一种对食品中非法添加的托拉塞米进行定性、定量检测的方法及应用与流程

1.本发明属于检测技术领域，具体涉及一种对食品中非法添加的托拉塞米进行定性、定量检测的方法及应用。


背景技术：

2.随着现代经济社会的发展，人们物质生活水平极大提高，快节奏的生活方式和不健康的饮食习惯使得肥胖现象日渐凸显。为了达到短期内瘦身的目的，人们更倾向于购买瘦身产品，而所谓“天然”的减肥食品，格外受到人们的青睐。为了使产品达到快速瘦身的效果，许多不法商家人为添加利尿剂等可以短期内减低体重的化学药物，以达到减肥瘦身的假象，而这些非法添加的化学药物，种类未知，剂量不明，长期大量服用，会产生严重的不良反应，严重威胁消费者的利益和健康。所以应该不断加强对此类商品的抽检监测能力和监管力度，切实保障消费者的利益和生命安全。
3.托拉塞米的化学名为1
‑
[4
‑
氨基吡啶
‑3‑
基]磺酰
‑3‑
异丙基脲，是新一代高效髓袢利尿剂，是目前一种新发现的减肥类非法添加的化学药物。其可能会导致头晕、头痛、恶心、虚弱、呕吐、高血糖、排尿过多、高尿酸血症、低钾血症、极度口渴、血容量不足、阳萎、食道出血、消化道不良等不良反应，作为一种处方药，应当在医生指导下使用，如若在不知情的情况下大量服用，会造成未知的严重后果，故有必要加强对该成分的筛查力度。
[0004]
现有技术中采用高效液相色谱法测定托拉塞米，但由于样品只是针对注射用品中托拉塞米的检测，对于减肥类食品或保健食品中采用该方法检测时，由于样品处理方法不明确，导致检测结果不准确，灵敏度不高，检测假阴性，如何能快速准确有效检测出托拉塞米，亟需开发一种新的检测方法。


技术实现要素：

[0005]
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种食品中非法添加托拉塞米的定性定量检测的方法和应用，尤其是减肥类食品或保健食品中非法添加的托拉塞米的检测，利用液相色谱
‑
质谱联用技术，实现同时对托拉塞米进行定性和定量分析的方法，填补了国内外对食品中托拉塞米同时进行定性、定量测定的空白。
[0006]
为实现上述目的，本发明一方面提供一种对食品中非法添加的托拉塞米进行定性、定量检测的方法，其包括如下步骤：
[0007]
s1、样品前处理：若食品样品为固体时，取1g，精确至0.0001g，若食品样品为液体时，取1ml，置于50ml量瓶中，加入甲醇35～45ml，振摇，超声提取，加甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22μm的滤膜过滤，取续滤液作为待测样品溶液；
[0008]
s2、制备标准溶液：配制托拉塞米标准储备液，然后将标准储备液用甲醇稀释为标准使用液，再用甲醇将标准使用液配制成不同浓度的标准系列溶液；
[0009]
s3、样品定性测定：采用高效液相色谱
‑
串联质谱仪分别测定食品样品的续滤液及
标准溶液，记录食品样品和标准溶液中各化合物的色谱保留时间，以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子对的相对丰度，记录浓度相当的试样与标准溶液中相应成分的相对离子丰度；当试样中检出与托拉塞米标准溶液色谱峰保留时间一致的色谱峰，变化范围在
±
2.5％之内，并且相对离子丰度允许偏差不超过下表规定的范围，确定试样中检出相应化合物；
[0010]
相对离子丰度的最大允许偏差
[0011][0012]
s4、样品定量测定：将托拉塞米的标准系列溶液采用液相色谱
‑
串联质谱法进行测定，根据标准溶液的峰面积a与标准系列溶液的浓度绘制标准曲线，得回归方程a＝kc b，将待测样品的峰面积a带入标准曲线回归方程中，计算得到待测样品中非法添加的托拉塞米的浓度，继而得出样品中托拉塞米的含量。
[0013]
如上所述的方法，步骤s1和s2的操作顺序可相互颠倒，对结果不会产生影响。
[0014]
如上所述的检测方法，优选地，在步骤s1中，食品样品为固体时，需要先将食品研细，取粉末进行称量。
[0015]
如上所述的检测方法，优选地，在步骤s1中，超声的功率为150w，频率为40khz，时间为30min，续滤液用甲醇稀释至标准系列溶液浓度范围内，进行上样检测。
[0016]
