本发明涉及植物微繁殖领域，即通过组织培养技术进行人工植物繁殖。更具体地说，本发明涉及大麻的微繁殖方法、重组蛋白、包含该重组蛋白的细胞培养基和产生该重组蛋白的方法。
背景技术
植物的无性繁殖，例如通过营养繁殖和/或组织培养，可用于农业和/或生物化学目的的植物培养过程。例如，无性繁殖可以减少植株间的变异，从而更好地控制生物质产品的化学特性。此外，可以根据优先特性选取单株或少量植株用于在下一代植株中的大规模性状复制。
在营养繁殖中，可以从母本植株获取插条(cuttings)，在受控湿度和温度下放入液体生根溶液中以产生新根，由此获得母本植株的无性繁殖副本。驱动根系生长的有插条的营养储备、潮湿环境和基质、以及插条生根信号传导激素的不平衡。然而，这种方法的缺点是，扦插克隆的质量取决于母本植株的状况。如果母亲有螨虫、病毒、霉菌或营养不足，克隆株必定会在存活和形成新根时遭遇这些状况。因此通常很容易将植物病害传给下一代。随着时间的推移，发生突变的风险也会增加。此外，由于母本植株没有永生性且需要持续维护，克隆的收获率有限。
如本领域所知，微繁殖或组织培养能够由库存材料快速生产大量后代植株。该技术还可用于繁殖特定的感兴趣的遗传株，例如新的遗传改造株或育种株。优选株可以无限期保留，不需要指定母本植株也不需要从生产株重新取样繁殖。取而代之，可以低温保存和储存母本植株的组织，在需要时重复使用。这样，遗传谱系可以假死状态(suspended animation)得以长期维持(也称为“组织库”)，无需占用大量空间来保护它免受病虫害的侵害。此外，还可以生产无病原移植体。可以在制备用于克隆的植物组织时消除病虫害，即新一代将是无菌的，从一开始就没有病虫害。这种方法还可特别适用于繁殖不产生种子或难以通过自然营养繁殖来繁殖的植物。
通常，在无菌条件下从植株上切取部分健康植物组织。然后将外植体材料分离、清洗、灭菌后放入生长培养基中，例如含有能量源(如蔗糖)、必需营养物质和一种或多种植物生长调节剂(如激素)的培养基。生长培养基通常可以是凝胶，用来在生长期间为外植体提供支持。有利的是，过程的这一阶段可体外(in vitro)进行。将外植体保持低温，并用不同的激素令其成长经历各生长阶段。待植株足够大即对将它进行扦插或“扩增”成数百株植株。每一份新的插条或克隆经历以上相同的清洗和凝胶培养过程，直到最后将它们暴露于另外的激素以促进生根。然后令组培苗充分发育，将其缓慢引入或“强化适应”生产性生长环境。由于组培苗是在理想的快速生长条件下发育的，这可能导致这些组培苗易患病且资源利用率低，因此可能需要一些时间来适应更自然的条件，如强化过渡阶段所提供的那样。最终，获得了具有相同基因且无病虫害的新生产株，并且能以令人难以置信的准确度生产数千株的新生产株。
遗憾的是，组织培养过程可能需要几个月，并且可能需要高水平的后勤组织了解和跟踪培养的各种需求。组织培养技术是资本密集型的，例如与营养繁殖等传统方法相比成本昂贵，并且需要专业技能。在某些情况下，生产成本可能高到平均每棵植株的成本都高得难以承受。这种技术的经济可行性和实用性一直受到质疑，例如在林业部门。组织培养技术与方法的最新进展在不影响植株产物质量的情况下部分解决了成本因素。影响组织培养植物成本的主要因素是能源(电)、劳动力和化学品。在工业化国家，劳动力是降低生产成本时需要考虑的主要因素。因此，商业生产单位需要持续监控资本、化学品、能源、劳动力和研发工作等方面的成本投入，以制定更好的方案来降低生产成本。
培养基中的化学物质如碳源、胶凝剂、无机和有机补充剂以及生长调节剂也会增加这项技术的成本。通常用蔗糖作为碳源，琼脂用作胶凝剂，两者共同构成培养基中最贵的成分。
此外，一些植物物种更难进行胚胎发生即再生和/或转化，这限制了胚向植株转化，从而限制了效率和创利能力。
鉴于这些考虑，本领域需要一种可行的、更有效的、更具成本效益的方法来替代目前传统的营养繁殖和/或微繁殖方法。
作为本领域已知方法的举例，US2016/286749公开了直接和间接体细胞胚胎发生在可可(Theobroma cacao L)繁殖过程中的应用。
如本领域所知，微繁殖方法可采用间接体细胞胚胎发生。这是一种克隆繁殖，其中，来自有能力的体细胞源组织的细胞经培养形成未分化的细胞团，称为愈伤组织。利用组织培养基中的植物生长调节剂来诱导愈伤组织的形成，接着转而诱导愈伤组织形成胚。这些胚随后可以转化成植株。然而，这种组织培养技术可能很麻烦，并且，生产不同类型或不同物种植物所需的方案和条件之间存在显著差异。例如，诱导愈伤组织或胚胎形成所需的不同植物生长调节剂的比例可能因植物类型而异。
本领域已知的基于直接体细胞胚胎发生的方法可包括以下步骤序列：(i)诱导直接体细胞胚胎发生，(ii)体细胞胚的发育，(iii)直接体细胞胚的扩增，(iv)体细胞胚的萌发，以及(v)体细胞胚转化为植株。然而，直接体细胞胚的生产可能不适合大规模克隆繁殖，因为可获得的直接体细胞胎的数量是限制因素。
无论何种再生途径，植物组织培养已成为一种重要的生物技术和具有商业可行性的工具，可以在实验室中快速生产高质量、无病害且高产的种植材料，不论何种季节。
本发明的实施方式可特别适合大麻属植物的种植。大麻属(Cannabis)属于大麻科(Cannabaceae)，亦称汉麻科(hemp family)，属于被子植物门(Manoliophyta)即开花植物。它是一年生雌雄异株开花草本植物，已知包括三种：普通大麻(Cannabis Sativa)、印度大麻(Cannabis Indica)和莠草大麻(Cannabis Ruderalis)，但也可以将莠草大麻包括在普通大麻中从而将普通大麻和印度大麻视为两大主要种类。在某种程度上，甚至可将这三种视为一个物种即大麻(Cannabis Sativa)的亚种。此外，将汉麻(hemp)和休闲大麻(Marijuana)视为大麻属(Cannabis)下的种，都是大麻(Cannabis Sativa)家族的成员。然而，大麻属与汉麻和休闲大麻这些种之间存在着相当大的混淆。由于这三个术语经常互换使用，通常，理解汉麻相比休闲大麻(Marijuana)和大麻属(Cannabis)的不同用法和益处会有一定困难。这些生长迅速的植物可用作植物化学物质和/或纤维(如纤维素纤维和木质纤维)的来源。其代谢产物具有影响人体健康的强生物活性，其茎外和茎内组织可分别用于制造生物塑料和混凝土样材料。
大麻属植物含大麻素，因而具有独特的药理特性。大麻素是一组物质，包括100多种天然产物，主要积聚在雌花中。Δ9-四氢大麻酚(“THC”)是主要的精神活性大麻素，该化合物使得大麻属植物具有镇痛、止吐和刺激食欲的作用。大麻属植物之间的大麻素的含量和成分差异很大。在过去几十年中，大麻的选育和种植技术改进令效力提高。这项育种工作产生了数百种大麻素成分、外观和生长特性不同的品种，但都可以统称称为“休闲大麻(Marijuana)”。另一方面，汉麻(Hemp)通常仅指种植用于非药用途的大麻品种。大麻属植物长期以来被用于获取汉麻纤维、汉麻种子及汉麻油、用作蔬菜和榨汁的汉麻叶，还用于医药目的。
最近，大麻(cannabis)在医疗和休闲方面的合法使用增加，因此需要更好的种植和育种方法为市场提供更多更好的大麻。广泛的医疗用途和日益盛行的休闲用途造成了这种具有治疗和经济价值的作物的供应短缺。
大麻属植物是高度杂合物种。作为雌雄异株(雄花和雌花分处两不同植株)和风媒传粉物种，如果用种子种植，很难保持生物质产品的化学特性。即使是用来自同一雌株的种子种植，也会不断看到植株间的差异。因此，为了保持最终产品的一致性，筛选优良雌株并用营养繁殖和/或组织培养进行扩增。
传统上，大多数大麻种植者采用无性克隆法(vegetative cloning)。将母本植株的插条放在液体生根液中产生新根。插条一般高7.5到15cm，在去叶茎顶端有一些叶子，有点像小棕榈树。平均来说，健康克隆七天内可长出可移植的根，但不健康的克隆体可能需要三倍以上的时间，特别是将开花枝“再无性化(re-vegging)”时(再无性化可能发生于遗传谱系在新一代开始之前意外开花的情形)。然而，商业大麻种植者将受益于无需指定母本植株就能够生产大量克隆并无限期保存优选株，即组织培养技术所能够做到的。遗憾的是，出于前文所述的原因，当前组织培养技术总体来说成本过高，而大麻(Cannabis Sativa)植株的胚胎发生出了名得难，这进一步提高了成本。
