一种棕榈粕原料生物预处理方法与流程

1.本发明涉及生物饲料技术领域，具体涉及一种棕榈粕原料生物预处理方法。


背景技术：

2.棕榈粕是棕榈仁脱壳榨油后的副产品，形状、颜色与菜子粕相似，气味略有巧克力气味，棕榈仁粕视其脱壳程度和加工工艺，品质相差很大。与花生粕和椰子粕相似，棕榈籽粕的氨基酸成分在氨基酸平衡和消化率方面都很差，缺乏赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸。家禽对棕榈籽粕中赖氨酸和蛋氨酸的消化率低达59％，而大豆粕的相应值为90％。棕榈籽粕中其他必需氨基酸的消化率也低。氨基酸消化率低的原因是蛋白质被套在碳水化合物复合物中以及炼油工艺中的高温处理。
3.棕榈仁粕价格低廉，无霉性和副作用，如果直接饲喂，缺点是对单胃动物来说，能量和粗蛋白的利用率较低，因棕榈仁粕含粗纤维较高的因素，因此在用于单胃动物养殖上使用量不高、营养效果不是很理想的情况。但如果将棕榈仁粕进行降解和发酵后饲喂单胃动物，则完全改变存在的弊端，不仅消化吸收率大幅度提高、适口性改善、使用量提高2
‑
3倍，降低成本立竿见影，经济效益显著。
4.现有技术中对棕榈粕的处理方法常采用的是以下两种方法：(1)用纤维素酶、蛋白酶、甘露聚糖酶等酶将棕榈粕进行酶解，再通过发酵菌进行发酵，制备得到预处理的棕榈粕；(2)直接将棕榈粕与微生物混合发酵，没有前处理过程，制备得到预处理的棕榈粕。中国发明专利201911408582.6公开了一种营养发酵棕榈粕及其制备方法，其主要采用的技术手段是，以棕榈粕为原料，与水混合并搅拌均匀后，165℃进行处理10min；处理后按棕榈粕重量接入微生物菌种，在30℃～45℃下发酵；发酵完毕后进行低温干燥，得到营养发酵棕榈粕，实际解决的技术问题是提高动物的消化吸收能。但是该发明中棕榈粕中的营养价值利用率还是非常低，依然不能扩大其应用。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种棕榈粕原料生物预处理方法。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
7.一种棕榈粕原料生物预处理方法，其特征在于，由以下步骤组成：
8.s1：将2
‑
5重量份硝酸钠、0.5
‑
3重量份磷酸氢二钾、0.1
‑
1重量份七水硫酸镁、0.2
‑
2重量份氯化钾、0.01
‑
1重量份硫酸亚铁、15
‑
30重量份蔗糖、800
‑
1200重量份水混合，在常温、200
‑
500rpm下搅拌3
‑
8min，得混合液a，置于100
‑
130℃下进行灭菌10
‑
30min，再接种米曲霉，接种量为混合液a质量的0.05
‑
1wt％，在温度25
‑
32℃、100
‑
200rpm条件下培养16
‑
30h，得到种子液；
9.s2：将棕榈粕粉碎，过80
‑
140目筛，取150
‑
200重量份粉碎后的棕榈粕，加入5
‑
10重量份氯化钠、0.3
‑
0.5重量份硫酸镁、2
‑
3重量份磷酸二氢钾、800
‑
1200重量份水混合，置于
100
‑
130℃下进行灭菌10
‑
30min，再加入20
‑
50重量份种子液混合均匀，在温度为28
‑
32℃、ph＝6.5
‑
7.0、60
‑
100rpm、通气比为0.5
‑
0.8v/v
·
m条件下发酵18
‑
24h，得到高密度的米曲霉菌液；再将高密度的米曲霉菌液置于温度40
‑
45℃、ph＝7.0
‑
7.5、100
‑
150rpm、通气比为1.0
‑
1.2v/v
·
m诱导产酶4
‑
6h，得到复合液体酶制剂；
10.s3：将棕榈粕粉碎，过20
‑
50目筛，取60
‑
120重量份粉碎后的棕榈粕，再加入20
‑
50重量份复合液体酶制剂混合均匀，在温度为45
‑
55℃条件下酶解5
‑
8h，得到酶解物料；
11.s4：将1
‑
5重量份蛋白胨、1
‑
5重量份酵母浸粉、5
‑
20重量份葡萄糖、8
‑
20重量份豆粕粉、10
‑
25重量份玉米粉、1
‑
4重量份磷酸氢二钾、2
‑
10重量份氯化钠、0.1
‑
2重量份硫酸镁、800
‑
1200重量份水混合，在常温、200
‑
400rpm下搅拌3
‑
6min，得混合液b，将混合液b置于100
‑
130℃下进行灭菌10
‑
30min，再接种发酵菌液，接种量为混合液b质量的0.5
‑
1wt％，在32
‑
40℃、40
‑
100rpm、ph＝6.0
‑
6.8的条件下培养30
‑
72h，在培养期间每隔60
‑
90min通空气一次，通气比为0.5
‑
0.8v/v
·
m，每次通气时间为10
‑
15min，得到复合菌液；
12.s5：取80
‑
150重量份的酶解物料、5
‑
20重量份复合菌液混合，在常温、400
‑
600rpm下搅拌10