如上所述的检测方法，优选地，在步骤s2中，先配制100μg/ml标准储备液，之后采用100μg/ml标准储备液加入甲醇配制为托拉塞米浓度为5μg/ml的标准使用液a，再用标准使用液a加入甲醇配制为托拉塞米浓度为1μg/ml的标准使用液b，之后分别取0.1ml、0.2ml、0.4ml、1.0ml、2.0ml的标准使用液b，置于20ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，获得浓度依次为5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的标准系列溶液。
[0017]
如上所述的检测方法，优选地，所述100μg/ml标准储备液的制备为准确称取托拉塞米标准品10.0mg，精确至0.0001g，置于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0018]
如上所述的检测方法，优选地，在步骤s3和s4中，所述高效液相色谱的条件为色谱柱为资生堂capcell
‑
pak c
18
色谱柱或acquity uplc beh amide或与其性能相当者；流动相为a为10mmol/l的乙酸铵溶液，b为乙腈，a:b＝70:30；流速为0.5ml/min；柱温为20℃；进样量为10μl进行。
[0019]
如上所述的检测方法，优选地，在步骤s3和s4中，质谱的条件为离子源为电喷雾离子源，检测方式是多反应监测，扫描方式采用负离子模式，毛细管电压为负离子模式：4500v，离子源温度设为400℃，干燥气流量为12l/min，雾化气压力为70psi，鞘气温度为250℃，鞘气为n2；气帘气压力为35psi，辅助气压力为60psi；喷嘴电压为正离子模式：500v；负离子模式为2000v。
[0020]
如上所述的检测方法，优选地，在步骤s3和s4中，质谱测定条件中，托拉塞米的出峰时间为7.2min、定量离子对为346.8
‑
261.7、定性离子对为346.8
‑
196.0、碎裂电压为80v、碰撞电压为24v、检测模式为负离子检测。
[0021]
如上所述的检测方法，优选地，在步骤s4中，对标准系列溶液进行测定，得到相应的标准系列溶液的色谱峰面积，以标准系列溶液的浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；根据检测获得的样品的色谱峰面积，对应绘制的标准曲线，可得到相应进样样品中托拉塞米的浓度。
[0022]
如上所述的检测方法，优选地，将进样样品中托拉塞米的浓度代入下式可计算食品中托拉塞米的含量x：
[0023]
其中：
[0024]
x—食品样品中托拉塞米的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)或毫克每升(mg/l)；
[0025]
c—从标准曲线中读出的进样样品溶液中托拉塞米的浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
[0026]
v—样液最终定容体积，单位为毫升(ml)；
[0027]
m—试样溶液所代表的质量或体积，单位为克(g)或毫升(ml)；
[0028]
k—稀释倍数；
[0029]
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
[0030]
本发明另一方面提供如上所述的同时对食品中非法添加的托拉塞米定性定量检测的方法在食品中非法添加托拉塞米检测上的应用。
[0031]
如上所述，本发明的同时对食品中非法添加的托拉塞米定性定量检测的方法及应用，具有以下有益效果：
[0032]
本发明提供了一种对食品中非法添加的托拉塞米同时进行定性、定量检测的高效液相色谱
‑
串联质谱分析方法。该方法是利用高效液相色谱作为分离设备，三重四级杆质谱仪作为检测设备，利用质谱定性离子对进行定性分析，定量离子对外标法进行定量检测。本发明的方法专属性强，灵敏度高，操作简单高效，分析速度快，可快速对样品中非法添加的托拉塞米进行定性确证，并且对托拉塞米的含量进行准确的定量，大大提高了检测的灵敏度，避免漏检、假阴性结果的产生。该法适用于非法添加托拉塞米的筛查和确证，该方法填补了国内外对托拉塞米同时进行定性、定量测定的空缺，可为监管部门打击制假售假提供有效全面的技术支持。
[0033]
本发明的检测方法适用于压片糖果、饼干、饮料、口服液、茶叶饮料等食品，包括上述类似基质的片剂、胶囊剂等形式的保健食品。