普通大麻(Cannabis Sativa L.)及其相关物种的微繁殖方法，如本领域所知，可采用间接体细胞胚胎发生技术，其中，获取未分化的愈伤组织作为初级胚来源。例如，如本领域所知，固体或(半)液体培养基中组织外植体通过间接体细胞胚胎发生的繁殖可包括：
(i)避光条件下固体培养基中5至15周的初级胚发生，引发诱导和表达以产生初级胚，
(ii)次级胚发生，其中，(A)初级胚在固体或液体培养基中在避光条件下处理10至25周，以产生和扩增胚胎发生愈伤组织，然后(B)将胚胎发生愈伤组织在合适的液体培养基中在避光条件下处理1至6周，引发胚胎发生愈伤组织的表达以产生更多的新次级胚，
(iii)培养皿中的固体培养基上或生物反应器中的液体培养基中3-12周的次级胚预萌发(pre-germination)，形成子叶期的预萌发次级胚，
(iv)子叶期的预萌发次级胚直接种在温室中的培养基质上，由此皿外(ex vitro)萌发成组培苗，以及
(v)组培苗的发育。
然而，这种方法需要较长的时间来获得体细胞胚和再生植株，并且可能产生大量异常胚。此外，由于依赖于愈伤组织的形成，再生植株间体细胞克隆变异的可能性较高。鉴于过程耗时漫长且需要大量化学品，这项技术的成本仍然很高。
Duchow等人在“阿拉伯半乳聚糖蛋白刺激狭花天竺葵的体细胞胚胎发生和植株繁殖(Arabinogalactan-proteins stimulate somatic embryogenesis and plant propagation of Pelagonium sidoides)”(Carbohydrate Polymers，vol.152，pp.149-155)中记载了阿拉伯半乳聚糖蛋白刺激狭花天竺葵体细胞胚胎发生和植株再生的作用。
Mizuno等人在“精氨酸富集肽在烟草悬浮细胞中的细胞内化：构效关系研究(Cellular internalization of arginine-rich peptides into tobacco suspension cells:a structure-activity relationship study)”(Journal of Peptide Science，vol.15(4)，pp.259-263)中记载了精氨酸富集肽作为植物细胞内传递载体的潜在用途。
Chang等人在“提高香蕉体细胞胚胎发生的胚胎发生率的方法(A method to improve the embryogenesis rate of banana somatic cell embryogenesis)”(American Journal of Plant Sciences，vol.9(3)，pp.531-541)记载了一种重组蛋白Arg9-NLS-WIND1，它可以加入胚性愈伤组织诱导培养基中提高香蕉体细胞胚胎发生的胚胎发生率。
Shu等人在“烟草阿拉伯半乳聚糖蛋白NtEPc能促进香蕉(Musa AAA)体细胞胚胎发生(Tobacco arabinogalactan protein NtEPc can promote banana(Musa AAA)somatic embryogenesis)”(Applied Biochemistry and Biotechnology；A部：Enzyme Engineering and Biotechnology，vol.174(8)，pp.2818-2826)中记载了烟草阿拉伯半乳聚糖蛋白促进香蕉体细胞胚胎发生的作用。
Florez等人在“使用同源BABY BOOM转录因子增强可可体细胞胚胎发生(Enhanced somatic embryogenesis in Theobroma cacao using the homologous BABY BOOM transcription factor)”(MC Plant Biology，vol.15(1)，p.121)中记载了转录因子“Baby Boom”用于促进可可体细胞从营养态向胚态转化的用途。
Kubota等人在“光自养微繁殖的概念和背景(Concepts and background of photoautotrophic micropropagation)”(Progress in Biotechnology，Elsevier Science，vol.18，pp.325-334)中论述了光自养微繁殖的优势。
技术实现要素：
本发明实施方式目的之一是提供用于大麻植株的微繁殖或与之相关的可行、高效、可复制和/或高成本效益的手段和方法。
本发明实施方式的优势之一是，如本发明实施方式所述的手段和方法特别适用于大麻属植物的种植，例如普通大麻(Cannabis Sativa L.)。例如，可提供可复制的组织培养方法用于由外植体大量再生大麻植株，这能够消除本领域已知工艺的缺点(例如前文所述)。
本发明实施方式可基于或至少部分基于以下出乎意料的发现：通过将外植体材料暴露于一种或多种重组植物转录因子和/或阿拉伯半乳聚糖蛋白，例如在液体或固体培养基中，可以诱导直接体细胞胚胎发生。这些转录因子和/或阿拉伯半乳聚糖蛋白可以是与包括胚胎发生和细胞扩增在内植物生长发育相关的。
本发明实施方式的优势之一是，本发明的微繁殖方法可比本领域已知的传统营养繁殖方法和/或微繁殖方法更有效和/或更具成本效益。
本发明实施方式的优势之一是，可体外生产大量目标活植株，例如大麻属植物植株。
本发明实施方式的优势之一是，大规模微繁殖可用于选择需要的突变体、生产内源性次级代谢产物水平改变的植物、和/或基因工程。
本发明实施方式的优势之一是，实施方式所述方法特别适合和有利于大麻属植物的生产。
本发明实施方式的优势之一是，可实现胚到组培苗的高转化率。本发明实施方式的优势之一是每批体细胞胚可以都得到改进或增加。本发明实施方式的优势之一是，例如与至少一种现有技术方法相比，通过向植物细胞培养基中添加特定的重组转录因子和/或阿拉伯半乳聚糖蛋白，显著增加胚胎发生和胚到活组培苗的转化。
本发明实施方式的优势之一是，可将细胞穿透肽序列例如多精氨酸(Poly-Arg)转导域和/或核定位信号或序列(NLS)与重组转录因子或阿拉伯半乳聚糖蛋白融合，这样，细胞穿透肽序列如多精氨酸转导域可与细胞膜结合并迅速转移到细胞中，和/或使蛋白质带上NLS标记，以便通过核转运导入细胞核。
本发明实施方式的优势之一是，可将与重组转录因子或阿拉伯半乳聚糖蛋白融合的细胞穿透肽序列(例如多精氨酸转导域)和/或NLS导入植物细胞核，从而有效诱导植物体细胞的胚胎发生反应。
本发明实施方式的优势之一是，重组融合构建体可在作为大规模和/或低成本高通量生产平台的本氏烟草(Nicotiana Benthamiana)植株中采用瞬时表达方便地进行表达和纯化。然而，其它表达宿主生物体，例如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或其它植物表达系统，也在本发明的范围内。
本领域技术人员将能从本发明的以下详细描述中看出其他目的、优点和创新特征。
在第一方面，本发明涉及用于大麻(Cannabis Sativa L.)光自养微繁殖液体培养基的重组蛋白。该重组蛋白包含生长诱导部分与摄取增强部分的融合，其中，所述生长诱导部分包含与植物生长发育相关的阿拉伯半乳聚糖蛋白和/或植物转录因子，所述摄取增强部分包含细胞穿透肽序列和核定位信号。核定位信号由序列SEQ ID NO 1编码。
如本发明实施方式所述的重组蛋白可由编码序列SEQ ID NO 2编码，例如，编码序列可进行烟草密码子优化。
如本发明第一方面实施方式所述的重组蛋白中，摄取增强部分可包含所述细胞穿透肽序列，所述细胞穿透肽序列包含形成多精氨酸转导域的7至13个精氨酸、优选9个精氨酸的序列(如SEQ ID NO 3)。
