从愈伤组织悬浮培养物生产异硫氰酸酯的制作方法

本发明涉及异硫氰酸酯的体外生产领域，即，使用植物细胞培养物。更具体地，本发明涉及从十字花目(Brassicales)的细胞材料生产异硫氰酸酯的方法及其应用。

背景技术

异硫氰酸酯，通式为r-N＝C＝s结构，是天然产物和药物活性化合物中重要的功能性物质。这些化合物是重要的有机合成中间体，在药物、营养品、化妆品和农业等行业具有广泛应用。异硫氰酸酯可参与多种有机反应，用于合成各种类型的含硫、氮、氧的化合物，尤其是杂环化合物。异硫氰酸酯可广泛应用于制备有机合成产品，例如药品、化妆品原料、农药、染料等。异硫氰酸酯还可用于确定多肽和蛋白质中的氨基酸序列，并用作荧光素标志物。

异硫氰酸酯可通过属于十字花目(或称为芸薹目(Brassicales或Cruciales))的植物物种的几种植物生产。十字花目是开花植物的目，属于APG II系统下双子叶植物II类真蔷薇分支(Eurosids II)。该目许多成员共有的一个特征是产生硫代葡萄糖苷(glucosinolate)(芥子油)化合物。大多数分类系统包含此目，尽管有时立在白花菜目(Capparales)名下(命名选择取决于哪个被认为具有优先性)。这些分类中特别受欢迎的蔬菜和药用食品包括；西兰花、球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、山葵、辣根、萝卜、羽衣甘蓝、芥菜、豆瓣菜、木瓜种子、辣木种子、旱金莲和刺山柑等。这些物种产生不同比例的异硫氰酸酯，因此具有不同但可识别的相关风味。异硫氰酸酯作为防御病原体攻击的系统起作用。许多上述植物可以被归类为药用植物，也适合食用。它们含有多种植物化学物质，如生物碱、黄酮类化合物、酚类和硫代葡萄糖苷，被认为是世界大多数种群的救生药物的重要来源。在这些次级代谢产物中，硫代葡萄糖苷，尤其是它们的水解产物异硫氰酸酯，与其它不同的植物化学物质相比，具有无与伦比的生物活性。异硫氰酸酯化合物具有作为抗虫剂、抗氧化剂、除草剂、抗肿瘤发生和抗癌化合物的潜力。

异硫氰酸酯是由内源性酶黑芥子酶(β-硫代葡萄糖苷酶)水解(分解)硫代葡萄糖苷而产生的脂肪族和芳香族化合物。黑芥子酶是一种催化硫代葡萄糖苷水解的酶，它储存在黑芥子酶颗粒中，位于主要植物组织类型的某些韧皮部细胞的液泡中：地面组织、维管组织和表皮。因此这些细胞被称作黑芥子酶细胞(myrosin cell)。该酶黑芥子酶因此与完整植物细胞中的硫代葡萄糖苷物理分离。当上述植物被切伤或咀嚼时，黑芥子酶可以与硫代葡萄糖苷相互作用并从异硫氰酸酯的前体释放异硫氰酸酯。

上述植物都含有多种硫代葡萄糖苷，每一种在水解时形成不同的异硫氰酸酯。例如，西兰花是萝卜苷(glucoraphanin)(萝卜硫素(sulforaphane)的硫代葡萄糖苷前体)和黑芥子硫苷酸钾(sinigrin)(异硫氰酸烯丙酯(allyl isothiocyanate)的硫代葡萄糖苷前体)的良好来源。豆瓣菜富含豆瓣菜苷(异硫氰酸苯乙酯的前体)，而水芹含金莲葡糖硫苷(异硫氰酸苄酯的前体)。

一旦被吸收，硫代葡萄糖苷衍生的异硫氰酸酯会及时通过肝脏中称为谷胱甘肽S转移酶(GST)的一类II期解毒酶与谷胱甘肽偶联，然后在硫醚氨酸(mercapturic acid)途径中依次代谢。这种机制意在增加异硫氰酸酯的溶解度，从而促进尿液中的快速排泄。

目前，研究兴趣在于富含硫代葡萄糖苷的植物和各异硫氰酸酯的防癌活性。

事实上，大量研究证实，异硫氰酸酯的生物利用度大约是硫代葡萄糖苷的六倍，硫代葡萄糖苷没有生物活性，必须首先被水解才能被激活。因此，半个多世纪以来，异硫氰酸酯作为研究对象一直备受追捧。在发现萝卜硫素(一种来自西兰花的异硫氰酸酯)通过Keap1-Nrf2-ARE途径有力诱导哺乳动物细胞保护蛋白后，对这些独特的次级代谢产物的兴趣逐步增加。

此外，异硫氰酸苄酯也取得了相当大的研究和开发进展，异硫氰酸苄酯通常被归类为一种化学预防剂，被认为可以防止致癌和防止其他遗传毒性化合物到达被处理的组织的目标部位或与目标部位发生反应。较高的异硫氰酸苄酯摄入量与降低患肺癌、乳腺癌和结肠癌的风险相关，同时阻遏癌症的发展。在各种形式的异硫氰酸酯中，异硫氰酸苄酯表现出最强的抗癌作用之一。研究表明，它有助于预防肺癌和食道癌，还可以降低患其他癌症的风险，包括胃肠道癌。异硫氰酸苄酯可有效抑制多种促癌细胞色素酶，有助于防止癌发生。据报道，异硫氰酸苄酯诱导人胰腺癌细胞凋亡并抑制培养和异种移植的人乳腺癌细胞的生长。

在理解异硫氰酸酯的分子调控及其在防止亲电试剂和氧化剂中的关键作用方面取得进展的同时，也加大了将这些知识转化到改善人类健康和抗击疾病方面的努力。因此，业界对于实现成本效益好、产量高，同时确保在绿色化学原则下工作，而不开采天然植物资源的新生产方案给予了相当的关注。

制备异硫氰酸酯化合物，尤其是高纯度级的异硫氰酸酯化合物时，制备方法需要符合医药标准，制备方法的开发必须能够实现工业化生产，同时兼顾环保和成本效益。目前，异硫氰酸酯的合成方法很多：光气法、硫光气法、二硫化碳法和双(三氯甲基)法、碳酸盐法、硫脲分解法、硫代氯甲酸苯酯法、硫氰酸盐法等。

光气路线是将苯乙胺和二硫化碳溶解在有机溶剂中，在碱存在下引入光气生成异硫氰酸苯乙酯。光气也可以以光气替代产品的形式使用，如氯甲酸乙酯、双光气、三光气等。但是，反应过程中仍然无法避免光气的产生，光气会污染环境，存在较大的安全隐患。通过硫光气与胺类化合物直接反应制备异硫氰酸酯的方法，适用范围广，反应迅速，能用硫光气代替光气，提高了安全性。但是，硫光气为挥发性液体，有毒性，对环境危害极大，生产和运输不安全，从而该路线不利于大规模工业化生产；

在异氰化物路线中，异硫氰酸酯是由异氰化物和硫磺粉或硫化剂在金属催化剂存在下合成的。这种方法的主要问题是异氰化物的合成和提纯难度非常高。此外，异氰化物是一种剧毒物质，因此不能用于考虑食用的产品。

在硫氰酸酯路线中，利用卤代烃与硫氰酸酯反应生成异硫氰酸酯。但是，这种方法的缺点是整体产率较低，过程比较繁琐。

在二硫化碳路线中，其生产方法可包括以下步骤：将苯乙胺(或其他胺类有机化合物)和二硫化碳溶解在有机溶剂中，在碱催化下合成酰氨基二硫代氨基甲酸酯，在脱硫剂作用下反应，得到异硫氰酸酯化合物。关于脱硫剂的选择，还需进行大量研究，脱硫剂主要有氯甲酸甲酯和对甲苯磺酰氯、固体光气、元素碘、氯硅烷、磷酸氯或二环己基碳二亚胺等。该方法的优点是避免使用剧毒原料，但所得产品纯度低。接下来的纯化方案可以通过柱色谱进行。整体操作繁琐，试剂剂量大，使得该方法更适合实验级反应，不太适合工业化生产。