‑
30min，再置于温度为30
‑
40℃下发酵3
‑
8d，发酵完后放置在50
‑
65℃的干燥机中干燥，得到预处理棕榈粕。
13.本发明的核心点之一是克服传统处理棕榈粕直接采用复合酶进行酶解或者直接将棕榈粕和发酵菌直接混合发酵，采用复合酶成本高，而且直接发酵导致棕榈粕中的营养物质利用率不高，本发明就是为了节约成本并且将棕榈粕中的营养物质提取出来，使得棕榈粕的营养价值利用率提高。
14.米曲霉是高效产复合酶的菌种，除蛋白酶外，还能产淀粉酶、甘露聚糖酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶、果胶酶等，而棕榈粕中主要含有15
‑
23％的粗纤维，而粗纤维又主要以不溶性的非纤维素多糖为主，占干物质的33.6％，这些物质的存在会阻碍米曲霉在棕榈粕生长繁殖，并且米曲霉只能在棕榈粕的表面上生长，很难进入到棕榈粕内部生长，这就极大限制了米曲霉产酶的效率，进而也降低了棕榈粕的营养物质的利用率。主要是因为米曲霉要增殖就必须通过分泌能够降解棕榈粕的酶系的方式利用棕榈粕中的营养物质进行生长。综合考虑这些因素，选择米曲霉菌株生产高效的液体复合酶，以棕榈粕作为主要的发酵营养底物，采用液体发酵的方式诱导分泌与棕榈粕降解相对应的酶系，该种方式获得的液体复合酶不仅酶活高，而且针对性强。
15.在棕榈粕生物处理工序中加入发酵激活剂，该发酵激活剂中的添加了一定比例的微量金属离子，添加的微量金属离子能够激活高效蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等多种酶复合酶中各种酶的活性，采用特定比例的金属离子组合能够促进酶对底物的催化反应，提高反应速率，实现底物的高效转化，棕榈粕中的粗蛋白经发酵形成小分子多肽和氨基酸，提高可吸收性蛋白的含量，更易被消化吸收；粗纤维能够转化为可溶性糖，提高物质利用率；此外，添加了紫薯提取物中含有丰富的花青素、花色苷、黄酮等多酚类功能性成分以及矿质元素，一方面可以丰富预处理棕榈粕的营养价值和提高保健功效，同时还能够降低棕榈粕的刺激性气味，进而提高诱食性，提高预处理棕榈粕的风味；另一方面，紫薯提取物能够在一定程度上提高发酵的效率。
16.优选的，棕榈粕原料生物预处理方法，由以下步骤组成：
17.s1：将2
‑
5重量份硝酸钠、0.5
‑
3重量份磷酸氢二钾、0.1
‑
1重量份七水硫酸镁、0.2
‑
2重量份氯化钾、0.01
‑
1重量份硫酸亚铁、15
‑
30重量份蔗糖、800
‑
1200重量份水混合，在常温、200
‑
500rpm下搅拌3
‑
8min，得混合液a，置于100
‑
130℃下进行灭菌10
‑
30min，再接种米曲霉，接种量为混合液a质量的0.05
‑
1wt％，在温度25
‑
32℃、100
‑
200rpm条件下培养16
‑
30h，得到种子液；
18.s2：将棕榈粕粉碎，过80
‑
140目筛，取150
‑
200重量份粉碎后的棕榈粕，加入5
‑
10重量份氯化钠、0.3
‑
0.5重量份硫酸镁、2
‑
3重量份磷酸二氢钾、800
‑
1200重量份水混合，置于100
‑
130℃下进行灭菌10
‑
30min，再加入20
‑
50重量份种子液混合均匀，在温度为28
‑
32℃、ph＝6.5
‑
7.0、60
‑
100rpm、通气比为0.5
‑
0.8v/v
·
m条件下发酵18
‑
24h，得到高密度的米曲霉菌液；再将高密度的米曲霉菌液置于温度40
‑
45℃、ph＝7.0
‑
7.5、100
‑
150rpm、通气比为1.0
‑
1.2v/v
·
m诱导产酶4
‑
6h，得到复合液体酶制剂；
19.s3：将棕榈粕粉碎，过20
‑
50目筛，取60
‑
120重量份粉碎后的棕榈粕，加入质量为棕榈粕的0.5
‑
4wt％发酵激活剂，再加入20
‑
50重量份复合液体酶制剂混合均匀，在温度为45
‑
55℃条件下酶解5
‑
8h，得到酶解物料；
20.s4：将1
‑
5重量份蛋白胨、1
‑
5重量份酵母浸粉、5
‑
20重量份葡萄糖、8
‑
20重量份豆粕粉、10
‑
25重量份玉米粉、1
‑
4重量份磷酸氢二钾、2
‑
10重量份氯化钠、0.1
‑
2重量份硫酸镁、800
‑
1200重量份水混合，在常温、200
‑
400rpm下搅拌3
‑
6min，得混合液b，将混合液b置于100
‑
130℃下进行灭菌10
‑
30min，再接种发酵菌液，接种量为混合液b质量的0.5
‑
1wt％，在32
‑
40℃、40
‑
100rpm、ph＝6.0
‑
6.8的条件下培养30
‑
72h，在培养期间每隔60
‑
90min通空气一次，通气比为0.5
‑
0.8v/v
·
m，每次通气时间为10
‑
15min，得到复合菌液；
21.s5：取80
‑
150重量份的酶解物料、5