[0034]
本发明方法采用的液质联用法专属性强，灵敏度高，可实现定性、定量分析同时进行，且该方法操作简单高效，分析速度快，适用于非法添加托拉塞米的筛查和确证，定性的同时进行定量，可以为监管部门打击制假、售假提供有效全面的技术支持。
附图说明
[0035]
图1为本发明实施例2中托拉塞米的标准曲线图。
[0036]
图2为本发明实施例2中不同浓度托拉塞米标准系列溶液的提取离子色谱图。
[0037]
图3为本发明实施例2中托拉塞米的定性检测的质谱图。
[0038]
图4为本发明实施例2中托拉塞米的定量检测的质谱图。
[0039]
图5为本发明实施例2中空白样品的总离子流色谱图。
[0040]
图6为本发明实施例中阴性样品的总离子流色谱图。
[0041]
图7为本发明实施例9中实际样品的总离子流色谱图。
[0042]
图8为不同提取时间对提取效果的影响结果。
[0043]
图9为托拉塞米紫外扫描光谱图。
[0044]
图10为空白溶液的hplc色谱图。
[0045]
图11为托拉塞米对照品溶液的hplc色谱图。
[0046]
图12为样品溶液(托拉塞米)的hplc色谱图。
具体实施方式
[0047]
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0048]
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格。
[0049]
实施例1
[0050]
本实施例中所用试剂：乙腈(ch3cn)：色谱纯，乙酸铵(ch3coonh4)：色谱纯，甲醇(ch3oh)：分析纯，水为gb/t 6682规定的一级水。
[0051]
10mmol/l乙酸铵水溶液的配制：称取乙酸铵1.54g，用水稀释至2000ml，用0.45μm滤膜过滤后备用。
[0052]
所用的托拉塞米标准品的中文名称、英文名称、cas登录号、分子式、相对分子质量详见表1，标准品纯度≥95％。
[0053]
表1托拉塞米标准物质信息表
[0054][0055]
标准溶液的配制采用如下方法：
[0056]
(1)标准储备液(100μg/ml)：准确称取托拉塞米标准品10.0mg(精确至0.0001g)，置于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100μg/ml标准储备液。
[0057]
(2)标准使用液a：准确吸取托拉塞米标准储备液1ml，置于20ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成标准使用液a，托拉塞米浓度为5μg/ml。
[0058]
(3)标准使用液b：准确吸取标准使用液a 2ml，置于10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成标准使用液b，托拉塞米浓度为1μg/ml。
[0059]
(4)标准系列溶液：分别准确吸取标准使用液b各0.1ml、0.2ml、0.4ml、1.0ml、2.0ml，置于20ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为系列标准系列溶液s(1)～s(5)，托拉塞米浓度依次为5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml。
[0060]
检测样品的制备：
[0061]
(a)对于压片糖果、茶叶、饼干、片剂、胶囊类的样品采用如下方法：
[0062]
取适量研细，称取粉末1g(精确至0.0001g)置于50ml量瓶中，加入甲醇40ml，振摇，超声提取30min，放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀，用滤膜(0.22μm，有机相型)过滤，取续滤液，可根据实际浓度适当稀释至线性范围内，供液相色谱
‑
质谱联用仪分析。
[0063]
(b)对于饮料、口服液采用如下方法：
[0064]
准确吸取1ml，置50ml量瓶中，加入甲醇40ml，振摇，超声提取30min，放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀，用滤膜(0.22μm，有机相型)过滤，取续滤液，可根据实际浓度适当稀释至线性范围内，供液相色谱