如本发明第一方面实施方式所述的重组蛋白中，生长诱导部分可包含植物转录因子，所述植物转录因子包含以下一种或多种：Baby Boom、BBM(例如UnitprotKB/Swiss Prot，登录ID：Q6PQQ4，条目版本114，序列版本2，测序日期2005-08-30，录入日期2020-02-26)，Leafy Cotyledon，LEC，例如含B3结构域转录因子LEC2(例如UniprotKB/Swiss-Prot，登录ID：Q1PFR7，条目版本89，序列版本1；测序日期2006-05-16，输入日期2020-02-26)，Wuschel，WUS(例如UniprotKB/Swiss Prot，登录ID：Q9SB92，条目版本139，序列版本2，测序日期2005-03-15，输入日期2020-02-26)，含RWP-RK结构域蛋白4(RWP-RK Domain-Containing 4，RKD4)(例如UniprotKB/Swiss Prot，登录ID：Q9LVU8，条目版本86，序列版本1，测序日期2000-10-01，录入日期2020-02-26)，伤口诱导脱分化蛋白1(Wound Induced Dedifferentiation 1，WIND1)(例如UniProtKB/Swiss Prot，登录ID：A0A178WKP5，条目版本21，序列版本1，测序日期2016-09-07，录入日期2019-12-11)，以及Plethora2，PLT2(例如UniProtKB/Swiss Prot，登录ID：Q5YGP7，条目版本110，序列版本1，测序日期2004-11-23，录入日期2020-02-26)。
如本发明第一方面实施方式所述的重组蛋白中，所述植物转录因子可包含来自拟南芥(Arabidopsis Thaliana)的AP2样乙烯响应转录因子BBM或所述来自拟南芥的AP2样乙烯响应转录因子BBM的类似物，所述类似物是宿主密码子优化的。
如本发明第一方面实施方式所述的重组蛋白中，所述宿主可以是本氏烟草。
第二方面，本发明涉及包含如本发明第一方面实施方式所述重组蛋白的植物细胞培养基。
如本发明第二方面实施方式所述的植物细胞培养基可包含浓度为0.05mg/L至5mg/L的重组蛋白。
如本发明第二方面实施方式所述的植物细胞培养基可包含盐和/或维生素。
如本发明第二方面实施方式所述的植物细胞培养基可包含以下一种或多种：6-苄基氨基嘌呤、乙烯磷(Ethephon)、凯茵庭(Kinetin)、腐胺、亚精胺、过氧化氢、6-(Y,Y-二甲基烯丙基氨基)嘌呤、赤霉酸或赤霉素以及萘乙酸。
如本发明第二方面实施方式所述的植物细胞培养基可以是用于光自养微繁殖的液体培养基。
在第三方面，本发明涉及大麻(Cannabis Sativa L.)的微繁殖方法。该方法包括获取来自大麻植株的外植体材料；和通过在如本发明第二方面实施方式所述植物细胞培养基中在外植体材料中诱导胚胎发生来提供初级胚和/或次级胚。
如本发明第三方面实施方式所述的方法中，提供初级胚和/或次级胚可包括光自养方法，其中，外植体材料接受光照以激发直接体细胞胚胎发生。
如本发明第三方面实施方式所述的方法中，所述接受光照射包括暴露于来自光合成活性辐射(PAR)源的波长400nm到700nm的、合光子通量100到200μmol m-2s-1的光。
独立和从属权利要求记述了本发明的具体特征和优选特征。视情况而定，从属权利要求中的特征可与独立权利要求的特征相结合，也可与其他从属权利要求的特征相结合，不一定局限于权利要求书中呈现的那样。
附图说明
图1至图4显示本发明实施方式所述方法相关实施例中，大麻(Cannabis Sativa L.)体细胞胚胎发生的组织学表现。
图1显示在外植体表面球形胚发育的纵切面(比例尺＝50mm)。
图2显示早期心形胚的纵切面(比例尺＝50mm)。
图3显示晚期心形胚的纵切面(比例尺＝50mm)。
图4显示体细胞胚(子叶期)的纵切面，显示清晰的两片子叶和根分生组织(比例尺＝50μm)。
附图是示意性的，没有限定性。附图中的元素不一定按比例显示。本发明不局限于附图所示的本发明具体实施方式。
具体实施方式
尽管下文描述了示例性实施方式，但本发明仅由权利要求来限定。因此，将权利要求明确包括在此处的具体说明部分，其中，每项权利要求以及权利要求从属关系所允许的每种权利要求组合方式各自构成本发明的各种实施方式。
在权利要求中，“包含”或“包括”一词不限于其后所述的特征、元素或步骤，也不排除其他特征、元素或步骤。这一用语表示存在述及特征，但不排除还存在或加入一项或多项特征。
在此处具体说明部分给出了各种具体细节。本发明的实施方式可以不用这些具体细节来实施。此外，为了清楚和简洁起见，公知的特征、元素和/或步骤未必在此详述。
下面结合实施方式来具体说明本发明的实施，以便本领域技术人员更好地理解本发明。需要说明的是，实施方式仅用于进一步解释本发明。不应将实施方式理解为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员可以看出，本领域技术人员能够更好地理解本发明的保护范围。对本发明所公开的方法进行的非必要改进和调整仍应属于本发明的保护范围之内。同时，所用原材料未必一概详述。原材料可以是市售产品。本领域技术人员所知的工艺步骤或制备方法未必在此详述。本文全文举用普通大麻(Cannabis Sativa L.)(工业纤维汉麻(hemp))作为示例。
在第一方面，本发明涉及包含生长诱导部分与摄取增强部分融合体的重组蛋白。生长诱导部分包含与植物生长发育相关、例如与胚胎发生和/或细胞扩增相关的阿拉伯半乳聚糖蛋白和/或至少一种植物转录因子。摄取增强部分包含细胞穿透肽序列和核定位信号或序列。
重组蛋白可以是适用于(例如专用于)在外植体组织材料或培养细胞植物材料暴露于所述重组蛋白时诱导和/或改善胚胎发生的重组蛋白。
如本发明实施方式所述的重组蛋白中，细胞穿透肽序列可包含形成多精氨酸(poly-Arg)转导域的精氨酸序列。多精氨酸转导域可由含有9个精氨酸残基(RRRRRRRRR)的序列构成。所述细胞穿透肽序列可适配用于实现蛋白质的细胞间有效转运，例如穿越细胞膜。
如本发明实施方式所述的重组蛋白中，核定位序列可适配用于标记重组蛋白例如重组蛋白整体或至少其生长诱导部分，用于通过核转运进入细胞核。通常，NLS由暴露在蛋白质表面的一个或多个带正电的赖氨酸或精氨酸短序列组成。在本发明中，NLS由肽序列SEQ ID NO:1编码，例如对应于肽序列SEQ ID NO:1。
在如本发明实施方式所述的重组蛋白中，生长诱导部分可包含至少一种植物转录因子，其中，至少一种植物转录因子包含以下一种或多种：Baby Boom(BBM)、Leafy Cotyledon(LEC)、Wuschel(WUS)、含RWP-RK结构域蛋白4(RKD4)，伤口诱导脱分化蛋白1(WIND1)和Plethora2(PLT2)。
例如，Baby Boom转录因子(AP2样乙烯响应转录因子BBM)基因可能参与体细胞胚胎发育能力的取得。BBM是AP2/ERF家族的转录因子，在种子和根分生组织中表达。它最初分离出来时是作为组织培养中胚胎发生细胞的标记物，它激活与细胞扩增和生长相关的复杂的发育路径网络。在甘蓝型油菜(Brassica napus)小孢子胚和拟南芥合子胚的基底区观察到BBM表达。它还被鉴定到存在于拟南芥属(Arabidopsis)幼苗的根分生组织和侧根中，并且是蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)根中的生长素诱导基因。BBM基因在甘蓝型油菜小孢子胚胎发生早期表达，推测BBM基因参与了从发育的营养态向胚胎发生态的转变。BBM在拟南芥和甘蓝型油菜中的异位表达诱导幼苗的营养组织自发形成体细胞胚和子叶样结构。在拟南芥中组成性表达GmBBM也可诱导类似的效果。在烟草中，异源BBM表达引起芽和愈伤组织的自发形成，表明其在促进细胞扩增和形态发生中发挥作用。
如果BBM在感兴趣的植物细胞材料(如大麻(Cannabis Sativa L.)植物细胞材料)中过度表达，可有利地诱导胚胎发生。然而，为了将外源转录因子(如BBM)导入感兴趣的植物材料中表达，需要将转录因子有效地转移到细胞和细胞核中。如本发明实施方式所述重组蛋白的优势之一是能够实现这种高效率的有效转移。
例如，植物转录因子可包含来自拟南芥的AP2样乙烯响应转录因子BBM(BBM_ARATH–UniProt:Q6PQQ4，版本110，16-01-2019)，或来自拟南芥的AP2样乙烯响应转录因子BBM的类似物，其中，所述类似物针对宿主物种进行了密码子优化，所述宿主是适合生产环境中表达的物种，例如本氏烟草。
在优选实施方式中，重组蛋白包含9个精氨酸残基(Arg9)的融合体或由所述融合体构成，核定位信号或序列由肽序列SEQ ID NO:1编码(NLS)，还含有来自拟南芥的AP2样乙烯响应转录因子BBM或其本氏烟草密码子优化的类似物。该重组蛋白在下文中称为“Arg9-NLS-BBM”。