‑
20重量份复合菌液混合，在常温、400
‑
600rpm下搅拌10
‑
30min，再置于温度为30
‑
40℃下发酵3
‑
8d，发酵完后放置在50
‑
65℃的干燥机中干燥，得到预处理棕榈粕。
22.所述发酵激活剂的制备方法如下：将15
‑
25重量份酵母培养物、1
‑
5重量份紫薯提取物、0.5
‑
3重量份甘露醇、0.5
‑
3重量份酪素、0.5
‑
3重量份液体石蜡、0.5
‑
3重量份聚山梨酯
‑
80、0.01
‑
0.1重量份微量元素混合，在300
‑
600rpm下常温搅拌10
‑
30min，得到发酵激活剂。
23.所述紫薯提取物的制备方法如下：s1、将紫薯洗净后去皮，切成厚度为2
‑
6mm的紫薯片，置于60
‑
80℃下干燥8
‑
16h，用粉碎机粉碎，过100
‑
200目筛，得到紫薯粉；
24.s2、取30
‑
60重量份上述紫薯粉，加入150
‑
300重量份ph＝2.5
‑
5的盐酸水溶液，在温度40
‑
60℃、200
‑
400rpm下提取1
‑
4h，过滤，得滤液a和滤渣a，向滤渣a中浓度为85
‑
95％(v/v)的乙醇水溶液，所述乙醇水溶液的质量为滤渣a质量的1
‑
3倍，在60
‑
70℃下提取6
‑
10h，过滤，得到滤液b；
25.s3合并滤液a和滤液b，置于经截留分子量为45
‑
60kda的超滤膜，在0.2
‑
0.6mpa下过滤，得滤液c，将滤液c置于30
‑
50℃下减压旋转蒸发浓缩3
‑
6h，将浓缩液置于50
‑
70℃下干燥8
‑
18h，得到紫薯提取物。
26.所述微量元素由马富酸亚铁、甘氨酸铜、乳酸锌、葡萄糖酸钙中一种或两种以上组成；优选的，所述微量元素由马富酸亚铁、甘氨酸铜、乳酸锌、葡萄糖酸钙按照质量比1:1:1:1组成的混合物。
27.本发明的核心点之二在于发酵过程中采用按照特定比例组成的特定菌液对棕榈
粕进行发酵，进一步提高棕榈粕的营养物质的利用率。迟缓芽孢杆菌是属于饲料添加剂目录允许使用的菌种之一，属于好氧发酵菌，主要用于产甘露聚糖酶，迟缓芽孢杆菌发酵产生的甘露聚糖酶能够降解棕榈粕中甘露聚糖为甘露寡糖，甘露寡糖属于功能性益生元，能够激活机体免疫力；而粪肠球菌能产生细菌素等抑菌物质，抑制大肠杆菌和沙门氏菌等病原菌的生长，改善肠道微环境，还能抑制肠道内产尿素酶细菌和腐败菌的繁殖，减少肠道尿素酶和内毒素的含量，使血液中氨和内毒素的含量下降，有利于机体健康；粘红酵母是海洋中自然存在的一种单细胞酵母品系，富含蛋白质、氨基酸、脂肪酸、类胡萝卜素、消化酶、维生素、核苷酸等，具有较高的营养价值和活性作用，通过选择粘红酵母发酵处理棕榈粕，不仅可以提高消化利用率，获得丰富的益生物质，而且可以改善棕榈粕的的感官颜色，提高其在饲料配方中的添加比例。
28.此外，采用三者同时使用进行发酵，在不影响菌种之间繁殖情况下，各自发挥每种菌的优势，同时采用三者菌进行发酵能够有效提高棕榈粕粗纤维的降解率，进而提高粗纤维酶解后的可溶性糖的利用率，还能够提高酸溶性蛋白的含量，提高棕榈粕的利用价值。
29.所述s4中发酵菌液为迟缓芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、粘红酵母菌液中的一种或两种以上；优选的，所述发酵菌液由迟缓芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、粘红酵母菌液三种混合液组成，所述迟缓芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、粘红酵母菌液按照质量比(1
‑
5)：(1
‑
3)：(1
‑
3)。
30.所述迟缓芽孢杆菌菌液的制备方法如下：将5
‑
12重量份蛋白胨、1
‑
6重量份酵母浸粉、1
‑
8重量份氯化钠、800
‑
1200重量份水混合均匀，调节ph为7.0
‑
7.5，得培养基a，在100
‑
130℃下进行灭菌10
‑
30min，接种迟缓芽孢杆菌，接种量为培养基a质量的0.3
‑
1wt％，在温度27
‑
35℃、80
‑
140rpm的摇床下培养15
‑
28h，得到迟缓芽孢杆菌菌液。
31.所述粪肠球菌菌液的制备方法如下：将5
‑
10重量份蛋白胨、15
‑
30重量份葡萄糖、2
‑
8重量份酵母浸粉、1
‑
6重量份乙酸钠、1重量份磷酸氢二钾、1重量份柠檬酸氢二胺、04重量份硫酸镁、0.1
‑
1重量份硫酸锰、800
‑
1200重量份水混合均匀，调节ph为6.0
‑
7.0，得培养基b，在100
‑
130℃下进行灭菌10
‑
30min，接种粪肠球菌，接种量为培养基b质量的0.3
‑
1wt％，在温度32
‑
37℃、80
‑
140rpm的摇床下培养28
‑
48h，得到粪肠球菌菌液。
32.所述粘红酵母菌液的制备方法如下：5