‑
质谱联用仪分析。
[0065]
检测所用仪器的条件
[0066]
(1)液相色谱条件
[0067]
a)色谱柱：资生堂capcell
‑
pak c
18
色谱柱(4.6mm
×
150mm,5μm)或acquity uplc beh amide或与其性能相当者；
[0068]
b)流动相：a为含10mmol/l的乙酸铵溶液，b为乙腈，a:b＝70:30；
[0069]
c)流速：0.5ml/min；
[0070]
d)柱温：20℃；
[0071]
e)进样量：10μl。
[0072]
(2)质谱条件
[0073]
a)离子源：电喷雾离子源(esi)；
[0074]
b)检测方式：多反应监测(mrm)；
[0075]
c)扫描方式：负离子模式；
[0076]
d)毛细管电压：4500v；
[0077]
e)离子源温度：400℃；
[0078]
f)干燥气流量：12l/min；
[0079]
g)雾化气压力：70psi；
[0080]
h)鞘气温度：250℃，鞘气(n2)；
[0081]
i)气帘气压力：35psi；
[0082]
j)辅助气压力：60psi；
[0083]
k)喷嘴电压：正离子模式：500v；负离子模式：2000v；
[0084]
l)其他质谱参数见表2。
[0085]
表2托拉塞米定性、定量离子和质谱分析参数
[0086][0087]
实施例2
[0088]
(一)定性测定
[0089]
按照高效液相色谱
‑
串联质谱条件测定试样和标准系列溶液，记录试样和标准系列溶液中各化合物的色谱保留时间，以相对于最强离子丰度的百分比作为定性离子对的相
对丰度，记录浓度相当的试样与标准系列溶液中相应成分的相对离子丰度。当试样中检出与托拉塞米标准品色谱峰保留时间一致的色谱峰(变化范围在
±
2.5％之内)，并且相对离子丰度允许偏差不超过表3规定的范围，可以确定试样中检出托拉塞米。
[0090]
表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
[0091][0092]
(二)定量检测
[0093]
方法同实施例1中，对托拉塞米浓度依次为5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的标准系列溶液分别取10μl注入高效液相色谱
‑
串联质谱仪进行测定。
[0094]
1、标准曲线的制作
[0095]
将标准系列溶液按仪器参考条件进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积。以标准系列溶液的浓度(c)为横坐标，以色谱峰的峰面积(a)为纵坐标，绘制标准曲线，并得回归方程a＝kc b。
[0096]
托拉塞米的标准曲线如图1所示，得到的回归方程为：a＝2207.9c
‑
1038.2，r＝0.9998。
[0097]
托拉塞米的提取离子色谱图如图2所示。
[0098]
托拉塞米用于定性检测的质谱图如图3所示，用于定量检测的质谱图如图4所示。
[0099]
2、试样溶液的测定
[0100]
采用高效液相色谱
‑
串联质谱法，将试样溶液按仪器参考条件进行测定，得到相应的样品溶液的色谱峰面积，将待测样品的峰面积a带入标准曲线回归方程中，得到待测液中托拉塞米的浓度，平行测定次数不少于两次。
[0101]
3、空白试验
[0102]
除不加试样外，均按试样同法操作。
[0103]
空白样品的总离子流色谱图如图5所示。
[0104]
4、结果计算
[0105]
将高效液相色谱
‑
串联质谱法测得的浓度代入下式计算样品中托拉塞米的含量：
[0106][0107]
式中：
[0108]
x—试样中托拉塞米的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；
[0109]
c—从标准曲线中读出的供试品溶液中托拉塞米的浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；
[0110]
v—样液最终定容体积，单位为毫升(ml)；
[0111]
m—试样溶液所代表的质量，单位为克(g)；
[0112]
k—稀释倍数。
[0113]
计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
[0114]