转录反式激活因子(TAT)蛋白转录域(PTD)是衍生自HIV TAT蛋白的一段特殊的10-20氨基酸序列。加入培养基中后，TAT融合蛋白会迅速进入细胞。在细胞内，TAT融合蛋白被细胞机能降解或重新折叠成功能蛋白。大多数TAT-PTD含有Arg和Lys氨基酸，它们带强正电。因此，推测这些氨基酸序列会与细胞膜结合并迅速转移到细胞内。Poly-Arg转导域是根据已知转导域序列的人工序列。其转导效率高于HIV的TAT-PTD。实验表明，它可用于引导外源蛋白转移到细胞膜上。
因此，将生长诱导部分(例如包含BBM转录因子)与作为摄取增强部分的多精氨酸转导域连接，可以获得良好的向细胞内转移。此外，将核定位信号或序列(NLS)与该构建体连接，可将重组蛋白加标以便通过核转运导入细胞核。“核导入”的机制非常简单：蛋白质穿过核膜进入细胞核。核膜由同心膜即外膜和内膜构成。内膜与外膜在多个位置相接，在胞质和核质之间形成通道。这些通道被核孔复合物(NPC)占据，NPC是介导跨核膜转运的复杂多蛋白结构。
翻译后带NLS的蛋白质与输入蛋白(又名核转运蛋白)紧密结合，与所述复合物一起穿过核孔。此时，Ran-GTP与输入蛋白-蛋白复合物结合导致输入蛋白失去与蛋白质的亲和力。蛋白质被释放，此时，Ran-GTP/输入蛋白复合物通过核孔移出细胞核。细胞质中的GTP酶(GTPase)激活蛋白(GAP)将Ran-GTP水解为GDP，这引起Ran构象改变，最终降低其对输入蛋白的亲和力。输入蛋白被释放，Ran-GDP再循环回细胞核，在那里，鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)将其GDP变回GTP。
第二方面，本发明涉及包含如本发明第一方面实施方式所述重组蛋白的植物细胞培养基。植物细胞培养基可以是用于直接初级和/或次级体细胞胚胎发生的合适细胞培养基，例如用于在体细胞(例如大麻(Cannabis Sativa L.)体细胞)暴露于所述细胞培养基时显著提高胚胎发生率。植物细胞培养基可以是用于令直接体细胞胚(例如大麻体细胞的直接体细胞胚)在暴露于所述细胞培养基时成熟和/或预萌发的合适自养细胞培养基。植物细胞培养基可以是用于令直接体细胞胚(例如大麻体细胞的直接体细胞胚)在暴露于所述细胞培养基中时萌发的合适自养细胞培养基。植物细胞培养基可以是用于令直接体细胞胚(例如大麻体细胞的直接体细胞胚)在暴露于所述细胞培养基中时芽伸长和生根的合适自养细胞培养基。
如本发明第一方面实施方式所述的重组蛋白，例如Arg9-NLS-BBM重组蛋白，其量例如浓度可以是0.05mg/L至5mg/L，优选0.5mg/L至3mg/L，更优选约2mg/L。
植物细胞培养基可包含病毒载体。
植物细胞培养基可包含如本领域所知初级胚诱导和发育所需的成分。例如，培养基可包括能量源(即植物可用的能量源)，例如蔗糖。培养基可包含营养物质。然而，在本发明的另一些实施方式中，培养基不含能量源，例如，没有显著含量的任何能量源。培养基，例如在溶液中，可含有宏量(macro)盐和/或微量(micro)盐。培养基可包含维生素。
所述植物细胞培养基可适合用作光自养微繁殖的培养基。本申请中提及光自养培养基和/或方法时应理解为是指用于微繁殖的培养基和/或方法，培养基中没有显著含量的糖。尽管光自养可更狭义地定义为一种营养类型，即活生物体在没有任何外源性有机成分作为营养物质的条件下生长，例如光自养培养基没有任何有机成分，但在本申请中，光自养一词的使用不那么狭义，即光自养指仅用内源性碳水化合物作为主要能源的植物营养类型，因此，出于实际目的，光自养微繁殖是指培养基(基本上)不向植物提供糖以满足其能量需求的微繁殖。但是，糖和/或其他碳水化合物可能是琼脂和其他胶凝剂的显著组成部分，此时，就光自养微繁殖的实际定义而言，这些糖和/或其他碳水化合物不一定视为实质性的外源碳水化合物来源。
培养基还可包含一种或多种植物生长调节剂和/或一种或多种生长激素。培养基可包含以下一种或多种：6-苄基氨基嘌呤(BAP)、乙烯磷、凯茵庭、腐胺、亚精胺、过氧化氢、6-(Y,Y-二甲基烯丙基氨基)嘌呤(2iP)和赤霉酸/赤霉素。
培养基可包含合成植物生长素。培养基可包含植物激素2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4D)。然而，在优选实施方式之一中，培养基不含植物激素2,4D，因为已知这会产生体细胞克隆变异和大量不能转化为植株的胚。合成植物生长素可包括萘乙酸(NAA)，例如1-萘乙酸。该合成生长素可按能够支持直接体细胞胚胎发生的量来提供，例如，0.01mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L、0.30mg/L、0.50mg/L、0.75mg/L、1.0mg/L、1.25mg/L、1.5mg/L、1.75mg/L、2.25mg/L、2.5mg/L、2.75mg/L或3.0mg/L，更优选1.0mg/L，或是以上示例列表中任选两个端点所成任何范围内的浓度。
植物细胞培养基可以是光混合营养型和/或光异养培养基。然而，在优选实施例之一中，植物细胞培养基可以是光自养培养基。
以下表A详细描述了如本发明实施方式所述植物细胞培养基的一个具体组成示例，其中包含NaNO3、NAA和Arg9-NLS-BBM重组蛋白。该组合物可特别适合作为诱导胚胎发生的培养基。
[表A]
以下表B详细描述了如本发明实施方式所述植物细胞培养基的一个具体组成示例，其中包含NaNO3、BAP、100倍(100X)氨基酸母液和Arg9-NLS-BBM重组蛋白。该组合物可特别适合作为用于胚胎成熟的培养基。
[表B]
植物细胞培养基还可包含激发子，例如，浓度为约0.01μM至约1m，优选浓度为约1μM至约500mm，更优选浓度为约10μM至约200mm，且最优选浓度为约50μM至约50mm。
激发剂(一种或多种)可选自以下一种或多种：生物激发子、生物激发子衍生的微生物组分或产物、以及非生物激发子。适宜激发剂的例子包括生物激发子，例如：灰霉菌(Botrytis cinerea)、大雄疫霉(Phytophthora megasperma)，松柏条纹霉(Pinellas stripticum)，少孢霉属(Oligosporas sp.)，乳腐霉(Pythiummamiallatum)，钾腐霉(Pythium sylvaticum)，大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)，轮枝菌属(Verticillium sp.)，微小青霉(Penicillium minioluteum)，雪松疫霉(Phytophthora lateralis)，辛卡胞孢菌(Cytospora cincta)，白口胞孢菌(Cytospora leucostoma)，芸苔生链格孢菌(Alternaria brassicicola)，茄链格孢菌(Alternaria solani)，瓜链格孢菌(Alternaria cucumerina)，鳞状葡萄孢菌(Botrytis squamosa)，异旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus)，苜蓿炭疽病(Colletotrichum trifolii)，圆形炭疽菌(Colletotrichum orbiculum)，禾谷炭疽菌(Colletotrichum graminicola)，胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)，花柱帚梗柱孢霉(Cylindrocladium floridanum)，克地镰刀菌(Fusarium crookwellense)，异孢镰刀菌(Fusarium heterosporium)，粘着尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporam f.sp.conglutinans)，番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporam f.sp.lycopersici)，豌豆枯萎病菌(Fusarium oxysporam f.sp.pisi)，玉米赤霉菌(Gibberella zeae)，禾顶囊壳菌小麦变种(Gaeumaimomyces graminis var.tritici)，地霉属(Geotrichum sp.)