一种斑马鱼精巢损伤修复模型的构建方法与流程

1.本发明属于损伤修复模型技术领域，具体涉及一种斑马鱼精巢损伤修复模型的构建方法。


背景技术：

2.精巢(睾丸)既是精子发育成熟的重要场所，也是重要的内分泌器官，精巢发育异常或功能损伤会导致男性不育等生殖类疾病的产生。近年来，生殖健康已经成为全球范围内一个优先关注的议题，是人类健康重要组成部分。我国是人口大国，也是生殖健康问题十分突出的国家，据2018年中国人口协会发布的调查。结果显示，中国不孕不育患者目前已超过5000万，占育龄人口的15％。而20多年前，中国育龄人群中不孕不育率仅为3％。在呈现快速增长趋势的不孕不育患者中，25岁至30岁的人数居多。过去不孕不育原因通常男女各占一半，但近年来男方问题的比例正呈现持续增高趋势。影响男性不育原因既有睾丸先天发育异常，又有后天获得性睾丸损伤，致使生精功能受损，导致无精、少精、精子畸形率高或活力差等临床症状出现。环境恶化如放射性和重金属污染，不良生活习性，药物的滥用以及外力损伤等会导致男性后天获得性睾丸损伤,致使睾丸生精功能损伤，导致男性不育的发病率逐年升高。然而，睾丸(精巢)损伤修复的过程高度组织和协调，受到一系列基因的精细调控，而调控这一过程详细的分子机制远未被认识清楚。因此，利用模式动物揭示调控精巢损伤修复的分子机制具有重要的理论价值和临床意义。