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15％，空白试验应无干扰。
[0115]
实施例3灵敏度检测
[0116]
称取空白固体试样1g(精确至0.0001g)或准确量取空白液体试样1ml，于50ml量瓶中，准确添加一定浓度的对照品溶液，加入甲醇40ml，振摇，超声提取30min，放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀，用滤膜(0.22μm，有机相型)过滤，取续滤液，经液相色谱
‑
质谱联用仪分析，以信噪比为3:1时对应的托拉塞米浓度计算检出限，以信噪比为10:1时对应的托拉塞米浓度计算定量限。按实施例2中方法进行检测，获得直接检测托拉塞米的定量限浓度为1.5ng/ml，最低检出限浓度为0.5ng/ml。
[0117]
固体和液体取样量为1g或1ml，定容体积为50ml时，托拉塞米的定量限为75μg/kg或75μg/l，检出限为25μg/kg或25μg/l。
[0118]
实施例4色谱
‑
质谱条件的考察
[0119]
1、色谱柱的考察
[0120]
非法添加实验的样品往往比较复杂，杂质相对较多，对色谱柱的分离效果和耐用性要求较高。试验分别考察了acquity uplc beh amide(2.1
×
50mm,1.7μm)、资生堂capcell
‑
pak c
18
(4.6mm
×
150mm,5μm)、techmate c
18
‑
st(4.6mm
×
250mm,5μm)和techmate c
4 st(4.6mm
×
250mm,5μm)等4种不同色谱柱的分离效果和耐用性，结果表明，acquity uplc beh amide的分析时间最短，acquity uplc beh amide和资生堂capcell
‑
pak c
18
的分离效果均能满足实验需求。虽然超高效色谱柱分析时间短，但是杂质较多的样品容易造成色谱柱柱压升高，耐用性不理想。本发明中最终采用资生堂capcell
‑
pak c
18
(4.6mm
×
150mm,5μm)色谱柱进行托拉塞米非法添加的检验，分析时间较短，分离度可以达到要求，且连续分析上百批次样品也能很好的满足实验要求。
[0121]
2、流动相体系的考察
[0122]
流动相在选择上不仅要考虑待分析物的峰形和分离效果，还要兼顾离子响应强度。托拉塞米极性较大，需要选择适宜的流动相，以使其与极性干扰峰分离，降低基质效应，增强离子响应强度。试验分别考察了甲醇
‑
水、乙腈
‑
水、甲醇
‑
醋酸铵水溶液、乙腈
‑
醋酸铵水溶液等流动相系统，结果表明，醋酸铵水溶液能够有效改善托拉塞米的峰形，乙腈为有机相的流动相体系有利于分离和改善离子响应强度。调整水相和有机相的比例，最终确定10mmol/l的乙酸铵溶液：乙腈＝70:30作为托拉塞米分析用流动相。
[0123]
3、质谱条件的优化
[0124]
取浓度为5μg/ml的托拉塞米标准中间液a用于质谱条件的优化。采用电喷雾源(esi)进行离子化，分别用正离子模式和负离子模式进行全扫描，结果表明，托拉塞米在esi
‑
模式下响应最好，故本发明方法采用负离子模式进行检测。在esi
‑
模式下进行母离子扫描，扫描范围为m/z 200～500，得到[m h]
‑
峰，并适当调节相应的毛细管电压，使得母离子一级扫描时响应最高。
[0125]
确定母离子及其毛细管电压后，继而进行子离子扫描，经仪器二级质谱参数自动优化程序进行优化，得到最佳二级质谱条件，继而得到托拉塞米的二级质谱优化参数。最终将优化后得到的定量定性离子对、碰撞能量作为托拉塞米的mrm扫描参数。
[0126]
实施例5样品前处理方法的考察
[0127]
1、提取溶剂的选择
[0128]
选择合适的前处理方法对非法添加物的检测至关重要，试验考察了常用的有机试剂:甲醇、50％甲醇、乙腈、50％乙腈的提取效果，甲醇和乙腈的提取效果较好，考虑实验成本等因素，最终确定采用甲醇超声提取法对样品进行前处理，该方法简单便捷，可以满足实验的需要。
[0129]
2、提取时间的考察
[0130]
取样品初芯植物低聚糖果(清远市龙唐医药科技有限公司，批号20081306)研细，精密称定，每份约1g，分别置于50ml量瓶中，加入甲醇40ml，振摇，室温下分别超声(功率150w，频率40khz)提取10、20、30、40、50、60min，放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀，用滤膜(0.22μm，有机相型)过滤，取续滤液，经液相色谱