，托氏小球腔菌(Leptosphaeria torrae)，血球丛赤壳菌MPVI(Nectria haematococca MPVI)，豌豆球腔菌(Mycosphaerella pinodes)，乌氏蛇口壳菌(Ophiostoma ulmi)，根朽病菌(Phoma lingam)，豌豆脚腐病菌(Phoma pinodella)，晚疫病菌(Phytophthora infestans)，芒孢腐霉(Pythium aristosporum)，禾生腐霉菌(Pythium graminicola)，终极腐霉菌(Pythium ultimum)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，核盘霉属(Sclerotinia sp.)，结节核盘菌D-45(S.nodoram D-45)，变色栓菌(Trametes versicolor)，玉米黑粉菌(Ustilago maydis)，果黑星病菌(Venturia inequalis)；生物激发子衍生的微生物组分或产品，如：壳聚糖、地衣聚糖、葡甘聚糖、平菇葡聚糖(Pleuran)、葡聚糖、羧甲基葡聚糖、羟甲基葡聚糖、磺乙基葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露五糖、甘露四糖、纤维溶素(Cellulysin)、Multifect XL、Multifect CL、树脂酶、Pulpxyme、SP431、果胶酯酶Pectinol、果胶甲酯酶Rapidase、Klerzyme、几丁质酶；或非生物激发子，如花生四烯酸、反油酸、环AMP、双丁酰环AMP、甲基茉莉酮、顺式茉莉酮、茉莉酸、/3-葡聚糖、咪康唑、阿魏酸、AMO-1618、Triton X-100、苯甲酸、水杨酸、没食子酸丙酯、芝麻酚、氯化氯胆碱、3,4-二氯苯氧基三乙基-,(胺)、氯乙基膦酸、，二乙基二硫代氨基甲酸、去甲二氢愈创木酸、二硫代苏糖醇、焦亚硫酸钠、焦亚硫酸钾、d-氨基-DL-苯丙氨酸、硫酸氧钒、烯效唑(Uniconazol)、多效唑(Paclobutrazol)、精胺、亚精胺、腐胺、卡达瓦林(Cadavarine)、硫酸鱼精蛋白、SKF-7997、MER 29、嘧啶醇Ancymidol、三丁氯苄膦D(Phosphon D)、硫脲、硫酸葡聚糖、对苯二酚、，壳聚糖谷氨酸盐、芬丙苯吗(Fenpropemorph)、咪鲜胺(Prochloraz)、萘替芬(Naptifine)、EDU、HTA、MPTA、谷胱甘肽、EGTA、赤霉素、脱落酸、1,3-二苯基脲、重氮烷基脲(Diazolidenyl urea)、间苯三酚、藻酸钠、卡拉胶、氯化铝、乙烯、乙酰水杨酸、氯化钠、乙酸。
然而，培养基也可以多组件试剂盒的形式提供，其中包括各自独立的原初培养基和一种或多种激发子。在使用中，例如在如本发明实施方式所述的方法中，根据具体植物物种细胞系和代谢物的性质，可在从接种到培养持续期间的任意时刻将激发子加入培养物(由原初培养基和感兴趣的细胞形成)中，优选指数生长阶段早期到稳定期。
此外，多组件试剂盒中可包含各自独立的多种激发子，由此可以在使用中第二次或更多次地向悬浮培养物中添加激发子，例如，在前次激发后约6小时至约1个月期间，更优选在前次激发后约12小时至约2周期间，最优选在前次激发后约12小时至约7天期间。
植物细胞培养基可包括苄基氨基嘌呤(BAP)和Meta-Topolin(MT)，例如作为对刺激植物生长发育、芽伸长和植株生根特别有利的组合。
植物细胞培养基可以是液体、半液体或固体形式。例如，植物细胞培养基可包含多孔支撑剂形成固体培养基，例如Florialite、纸浆与蛭石的混合物(Nisshinbo工业公司(Nisshinbo Industries Inc.)，东京)。优选地，植物细胞培养基可以是液体培养基，例如，用它可以缩短获得组培苗的整体过程。例如，当在如本发明实施方式所述的方法中用以生产大麻(Cannabis Sativa L.)植株时，例如采用如本发明第三方面实施方式所述的方法，用固体培养基生产大量胚可能需要13到16个月，而用主要为液体的培养基生产大量胚可能只需要6到9个月。
在第三方面，本发明提供了一种用于植物微繁殖的方法。本发明实施方式总体涉及一种生物技术策略，用以获得用于繁殖植物(例如体外(in vitro))的高效和/或高成本效益的微繁殖方法，该策略和方法能够提高胚到组培苗的转化率，适合例如大麻(Cannabis Sativa)植株的繁殖。
微繁殖方法包括获取外植体材料，例如取自待繁殖植株的一片或多片组织。微繁殖方法可特别适用于大麻属植物的繁殖，例如普通大麻(Cannabis Sativa L.)。然而，微繁殖方法可同样适用于例如至少大麻科的其他植物和其他植物药类植物，例如以下所述：欧蓍草(Achillea millefolium)、牛膝(Achyranthes bidentate)、欧乌头(Aconitum napellus)、夏侧金盏花(Adonis aestivalis)、墨西哥藿香(Agastache Mexicana)、仙鹤草(Agrimonia eupatoria)、桦芸香(Agathosma betulina)、葱属(Allium sp)、药用牛舌草(Anchusa officinalis)、假银莲花(Anemopsis californica)、白芷(Angelica dahurica)、当归(Angelica polymorpha sinensis，A.sinensis)、山金车(Arnica Montana)、阿密茴香(Ammi visnaga)、熊果(Arctostaphylos uva-ursi)、柳叶马利筋(Asclepias tuberosa)、黄芪(Astragalus membranaceus)、华黄芪(Astragalus chinensis)、板兰(Baphicacanthus cusia)、红木(Bixa Orellana)、柴胡(Bupleurum falcatum)、曼陀罗(Bragmansia(Datura)spp.)、牧根草风铃草(Campanula rapunculus)、罗克斯堡葛缕子(Carum roxburgianum)、印度藏茴香(Carum copticum)、决明子(Cassia tora)、黄地百合(Chamaelirium luteum)、猪苓(Chimaphila umbellate)、非洲喜冬草(Commiphora Africana)、毒堇(Conium maculatum)、合欢菊(Crithium maritimum)、洋金花(白曼陀罗)(Datura metel(Datura alba))、毛曼陀罗(Datura inoxia)、香青兰(Dracocephalum moldavica)、紫锥花属(Echinacea sp.)、旱莲草(Eclipta alba(E.prostrata))、内华达麻黄(Ephedra nevadensis)、加州圣草(Eriodictyon californicum)、杜仲(Eucommia ulmoides)、贯叶泽兰(Eupatorium perfoliatum)、六瓣蚊子草(Filipendula vulgaris(F.hexapetala))、匍枝白珠(Gaultheria procumbens)、欧亚路边青(Geum urbanum)、鱼腥草(Houttuynia cordata)、积雪草(Hydrocotyle asiatica(Centella asiatica))、安索斯贯叶连翘(Hypericum perforatum cv.Anthos)、土木香(Inula helenium)、麻风树(Jatropha curcas)、松红梅(Leptospermum scoparium)、胡枝子(Lespedeza capitate)、波特当归(Ligusticum porter)、女贞(Ligustrum lucidum)、小花紫草(Lithospermum officinale)、枸杞(Lycium barbarum)、刺毛黧豆(Mucuna pruriens)、药用茄参(Mandragora officinarum)、牛至(Origanum dictamnus)、欧蓍草(药用墙草)(Parietaria judaica(P.officinalis))、余甘子(Phyllanthus emblica)、牙买加苦树(Picrasma excelsa)、半夏(Piniella ternate)、广藿香(Pogostemon patchouli)、何首乌(Polygonum multiflorum)、白头辐状多叶草(Porophyllum raderale ssp.Macrocephalum)、夏枯草(Prunella vulgaris)、葛根(野葛)(Pueraria lobata(P.thunbergiana))、蛇形萝芙木(Rauvolfia serpentine)、伞房海鹤藤(Rivea corymbose)、加拿大血根(Sanguinaria Canadensis)、道格拉斯风轮菜(Satureja douglasii)、裂叶荆芥(Schizonepeta tenuifolia)、黄芩(Scutellaria baicalensis)、黄果茄(颠茄)(Solanum xanthocarpum(S.surattense)、纤细纸荚豆(Sutherlandia frustescens)、斑叶钟花树(Tabebuia impetiginosa)、小白菊(Tanacetum parthenium)、蒺藜(Tribulus terrestris)、栝蒌(Trichosanthes kirilowii)、特纳草(Turnera diffusa)、非洲马铃果(Voacanga africana)和南非醉茄(Withania somnifera)。