‑
12重量份蛋白胨、10
‑
25重量份葡萄糖、2
‑
7重量份酵母浸粉、0.05
‑
1重量份麦芽浸粉、800
‑
1200重量份水混合均匀，调节ph为5.0
‑
6.5，得培养基c，在100
‑
130℃下进行灭菌10
‑
30min，接种粘红酵母，接种量为培养基c质量的0.1
‑
1wt％，在温度28
‑
34℃、120
‑
160rpm的摇床下培养40
‑
72h，得到粘红酵母菌液。
33.本发明的有益效果：
34.1、本发明打破了传统采用复合酶进行处理棕榈粕，利用米曲霉能够产生蛋白酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶等，借助高效液体发酵的方式针对性获得大量能够降解棕榈粕的酶系，然后在发酵激活剂的辅助下，将酶系对以棕榈粕为主要原料的底物进行发酵前酶解预处理，使用液体发酵棕榈粕诱导产生的复合酶比直接添加复合酶降解效率更高，主要是通过此法获得的复合酶之间的组合更合理，对棕榈粕的处理具有针对性。经过酶解后的棕榈粕，一部分大分子物质已经被降解，基本能满足接种微生物营养的需求，不需要额外添加豆粕、玉米、麸皮等辅料。
35.2、本发明采用发酵激活剂中的微量金属元素能够激活复合酶中各种酶的活性，紫
薯提取物能够降低棕榈粕的刺激性气味，因此棕榈粕中营养物质的利用率及诱食性得到大幅度提高，另外，发酵增强剂也能够提高发酵的效率，缩短发酵时间，稳定发酵产品的质量。
36.3、本发明选择的菌种的菌株活力强，菌种之间具有协同共生关系，适应好氧、微好氧、厌氧的发酵各阶段环境，菌种活菌初始数量级高，发酵开始就能形成有益微生物的菌群优势，能有效抑制有害微生物的生长和繁殖，使棕榈粕发酵过程沿着有益微生物菌群的性能进行。发酵过程中能有效对棕榈粕中的粗蛋白质和粗纤维素等进行分解，促进物料营养性能的提高，并有助于微生物菌群的生长和繁殖，有力提高发酵功效。
37.4、本发明采用酶解与微生物发酵相结合对棕榈粕进行生物预处理后，大分子蛋白质、非淀粉多糖得到大幅度降解，获得大量易消化的氨基酸、小肽、多肽、寡糖等物质，并且微生物发酵产生了大量的维生素、有机酸、抗菌素等代谢产物，不仅全面提高了棕榈粕的营养价值、改善了棕榈粕气味，同时还增加了益生功效
具体实施方式
38.下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
39.本技术中部分原料的介绍：
40.实施例中棕榈粕，采用市售棕榈粕，购于临朐县华懋饲料有限公司。
41.实施例中蛋白胨购于湖北万业医药有限公司，含量：99％，食品级。
42.实施例中酵母浸粉购于西安沐森生物工程有限公司，含量：99％，食品级。
43.实施例中葡萄糖购于山东鑫旺博新材料有限公司，货号：01，食品级。
44.实施例中柠檬酸氢二胺购于成都万象宏润生物科技有限公司，货号：234679789，含量：99％，食品级。
45.实施例中乙酸钠购于江苏科伦多食品配料有限公司，含量：98.5％，食品级。
46.实施例中酪素购于郑州明瑞化工产品有限公司，含量：99％，食品级。
47.实施例中甘露醇购于西安沐森生物工程有限公司，含量：99％，食品级。
48.实施例中紫薯，采用市售紫薯，购于平邑县旺佳佳园艺场。
49.实施例中葡萄糖酸钙购于广东海升食品配料有限公司，含量：99％，食品级。
50.实施例中甘氨酸铜购于陕西润丰生物技术有限公司，货号：30635，含量：99％，食品级。
51.实施例中马富酸亚铁购于济南允诚生物科技有限公司，含量：99％，食品级。
52.实施例中乳酸锌购于河北吉捷生物科技有限公司，含量：99％，食品级。
53.实施例中聚山梨酯
‑
80购于惠州源乐生物科技有限公司，含量：99％，食品级。
54.实施例中液体石蜡购于东莞市中祥精细油品有限公司，型号：15#，食品级。
55.实施例中枯草芽孢杆菌购于，菌种编号：cicc 10071。
56.实施例中迟缓芽孢杆菌，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cicc 10365。
57.实施例中粘红酵母购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：cicc 31229。
58.实施例中粪肠球菌为通过筛选驯化获得的耐热菌株(申请号：
cn202010217211.6)，菌株保藏编号：rsfc001。
59.实施例1
60.一种棕榈粕原料生物预处理方法，由以下步骤组成：
61.s1：将3重量份硝酸钠、1重量份磷酸氢二钾、0.3重量份七水硫酸镁、0.3重量份氯化钾、0.01重量份硫酸亚铁、20重量份蔗糖、1000重量份蒸馏水混合，在常温、300rpm下搅拌5min，得混合液a，置于121℃下进行灭菌20min，再接种米曲霉，接种量为混合液a质量的0.06wt％，在温度28℃、150rpm条件下培养20h，得到种子液；