‑
质谱联用仪分析。通过比较样品以甲醇超声提取10min、20min、30min、40min、50min、60min后的色谱响应，发现以甲醇为提取溶剂，当提取时间达到30min，托拉塞米的峰面积达到最大值，当继续增加超声时间，峰面积不再增加，因此，超声提取时间选择为30min，可以将样品中的托拉塞米提取完全。提取时间对提取效果的影响如图8所示。
[0131]
实施例6重复性试验考察
[0132]
准确称取研细后的初芯植物低聚糖果(清远市龙唐医药科技有限公司，批号20081306)6份，每份1.0000g，置于50ml量瓶中，加入甲醇40ml，振摇，室温下超声(功率150w，频率40khz)提取30min，放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀，再精密量取上清液1.0ml至100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取上清液1.0ml至100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，上清液用滤膜(0.22μm，有机相型)过滤，取续滤液。采用实施例1中的液相和质谱条件进行分析。获得托拉塞米色谱峰的保留时间，采用实施例2中的定量检测方法计算出样品所含托拉塞米的含量，结果见表4，托拉塞米保留时间的相对标准偏差为0.3％，含量的相对标准偏差为0.7％，结果表明，重复性良好。
[0133]
表4托拉塞米的重复性考察
[0134][0135]
实施例7回收率试验考察
[0136]
准确称取已知含量的初芯植物低聚糖果(清远市龙唐医药科技有限公司，批号20081306)0.5000g置于50ml量瓶中，分别加入托拉塞米对照品(具体见表5所示)，每个样品平行操作3份，加入甲醇40ml，振摇，室温下超声(功率150w，频率40khz)提取30min，放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀，再精密量取上清液1.0ml至100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取上清液1.0ml至100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，上清液用滤膜(0.22μm，
有机相型)过滤，取续滤液即得。采用实施例1中所述液相和质谱条件进行分析，带入实施例2中的回归方程定量，计算平均回收率及相对标准偏差(rsds)(n＝9)，结果见表5。
[0137]
由结果可知，托拉塞米回收率在98.5％～101.6％之间，平均回收率为99.4％，rsd为1.0％，表明该方法准确性良好，回收率可以满足含量测定的要求
[0138]
表5托拉塞米的回收率及其rsds(n＝9)
[0139][0140]
实施例8稳定性考察
[0141]
取实施例6中的样品溶液，采用实施例1中所述液相和质谱条件进行分析，分别于0、2、4、8、10、12h进样测定，计算托拉塞米的峰面积rsd，结果见表6所示，结果表明，样品溶液在12h内稳定。
[0142]
表6托拉塞米稳定性考察
[0143][0144]
实施例9实际样品测定
[0145]
采用本发明实施例1和2中的方法分别对15批食品(含保健食品)样品中非法添加的托拉塞米进行定性和定量测定。15批样品信息如表7所示。利用本法对该15批样品进行检测，采用实施例1中所述液相和质谱条件进行分析，带入实施例2中的回归方程定量，其中2批样品检测出含有托拉塞米成分，样品编号分别为8和14。样品的总离子流色谱图如图7所示，测定结果见表7所示。结果表明，共有2批样品中检测出非法添加了托拉塞米，检出率为13.3％。
[0146]
表7样品信息及测定结果
[0147]
编号样品名称样品批号剂型托拉塞米含量/mg/kg1魔芋绿茶肉碱奶茶20191210冲剂未检出2果蔬丽人轻畅颗粒20191223颗粒剂未检出3左旋肉碱咖啡粉20191103粉剂未检出4碧迪牌秀尔茶20190201茶剂未检出5完美牌高纤乐冲剂20200707冲剂未检出