在优选实施例中，获取外植体材料可包括从大麻(Cannabis Sativa L.)植株获取外植体材料。外植体材料可来自植物的叶、果实、嫩枝、蓓蕾(buds)、花、树皮、根、枝、茎、籽、球果(cone)、针叶(needles)或形成层组织。具体优选实施方式之一中，细胞可衍生自下胚轴分生端植物组织。
根据本发明第二方面的实施方式，微繁殖方法包括通过将外植体材料和/或由其衍生的细胞材料置于植物细胞培养基中来诱导胚胎发生，从而提供初级胚和/或次级胚。优选地，诱导的胚胎发生是直接体细胞胚胎发生，其中，胚在没有愈伤组织形成的情况下直接从外植体开始。因此，胚是由前胚决定细胞(Pre-Embryonic Determined Cells，PDC)形成的。这种细胞主要存在于胚组织、体外培养的幼株的某些组织、下胚轴、珠心、胚囊等中。因此，提供初级胚和/或次级胚可包括用直接体细胞胚胎发生扩增(例如体外扩增)直接体细胞胚(direct somatic embryo，DSE)的光自养方法。提供初级胚和/或次级胚可包括接受光照，例如，在初级胚和/或次级胚发育步骤期间基本上连续接受光照。接受光照可包括暴露于光合有效辐射(PAR)(例如来自PAR源的PAR)。PAR可包括或由波长为400至700nm的光构成。PAR可按100至200μmol m-2s-1的光合光子通量来提供，优选在初级胚发育期间和次级胚发育期间都提供。优选按24小时连续光照循环来提供光照。这样的光照条件或特别适合大麻(Cannabis Sativa L.)的繁殖。
然而，本发明的实施方式不局限于直接体细胞胚胎发生，可以涉及例如间接体细胞胚胎发生、单细胞培养、非合子胚胎发生、根茎培养、分生组织培养、花药培养、体细胞杂交、胚培养、胚珠培养、子房培养、毛状根培养，诸如此类。
体细胞胚胎发生的优势之一是，它是高效的植物(如大麻(Cannabis Sativa L.))繁殖方法。体细胞胚胎发生可提供大量优质的种植材料。此外，还可以获得良好的遗传品质和植株健康。体细胞胚胎发生是一种克隆繁殖，体细胞组织中有能力的细胞能够发育成胚并进一步转化为植株。体细胞胚胎发生法可用于克隆繁殖遗传均一的植物材料、用于消除病毒、用于为遗传转化提供来源组织、用于从单个细胞生成整株植物以及用于开发合成种子技术。
例如，在优选实施例中，植物细胞培养基包含含有植物转录因子BBM的重组蛋白。例如，通过在大麻(Cannabis Sativa L.)中过度表达BBM，可容易地诱导胚胎发生。优选地，重组蛋白的Arg9部分和NLS部分可高效且有效地将BBM转入大麻的细胞核中。
提供初级胚和/或次级胚可包括通过直接体细胞胚胎发生(例如使用光自养方法)提供初级胚。在该步骤中，可将外植体材料置于诱导培养基中，所述诱导培养基包含如本发明第二方面实施方式所述植物细胞培养基或由其组成，并接受光照下，例如光照时间足以获得初级胚。可任选地将初级胚从诱导培养基转移至发育培养基，并在光照下培养足够长的时间以进一步扩增初级胚。
提供初级胚和/或次级胚可包括通过直接体细胞胚胎发生提供次级胚。提供次级胚可包括从初级胚获取组织，例如初级胚的上胚轴。可任选地将从初级胚获取的组织切碎。可以从光自养步骤获得的鱼雷胚获取组织，所述光自养步骤中在诱导培养基中令外植体材料发育；根据本发明的其他实施方式，也可以在于发育培养基中进一步扩增初级胚这一可选步骤后从初级胚衍生的上胚轴材料获取组织。出乎意料的是，这是用于形成次级胚的方便而高效的组织来源，至少以普通大麻(Cannabis Sativa L.)为例是如此。
提供次级胚还可包括将组织或由组织切碎形成的一块或多快碎片置于诱导培养基中，所述诱导培养基即前文所述的诱导培养基或是包含如本发明第二方面实施方式所述植物细胞培养基或由其组成的另一诱导培养基，并让组织接受光照，例如光照时间足以获得次级胚。任选地，可将次级胚转移至发育培养基并在光照下培养以进一步扩增次级胚。
孵育可持续一段足够的时间以允许胚(例如次级胚)成熟、预萌发以及可选地萌发。光自养步骤之后可以是植株再生步骤和/或植株生长培养步骤。因此，用如本发明实施方式所述的方法可以在例如植株再生和常规植株生长培养步骤(例如培育步骤)后获得植株、带花植株和植物材料。
微繁殖方法可包括将初级胚和/或次级胚(优选至少次级胚)转移至培养基中并于其中培养的步骤，所述培养基为用于直接初级胚和/或次级胚成熟并预萌发成为植株的培养基，所述培养例如可持续足够的时间以允许胚在所述培养基中成熟、预萌发以及任选地萌发。用于成熟和预萌发的培养基可以是如本发明第二方面实施方式所述的培养基。用于成熟和预萌发的培养基可包含1000X氨基酸母液，优选浓度例如约2ml/L，其中包含L-赖氨酸91.3mg、L-亮氨酸65.6mg、L-色氨酸102.1mg、精氨酸87.1mg和甘氨酸37.52mg。
例如，形成初级胚、形成次级胚和成熟以及预萌发的步骤可在5至9周的周期内进行，例如在5至7周，尤其以普通大麻(Cannabis Sativa L.)繁殖为例而言。适当地，可在所述处理期间多次更换(例如更新)培养基，例如在成熟和预萌发步骤期间更换三到八次。
微繁殖方法可包括，例如在胚萌发即转化为植株的步骤中，从预萌发或萌发的胚发育成植株。该步骤可在萌发和转化培养基中进行，例如包含如本发明第二方面实施方式所述培养基的萌发和转化培养基。
例如，可用常规方法将预萌发或萌发的次级胚发育成植株。例如，可将体外生成的材料移植到苗圃中在培养基质中进行炼苗，所述培养基质可包括例如珍珠岩、椰子泥炭、土壤等成分的混合物。随后，可将这些植株移植到大田长成大麻。
例如，形成初级胚、次级胚、成熟、预萌发和植株初发育的过程，例如从初始体外诱导到温室，以普通大麻(Cannabis Sativa L.)为例，其周期可以是8周至1年，优选20至28周。
提供初级胚和/或次级胚的步骤所用的一种或多种植物细胞培养基和/或用于成熟和预萌发的培养基和/或用于胚的萌发和由胚转化为植株的培养基可以是液体形式。使用中，这种液体介质可容纳于任意合适的容器中，但优选如本发明实施方式所述方法中使用的光生物反应器。孵育可在23℃至29℃的温度进行，优选25℃至26℃。成熟、预萌发和萌发步骤可在光照下进行。光照可包括暴露于光合有效辐射(PAR)，例如400nm至700nm的波长、例如100至200μmol m-2s-1的光合光子通量。例如，可采用光生物反应器，例如鼓泡式光生物反应器或气升式光生物反应器。使用任何其他生物反应器、通过连续和/或临时浸泡，也在本发明范围内。
此外，通过在光生物反应器中成熟、预萌发、萌发和/或由胚转化为植株，植物营养繁殖过程的实施可以高效且简便。采用此类生物反应器使该过程易于自动化，并由于减少了对手动步骤和使用凝胶剂的需要等因素而节省了成本和劳动力。
光自养方法的优势之一是，培养周期可显著缩短，例如可比传统光混合营养系统缩短多达50％。