鉴于此，本领域需要开发一种安全、简单、环保、经济的工艺，能够实现工业化生产异硫氰酸酯化合物的制备和纯化方法，得到高纯度、高品质的异硫氰酸酯化合物，满足不断增长的医药和工业生产要求，同时尊重绿色化学原则，最重要的是，无需开采天然植物资源。

HEGAZI等人:“从牙刷树(Salvadorapersica L.)的愈伤组织培养物生产异硫氰酸苄酯(Benzyl isothiocyanate production from Salvadorapersica L.callus cultures)”，IOSR Journal of Biotechnology and Biochemistry,卷.2(2),第2455-264X页，公开了一种从牙刷树(Salvadora persica L.)(一种原产于埃及的药用植物)的愈伤组织培养物中生产异硫氰酸苄酯(BITC)的体外生产方法。在穆拉希吉和斯科格(Murashige and Skoog)(MS)培养基上培养两种类型的外植体，叶和茎部分，培养基中单独或与激动素(Kn)组合补充不同浓度的2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)，用于愈伤组织诱导和维持。此外，测定了不同浓度的两种氨基酸前体(苯丙氨酸(Phe)和半胱氨酸(Cys))对愈伤组织生长和BITC含量的作用。与完整植物相比，在愈伤组织中观察到高BITC含量的存在。

ES 2 694 706A1公开了一种通过向培养基中添加冠菌素(coronatin)(茉莉酸甲酯(methyl jasmonate)的十八烷类前体(octadecanoid precursor)的结构和功能类似物)或茉莉酸甲酯来增加细胞培养物中硫代葡萄糖苷产量的方法。因此，包含冠菌素或茉莉酸甲酯的培养基可用于增加植物细胞中硫代葡萄糖苷的产量。

BAENAS等人:“生物诱导剂有效增加十字花科苗芽中的硫代葡萄糖苷含量(Biotic Elicitors Effectively Increase the Glucosinolates Content in Brassicaceae Sprouts)”，Journal of Agricultural and Food Chemistry,卷62(8),第1881-1889页，公开了在受控生长条件下生物诱导剂之间的比较，以提高十字花科物种的植物化学质量，例如使即食苗芽富含促进健康的硫代葡萄糖苷。植物激素茉莉酸甲酯(25μM)、茉莉酸(150μM)和水杨酸(100μM)、低聚糖葡萄糖(277mM)和蔗糖(146mM)以及氨基酸dl-甲硫氨酸(5mM)作为诱导剂的作用在8天发芽的甘蓝(西兰花)、欧洲油菜(大头菜)、芜菁(白萝卜)和萝卜(中国月季萝卜和红萝卜)上进行了研究。

技术实现要素：

本发明的实施方式的一个目的是提供用于或涉及异硫氰酸酯生产的有效、可再现、安全、简单、环境友好和/或成本效益好的手段和方法。

本发明的实施方式的一个优点在于提供了用于以恒定且工业的规模从生物材料生产异硫氰酸酯的手段和方法。

本发明的实施方式的一个优点在于提供了优于传统的田间栽培和工业规模的化学合成的具有商业价值的异硫氰酸酯的成本效益好、环境友好和/或更有效的替代方案。

本发明的实施方式的一个优点在于可以不受或少受环境和季节因素与植物之间相互作用干扰地提供异硫氰酸酯。

本发明的实施方式的一个优点在于从十字花目(芸苔目)植物的愈伤组织培养物中生产异硫氰酸酯时可以实现更高的生产效益，所述十字花目植物包括但不限于以下植物科：叠珠树科、藜木科、十字花科、山柑科、番木瓜科、醉蝶花科、环蕊科、刺枝树科、池花科、辣木科、瘤药树科、木樨草科、刺茉莉科、夷白花菜科、烈味三叶草科和旱金莲科。

本发明的实施方式的一个优点在于可以克服或减轻用于生产异硫氰酸酯的现有技术方法的一个或多个缺点，例如上文简要概述的方法及其相关缺点。

从以下对本发明的详细描述中，本领域技术人员将容易明白其他目的、优点和新颖特征。

在第一方面，本发明提供了一种生产异硫氰酸酯的方法，该方法包括在半固体或固体愈伤组织诱导培养基中，由从甘蓝植物的外植体材料获得的细胞形成紧密的愈伤组织聚集体。该方法可以包括从外植体材料获得细胞和/或获得外植体材料。该方法包括转移愈伤组织聚集体中的细胞(例如转移愈伤组织聚集体)至摇瓶中的液体培养基中的悬浮培养物，该液体培养基含有多种诱导剂，和任选的吸附剂。该方法包括在摇瓶中培养后，将细胞从悬浮培养物转移到含有多种诱导剂和任选的吸附剂的生物反应器中的进一步悬浮培养物中。该方法包括由从生物反应器获得的细胞中提取和/或纯化至少一种异硫氰酸酯。多种诱导剂包括壳聚糖和水杨酸以增加异硫氰酸苄酯或任何其他异硫氰酸酯的积累。

根据本发明的实施方式的方法可包括在半固体或固体诱导培养基中启动叶的紧密愈伤组织聚集体，以及在进一步的半固体或固体愈伤组织诱导培养基中继代培养和扩增紧密的愈伤组织聚集体，例如新鲜的半固体或固体诱导培养基，例如具有与半固体或固体诱导培养基相同或相似的组成，例如在半固体或固体诱导培养基中引发紧密愈伤组织聚集体约4周后。

在根据本发明实施方式的方法中，提取和/或纯化可以包括通过溶剂提取从生物反应器中分离作为细胞次级代谢产物的至少一种异硫氰酸酯。

在根据本发明的实施方式的方法中，从外植体材料获得的细胞可以来源于植物的叶、果实、芽、苞、花、树皮、根、枝、茎、种子、球果、针叶或形成层组织。

在根据本发明实施方式的方法中，从外植体材料获得的细胞可以是从下胚轴外植体材料获得和/或是其中所述源自植物组织分生区的细胞。

在根据本发明的实施方式的方法中，从外植体材料获得的细胞可以从产生次级代谢产物异硫氰酸苄酯和/或其他异硫氰酸酯的植物品种的外植体材料获得。

在根据本发明实施方式的方法中，愈伤组织诱导培养基可以包括穆拉希吉和斯科格培养基和/或B-5培养基，

在根据本发明实施方式的方法中，至少一种诱导剂可以包含至少一种非生物诱导剂和/或至少一种生物诱导剂和/或源自生物诱导剂的至少一种微生物组分(microbial fraction)或产物。

在根据本发明实施方式的方法中，至少一种诱导剂可包括壳聚糖和/或水杨酸以增加异硫氰酸苄酯或任何其他异硫氰酸酯的积累。

在根据本发明的实施方式的方法中，至少一种吸附剂可包括脂肪族吸附剂和/或不混溶的液相吸附剂。

在根据本发明的实施方式的方法中，从培养的早期指数生长期到稳定期，多种诱导剂(和/或吸附剂)可被加入悬浮培养物中，和/或进一步悬浮培养物中。

在根据本发明的实施方式的方法中，多种诱导剂(和/或吸附剂)可被多次加入悬浮培养物中和/或进一步悬浮培养物中，其中所述多次被六小时到一个月范围内的时间段间隔。

在根据本发明实施方式的方法中，诱导培养基和/或液体培养基可以包括以下一种或多种：碳源、有机氮源、无机氮源、粗盐(macrosalt)、微盐(microsalt)、稀有微量元素、维生素、有机补充剂、植物激素、激素替代品或衍生物、激素抑制剂、合成生长调节剂、生物合成前体、代谢抑制剂、非代谢抑制剂、刺激剂、活化剂、抗褐变剂、抗氧化剂、稳定剂、增强剂、自由基、清除剂、调理剂和还原剂。

在根据本发明实施方式的方法中，诱导培养基可以包括生长素(auxin)和/或细胞分裂素和/或滥长素(giberellin)。

在本发明实施方式的方法中，愈伤组织聚集体和/或悬浮培养物和/或进一步悬浮培养物可以重复继代培养(例如，以每周、每两周或每月的方式进行)。优选地，紧密的愈伤组织聚集体可以在大约4周后转移到新鲜的培养基中，例如，其具有与愈伤组织诱导培养基相同或相似的组合物。