6荷叶苦瓜调味茶20200105茶剂未检出7譙春堂决明子大麦茶2020年4月10日茶剂未检出8植物肽益生菌压片糖果19101501糖果323009大麦若叶青汁2020/09/10茶剂未检出10清清饮20200601固体饮料未检出11纳斐尔酵素果冻2020/07/28果冻未检出12膳食纤维橙味饮料2019/06/03液体饮料未检出13常润茶2020/05/15茶剂未检出14初芯植物低聚糖果20081306糖果4620015玉米须茶2020年8月12日茶剂未检出
[0148]
上述实验结果表明，经过本方法处理后的阴性样品总离子流色谱图(可参见图6)与空白样品的总离子流色谱图(可参见图5)相比都没有出现明显的杂峰，表明本法在托拉塞米处无干扰。并且，从实施例6的重复性试验可以看出，本法具有良好的精密度和重复性(见表4)；从实施例7的回收率试验可以看出，本发明方法具有良好的回收率和相对标准偏差(见表5)；从实施例8的稳定性试验可以看出，溶液在12h内稳定性良好(见表6)，这说明使用本发明的方法可以快速有效的进行食品及保健食品中托拉塞米定性、定量的测定。
[0149]
对比例
[0150]
此外，还采用高效液相色谱法对样品进行托拉塞米含量的测定，作为对比例以验证本发明测定方法的准确性。
[0151]
1材料与方法
[0152]
1.1仪器与试剂
[0153]
alliance acquity e2695 hplc系统，包括四元高压梯度泵、自动进样器、2998二极管阵列检测器以及empower色谱工作站(美国waters公司)；电子分析天平xp 205型(瑞士梅特勒
‑
托利多仪器公司)；as系列超声波清洗机(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；mili
‑
q去离子水发生器(美国millipore公司)。
[0154]
甲醇(色谱纯)、磷酸二氢钾、磷酸(分析纯)(国药集团有限公司)、实验用水为milli
‑
q超纯水。
[0155]
托拉塞米对照品(纯度100.0％，购自中国食品药品检定研究院)
[0156]
1.2实验方法
[0157]
1.2.1色谱条件
[0158]
采用techmate c
18
‑
st(250mm
×
4.6mm，5μm)色谱柱；流动相为甲醇
‑
20mmol/l磷酸二氢钾溶液(磷酸调节ph至3.0)(20:80，v:v)等度洗脱；检测波长：280nm；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；进样量：20μl。
[0159]
1.2.2溶液配制
[0160]
对照品储备溶液(1.005mg/ml):精密称取托拉塞米对照品20.10mg，置20ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得对照品储备溶液；
[0161]
对照品使用溶液(100.5μg/ml):精密量取5ml对照品储备溶液，置50ml容量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，得对照品使用溶液；
[0162]
标准系列工作液：分别精密量取对照品使用溶液0.5、1、2、4、6、8ml，置于10ml容量
瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，标准系列溶液浓度分别为5.02、10.0、20.1、40.2、60.3、80.4μg/ml。
[0163]
供试品溶液：准确称取混匀后的样品粉末约2g，置于100ml容量瓶中，加适量甲醇振摇溶散后超声提取30min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取上清液1ml置20ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜后进行液相分析。
[0164]
2方法学考察
[0165]
2.1波长的选择
[0166]
本实验采用紫外检测器，由托拉塞米紫外光谱扫描图得知，化合物在280nm处有最大吸收峰，因此选择检测器波长为280nm进行测定，以提高检测灵敏度，托拉塞米紫外扫描光谱图见图9。
[0167]
2.2专属性及系统适应性试验
[0168]