技术实现要素：

3.本发明提供了一种斑马鱼精巢损伤修复模型的构建方法，发现斑马鱼精巢具有强大的损伤修复能力，对于研究男性不育症治疗中提供了模型依据。
4.本发明提供了一种斑马鱼精巢损伤修复模型的构建方法，包括转基因系tg(gsdf:egfp)斑马鱼构建和成年tg(gsdf:egfp)转基因系斑马鱼精巢组织损伤。
5.进一步地，所述转基因系tg(gsdf:egfp)斑马鱼构建过程为：构建质粒pt2a
‑
gsdf
‑
egfp，将pt2a
‑
gsdf
‑
egfp转入一细胞期斑马鱼受精卵当中，经培养至成年筛选其后代并培养，即获得转基因系tg(gsdf:egfp)斑马鱼。
6.进一步地，所述pt2a
‑
gsdf
‑
egfp的浓度为15ng/ul。
7.进一步地，后代筛选依据是性腺有荧光的后代。
8.进一步地，所述成年tg(gsdf:egfp)转基因系斑马鱼精巢组织损伤过程包括：
9.首先，选3月龄性成熟tg(gsdf:egfp)转基因系斑马鱼，用麻醉剂进行麻醉固定；
10.然后，先对绿色的精巢组织上的皮肤组织刺孔，再对绿色精巢组织进行部分组织摘除；
11.于养殖系统进行培养，正常喂食养殖，养殖14天。
12.进一步地，摘除的精巢组织面积为摘除一侧1/2的精巢组织。
13.进一步地，所述麻醉剂为ethyl 3
‑
aminobenzoate methanesulfonate(sigma,
e10521)。
14.进一步地，所述麻醉剂的体积分数为0.22％。
15.进一步地，构建的斑马鱼精巢损伤修复模型能够在14dpa内损伤精巢组织实现完全再生。
16.进一步地，构建的斑马鱼精巢损伤修复模型，14dpa雄鱼与野生型雌鱼子代与对照组无差异，能完全受精，14dpa内生殖能力完全恢复。
17.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
18.1、本发明通过切除成年tg(gsdf:egfp)转基因系斑马鱼1/2的精巢组织成功构建了一种斑马鱼精巢损伤修复模型。
19.2、本发明提供了构建斑马鱼精巢损伤修复模型的具体方法步骤。
20.3、本发明通过成功构建斑马鱼精巢损伤修复模型发现精巢被切除1/2体积能在2周内完全再生，且生殖能力也完全恢复，说明斑马鱼精巢损伤后有强大的修复能力，为深入理解精巢损伤修复的分子调控机制做出贡献，且为男性不育症中治疗提供了模型依据。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为本发明构建的tg(gsdf:egfp)生殖转基因鱼系；
23.其中，3月龄(3months post fertilization,mpf)具有tg(gsdf:egfp)生殖转基因和casper双重背景雄鱼精巢；
24.图2为本发明中精巢损伤再生修复荧光图；
25.其中，图2(a)表示精巢切除之前(before amputation)荧光图；
26.图2(b)表示精巢切除1/2体积后0dpa的精巢荧光图；
27.图2(c)表示精巢切除1/2体积后7dpa的精巢荧光图；
28.图2(d)表示精巢切除1/2体积后14dpa的精巢荧光图；
29.图3为本发明中精巢再生过程中精巢面积的统计图(n＝7,mean士s.e.m),ba:before amputation；
30.图4为本发明中14dpa雄鱼与野生型雌鱼子代与对照组受精情况图。
具体实施方式
31.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
32.实施例1
33.本实施例提供了一种斑马鱼精巢损伤修复模型的构建方法，具体过程如下：
34.一、构建步骤
35.1、转基因系tg(gsdf:egfp)斑马鱼构建
36.该转基因系能够特异标记支持细胞，方便在体式荧光背景下对精巢组织进行摘除；
37.(1)构建质粒pt2a
‑
gsdf
‑
egfp；
38.(2)将15ng/ul pt2a
‑
gsdf
‑
egfp显微注射到一细胞期斑马鱼受精卵当中；
39.(3)经培养至成年筛选其后代，将性腺是有荧光的后代挑选并培养。
40.需要说明的是，上述构建步骤的详细过程可以参见论文cao z,mao x,and luo l.(2019).germline stem cells drive ovary regeneration in zebrafish.cell reports,26(7),1907
‑
1917。
41.2、成年tg(gsdf:egfp)转基因系斑马鱼精巢组织切除损伤
42.(1)选3月龄性成熟tg(gsdf:egfp)转基因系斑马鱼，用0.22％的麻醉剂ethyl 3
‑
aminobenzoate methanesulfonate(sigma,e10521)进行麻醉固定；
43.(2)利用wpi 55#手术镊子在荧光显微镜下先对绿色的精巢组织上的皮肤组织刺一个小孔，再对绿色精巢组织进行组织摘除，摘除一侧1/2的精巢组织；
44.(3)手术完后，将鱼尽快移入养殖系统进行培养，正常喂食养殖，养殖14天，在修复的第2天(2days post fertilization,dpa)，第7天(7dpa)和第14天(14days post fertilization,dpa)进行显微拍照。
45.3、评估损伤修复程度和生殖力恢复程度
46.(1)损伤修复程度评估：计算2dpa，7dpa，14dpa损伤精巢组织的荧光表面积并进行数据统计；
47.(2)生殖力恢复程度评估：将修复14dpa的雄鱼与野生型雌鱼进行交配，检测受精率，评估其生殖力。
48.二、实验结果
49.如图1所示，tg(gsdf:egfp)生殖转基因鱼系构建成功，3mpf具有tg(gsdf:egfp)生殖转基因和casper双重背景雄鱼精巢(标尺，1mm)；
50.如图2所示，通过精巢组织切除前后的变化可以发现，精巢被切除1/2体积能在2周内完全再生(标尺，1mm)；
51.如图3所示，从精巢再生过程中精巢面积的变化可以看到，精巢被切除1/2体积能在2周内完全再生；
52.如图4所示，14dpa雄鱼与野生型雌鱼子代与对照组无差异，能完全受精，说明其生殖能力也完全恢复，斑马鱼精巢损伤后有强大的修复能力，为深入理解精巢损伤修复的分子调控机制做出贡献。
53.综上所述，本发明通过切除斑马鱼1/2精巢组织成功构建了一种斑马鱼精巢损伤修复模型，可以在14天完全修复损伤，生殖能力也完全恢复，对于研究男性不育症治疗中提供了模型依据。
54.需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
55.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。