在根据本发明的实施方式的方法中，起始步骤、转移至摇瓶步骤和/或转移至生物反应器步骤可以分批工艺和/或半连续工艺和/或连续工艺进行。半连续工艺可以以补料分批或重复分批模式操作。在根据本发明的实施方式的方法中，继代培养可以每周、每两周或每个月进行。半连续工艺可以补料分批或重复分批模式操作，其中培养持续时间可以在介于约两天至约几个月，优选介于约六天和约二十天之间。连续工艺可以以两相系统操作，其中植物细胞可以在生物反应器系统中悬浮或固定生长，培养基可以在生物反应器和吸附剂储存器或树脂柱之间循环以吸附次级代谢产物。根据本发明的实施方式的方法的进一步迭代或连续应用，可以从衍生自定期继代培养的愈伤组织培养物和/或悬浮细胞培养物的细胞开始，例如，在先前的迭代或在方法的先前应用期间获得的细胞开始。

在根据本发明的实施方式的方法中，所述细胞或其衍生的细胞可能已经经受遗传操作。

在根据本发明的实施方式的方法中，液体培养基可包含浓度范围为10mg/L至40mg/L的水杨酸和浓度为200mg/L至600mg/L的壳聚糖。

在根据本发明的实施方式的方法中，外植体材料可来自甘蓝(Brassica oleracea L.var.Capitata)植物。

在第二方面，本发明涉及根据本发明的实施方式的方法的用途，用于制造药物产品、食品或饮品、补充剂、添加剂、皮肤护理产品、毛发护理产品或农业产品。

独立和从属权利要求描述了发明的特定和优选特征。从属权利要求的特征可以适当地与独立权利要求的特征以及其他从属权利要求的特征结合，而不仅如权利要求中明确描述的。

附图的简要说明

图1显示了用于说明本发明的实施方式的实例中的，分别在锥形瓶和生物反应器中的细胞悬浮培养物的异硫氰酸苄酯含量作为时间的函数的比较。

图2显示了用于说明本发明实施方式的实例中的非-GMO Impala F1卷心菜(甘蓝(Brassica Oleracea L.var.Capitata))的愈伤组织。

附图是示意性而非限制性的。附图中的元素不一定按比例表示。本发明不一定限于附图中所示的本发明的具体实施方式。

具体实施方式

尽管下文描述了示例性实施方式，但本发明仅受所附权利要求的限制。所附的权利要求在此明确地纳入此发明详述中，其中每项权利要求及其由权利要求所定义的依赖结构所允许的每项组合构成本发明的单独的实施方式。

权利要求中所用词语“包含”不限于其后所述的特征、元素或步骤，并且不排除其他特征、元素或步骤。因此，这规定了提及的特征的存在，而不排除进一步存在或增加一个或多个特征。

在此详述中，提出了各种具体的细节。本发明的实施方式可以在没有这些具体细节的情况下进行。此外，为了本公开的清楚和简明，不一定对众所周知的特征、元素和/或步骤进行详细描述。

下面参考实施方式对本发明的实施方式具体描述，以便于本领域的技术人员对本发明的理解。应注意，这些实施方式仅用于进一步解释本发明。不能将这些实施方式理解为限制本发明的保护范围。本领域的技术人员将意识到，本发明的保护范围可以由本领域的技术人员更好地理解。本发明公开的方法的非必要的改进和调整应仍落在本发明的保护范围内。同时，正在使用的原材料并不总是详细描述。原材料可以是市售可得的产品。并不总是详细描述的工艺步骤或制备方法是本领域技术人员已知的工艺步骤或制备方法。

由于许多高价值的代谢产物的植物来源没有被驯化，这些植物物种通常生长缓慢，且数量有限，且目标分子的浓度变化很大，常规以极低的浓度存在，因此使大规模提取变得复杂。代谢物的全化学合成可以提供用于生产简单分子的有吸引力的路线。然而，许多代谢产物具有多个手性中心，具有与其功能相关的区域特异性和立体特异性特征，使得全化学合成变得困难或没有利润。通过半合成生产代谢产物代表另一种途径，尽管半合成路线可能仍然很昂贵，且通常产生可能对环境有害的有毒副产品，半合成路线可以规避与这些高价值植物化学品的全合成相关的一些问题。相比于其他潜在策略，使用植物细胞培养物用于合成代谢产物提供了一些优点，尤其是对于具有复杂结构的代谢产物的生产。例如，可以在不开采天然植物资源的情况下生产次级代谢产物。在愈伤组织培养基中由少量植物材料起始的细胞生长和生物合成的速率可以相当高，并且可以通过定期继代培养无限维持。通过体外生长大量未分化的组织来生产次级产物，可以规避植物生产的季节性和时间特异性。

愈伤组织为，但不限于，在固体基质上生长的无序(unorganized)组织块。当应对伤口或虫害以及嫁接时，愈伤组织在植物上自然形成。愈伤组织可以通过定期的继代培养无限地繁殖，且可用于克隆许多整株植物。可以通过提高激素水平诱导愈伤组织形成。例如，用于生产愈伤组织的组织培养基可以包含细胞分裂素和生长素作为添加剂。在愈伤组织形成期间，在形态(愈伤组织通常由未特化的实质细胞构成)和代谢上都可能发生某种程度的去分化，例如，发育和特化期间的变化在某种程度上被逆转了。

这种去分化的一个后果是大多数植物培养物失去了光合作用的能力。这对愈伤组织的培养有重要的影响，因为其代谢状况可能会与供体植物的不一致。这可能会促使除了常规矿物质营养外，向培养基中加入其他成分，例如维生素和最重要的碳源。愈伤组织培养通常在黑暗中进行(缺乏光合能力将不是缺点)，因为光会促进愈伤组织的分化。在长期培养过程中，培养物可能失去对生长素和/或细胞分裂素的需求。这个过程被称为习惯化，在来自一些植物物种(例如甜菜)的愈伤组织培养中常见。尽管如此，愈伤组织培养在植物生物技术中极为重要，并进一步扩展到制药、营养品、化妆品和农业。

本发明人对异硫氰酸酯、其健康益处和强调绿色化学重要性的提取方法的持续研究，结果是实现了从治愈组织中提取异硫氰酸酯的方法。下文公开了一种方法，其符合当前的经济和工业趋势，并提供了合适的成本效益好、环境友好且比传统的田间栽培和/或工业规模的化学合成更有效的替代方法。

在第一方面，本发明涉及一种用于生产异硫氰酸酯的方法。该方法包括在半固体或固体愈伤组织诱导培养基中，由从十字花目植物物种的植物外植体材料中获得的细胞形成紧密愈伤组织聚集体，并从愈伤组织聚集体转移细胞(例如，转移愈伤组织聚集体)至摇瓶中的液体培养基中的悬浮培养物进行培养。该液体培养基包含至少一种诱导剂和/或吸附剂。该方法包括将细胞从摇瓶转移到生物反应器中的进一步悬浮培养物，例如，大波浪式生物反应器，其中包含至少一种诱导剂和/或吸附剂，并由从生物反应器中获得的细胞中提取和/或纯化至少一种异硫氰酸酯。

根据本发明的实施方式的方法是生产异硫氰酸酯的方法，例如异硫氰酸苄酯、萝卜硫素、莱菔素(sulforaphene)、莱菔子素(raphanin)、异硫氰酸烯丙酯、异硫氰酸甲酯、异硫氰酸荧光素、糖芥灵(erysolin)、甘油三芥酸酯、萝卜硫素亚砜类似物(iberin)、1-异硫氰基-5-(甲基亚磺酰基)戊烷(alyssin)、5-(甲硫基)戊基-异硫氰酸酯(berteroin)、3-(甲硫基)丙基异硫氰酸酯(iberverin)、桂竹香素(cheirolin)、5-甲基亚磺酰基戊基异硫氰酸酯、6-甲基亚磺酰基己基异硫氰酸酯、7-甲基亚磺酰基庚基异硫氰酸酯、8-甲基亚磺酰基辛基异硫氰酸酯、异硫氰酸苯乙酯、4-(α.-L-(鼠李糖苷吡喃糖基氧基)异硫氰酸苄酯、3-(α.-L-鼠李糖苷吡喃糖基氧基)异硫氰酸苄酯、2-(αL-鼠李糖苷吡喃糖基氧基)异硫氰酸苄酯、4-(4'-O-乙酰基-.α.-L-鼠李糖苷吡喃糖基氧基)异硫氰酸苄酯和/或其任何衍生物。