对照品溶液和供试品溶液的液相色谱图中托拉塞米的理论塔板数分别为10214和11243，峰形对称，供试品溶液中托拉塞米峰与其他杂质峰分离较好，空白溶剂不干扰样品测定，该方法专属性良好，空白溶剂色谱图、对照品溶液及样品溶液色谱图见图10
‑
12。
[0169]
2.3线性关系考察
[0170]
取标准系列工作液，按照“1.2.1”项下色谱条件进行分析，记录色谱图。以托拉塞米浓度c(μg/ml)为横坐标，峰面积a为纵坐标进行回归，绘制标准曲线，托拉塞米的回归方程为：a＝114166c
‑
3781.1(r＝0.9997，n＝6)，结果表明，托拉塞米在5.02～80.4μg/ml内，浓度与峰面积呈良好的线性关系。
[0171]
2.4精密度试验
[0172]
精密吸取托拉塞米对照品溶液20μl，按“1.2.1”项下色谱条件测定，重复进样6次，托拉塞米色谱峰保留时间和峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation；rsd)分别为0.92％(n＝6)和0.83％(n＝6)。结果表明，仪器的精密度良好。
[0173]
2.5重复性试验
[0174]
精密称取研细后的初芯植物低聚糖果(清远市龙唐医药科技有限公司，批号20081306)6份，按照“1.2.2”项下同法制备供试品溶液，采用“1.2.1”项下色谱条件测定，按外标法计算托拉塞米的含量。样品中托拉塞米保留时间的相对标准偏差为0.6％，含量的相对标准偏差为1.3％，结果表明，重复性良好。
[0175]
托拉塞米的重复性考察
[0176][0177]
2.6加标回收实验
[0178]
准确称取已知含量的初芯植物低聚糖果(清远市龙唐医药科技有限公司，批号20081306)1g置于100ml量瓶中，分别加入托拉塞米对照品(具体见下表所示)，每份样品平行操作3份，按“1.2.2”项下同法制备供试品溶液，按“1.2.1”项下色谱条件测定，采用外标法定量，计算平均回收率及相对标准偏差(n＝9)，结果如下表所示。由结果可知，托拉塞米
回收率在98.3％～101.1％之间，平均回收率为99.6％，相对标准偏差(rsd)为1.0％，表明该方法回收率良好，准确度符合实验要求。
[0179]
托拉塞米的回收率及其rsds(n＝9)
[0180][0181][0182]
2.7检出限考察
[0183]
称取空白样品(未检测出托拉塞米的样品)2g，加入一定浓度的对照品溶液，按“1.2.2”项下所述的方法进行样品前处理，按“1.2.1”项下色谱条件进行测定，以信噪比为3时对应的对照品浓度计算托拉塞米的检出限。结果显示，托拉塞米的最低检测浓度为25ng/ml。
[0184]
固体和液体取样量为2g或2ml，定容体积为50ml时，托拉塞米的检出限为625μg/kg或625μg/l。
[0185]
3实际样品测定
[0186]
采用上述实验方法对实施例9中的15批食品(含保健食品)样品中非法添加的托拉塞米进行定性和定量测定。其中2批样品检测出含有托拉塞米成分，样品编号分别为8和14，样品中托拉塞米的含量分别为33100mg/kg和46700mg/kg。
[0187]
采用本发明的方法测定的结果分别为32300mg/kg和46200mg/kg，与对比例相比，结果的相对平均偏差分别为1.2％和0.5％，说明采用两种方法测定的结果相似。但是本发明所建立方法在重复性和精密度方面均比现有技术更具优势，检出限浓度比原有技术降低了50倍，重复性的rsd更低，本发明的技术更有利于产品中非法添加托拉塞米的定性和定量测定。
[0188]
综上所述，本发明提供了一种对食品(含保健食品)中非法添加的托拉塞米同时进行定性、定量检测的液相色谱
‑
串联质谱分析方法。该方法是用高效液相色谱仪作为分离设备，三重四级杆质谱仪作为检测器，利用质谱定性离子对进行定性分析，定量离子对外标法进行定量检测。方法的前处理简便、灵敏度高、专属性强、效率高，能同时对食品(含保健食品)中非法添加的托拉塞米进行定性和定量分析，能应用于食品安全监管中，以预防这种减肥类药品在食品中的非法添加。
[0189]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因
此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。