62.s2：将棕榈粕粉碎，过100目筛，取160重量份粉碎后的棕榈粕，加入8重量份氯化钠、0.4重量份硫酸镁、2.5重量份磷酸二氢钾、1000重量份蒸馏水混合，置于121℃下进行灭菌20min，再加入40重量份种子液混合均匀，在温度为30℃、ph＝6.8、80rpm、通气比为0.6v/v
·
m条件下发酵20h，得到高密度的米曲霉菌液；再将高密度的米曲霉菌液置于温度42℃、ph＝7.2、140rpm、通气比为1.1v/v
·
m诱导产酶5h，得到复合液体酶制剂；
63.s3：将棕榈粕粉碎，过40目筛，取100重量份粉碎后的棕榈粕，再加入40重量份复合液体酶制剂混合均匀，在温度为50℃条件下酶解6h，得到酶解物料；
64.s4：将2重量份蛋白胨、2重量份酵母浸粉、8重量份葡萄糖、10重量份豆粕粉、15重量份玉米粉、2重量份磷酸氢二钾、3重量份氯化钠、0.3重量份硫酸镁、1000重量份蒸馏水混合，在常温、300rpm下搅拌5min，得混合液b，将混合液b置于121℃下进行灭菌20min，再接种发酵菌液，接种量为混合液b质量的0.8wt％，在37℃、50rpm、ph＝6.2的条件下培养36h，在培养期间每隔60min通空气一次，通气比为0.6v/v
·
m，每次通气时间为12min，得到复合菌液；
65.s5：取90重量份的酶解物料、10重量份复合菌液混合，在常温、500rpm下搅拌20min，再置于温度为35℃下发酵5d，发酵完后放置在60℃的干燥机中干燥，得到预处理棕榈粕。
66.所述发酵菌液为迟缓芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、粘红酵母菌液按照质量比1:1:1组成混合物；
67.所述迟缓芽孢杆菌菌液的制备方法如下：将8重量份蛋白胨、3重量份酵母浸粉、3重量份氯化钠、1000重量份蒸馏水混合均匀，调节ph为7.5，得培养基a，在121℃下进行灭菌20min，接种迟缓芽孢杆菌，接种量为培养基a质量的0.5wt％，在温度30℃、100rpm的摇床下培养18h，得到迟缓芽孢杆菌菌液；
68.所述粪肠球菌菌液的制备方法如下：将8重量份蛋白胨、20重量份葡萄糖、5重量份酵母浸粉、3重量份乙酸钠、1重量份磷酸氢二钾、1重量份柠檬酸氢二胺、0.4重量份硫酸镁、0.2重量份硫酸锰、1000重量份蒸馏水混合均匀，调节ph为6.5，得培养基b，在121℃下进行灭菌20min，接种粪肠球菌，接种量为培养基b质量的0.5wt％，在温度35℃、100rpm的摇床下培养36h，得到粪肠球菌菌液；
69.所述粘红酵母菌液的制备方法如下：8重量份蛋白胨、15重量份葡萄糖、3重量份酵母浸粉、0.1重量份麦芽浸粉、1000重量份蒸馏水混合均匀，调节ph为5.5，得培养基c，在121℃下进行灭菌20min，接种粘红酵母，接种量为培养基c质量的0.2wt％，在温度30℃、140rpm的摇床下培养48h，得到粘红酵母菌液。
70.预处理后棕榈粕的有效活菌数为迟缓芽孢杆菌＝2.8
×
108cfu/g、粪肠球菌＝1.5
×
109cfu/g、粘红酵母菌＝1.0
×
108cfu/g。
71.实施例2
72.与实施例1基本相同，其区别仅在于所述发酵菌液为迟缓芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液按照质量比1:1组成混合物；
73.所述迟缓芽孢杆菌菌液的制备方法如下：将8重量份蛋白胨、3重量份酵母浸粉、3重量份氯化钠、1000重量份蒸馏水混合均匀，调节ph为7.5，得培养基a，在121℃下进行灭菌20min，接种迟缓芽孢杆菌，接种量为培养基a质量的0.5wt％，在温度30℃、100rpm的摇床下培养18h，得到迟缓芽孢杆菌菌液；
74.所述粪肠球菌菌液的制备方法如下：将8重量份蛋白胨、20重量份葡萄糖、5重量份酵母浸粉、3重量份乙酸钠、1重量份磷酸氢二钾、1重量份柠檬酸氢二胺、0.4重量份硫酸镁、0.2重量份硫酸锰、1000重量份蒸馏水混合均匀，调节ph为6.5，得培养基b，在121℃下进行灭菌20min，接种粪肠球菌，接种量为培养基b质量的0.5wt％，在温度35℃、100rpm的摇床下培养36h，得到粪肠球菌菌液。
75.实施例3
76.与实施例1基本相同，其区别仅在于所述发酵菌液为迟缓芽孢杆菌菌液、粘红酵母菌液按照质量比1:1组成混合物；
77.所述迟缓芽孢杆菌菌液的制备方法如下：将8重量份蛋白胨、3重量份酵母浸粉、3重量份氯化钠、1000重量份蒸馏水混合均匀，调节ph为7.5，得培养基a，在121℃下进行灭菌20min，接种迟缓芽孢杆菌，接种量为培养基a质量的0.5wt％，在温度30℃、100rpm的摇床下培养18h，得到迟缓芽孢杆菌菌液；