本方法包括在半固体或固体愈伤组织诱导培养基中从十字花目植物物种的植物的外植体材料(例如含硫代葡萄糖苷的植物组织材料)获得的细胞形成(例如起始)紧密愈伤组织聚集体。

本方法可以包括在引入愈伤组织诱导培养基之前对外植体材料表面灭菌。可以使用常规的灭菌技术，例如70％酒精、15％次氯酸钠和\"Chlorox\"(一种可从高乐氏(Chlorox)公司商购的漂白剂)处理。此外，抗微生物剂例如头孢西丁、苯来特、氯唑西林、氨苄西林、硫酸庆大霉素和磷霉素也可用于植物材料的表面消毒。因此，从植物中提取的外植体可用来建立愈伤组织培养。

细胞可以来自植物的叶子、果实、芽、穗、花、皮、根、枝、茎、种子、球果、针叶或形成层组织。细胞可以从下胚轴外植体材料获得。细胞可以源自分生区植物组织。在本发明的特别优选实施方式中，细胞可以源自下胚轴分生区末端植物组织。在一个优选的实施方式中，细胞是从产生次级代谢异硫氰酸苄酯和/或其他异硫氰酸酯的植物物种的外植体材料获得的。例如，细胞可以是甘蓝(Brassica oleracea L.)植物细胞，例如甘蓝(var.Capitata)。细胞可以是非-GMO的Impala F1卷心菜(甘蓝)(Brassica oleracea L.var.Capitata)的细胞。

由于包含愈伤组织的典型去分化细胞的异质群，挑选高产细胞系可能被认为是建立可盈利的代谢产物生产平台的重要的且非显而易见的步骤。由于植物中代谢产物的积累是基因型特异的，因此选择合适的物种和随后用于生成愈伤组织的器官可能是重要的。此外，这种选择过程可以通过精妙的基于化学的方法来促进。例如，通过外源中间体的应用，鉴定通过目标途径表达高水平代谢产物通量的细胞系。按照本发明的示例，但不限于，非-GMO Impala F1卷心菜(甘蓝(Brassica oleracea L.var.Capitata))的下胚轴外植体的愈伤组织聚集体可用于生产和提取异硫氰酸苄酯。

愈伤组织诱导培养基可包含蔗糖，例如3质量％的分析纯蔗糖。愈伤组织诱导培养基可包含胶凝剂，例如0.6质量％的植物凝胶(CAS号71010-52-1，可购自西格玛奥德里奇公司有限公司(Sigma-Aldrich Co.LLC))。

愈伤组织诱导培养基可以包括穆拉希吉和斯科格培养基和/或甘博格(Gamborg)B-5培养基，愈伤组织诱导培养基可以包括以下一种或多种：碳源、有机氮源、无机氮源、粗盐、微盐、稀有微量元素、维生素、有机补充剂、植物激素、激素替代品或衍生物、激素抑制剂、合成生长调节剂、生物合成前体、代谢抑制剂、非代谢抑制剂、刺激剂、活化剂、抗褐变剂、抗氧化剂、稳定剂、增强剂、自由基、清除剂、调理剂和还原剂。

愈伤组织诱导培养基可以碱性培养基。使用前，可以对培养基进行高压灭菌处理，例如，在121℃保持25分钟。

愈伤组织诱导培养基可以包含生长素，例如2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)和/或细胞分裂素，例如，6-苄氨基嘌呤(BAP)，和/或滥长素。例如，培养基可以包含2.4-d(例如浓度为3.0mg/l)和BAP(例如浓度为1.0mg/l)。观察到后一种组合对芸苔植物愈伤组织，例如，对有机非-GMO Impala F1卷心菜(甘蓝(Brassica oleracea L.var.Capitata))愈伤组织，有显著诱导作用。生长调节剂的其他比例以及不同生长素、细胞分裂素和/或滥长素的使用也在本发明的范围内。

优选地，紧密的愈伤组织聚集体可以在大约4周后转移到新鲜的培养基中，例如，其具有与愈伤组织诱导培养基相同或类似的组合物，以继代培养并扩大紧密愈伤组织聚集体。

本方法包括将愈伤组织(或愈伤组织的细胞)转移至至少一个摇瓶中的液体培养基中的中间规模悬浮培养物，并在液体培养基中培养该悬浮培养物。成功形成愈伤组织后，只需将从愈伤组织中获得的细胞(例如愈伤组织或从中获得的细胞)添加到液体培养基中，即可生成细胞悬浮培养物，且加入诱导剂和/或吸附剂以增加次级代谢产物的产生。在中间规模的悬浮培养建立后，产生的悬浮培养物具有显著的放大能力，能在工业相关的生物反应器中生长，以最大化代谢产物的生物合成水平。\"悬浮培养\"用于描述分散在液体营养培养基中的结构未分化细胞。应理解，悬浮培养物可包含处于不同聚集阶段的细胞。例如，在根据本发明的实施方式的悬浮液中可以遇到一系列聚集体尺寸，尺寸范围从直径几十微米(单个细胞或很少聚集的细胞)到直径数毫米的聚集体，由以下组成：数以千计的细胞。

愈伤组织培养物通常会表现出生长形态、生产力、生产概况和其他特征的可变性。由于单个细胞系对生长培养基成分的偏好不同，许多不同的生长培养基可用于愈伤组织的诱导和增殖，例如在根据本发明实施方式的方法中使用的愈伤组织诱导培养基和/或液体培养基中。合适的培养基组合物可能取决于培养的物种而异。

植物悬浮培养物能够实现快速的生长速度和高细胞密度。然而，最佳条件从一种细胞系到另一种细胞系会有所不同，因此，必须考虑对任何给定细胞系进行快速优化的方法。各种物种的最初培养物可以通过转移到合适的悬浮培养营养培养基中进行继代培养。

液体培养基可包含以下一种或多种：碳源、有机氮源、无机氮源、粗盐、微盐、稀有微量元素、维生素、有机补充剂、植物激素、激素替代品或衍生物、激素抑制剂、合成生长调节剂、生物合成前体、代谢抑制剂、非代谢抑制剂、刺激剂、活化剂、抗褐变剂、抗氧化剂、稳定剂、增强剂、自由基、清除剂、调理剂和还原剂。

营养培养基中的某些类别的添加剂在本发明中以特殊名称表示，并在此处定义。如本文所用，术语\"抗褐变剂\"指的是添加到培养基中以在细胞培养过程中防止色素形成的组分。这些色素包括酚类和相关化合物，通常观察到其对细胞生长、活力和产物形成的具有有害影响。如本文所用，术语\"生物合成前体\"用于描述添加至营养培养基中的化合物，其被细胞代谢并纳入感兴趣的代谢物(例如异硫氰酸苄酯)中。如本文所用，术语\"代谢抑制剂\"用于描述添加至营养培养基中干扰特定生物合成途径的化合物。例如，代谢抑制剂可用于通过阻断与次级代谢产物竞争早期生物合成前体的不同途径增强生物合成。如本文所用，术语刺激剂或活化剂用于描述添加至营养培养基中刺激或活化特定生物合成途径的化合物，例如导致生物合成的那些。应理解，本文所述的添加剂的作用机制可能未被研究透彻。

应当理解，在本发明的实施方式中由权利要求的范围所限定的允许范围内，可以在培养基中进行修改，例如替换其他常规盐组合物(例如有机物、维生素、氨基酸、前体、活化剂和抑制剂)、各种成分的添加或去除、生长调节剂或比例的改变。

除了非挥发性溶解营养，气态组分，主要是氧气、二氧化碳和乙烯(植物激素)在生长和产物制备中起着重要作用。两个参数是重要的。有利于生长和次级代谢产物形成的溶解性气体浓度显然是重要的，因为它们决定了反应器的操作条件。此外，消耗率或产率需要被纳入反应器设计，以便保持最佳特定浓度。

