释，每孔100μl加入96孔酶标微孔板中，4℃过夜；次日倒掉孔中液体，洗涤液洗涤3次，最后一次拍干，然后每孔加入200μl封闭液(5％bsa)，37℃封闭1h。洗涤液洗涤3次，干燥，真空包装。
[0138]
4.13asfv cd2v c
‑
elisa检测试剂盒的操作步骤
[0139]
4.13.1将待检样品用样品稀释液1:2稀释，每孔加入50μl稀释后的待检血清，再加入50μl 1:10000稀释的酶标单抗，同时设置标准阴性、阳性对照，37℃孵育30min，洗涤液洗涤5次后每孔加入100μl tmb底物显色液，室温显色15min，2mol/l h2so
4 50μl/孔终止显色，测定od
450nm
值并根据公式计算血清抑制率。
[0140]
4.13.2结果判定：当被检血清的pi≥50％时，可判定为阳性；当被检血清pi≤40％时，可判定为阴性；当被检血清的pi范围为40％＜pi＜50％时，可判定为可疑。
[0141]
5cd2v竞争性单克隆抗体序列的测定
[0142]
5.1杂交瘤细胞rna的提取
[0143]
当cd2v竞争性单克隆抗体30h6杂交瘤细胞长至单层时，弃掉培养液并使用3ml无菌pbs吹打并计数，收集1
×
106个细胞至1.5ml离心管中，800r/min离心5min，弃上清后以rna提取试剂盒按照说明书操作步骤提取杂交瘤细胞的rna。
[0144]
5.2杂交瘤细胞提取rna的rt
‑
pcr扩增与鉴定
[0145]
设计简并引物14条(其中vh
‑
f 4条，vh
‑
r 2条，vl
‑
f 6条，vl
‑
r 2条)，总计20对。
[0146]
表11单克隆抗体重链和轻链rt
‑
pcr扩增引物
[0147]
引物序列(5'至3')seq id no:mvl
‑
f1atggagacagactcctgctat4
mvl
‑
f2atggattttcaggtgttttcag5mvl
‑
f3atgragtcacakacggtcttyrta6mvl
‑
f4atgaggkccchgctytyctkggr7mvl
‑
f5atgaagttgcctgtgctgttg8mvl
‑
f6atgatgagtcctgccttcc9mvl
‑
r1actggatggtgggagga10vl
‑
r2cccaagcttacttgggaagatgga11mvh
‑
f1atggratgsagctgmatsctctt12mvh
‑
f2atgracttcgggyctkggtttt13mvh
‑
f3atggctgtcttggggctcttct14mvh
‑
f4atggrcagtachtyy15mvh
‑
r1ayctccacacrccagtggatagac16vh
‑
r2cccaagcttrccarkggatra17
[0148]
注：r＝a/g，s＝c/g，y＝c/t，m＝c/a，k＝t/g，h＝a/t，d＝g/t/a
[0149]
以提取的rna为模板，引物见表11，反应体系50μl(10
×
one step rna pcr buffer 5μl，mgcl2(25mm)10μl，dntp mixture(10mm)10μl，rnase inhibitor(40u/μl)1μl，amv rtase xl(5u/μl)1μl，amv
‑
optimized taq(5u/μl)1μl，f等量混合引物1.5μl，r等量混合引物1.5μl，模板4μl，ddh2o 15μl)，反应程序(50℃反转录30min，94℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，扩增35个循环，最后72℃延伸10min)。最后取8μl产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察rt
‑
pcr扩增结果，鉴定后选取合适引物对vh和vl进行大量扩增(本步骤重复两次)。使用2％琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，然后使用胶回收试剂盒回收vh和vl目的基因。
[0150]
5.3vh和vl的连接转化与鉴定
[0151]
将回收纯化的vh和vl目的基因与连接，反应体系如下：1μl4μl回收纯化的pcr产物。室温反应30min。
[0152]
取trans 5α感受态细胞各50μl于冰上融化后，加入连接产物混匀，冰浴30min，于42℃水浴热激45s，再冰浴2
‑
3min。加入600μl的lb液体培养基，37℃、220r/min摇床复苏培养60min后，取100μl菌液均匀涂布于lb固体培养基(amp抗性)，于37℃温箱中培养12～15h，观察转化单菌落的出现。挑取4～6个单菌落于1.5ml离心管(600μl的amp抗性lb液体培养基)，于37℃、220r/min摇床中培养，并设立对照。
[0153]
37℃培养4小时后，每个离心管取2.0μl菌液进行菌液pcr鉴定。反应体系20μl：rtaq酶(5u/μl)0.2μl，10
×
pcr buffer 2.0μl，dntp(2.5mm)2.0μl，m13
‑
f(10μm)1.0μl，m13
‑
r(10μm)1.0μl，菌液2.0μl，ddh2o 9.8μl；反应程序：95℃预变性4min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，扩增32个循环，最后72℃延伸10min。最后取8μl产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察pcr扩增结果，选取阳性克隆菌液送至测序。
[0154]
选择30h6单克隆抗体轻、重链基因克隆经鉴定后的3个阳性克隆为测序样品，获得抗体可变区核苷酸序列，使用dnastar和igblast软件进行比对，结果显示：3个轻链可变区基因均长408bp，编码136个氨基酸；3个重链可变区基因序列均长438bp，编码146个氨基酸。重链可变区具有如下面seq id no:2所示的氨基酸序列：
[0155]
esgsligdlgslklsgqsglqlhvkpevmlcatlvmapfyrasgrlewvatftsyfwkewslgsmvslrsevkgrfamyfgvrqtpegavptsdinakntlgisrslscateggdlqmsdfstgmstvsyqvgfkv。
[0156]
轻链可变区具有如下面seq id no:3所示的氨基酸序列：
[0157]