在间接体细胞胚胎发生中，来自有能力的源组织的细胞经培养形成未分化的细胞团，称为愈伤组织。然而，与间接体细胞胚胎发生相比，直接胚胎发生具有一定的优势，例如获得直接体细胞胚所需的时间更短，培养时间缩短，这能降低体细胞克隆变异的频率，以及能够最小化或消除产生嵌合植株的风险。直接体细胞胚胎发生是一项形态学事件，其中，体细胞胚直接起源于植物的组织基质，不形成作为中间阶段的愈伤组织。这是直接体细胞胚胎发生与间接体细胞胚胎发生之间的关键区别：间接体细胞胚胎发生需要形成愈伤组织。这些再生类型之间的另一个区别是对生长调节剂作用的反应。直接体细胞胚胎发生一般以只添加细胞因子或其他应激剂的单一培养基培养为特点，间接体细胞胚胎发生的特点一般在于初始培养基中必需高浓度的生长素或特定的生长素/细胞因子比例来形成愈伤组织。愈伤组织形成后，与用于胚胎发生性愈伤组织诱导的培养基相比，随后的转移过程中使用另一种没有生长素或生长素浓度较低的培养基。间接体细胞胚胎发生需要小心的时间控制和定量控制过程，且这种控制过程需要针对具体的植物物种进行调整。
这样，在直接体细胞胚胎发生中，与间接体细胞胚胎发生程序相比，胚的产生无需形成任何胚胎发生性愈伤组织，由此提供了在短时间内获得大量正常胚的方法。在本发明的具体实施方式中，用于体细胞胚胎发生的植物是大麻，优选普通大麻(Cannabis Sativa L.)。如本发明实施方式所述用于形成初级胚和次级胚的方法中使用直接体细胞胚胎发生，由此可避免与使用未分化愈伤组织材料相关的问题。
采用这种方法，不仅可以增加体外组培苗的生长，而且还可以将微生物污染造成损失的风险降至最低，降低生产成本，改善组培苗的生理特性，并实现更好的皿外(ex vitro)炼苗。体细胞胚以光自养方式生长的能力使得自动化成为可能，由此降低了生产成本。此外，光自养生长可以提高体细胞胚的质量，还可以缩短和简化萌发和组培苗发育过程。
常规微繁殖的发育和操作阶段一般分为四个或五个阶段。对于光自养微繁殖来说，划分阶段的数量可以少于传统光混合营养微繁殖，因为在光自养微繁殖中，通过繁殖具有光合作用活性的有叶节点插条作为外植体，扩增阶段和生根阶段可以合并成一个阶段。因此，只有培养物的导入/起始阶段(阶段I)可能处于光异养/光混合营养条件下，该阶段中建立无病毒(或病原体)的培养物来诱导体细胞胚。一旦能够进行光合作用的叶绿体器官发育成熟，培养物即可进入光自养微繁殖条件。可取消炼苗阶段，从而形成仅由起始(阶段I)和扩增/生根(阶段II)两个阶段组成的光自养微繁殖系统，而传统的光混合营养微繁殖需要四个阶段：起始(阶段I)、扩增(阶段II)，生根/准备(第三阶段)和炼苗(第四阶段)。
以下，以实施例和实验结果来说明本发明实施方式的内容和应用。应当理解，这样的实施例和/或实验结果仅仅是说明性的，不是对本发明的限制。
通常，体细胞胚胎发生的应用要求开发统一、高效的再生系统，能够产生性能如同种子衍生植株的植株。制定用更易获得的材料建立胚胎发生性培养物的方案将缓解与未成熟胚外植体相关的许多问题。举例来说，本发明描述了一种简单高效的方案，该方案采用来自成熟、干燥种子的子叶，由此可高频率地诱导体细胞胚。大麻(Cannabis Sativa L.)成熟种子(USO-31)得自Agrolitpa公司(立陶宛克里瓦)。种子表面用0.1％(W/V)氯化汞水溶液消毒8分钟，并用无菌蒸馏水彻底清洗(3遍)数次。然后，将种子分成两半，从子叶中取出胚轴。为了诱导体细胞胚胎发生，将脱胚(deembryonated)子叶(没有任何原有分生组织)置于改良的光自养MS基础培养基上，培养基在先前的实验中进行了优化，添加10mg L-1柠檬酸、1ml/L NAA和6g L-1Floralite(Nishinbo工业公司，东京)用于对照培养基 重组Arg9-NLS-BBM融合蛋白，根据本发明实施方式，对于另一培养基。用于诱导大麻(Cannabis Sativa L.)体细胞胚胎发生的最佳或至少相当适宜的培养基的组成如前文表A所示。
将第二组脱胚子叶(也没有任何原有分生组织)置于相同的优化光自养MS基础培养基上，仅此一次添加了不同浓度重组Arg-NLS-BBM融合蛋白，根据本发明的实施方式，浓度分别为从0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L至3.0ml/L，以此检测大麻直接胚胎发生诱导率相比对照培养基的提高。根据拟南芥基因BBM_ARATH的序列(见前文UniProtKB的援引内容)、Poly-Arg和NLS，合成Arg9-NLS-BBM的人工序列。融合构建体在本氏烟草植株中瞬时过表达，提取并纯化重组蛋白。纯化蛋白经滤膜除菌后加入细胞培养基。
所用培养基均为改良自养MS(Murashige&Skoog 1962)基础培养基，其中以NaNO3替代NH4NO3。将pH值调至5.7±0.1，并将培养基在121℃和1.04kg cm–2压力下高压灭菌20分钟。将含有0.6％(W/V)Florialite的15ml液体培养基照常分配到培养管(25′150mm)中，并用单层奶酪布包裹的非吸收性棉塞塞住。
培养物在生长室(Conviron公司，德国)中于25±2℃和24小时光周期下培养，所示光周期来自光合有效辐射(PAR)源，400-700nm，100-200μmol m-2s-1光合光子通量。
用立体显微镜(LaxcoTMLMS-Z300系列立体变焦显微镜系统，赛默科技公司(Thermo Scientific)，比利时)观察到体细胞胚时，将具有扩增胚的胚发生团转移到新鲜胚胎成熟培养基上，该培养基由前述优化光自养MS基础培养基组成，添加2ml/L氨基酸母液(1000X，L-赖氨酸91.3mg，L-亮氨酸65.6mg，L-色氨酸102.1mg、精氨酸87.1mg和甘氨酸37.52mg)，含BAP(2.22mM)作为对照培养基，在另一培养基中添加重组Arg9-NLS-BBM融合蛋白，如前文表B所示。
为了萌发，将体细胞胚由胚成熟培养基转移到胚萌发培养基上，胚萌发培养基由一半强度的前述优化光自养MS基础培养基组成，两种培养基中都不含任何生长调节剂，但另一培养基中仍含有重组Arg9-NLS-BBM融合蛋白，如以下表C中的组成。
[表C]
为了由萌发的体细胞胚进一步获得芽伸长和全面的根发育，将组培苗转移至优化光自养MS基础培养基，对照培养基含BAP和Meta-Topolin(MT)，另一培养基含BAP MT 重组Arg9-NLS-BBM融合蛋白，根据以下表D中的组成所示，两者均于25±2℃和24小时光周期下培养，所示光周期来自光合有效辐射(PAR)源，400-700nm，100-200μmol m-2s-1光合光子通量。
[表D]
每个处理组合至少培养35个外植体，每个实验重复三次。计算胚胎发生百分比和每一培养物的平均胚数，用邓肯多差距检验对数据进行统计分析。各处理之间，平均数后字母相近的在1％水平没有显著差异。
为了进行组织学研究，胚胎发生不同阶段的胚在FAA(甲醛-乙酸-乙醇)中固定24小时。胚胎经乙醇-二甲苯组织脱水后透化并包埋在石蜡中。用切片机将组织切成6mm，固定在玻片上，番红染色。
照片是尼康光学显微镜下拍摄的。培养开始后28天内，观察到源自成熟子叶外植体的直接体细胞胚胎发生。诱导培养基上培养7天后，子叶膨大。在加有不同浓度重组Arg9-NLS-BBM融合蛋白的优化光自养MS基础培养基上培养2周后，外植体切端出现绿色圆形结构。这些突起称为胚。胚胎发生频率随重组Arg9-NLS-BBM融合蛋白的浓度从0.5mg/L升至2.0mg/L而增加，但浓度再升至3.0ml/L时，胚胎发生频率降低。在不同浓度的试验中，重组Arg9-NLS-BBM融合蛋白浓度在2ml/L是胚胎发生频率高且体细胞胚数最多的最佳浓度。在2ml/L浓度获得的最大胚胎发生率为88.2％，在1％水平有统计学显著性。
此外，含有重组外源蛋白的培养基中，大麻(Cannabis Sativa L.)的胚胎发生诱导率显著高于对照培养基上的。这表明，重组蛋白与外植体细胞接触后，poly-Arg转导域可引导其后的氨基酸穿过细胞膜。NLS可引导其后的蛋白质进入细胞核。在细胞核内，转录因子BBM能与目标DNA序列结合，并能显著诱导大麻的体细胞胚胎发生反应率。
将88.2％的胚胎发生团在4周内形成的体细胞胚转移至成熟培养基。簇中可见不同形状和阶段的胚，表明胚胎发生过程是异步的。在相同成熟培养基上培养4周后还看到了子叶胚。大多数胚形态正常，外观呈绿色，具有明显的下胚轴区域和正常的子叶。许多胚通过下胚轴伸长和子叶膨大进一步发育，产生晚期胚。这些胚经常表现出次级胚发生，除非转移到胚萌发培养基，早期胚由下胚轴和子叶产生。在大麻(Cannabis Sativa L.)未成熟小叶的体细胞胚胎发生过程中，球状、心形和鱼雷阶段没有明确划分。