该液体培养基包含至少一种诱导剂和/或吸附剂。诱导剂和/或吸附剂可以存在于液体培养基中，在加入愈伤组织之前或之后，例如，在一个或多个预定时间。

至少一种诱导剂可以包含至少一种非生物诱导剂和/或至少一种生物诱导剂和/或至少一种微生物级或源自生物诱导剂的产物。通过在悬浮培养基中包含一种或多种诱导剂，可以在根据实施方式的方法中的悬浮细胞培养物中增加次级代谢产物的生成的产率。如本文所用，术语\"诱导剂\"包括当应用于植物或植物细胞培养物时，引起次级代谢产物产量增加的生物和非生物来源的化合物。许多不同的和多种的化合物可用作诱导剂，取决于它们的来源性质和它们与细胞代谢的作用模式。

合适的诱导剂实例包括生物诱导剂例如：灰葡萄孢大雄疫霉(Botrytis cinerea Phytophthora megasperma)、皮内拉斯条状体(Pinellas stripticum)、寡孢子菌种(Oligosporas sp.)、玛米亚腐酶(Pythium mamiallatum)、林腐霉(Pythium sylvaticum)、大丽花轮枝孢(Verticillium dahlia)、大丽花轮枝孢属(Verticillium sp.)、朱黄青霉(Penicillium minioluteum)、雪松疫霉(Phytophthora lateralis)、核果干腐壳蕉孢菌(Cytospora cincta)、桃干枯壳蕉孢菌(Cytospora leucostoma)、甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)、茄链格孢菌(Alternaria solani)、瓜链格孢菌(Alternaria cucumerina)、葱鳞葡萄孢菌(Botrytis squamosa)、异旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus)、苜蓿炭疽菌(Colletotrichum trifolii)、圆盘炭疽菌(Colletotrichum orbiculum)、禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、光亮柱状分歧孢菌(Cylindrocladium floridanum)、克地镰孢菌(Fusarium crookwellense)、疣蠕孢镰孢菌(Fusarium heterosporium)、尖孢镰孢蓝豆亚种(Fusarium oxysporam f.sp.Conglutinans)、尖孢镰孢番茄小种(Fusarium oxysporam f.sp.Lycopersici)、尖孢镰孢豌豆小种(Fusarium oxysporam f.sp.Pisi)、玉米赤霉(Gibberella zeae)、小麦禾麦真菌变种(Gaeumaimomyces graminis var.tritici)、地霉菌属(Geotrichum sp.)、钩端螺旋体(Leptosphaeria torrae)、鞭毛藻丛赤壳菌MPVI(Nectria haematococca MPVI)、豌豆球腔菌(Mycosphaerella pinodes)、荷兰榆树病菌(Ophiostoma ulmi)、甘蓝茎点霉(Phoma lingam)、豌豆脚腐病菌(Phoma pinodella)、晚疫病菌(Phytophthora infestans)、群结腐霉(Pythium aristosporum)、禾生腐霉(Pythium graminicola)、终极腐霉(Pythium ultimum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、核盘酶属(Sclerotinia sp.)、S.nodoram D-45、变色栓菌(Trametes versicolor)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、苹果黑星病菌(Venturia inequalis)；衍生自生物诱导剂的微生物级分或产品，例如：壳聚糖、地衣聚糖、葡甘露聚糖、普鲁聚糖(Pleuran)、葡聚糖、羧甲基葡聚糖、羟甲基葡聚糖、磺乙基葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露五糖、甘露四糖、纤维素溶素、Multifect XL、Multifect CL、树脂酶、Pulpxyme、SP431、果胶醇(Pectinol)、快速蛋白酶(Rapidase)、辅酶(Klerzyme)、几丁质酶；或非生物诱导剂，例如：花生四烯酸、反油酸、环AMP、二丁环AMP、甲基茉莉酮、顺式茉莉酮、茉莉酸、/3-葡聚糖、咪康唑、阿魏酸、AMO-1618、TritonX-100、苯甲酸、水杨酸、没食子酸丙酯、芝麻酚、氯化氯胆碱、3,4-二氯苯氧基三乙基-,(胺),氯乙基膦酸、二乙基二硫代氨基甲酸、去甲二氢愈创木酸,二硫苏糖醇、焦亚硫酸钠、焦亚硫酸钾、d-氨基-DL-苯丙氨酸、硫酸钒、Paclobut Unicon精胺、亚精胺、腐胺、尸胺、硫酸鱼精蛋白、SKF-7997、MER29、嘧啶醇(Ancymidol)、三唑酮(Triadimefon)、膦D、硫脲、葡聚糖硫酸盐、对苯二酚、壳聚糖谷氨酸、苯丙吗啉、丙氯灵、萘普生、MDU、TA，、赤霉素、脱落酸、1,3-二苯基脲、重氮基脲、间苯三酚、海藻酸钠、角叉菜胶、氯化铝、乙烯、乙酰水杨酸、氯化钠、乙酸。

应当理解，上述诱导剂仅作为示例提及，并不旨在限制本发明的范围。但是，特别优选的诱导剂包括水杨酸和壳聚糖。至少一种诱导剂可包含壳聚糖和/或水杨酸以增加异硫氰酸苄酯或任何其他异硫氰酸酯的积累。优选地，至少一种诱导剂可以包含壳聚糖和水杨酸。

在本发明的一个实施方式中，一种或多种诱导剂可以提供于(例如添加到)悬浮培养物中，以约0.01μM至约1M的浓度，优选以约1μM至约500mM的浓度，更优选以约10μM至约200mM的浓度，并且最优选以约50μM至约50mM的浓度。

优选地，可以在从接种时间到培养持续时间期间的任何时间将一种或多种诱导剂添加到悬浮培养物中，优选在从早期指数生长期到稳定期的时间，这取决于代谢产物和特定植物物种细胞系的性质。可以从培养物的早期指数生长期到稳定期一次将至少一种诱导剂添加到悬浮培养物中。

至少一种诱导剂可以多次加入悬浮培养物中，其中多次的连续时间间隔在约六小时至约一个月的范围内，优选在约十二个小时到两周左右。例如，可以将一种或多种诱导剂第二次或多次添加到悬浮培养物中，例如在先前诱导后约六小时至约一个月之间进行，更优选在先前诱导后约十二小时至约两周之间，最优选在先前诱导后约十二小时至约七天之间。例如，在连续和/或周期性的基础上添加和/或补充诱导剂可能是有利的。例如，向悬浮培养物中第二次或后续添加一种或多种诱导剂的时间可以在先前诱导后持续约六小时至约一个月时，更优选在先前诱导后持续约十二小时至约两周时，最优选在先前诱导后持续约15小时至约5天时。最初添加一种或多种诱导剂也可能是合适的，例如在悬浮培养建立后的预定时间，例如悬浮培养开始后的一到几个小时或1、2、4或6天后，向当时含有细胞但还没有任何此类诱导剂的液体培养基添加诱导剂。

液体培养基可以包含例如至少一种诱导剂、至少一种吸附剂的替代或补充。例如，吸附剂可以包含在或添加到液体培养基中，例如，向悬浮培养物添加约1g/L至约500g/L的量，优选约20g/L至约300g/L的量，更优选约50g/L至200g/L的量。

例如，可以在接种到培养持续时间期间的任何时间，优选在接种到指数生长期结束之间将一种或多种吸附剂添加到悬浮培养物中。一种或多种吸附剂可以添加到液体培养基中，例如添加到悬浮培养物中，在培养过程中同时或不同时间，与一种或多种诱导剂联合用于悬浮培养，这取决于代谢产物的性质和特定植物物种的细胞系。