78.所述粘红酵母菌液的制备方法如下：8重量份蛋白胨、15重量份葡萄糖、3重量份酵母浸粉、0.1重量份麦芽浸粉、1000重量份蒸馏水混合均匀，调节ph为5.5，得培养基c，在121℃下进行灭菌20min，接种粘红酵母，接种量为培养基c质量的0.2wt％，在温度30℃、140rpm的摇床下培养48h，得到粘红酵母菌液。
79.实施例4
80.与实施例1基本相同，其区别仅在于所述发酵菌液为粪肠球菌菌液、粘红酵母菌液按照质量比1:1组成混合物；
81.所述粪肠球菌菌液的制备方法如下：将8重量份蛋白胨、20重量份葡萄糖、5重量份酵母浸粉、3重量份乙酸钠、1重量份磷酸氢二钾、1重量份柠檬酸氢二胺、0.4重量份硫酸镁、0.2重量份硫酸锰、1000重量份蒸馏水混合均匀，调节ph为6.5，得培养基b，在121℃下进行灭菌20min，接种粪肠球菌，接种量为培养基b质量的0.5wt％，在温度35℃、100rpm的摇床下培养36h，得到粪肠球菌菌液；
82.所述粘红酵母菌液的制备方法如下：8重量份蛋白胨、15重量份葡萄糖、3重量份酵母浸粉、0.1重量份麦芽浸粉、1000重量份蒸馏水混合均匀，调节ph为5.5，得培养基c，在121℃下进行灭菌20min，接种粘红酵母，接种量为培养基c质量的0.2wt％，在温度30℃、140rpm的摇床下培养48h，得到粘红酵母菌液。
83.对比例1
84.一种棕榈粕原料生物预处理方法，由以下步骤组成：
85.s1：将8重量份蛋白胨、3重量份酵母浸粉、0.3重量份氯化钾、0.01重量份硫酸亚
铁、1000重量份蒸馏水混合，在常温、300rpm下搅拌5min，得混合液a，置于121℃下进行灭菌20min，再接种枯草芽孢杆菌，接种量为混合液a质量的0.06wt％，在温度28℃、150rpm条件下培养20h，得到种子液；
86.s2：将棕榈粕粉碎，过100目筛，取160重量份粉碎后的棕榈粕，加入8重量份氯化钠、0.4重量份硫酸镁、2.5重量份磷酸二氢钾、1000重量份蒸馏水混合，置于121℃下进行灭菌20min，再加入40重量份种子液混合均匀，在温度为30℃、ph＝6.8、80rpm、通气比为0.6v/v
·
m条件下发酵20h，得到高密度的枯草芽孢杆菌菌液；再将高密度的枯草芽孢杆菌菌液置于温度42℃、ph＝7.2、140rpm、通气比为1.1v/v
·
m诱导产酶5h，得到复合液体酶制剂；
87.s3：将棕榈粕粉碎，过40目筛，取100重量份粉碎后的棕榈粕，再加入40重量份复合液体酶制剂混合均匀，在温度为50℃条件下酶解6h，得到酶解物料；
88.s4：将2重量份蛋白胨、2重量份酵母浸粉、8重量份葡萄糖、10重量份豆粕粉、15重量份玉米粉、2重量份磷酸氢二钾、3重量份氯化钠、0.3重量份硫酸镁、1000重量份蒸馏水混合，在常温、300rpm下搅拌5min，得混合液b，将混合液b置于121℃下进行灭菌20min，再接种发酵菌液，接种量为混合液b质量的0.8wt％，在37℃、50rpm、ph＝6.2的条件下培养36h，在培养期间每隔60min通空气一次，通气比为0.6v/v
·
m，每次通气时间为12min，得到复合菌液；
89.s5：取90重量份的酶解物料、10重量份复合菌液混合，在常温、500rpm下搅拌20min，再置于温度为35℃下发酵5d，发酵完后放置在60℃的干燥机中干燥，得到预处理棕榈粕。
90.所述发酵菌液为迟缓芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、粘红酵母菌液按照质量比1:1:1组成混合物；
91.所述迟缓芽孢杆菌菌液的制备方法如下：将8重量份蛋白胨、3重量份酵母浸粉、3重量份氯化钠、1000重量份蒸馏水混合均匀，调节ph为7.5，得培养基a，在121℃下进行灭菌20min，接种迟缓芽孢杆菌，接种量为培养基a质量的0.5wt％，在温度30℃、100rpm的摇床下培养18h，得到迟缓芽孢杆菌菌液；
92.所述粪肠球菌菌液的制备方法如下：将8重量份蛋白胨、20重量份葡萄糖、5重量份酵母浸粉、3重量份乙酸钠、1重量份磷酸氢二钾、1重量份柠檬酸氢二胺、0.4重量份硫酸镁、0.2重量份硫酸锰、1000重量份蒸馏水混合均匀，调节ph为6.5，得培养基b，在121℃下进行灭菌20min，接种粪肠球菌，接种量为培养基b质量的0.5wt％，在温度35℃、100rpm的摇床下培养36h，得到粪肠球菌菌液；
93.所述粘红酵母菌液的制备方法如下：8重量份蛋白胨、15重量份葡萄糖、3重量份酵母浸粉、0.1重量份麦芽浸粉、1000重量份蒸馏水混合均匀，调节ph为5.5，得培养基c，在121℃下进行灭菌20min，接种粘红酵母，接种量为培养基c质量的0.2wt％，在温度30℃、140rpm的摇床下培养48h，得到粘红酵母菌液。
94.测试例1