在萌发培养基上培养的胚中，92％以上的组培苗是由胚产生的。平均植株转化率为86％。子叶体细胞胚产生区的组织学表现证实，发育过程的诱导实际上是胚胎发生性的而不是器官性的。胚胎发生团的光镜观察显示中心区域存在含有细胞质细胞的结节状结构。体细胞胚的发育经历了典型的球形、心形、鱼雷形和子叶期胚发育。胚胎发生的第一个标志是出现球状结构，由一个明显的茎附着在外植体表面，如图1所示。心形胚，见图2，双侧对称，同时显现一根宽的胚柄状茎。有些结构还有带单极分生组织的维管组织，这些最终发育成根。密集染色的分生区常常被薄壁组织完全包围。在这一阶段，观察到清晰的双极胚胎发育，具有组织化的根茎部分，见图3。子叶期胚胎显示有两个明显的子叶，见图4。
在本研究中，利用子叶获得了高频率的体细胞胚胎发生，来自成熟种子的子叶是大麻体细胞胚胎发生的方便、易得和有效的外植体。总之，在我们的发现中，我们发现将重组Arg9-NLS-BBM融合蛋白添加到培养基中后，普通大麻(Cannabis Sativa L.)的胚胎发生诱导率，与对照组相比，可显著提高19％。据我们所知，这也是首次报道在光自养培养基中添加人工植物转录蛋白可诱导普通大麻(Cannabis Sativa L.)直接胚胎发生。鉴于光自养微繁殖的出现和普通大麻(Cannabis Sativa L.)及其他大麻的经济价值，亟需开发劳动密集度低的自动化的、更能产生无需炼苗的强化植株的组织培养方法。本发明的主要优点之一是由于培养基中不含糖和采用非琼脂支持基质而大大减少了污染。这进一步表明培养过程的严苛程度降低，无菌环境放松。此外，添加植物转录因子可以显著提高胚胎发生率和组培苗转化率。本发明允许使用更大的培养容器，这间接意味着全过程的自动化以及商业化时更高的通量。
下面的表格总结了以上讨论的实验结果。比较了光自养培养基对照和加有不同含量重组Arg9-NLS-BBM融合蛋白的培养基。“总体质量”指标根据Niedz等的格式塔评级形成，其中，分值1、2、3分别对应于总体质量差、中、优。
序列表
<110> 比贝婷作物科学有限公司(Perpetuum CropScience BVBA)
<120> 转录因子介导的促进直接体细胞胚胎发生
<130> TR009WO
<150> EP19162059.0
<151> 2019-03-12
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 核定位信号
<400> 1
Arg Arg Lys Pro Ser Trp Arg Glu Arg Glu Asn Asn Arg Arg Arg Glu
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg
20
<210> 2
<211> 1839
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 烟草密码子优化的重组蛋白编码序列
<400> 2
aggagaagac gtcggaggag aaggagacgt agaaagcctt cttggcggga aagagaaaac 60
aaccgtagga gggaaagaag acgaaggatg aattctatga acaactggct gggcttttcc 120
ttatctccgc atgatcagaa tcatcataga actgatgtcg attcttcaac taccaggact 180
gctgtggacg tcgctggtgg atactgcttc gaccttgctg caccgagcga cgaatcatca 240
gctgttcaga ccagttttct ctcaccattt ggagtaactt tggaggcatt cacgcgtgat 300
aataattctc attctcggga ttgggatata aatggtggtg cttgtaataa catcaataat 360
aatgagcaga atggtccgaa attggagaat tttctgggaa gaacaaccac catttacaac 420
acaaacgaaa cagtagtgga tggcaatgga gattgcggtg gaggtgatgg aggtggcggt 480
ggttcacttg gattgtctat gataaagaca tggttgagta accattctgt tgcaaatgct 540
aatcatcagg ataacgggaa tggagcaagg ggattgagtt tatcaatgaa ctcttctaca 600
agcgacagta acaattataa caataatgat gatgttgttc aagaaaaaac aatagtcgat 660
gttgttgaaa caactccaaa gaagacaatt gaatcctttg gacaaagaac tagcatatac 720
agaggagtga ctaggcaccg atggacaggg cgttatgagg cacatctttg ggataattct 780
tgtaaaagag aaggacagac caggaaggga cgacaggtat acctcggtgg ttatgacaag 840
gaggagaaag ctgctagggc ttatgattta gcagctctca agtattgggg cacaacaacc 900
acaacaaatt tccctctttc tgagtatgaa aaagaagtcg aagagatgaa gcacatgaca 960
aggcaggaat acgtagcttc tcttagaaga aagtctagtg gcttttcacg gggcgctagt 1020
atatacagag gtgttactag gcatcaccaa cacggacgat ggcaggcaag aattggtcga 1080
gttgctggaa ataaagacct gtacctggga actttcggga cccaagagga agccgcagag 1140
gcttacgata ttgctgctat taaattcagg ggattatcag ccgtcactaa ctttgatatg 1200
aataggtata atgttaaggc tattcttgaa tctccttcat taccaattgg gagtagcgcc 1260
aagagattga aggatgtaaa caatccggta cctgctatga tgattagcaa taacgtaagc 1320
gagtcagcta acaatgtttc tggatggcaa aatacggctt tccagcacca tcagggtatg 1380
gacctttcat tgctgcaaca gcagcaggaa aggtatgtgg ggtactacaa tggtggtaat 1440
ttgagtacag agagcaccag agtttgtttt aagcaggaag aagagcaaca acattttttg 1500
aggaattctc cttcacacat gaccaatgtt gatcaccatt ctagtacctc agatgattct 1560
gtaacagtct gtggaaatgt cgtctcatac ggtggatacc agggattcgc tattccagtt 1620
ggcacaagtg tcaactatga tccatttaca gctgcagaga tcgcctataa cgcaaggaac 1680
cactattatt acgcacaaca tcaacaacaa caacagattc aacagtcccc gggtggagac 1740
ttcccagttg caattagcaa caatcacagc tctaatatgt actttcatgg agaaggcggt 1800
ggtgagggtg cacctacctt ttctgtgtgg aacgatacc 1839
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多精氨酸转导域
<400> 3
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
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