一种或多种吸附剂可包括大孔非离子交联聚合物材料。

一种或多种吸附剂可包括以下的一种或多种，或可以是一种或多种以下的市售产品：Amberlite XAD7、Amberlite XAD2、Amberlite XAD7HP、Amberlite XAD4、Amberlite XAD16、Amberlite XAD1600、AMBERLITE、AMBERLITE FP、Purasorb AP-250、Purasorb AP-400；Dowex L493、Dowex V493、Dowex L323、Diaion HP20、Diaion HP21、SEPABEADS SP207、SEPABEADS SP70、SEPABEADS SP700、SEPABEADS SP825、SEPABEADS SP850、Diaion HP2MG；SERDOLIT PAD I、SERDOLIT PAD II、SERDOLIT PAD III、SERDOLIT PAD IV、RP-8(默克公司(Merck))、木炭、活性炭、Supelpak-2、Supelρak-2B、Supelite DAX-8、Duolite XAD761、Dowex、Optipore L493、聚(苯乙烯-共-二乙烯基苯)、AMBERSORB 572、AMBERSORB 348F、二甲氨基甲基-聚苯乙烯、聚(4-乙基苯乙烯-共-二乙烯基苯)、弗罗里硅土(Florisil)、氢氧化铁、海泡石、拟绿1配体亲和吸附剂、拟黄2配体亲和吸附剂、拟红2配体亲和吸附剂、拟橙2配体亲和吸附剂、拟蓝1配体亲和吸附剂、拟蓝SA配体亲和吸附剂、拟蓝2配体亲和吸附剂、拟橙3配体亲和吸附剂、拟红3配体亲和吸附剂、拟蓝AP配体亲和吸附剂、拟橙1配体亲和吸附剂、拟黄1配体亲和吸附剂、Tenax TA、AMBERCHROM、AMBERJET、AMBERLYST、DUOLITE、MAC HP、丙烯酸阴离子树脂、XAD聚合物吸附剂、酚醛树脂、核级树脂。

优选地，在本发明的一个实施方式中，一种或多种吸附剂可以包括脂肪族吸附剂，例如HP2MG和XAD-7，其为特别优选的。

一种或多种吸附剂可以是或可以包括不混溶的液相吸附剂。不混溶液相吸附剂的实例包括但不限于二甲基硅氧烷聚合物(有机硅消泡剂A)、聚甲氧基硅烷(也称为硅油)、长链或支链(例如具有至少8个碳原子，优选具有12至20个碳原子)烷烃吸附剂，例如十六烷和乙二醇，或多元醇吸附剂，例如Myglyol。

一种或多种摇瓶中的液体培养物可以暴露于空气中并优选摇动和以其他方式轻轻地移动以将空气引入培养基中，或者可以通过管道将空气引入培养容器中。培养物可以在合适的生长条件下维持，优选在约15℃至27℃的温度下，更优选在25℃。pH值可介于约3至约7.5之间，优选介于约5.7至5.8之间。培养物可以在从完全黑暗到完全光照(窄带和/或广谱)的光照条件下生长不同的时间段。培养条件可根据培养的植物细胞种类和次级代谢产物或感兴趣的代谢产物而变化。

氧气可以显著影响次级生物合成的速率。二级生物合成途径中需氧步骤的高饱和常数可能需要细胞在摇瓶和/或生物反应器中经受高氧水平。也可以使用补充CO2维持高生长率。乙烯，一种植物激素，在植物生长和发育的所有方面(包括次级代谢)中发挥多效作用，因此也可以在根据实施方式的方法的后续阶段中添加到摇瓶和/或生物反应器中。

在摇瓶中和/或在随后的生物反应器中，次级代谢产物的生物合成也可以通过培养基更换来刺激，这可能是由于去除了产物从而防止了反馈抑制和产物降解。周期性去除废培养基带来产量优势，此外，还可通过去除表现出抑制活性的其他非所需的次级代谢产物来遏制次级生物合成。向正在进行活性生物合成的细胞补充新鲜培养基也可以通过提供已耗尽的必需营养素来提高产量。应当认识到，培养基更换的量、更换频率和补充的培养基的组合物可以根据具体情况而变化。例如，培养基可以连续或周期性地更换，例如每小时、每天、每隔几天或每周。

该方法包括将细胞从悬浮培养物转移到生物反应器中的进一步悬浮培养物，例如含有新鲜液体培养基，例如大波浪式生物反应器，其包含至少一种诱导剂和/或吸附剂和/或至少一种另外的诱导剂和/或吸附剂。生物反应器中的液体培养基可以具有与摇瓶中悬浮培养物所用相似的组合物。

植物细胞培养工艺的操作模式是指营养物质、细胞和产品随时间添加或去除的方式。初始时供应所有营养物质，并且在培养期结束时收获包含细胞和产物的培养物内容物，该操作模式被称为\"单阶段批处理\"。当批处理被分成两个连续阶段，即生长和生产阶段，并且培养基在两个阶段之间交换时，该操作模式被称为“两阶段批处理”。

\"分批补料(FED-batch)\"操作，特定培养基添加剂和营养物质在单阶段或两阶段分批培养过程中被周期性地或连续地供应。当收获分批培养的大部分(但不是全部)内容物时，加额外的新鲜培养基用于继续细胞生长和生产，该过程类似\"重复排注(repeated draw and fill)\"操作，被称为\"半连续处理\"。

当持续供应新鲜培养基并持续去除流出培养基时，该工艺称为“持续”。如果细胞保留在反应器内，则该工艺称为“灌注模式”。如果细胞被流出培养基持续去除，则该持续工艺称为“恒化器”。

应当认识到，这些不同的工艺操作模式与次级代谢产物生产方法相容，例如，具体地单独涉及本文所述的愈伤组织起始步骤、在摇瓶中悬浮培养的步骤和/或在生物反应器中进一步悬浮培养的步骤。

该方法包括从悬浮培养物中获得的细胞提取和/或纯化和/或分析至少一种异硫氰酸酯。这种提取和/或纯化可以包括通过溶剂萃取从包含细胞的液体培养基中分离作为细胞次级代谢产物的至少一种异硫氰酸酯。优选地，从悬浮培养物中回收作为次级代谢产物的至少一种异硫氰酸酯是通过使用合适溶剂利用溶剂萃取从细胞、吸附剂和营养培养基中分离次级代谢产物来进行的。

该方法还可以包括将获得的一种或多种异硫氰酸酯添加到药物产品、食品或饮品、补充剂或添加剂、皮肤或毛发产品或农业产品中。

该培养基，例如本文中上文所述的愈伤组织诱导培养基和/或液体培养基，可实现良好的总次级代谢产物形成，但也可有利地将细胞生物合成导向次级代谢产物生产。该培养基可以促进延长细胞活力和生物合成，此外，可以引起显著水平的产物被分泌到细胞外培养基中。这些特征在用于次级代谢产物生产的高效商业规模工艺的操作中可能特别重要。

在另一方面，本发明涉及根据本发明的第一方面的方法的用途，用于制造药物产品、食品或饮品、补充剂、添加剂、皮肤护理产品、毛发护理产品或农业产品。

因此，根据实施方式的用途可包括提供药物组合物，其包括通过根据本发明的实施方式的方法生产的一种或多种异硫氰酸酯和药学上可接受的赋形剂。例如，该药物组合物可以是但不限于抗癌药、抗生素、抗真菌药、抗组胺药、抗高血压药、抗原生动物药、抗丝虫药、抗疟疾药、抗血吸虫药、抗溃疡药、抗凝血药、抗凝血药、抗焦虑药、抗炎药、防腐剂、杀线虫剂、抗病毒剂、血管扩张剂和保护/预防剂。该组合物可以适合但不限于口服、鼻(内)、肠胃外、全身内(intrasystemically)、腹膜内、局部(如通过滴注透皮贴剂)、口腔给药或作为口服或鼻喷雾剂给药。药物组合物可适用于人或兽医应用。药物组合物或皮肤护理产品可适用于治疗或预防哺乳动物(例如人)的皮肤癌。该药物组合物可适用于治疗或预防哺乳动物(例如人)的过敏反应、动脉闭塞、阿尔茨海默病、癌症、低胆固醇血症、慢性胃炎、高血压、关节炎症(关节炎)、黄斑变性、胃溃疡和胃炎、中风和上呼吸道疾病。

根据实施方式的用途可包括提供食品或饮品、补充剂或添加剂，其包含通过根据本发明的实施方式的方法生产的一种或多种异硫氰酸酯，其中食品或饮品或补充剂可以是但不限于果汁、冰沙、奶昔、茶、汤、酱、沙拉、格兰诺拉麦片、谷物、面包、其他烘焙食品、油炸食品、药丸、喷雾和/或其他可摄入产品。食品或饮品、补充剂或添加剂可以适用于人或兽医应用。