qynaegkgdiqswgtpasflstislghqrsnkaglnimtlslkphaseikksasavegtqegvvtvtslcqmwgsscraalqnsepyislfsseylakslsyyasksvlggpcitfrsyqaiqtgttpytfggeylvtqfeqdfyk。
[0158]
6对比实验
[0159]
6.1重组cd2v质粒构建
[0160]
将2.1中筛选出的6个优势抗原表位区域通过linker进行链接后直接构建至表达载体pcaggs中，并未将c端的两个优势表位进行重复折叠，得到如下面seq id no:18所示的核苷酸序列：
[0161]
tatgataataatcgtagtggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcgattccccaactattacatataattgtactaattctttaataacatgtaaaaataataatgggacaggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcgttaatgatactaatggagatatccttaattattattggaatggtaataataattttggcggcggcggcggcggcggcggcggcggctcattgaatgaaacagaaaatataaatggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcaaacatgttgaagaaatagaaagtccaccaccctctgaatctaatgaagaagatatttctcacgatgacaccacttccatacatgaaccatctcccagagaaccattacttcctaagccttacagtcgttatcagtatggcggcggcggcggcggcggcggcggcggcatgcgtccctcaacacaaccactcaacccatttcccctacctaaaccatgcccgccacctaaaccatgtcctccacccaagccatgcccgccacccaaaccatgtcctccacctaaaccgtgttctccacccaaaccgtgtcgtccacctaaaccatgtcctccacctaaaccatgtcctccacctaaaccatgtcctccacctaaaccatgtcctccatccaaaccatgtccttcacctgaatcctattctccacccaaaccactacctagt。
[0162]
上述序列由北京擎科生物科技有限公司合成，并在序列两端分别引入ecori和xhoi酶切位点和his标签及信号肽区，通过两酶切位点将上述基因序列插入到真核表达载体pcaggs中构建pcaggs
‑
asfv
‑
cd2v(s)重组质粒，按照2中的操作步骤进行蛋白表达与纯化，并利用纯化的蛋白制备单克隆抗体，筛选到2株具备竞争效果的单克隆抗体20g9和32b8，分别建立竞争elisa(后续称20g9竞争elisa和32b8竞争elisa)，优化后的竞争elisa方法只有酶标抗体的浓度不一样，20g9
‑
hrp和32b8
‑
hrp均为1:10000稀释，结果判定方式也一致，将这两种竞争elisa与本公开利用30h6建立的竞争elisa(简称为30h6竞争elisa)进行灵敏度、特异性和临床样品检测的比较。
[0163]
6.2三种竞争elisa的特异性比较试验
[0164]
分别以三种竞争elisa检测asfv标准阳性血清、pcv2疫苗灭活阳性血清、prrsv疫苗灭活阳性血清、塞内卡灭活阳性血清、prv疫苗灭活阳性血清，根据显色结果和公式计算抑制率，由抑制率的高低来评价单抗c
‑
elisa的特异性。
[0165]
检测结果如表12所示，由表12可以看出，本公开的30h6竞争elisa对asfv标准阳性血清的抑制率明显高于20g9竞争elisa和32b8竞争elisa，但是对其余阳性血清的抑制率缺明显低于20g9竞争elisa和32b8竞争elisa，由此可见，相较于20g9竞争elisa和32b8竞争elisa，本公开的30h6竞争elisa能够更好地将猪的几种常见病与asfv区分开，因此本公开的30h6竞争elisa具有更好的特异性。
[0166]
表12单抗c
‑
elisa特异性检测结果
[0167][0168]
6.3三种竞争elisa的灵敏度比较试验
[0169]
将asfv标准阳性血清和阴性血清分别做梯度倍比稀释1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280，使用三种c
‑
elisa进行检测。
[0170]
检测结果如表13所示，由表13可以看出，20g9竞争elisa最低可以检测到1:320倍稀释的血清，32b8竞争elisa最低可以检测到1:160倍稀释的血清，而30h6竞争elisa最低可以检测到1:160倍稀释的血清640倍稀释的血清，由此可见，20g9竞争elisa和32b8竞争elisa的灵敏度均低于本公开的30h6竞争elisa的灵敏度。
[0171]
表13单抗c
‑
elisa敏感性试验结果
[0172][0173][0174]
6.4三种竞争elisa的临床样品检测
[0175]
使用三种优化后的c
‑
elisa反应条件，对40份待检灭活猪血清进行检测，比较三种竞争elisa的检测结果与id
‑
vet试剂盒检测结果的符合率。
[0176]
检测结果见表14。本公开的30h6竞争elisa检测出的阳性样本数为3份，阴性样品为37份，20g9竞争elisa试剂盒检出阳性阳本2份，阴性阳本38份，32b8竞争elisa试剂盒检出阳性阳本2份，阴性阳本38份。20g9和32b8竞争elisa的检测结果一致，与id
‑
vet试剂盒的符合率为97.5％，本公开的30h6竞争elisa与id
‑
vet试剂盒的检测结果符合率为100％，由此可见，本公开的30h6竞争elisa具有更高的检测准确率。
[0177]
表14本公开c
‑
elisa与idvet试剂盒的样品检测结果
[0178][0179]
综合三种竞争elisa检测方法的灵敏度性、特异性和临床样品的检测结果准确性，相比之下，本公开的30h6竞争elisa更具有优势，且酶标抗体的工作效率更高。
[0180]
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
[0181]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0182]
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。