95.营养成分含量测定：棕榈粕处理前的粗纤维含量16.58％、粗蛋白含量为17.5％、酸溶蛋白含量5.41％、还原糖含量0.96％、总酸含量0.52％，处理后结果见表1。
96.1、ph测定：采用酸度计进行测试ph；
97.2、还原糖测定：采用dns法进行检测；
98.3、粗纤维测定：参考国家标准gb/t 6434
‑
2006《饲料中粗纤维的含量测定过滤法》中的测试方法对本发明实施例1
‑
4和对比例1处理前后的棕榈粕进行测定，平行测试5次，取平均值。
99.4、粗蛋白及酸溶蛋白测定：参考国家标准gb/t 6432
‑
2018《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》中的半微量法对本发明实施例1
‑
4和对比例1处理前后的棕榈粕进行测定，平行测试5次，取平均值。
100.表1营养成分含量测定
[0101][0102]
采用米曲霉酶解和发酵联合使用能够有效提高粗纤维的溶解，提高酸溶蛋白、还原糖和总酸的含量，此外，加入发酵激活剂的微量金属离子能够激活复合酶系中蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等多种酶的活性，采用特定比例的金属离子组合能够促进酶对底物的催化反应，提高反应速率，实现底物的高效转化，棕榈粕中的粗蛋白经发酵形成小分子多肽和氨基酸，提高可吸收性蛋白的含量，更易被消化吸收；粗纤维能够转化为可溶性糖，提高物质利用率。具体比较实施例1
‑
4和对比例1可知，采用枯草芽孢杆菌作为复合液体酶制剂的效果远不如采用米曲霉进行产酶的效果，原因是枯草芽孢杆菌在诱导下产酶量不如米曲霉高，导致最后棕榈粕降解效率不高；未采用米曲霉先进行酶解再发酵得到的酸溶蛋白和还原糖等营养物质的含量增加并不多；添加的发酵激活剂中的微量金属离子能够激活高效蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等多种酶复合酶中各种酶的活性，提高酶解效率；采用迟缓芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、粘红酵母菌液三者共同发酵能够进一步提高棕榈粕的降解效率。
[0103]
实施例5
[0104]
一种棕榈粕原料生物预处理方法，由以下步骤组成：
[0105]
s1：将3重量份硝酸钠、1重量份磷酸氢二钾、0.3重量份七水硫酸镁、0.3重量份氯化钾、0.01重量份硫酸亚铁、20重量份蔗糖、1000重量份蒸馏水混合，在常温、300rpm下搅拌5min，得混合液a，置于121℃下进行灭菌20min，再接种米曲霉，接种量为混合液a质量的
0.06wt％，在温度28℃、150rpm条件下培养20h，得到种子液；
[0106]
s2：将棕榈粕粉碎，过100目筛，取160重量份粉碎后的棕榈粕，加入8重量份氯化钠、0.4重量份硫酸镁、2.5重量份磷酸二氢钾、1000重量份蒸馏水混合，置于121℃下进行灭菌20min，再加入40重量份种子液混合均匀，在温度为30℃、ph＝6.8、80rpm、通气比为0.6v/v
·
m条件下发酵20h，得到高密度的米曲霉菌液；再将高密度的米曲霉菌液置于温度42℃、ph＝7.2、140rpm、通气比为1.1v/v
·
m诱导产酶5h，得到复合液体酶制剂；
[0107]
s3：将棕榈粕粉碎，过40目筛，取100重量份粉碎后的棕榈粕，加入质量为棕榈粕的3wt％发酵激活剂，再加入40重量份复合液体酶制剂混合均匀，在温度为50℃条件下酶解6h，得到酶解物料；
[0108]
s4：将2重量份蛋白胨、2重量份酵母浸粉、8重量份葡萄糖、10重量份豆粕粉、15重量份玉米粉、2重量份磷酸氢二钾、3重量份氯化钠、0.3重量份硫酸镁、1000重量份蒸馏水混合，在常温、300rpm下搅拌5min，得混合液b，将混合液b置于121℃下进行灭菌20min，再接种发酵菌液，接种量为混合液b质量的0.8wt％，在37℃、50rpm、ph＝6.2的条件下培养36h，在培养期间每隔60min通空气一次，通气比为0.6v/v
·
m，每次通气时间为12min，得到复合菌液；
[0109]
s5：取90重量份的酶解物料、10重量份复合菌液混合，在常温、500rpm下搅拌20min，再置于温度为35℃下发酵5d，发酵完后放置在60℃的干燥机中干燥，得到预处理棕榈粕。
[0110]
所述发酵菌液为迟缓芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、粘红酵母菌液按照质量比1:1:1组成混合物；
[0111]
所述迟缓芽孢杆菌菌液的制备方法如下：将8重量份蛋白胨、3重量份酵母浸粉、3重量份氯化钠、1000重量份蒸馏水混合均匀，调节ph为7.5，得培养基a，在121℃下进行灭菌20min，接种迟缓芽孢杆菌，接种量为培养基a质量的0.5wt％，在温度30℃、100rpm的摇床下培养18h，得到迟缓芽孢杆菌菌液；