根据实施方式的用途可以包括提供包含通过根据本发明的实施方式的方法生产的一种或多种异硫氰酸酯的皮肤或毛发护理产品。皮肤或毛发护理产品可以是但不限于，头发清洗剂，如洗发水、漂洗剂、漂洗洗发水、护理洗发水等；头发化妆品，包括生发洗发水、护发素、头发护理剂、发乳、头发喷雾、发液、发蜡、发水、头发造型制剂、烫发液、染发剂、酸性染发剂、美发剂等，或皮肤化妆品，如护肤液、乳液、洗面奶、卸妆液、清洁液、润肤液、滋养霜、润肤霜、按摩霜、清洁霜、沐浴露、洗手液、香皂、剃须膏、防晒化妆品、除臭凝胶、除臭粉、除臭液、除臭喷雾、止汗凝胶、止汗粉、止汗液，止汗喷雾、组合除臭止汗凝胶、组合除臭/止汗粉、组合除臭/止汗液、组合除臭/止汗喷雾、卸妆凝胶、保湿凝胶、保湿精华、防紫外线精华、剃须泡沫、粉饼、粉底、唇膏、腮红、眼线、眼影、眉笔、沐浴制剂等；口腔清洁剂，如牙膏；或其他毛发和皮肤产品。皮肤或毛发产品可适用于人或兽医应用。

根据本发明实施方式的另一种用途可包括提供包含通过根据本发明实施方式的方法生产的一种或多种异硫氰酸酯的农业产品。农业产品可以是但不限于农用杀虫剂、粉剂、颗粒、喷雾剂、肥料、侧施肥料、沟内改良剂、土壤改良剂、堆肥或其他农业产品。

在根据实施方式的用途中，可以在药物产品、食品或饮品、补充剂、添加剂、皮肤护理产品或头发护理产品中提供一种或多种异硫氰酸酯，以在哺乳动物(例如人)中诱导第2阶段酶的活性。

在根据实施方式的用途中，可以在农业产品中提供一种或多种异硫氰酸酯以在植物中诱导第2阶段酶的活性。

以下示出实例和实验结果以说明本发明的实施方式的方面和应用。应当理解，这些实施例和/或实验结果仅是说明性的，并不旨在限制本发明。然而，下文实施例中描述的工艺可被认为是本发明的优选实施方式。可以进行具有技术人员能力范围内的明显改变的类似方法以生产不同的异硫氰酸酯，或相对于彼此以不同优选比例的异硫氰酸酯，和/或来自不同的核心十字花目植物物种，因此被视为同等在本发明的范围内。

种子制备和发芽

确定了卷心菜愈伤组织体外大规模生产的条件，以鉴定卷心菜中响应最佳的愈伤组织诱导。为此，挑选了各种卷心菜(包括非-GMO Impala F1卷心菜(甘蓝(Brassica oleracea L.var.Capitata))。所述栽培品种的F1杂交种子购自法国隆格-朱梅尔斯技术中心(Technisem,Longué-Jumelles)。种子在流动的自来水下洗60分钟。使用蒸馏水中70％酒精和0.1％氯化汞溶液(西格玛奥德里奇公司，比利时)对种子进行表面灭菌。将种子在该溶液中浸泡5分钟并在无菌条件下用高压灭菌的蒸馏水洗涤三次。这样做是为了除去种子包衣和种子周围的灰尘。第三次洗涤后，种子在高压灭菌的蒸馏水中保持五分钟，然后在层流气流柜中在高压灭菌的沃特曼纤维素滤纸(西格玛奥德里奇公司，比利时)片上干燥。

为了发芽，将种子置于一次性皮氏平板中的湿纸上；将板用封口膜(西格玛奥德里奇公司，比利时)密封并在20±2℃避光孵育。5-7天龄幼苗的下胚轴用作外植体用于愈伤组织形成。愈伤组织诱导培养基包含4.43g/l穆拉希吉和斯科格(MS)维生素溶液(M3900，西格玛奥德里奇公司，比利时。溶液包含(mg/ml)：2.0甘酸、100.0myo-肌醇、0.50烟酸、0.50盐酸吡哆醇、0.10盐酸硫胺素)，3.0％分析纯蔗糖(Amsbio，英国)，0.6％凝胶源(植物凝胶；西格玛奥德里奇公司，比利时)。为了研究诱导愈合组织生成和次级代谢产物的理想比例，过滤灭菌的激素补充剂；生长素；2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸；西格玛奥德里奇公司，比利时)，细胞分裂素；6-BAP(6-苄氨基嘌呤；西格玛奥德里奇公司，比利时)，和以各种浓度使用的氨基酸前体。在胶凝之前，用0.1NaOH和0.1N HCl(西格玛奥德里奇公司，比利时)将培养基的pH调整至5.5和5.7。培养基(50–55ml体积)被分配到大灭菌广口瓶中。用高压灭菌的聚丙烯盖密封广口瓶并在1.1kg/cm²压强下在121℃高压灭菌15分钟。然后让培养基放凉并在室温下储存直至使用。

愈伤组织诱导

所有培养物在空调孵育室中孵育。愈伤组织培养物在完全黑暗中被保持在25±2℃以避免由于酚类化合物的组织褐变。

为了研究不同栽培品种的愈伤组织诱导响应，检查了15种不同愈伤组织诱导培养基。非-GMO Impala F1卷心菜(甘蓝(Brassica oleracea L.var.Capitata))的下胚轴外植体在所有愈伤组织诱导培养基上同时培养，给予不同浓度的2,4-D和6-BAP。通常在第一次接种后两周之内，随着长度的增加，外植体组织的淡黄色转变为绿色，大约增加到原长的两倍。然后随着时间的推移，整个外植体组织变成新鲜的黄色胚性愈伤组织团。列表数据有助于推断CM1、CM3、CM6和CM9培养基对于愈伤组织诱导最有效，因为在这些培养基上培养的所有外植体组织都产生了活力和胚性俱佳的愈伤组织(100％愈伤组织诱导)。列表观察表明培养基中高浓度的2,4-D有利于重复细胞分裂和愈伤组织形成，并且发现如果与生长素分别以2:1的比例(至少)使用更好。

4周后将愈伤组织培养物继代培养到新鲜培养基，以增加愈伤组织培养物的总重量。在使用一次性生物反应器袋转移到优化的液体培养基之前，记录愈伤组织诱导百分比(％)、愈伤组织的平均鲜重和干重(mg/外植体)以及愈伤组织的颜色和质地。用于从非-GMO Impala F1卷心菜(甘蓝(Brassica Oleracea L.var.Capitata))生产异硫氰酸苄酯的细胞悬浮培养物的优化培养基的详细组合物示于下表。原始MS培养基含有NH4NO3，且被含有维生素B谱的NaNO3 代替。

诱导

除了无诱导剂的对照处理，将10g愈伤组织(鲜重/容器)转移到除了不同浓度的壳聚糖(200、400和600mg/L)和水杨酸(10、20和40mg/L)作为生物诱导剂外相同的培养基组合物中。收集愈伤组织后，确定鲜重和干重。将愈伤组织在烘箱中于45℃干燥至恒重后测定干重。还记录了每次处理的异硫氰酸苄酯浓度。培养4周后，记录数据。

悬浮培养物的建立-锥形培养瓶

在200ml锥形瓶(圣戈班高功能塑料化学器皿(Saint Gobain Performance Plastics Chemware)PFA刻度锥形瓶)中，从6g新鲜松散的愈伤组织建立悬浮培养物，瓶中含有60ml液体优化MS培养基，其中含有各1.0mg/L的2,4-D和Kin，此外还有200mg/L壳聚糖。如前所述，在高压灭菌之前将培养基的pH调整到5.7-5.8。用灭菌的非吸收性棉塞和两层铝箔将瓶封口，并在16小时光周期的培养房间(康威龙(Conviron)，德国)中在旋转振荡器(IKA实验室设备(IKA Laboratory Equipment)，比利时)上以100rpm的速度在25±2℃孵育。在每个生长阶段每隔7天对培养的细胞进行采样，直到孵育的第28天，并测定异硫氰酸苄酯的浓度。

悬浮培养物的建立-生物反应器实验

本研究中使用了一次性ReadyToProcess WAVE细胞袋生物反应器(GE生命科学(GE Life Sciences)，比利时)，其由5L的一次性细胞袋组成。将40g Impala F1卷心菜(甘蓝(Brassica oleracea L.var.Capitata))细胞栽培到含有4L(工作体积)的优化培养基(穆拉希吉和斯科格培养基，补充2,4-D和Kin各1mg/L，以及200mg/L壳聚糖)的培养细胞袋中。摇动角保持在6°，摇动速率保持在20摇/分钟且温度保持在25℃。pH保持在5.7-5.8。

以7天为间隔收集样品，直至第30天，用于异硫氰酸苄酯的定量分析。

异硫氰酸苄酯含量分析

为了测定异硫氰酸苄酯含量，进行了高效液相色谱(HPLC)。从锥形瓶培养和一次性ReadyToProcess WAVE细胞袋生物反应器实验愈伤组织和细胞进行异硫氰酸苄酯提取。使用含有MeOH:无菌水为70:30(v:v)的玻璃研钵和研杵(西格玛密理博公司(MilliporeSigma)，比利时)将样品均质化。然后将提取物转移到玻璃塞锥形瓶(DWK生命科学公司(DWK Life Sciences))中，并在恒温浴(飞世尔科学公司(Fiserscientific)，比利时)中恒定搅拌。在70℃下进行萃取30分钟，然后在HPLC进样前在英杰公司(Invitrolon)PVDF膜(聚偏二氟乙烯)(0.45μm，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，比利时)上过滤。

使用外标通过HPLC分析样品的甲醇提取物的异硫氰酸苄酯浓度。HPLC系统(Ultimate 3000自动化系统，赛默飞世尔科技公司，比利时)与UV-Vis检测器(UltiMate 3000多波长检测器，赛默飞世尔科技公司，比利时)和真空脱气机(UltiMate 3000SRD-3400HPLC脱气机，赛默飞世尔科技公司，比利时)联用。

通过自动进样器(UltiMate 3000WPS-3000自动进样器，赛默飞世尔科技公司，比利时)进样20μl；在C18反相LC色谱柱(Accucore C18 LC柱，赛默飞世尔科技公司，比利时)上进行色谱分离。柱温保持在30℃，检测波长为253nm。使用甲醇(溶剂A)和乙腈(溶剂B)(HPLC级，西格玛奥德里奇公司，比利时)获得最佳分离效率。流速为1ml/分钟。每次分析的运行时间为60分钟，柱清洗和平衡需要10分钟。

进样样品的异硫氰酸苄酯浓度计算为μg/g样品鲜重。

实验以完全随机化的设计进行，愈伤组织实验每次处理至少30次重复，细胞悬浮培养实验至少4次重复。使用由Snedecor和Cochran修改的邓肯多范围检验，通过方差分析(Anova)程序对数据进行统计分析。用不同字母标记的值被认为在p<0.04时具有统计学差异。

观察结果

非-GMO Impala F1卷心菜(甘蓝(Brassica oleracea L.var.Capitata))的源于下胚轴外植体的愈伤组织培养物积累异硫氰酸苄酯作为对生物诱导剂水杨酸和壳聚糖的响应。为了大量异硫氰酸苄酯积累，筛选这两种诱导剂的各种浓度。与对照培养物相比，水杨酸和壳聚糖均显示异硫氰酸苄酯积累显著增加，而愈伤组织鲜重的增加不显著。与水杨酸相比，用壳聚糖处理的愈伤组织增加了异硫氰酸苄酯的积累。用200mg/L浓度的壳聚糖处理后记录到异硫氰酸苄酯的最大积累(6.425μg/g鲜重)，与对照处理(1.248μg/g鲜重)相比，异硫氰酸苄酯产量增加了约5.1倍)，也达到了愈伤组织的最高鲜重和干重。尽管这种处理是最佳的，但培养基中的该壳聚糖浓度水平以上(400和600mg/L)时，异硫氰酸苄酯的产量会下降。与对照相比，用不同浓度的水杨酸(10–40mg/L)处理的愈伤组织在10mg/L时表现出最大的异硫氰酸苄酯积累(2.174μg/g鲜重)，这略微提高了异硫氰酸苄酯的产量。据记录，比对照处理增加了1.7倍。水杨酸诱导剂浓度的增加导致异硫氰酸苄酯积累的下降。结果列于下表中。

异硫氰酸苄酯最大积累量的诱导剂的最佳剂量用于进一步的实验(200mg/L壳聚糖)。据观察，异硫氰酸苄酯的产量受到生物诱导剂添加的高度影响。因此，诱导提供了一种用来增加次级代谢产物的体外产量的有吸引力的策略。实验表明，与对照相比，壳聚糖和水杨酸都增加了非-GMO Impala F1卷心菜(甘蓝(Brassica oleracea L.var.Capitata))愈伤组织培养物中异硫氰酸苄酯的积累。

壳聚糖和水杨酸的刺激作用可能是由于生物合成酶的刺激。壳聚糖是植物病原体真菌细胞壁的主要结构成分，可模拟其作用并激活植物中防御相关次级代谢产物的生物合成。此外，水杨酸在防御微生物和食草动物的攻击以及非生物胁迫方面具有重要作用。

据观察，壳聚糖比水杨酸更好地提高了异硫氰酸苄酯的生产。观察到诱导剂的另一个显著效果是异硫氰酸苄酯的积累是诱导剂剂量依赖性的。观察到随着诱导剂应用，异硫氰酸苄酯积累增加，并且诱导剂浓度增加超过最佳浓度导致愈伤组织培养物中异硫氰酸苄酯含量的降低。

图2显示了在本实验中获得的非-GMO Impala F1卷心菜(甘蓝(Brassica Oleracea L.var.Capitata))的愈伤组织。

细胞悬浮培养为工业生产各种有价值的植物化学物质提供了一种替代传统农业的方法。与固体培养相比，液体培养具有许多优点。细胞和培养基的接触表面积要大得多，这使得细胞更容易利用充分混合的营养物质。此外，可能形成的有害化合物可以被有效地稀释，防止细胞生长抑制。图1显示了在锥形瓶培养和一次性ReadyToProcess WAVE细胞袋生物反应器中，在不同孵育时间期间，用最佳浓度的壳聚糖(200mg/L)进行诱导对异硫氰酸苄酯积累的影响。使用这两种方法从细胞悬浮培养物中成功地扩大了异硫氰酸苄酯积累。

在孵育的7至30天其积累量变化，并随着孵育时间的增加而增加。该结果表明，用诱导剂培养细胞的持续时间对于异硫氰酸苄酯的最大积累可能很重要。代谢产物产生的量可能随与诱导剂孵育的持续时间而变化。发现用壳聚糖孵育异硫氰酸苄酯积累的最佳时间对于摇瓶培养和生物反应器均为21天。

比较锥形瓶和一次性ReadyToProcess WAVE细胞袋生物反应器系统，在非-GMO Impala F1卷心菜(甘蓝(Brassica Oleracea L.var.Capitata))细胞培养物中的异硫氰酸苄酯积累示于图1。

通常，在所有研究期间，生物反应器中的异硫氰酸苄酯产量高于使用锥形瓶培养的产量。使用生物反应器分别孵育7天和14天后，异硫氰酸苄酯含量分别为10.078和11.98μg/g鲜重。

异硫氰酸苄酯含量在21天后显著增加，达到最大值37.289μg/g鲜重，这实现了约5.8倍的增加，然后下降(达到24.269μg/g鲜重，仅增加3.7倍)。在7、14、21和30天后，生物反应器中的异硫氰酸苄酯含量分别比摇瓶培养高出约1.7、1.3、2.5和2倍。只有在14天之后，它们才大致相同。两者都在21天后产生最大的异硫氰酸苄酯积累，并在30天后下降。异硫氰酸苄酯积累减少可能是由于细胞生长停滞、异硫氰酸苄酯降解或转化为一些其他化学形式，或由于培养基营养组合物的变化。

摇瓶培养和生物反应器之间的不同性能可能是由于两个系统之间的流体动力学条件和气体组合物不同。锥形瓶和一次性ReadyToProcess WAVE细胞袋生物反应器(更大的容器)中空气-培养基界面的大表面积提供了足够的氧气和营养物质传质。通常，生物反应器的应用可以被认为是植物细胞培养工业化的先决条件。它们可以提供混合良好的培养基和无菌空气。