[0112]
所述粪肠球菌菌液的制备方法如下：将8重量份蛋白胨、20重量份葡萄糖、5重量份酵母浸粉、3重量份乙酸钠、1重量份磷酸氢二钾、1重量份柠檬酸氢二胺、0.4重量份硫酸镁、0.2重量份硫酸锰、1000重量份蒸馏水混合均匀，调节ph为6.5，得培养基b，在121℃下进行灭菌20min，接种粪肠球菌，接种量为培养基b质量的0.5wt％，在温度35℃、100rpm的摇床下培养36h，得到粪肠球菌菌液；
[0113]
所述粘红酵母菌液的制备方法如下：8重量份蛋白胨、15重量份葡萄糖、3重量份酵母浸粉、0.1重量份麦芽浸粉、1000重量份蒸馏水混合均匀，调节ph为5.5，得培养基c，在121℃下进行灭菌20min，接种粘红酵母，接种量为培养基c质量的0.2wt％，在温度30℃、140rpm的摇床下培养48h，得到粘红酵母菌液。
[0114]
所述发酵激活剂的制备方法如下：将20重量份酵母培养物、1重量份甘露醇、1重量份酪素、1重量份液体石蜡、1重量份聚山梨酯
‑
80、0.02重量份马富酸亚铁、0.02重量份甘氨酸铜、0.02重量份乳酸锌、0.02重量份葡萄糖酸钙混合，在500rpm下常温搅拌15min，得到发酵激活剂。
[0115]
实施例6
[0116]
一种棕榈粕原料生物预处理方法，由以下步骤组成：
[0117]
s1：将3重量份硝酸钠、1重量份磷酸氢二钾、0.3重量份七水硫酸镁、0.3重量份氯化钾、0.01重量份硫酸亚铁、20重量份蔗糖、1000重量份蒸馏水混合，在常温、300rpm下搅拌5min，得混合液a，置于121℃下进行灭菌20min，再接种米曲霉，接种量为混合液a质量的0.06wt％，在温度28℃、150rpm条件下培养20h，得到液体种子液；
[0118]
s2：将棕榈粕粉碎，过100目筛，取160重量份粉碎后的棕榈粕，加入8重量份氯化钠、0.4重量份硫酸镁、2.5重量份磷酸二氢钾、1000重量份蒸馏水混合，置于121℃下进行灭菌20min，再加入40重量份种子液混合均匀，在温度为30℃、ph＝6.8、80rpm、通气比为0.6v/v
·
m条件下发酵20h，得到高密度的米曲霉菌液；再将高密度的米曲霉菌液置于温度42℃、ph＝7.2、140rpm、通气比为1.1v/v
·
m诱导产酶5h，得到复合液体酶制剂；
[0119]
s3：将棕榈粕粉碎，过40目筛，取100重量份粉碎后的棕榈粕，加入质量为棕榈粕的3wt％发酵激活剂，再加入40重量份复合液体酶制剂混合均匀，在温度为50℃条件下酶解6h，得到酶解物料；
[0120]
s4：将2重量份蛋白胨、2重量份酵母浸粉、8重量份葡萄糖、10重量份豆粕粉、15重量份玉米粉、2重量份磷酸氢二钾、3重量份氯化钠、0.3重量份硫酸镁、1000重量份蒸馏水混合，在常温、300rpm下搅拌5min，得混合液b，将混合液b置于121℃下进行灭菌20min，再接种发酵菌液，接种量为混合液b质量的0.8wt％，在37℃、50rpm、ph＝6.2的条件下培养36h，在培养期间每隔60min通空气一次，通气比为0.6v/v
·
m，每次通气时间为12min，得到复合菌液；
[0121]
s5：取90重量份的酶解物料、10重量份复合菌液混合，在常温、500rpm下搅拌20min，再置于温度为35℃下发酵5d，发酵完后放置在60℃的干燥机中干燥，得到预处理棕榈粕。
[0122]
所述发酵菌液为迟缓芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、粘红酵母菌液按照质量比1:1:1组成混合物；
[0123]
所述迟缓芽孢杆菌菌液的制备方法如下：将8重量份蛋白胨、3重量份酵母浸粉、3重量份氯化钠、1000重量份蒸馏水混合均匀，调节ph为7.5，得培养基a，在121℃下进行灭菌20min，接种迟缓芽孢杆菌，接种量为培养基a质量的0.5wt％，在温度30℃、100rpm的摇床下培养18h，得到迟缓芽孢杆菌菌液；
[0124]
所述粪肠球菌菌液的制备方法如下：将8重量份蛋白胨、20重量份葡萄糖、5重量份酵母浸粉、3重量份乙酸钠、1重量份磷酸氢二钾、1重量份柠檬酸氢二胺、0.4重量份硫酸镁、0.2重量份硫酸锰、1000重量份蒸馏水混合均匀，调节ph为6.5，得培养基b，在121℃下进行灭菌20min，接种粪肠球菌，接种量为培养基b质量的0.5wt％，在温度35℃、100rpm的摇床下培养36h，得到粪肠球菌菌液；
[0125]
所述粘红酵母菌液的制备方法如下：8重量份蛋白胨、15重量份葡萄糖、3重量份酵母浸粉、0.1重量份麦芽浸粉、1000重量份蒸馏水混合均匀，调节ph为5.5，得培养基c，在121℃下进行灭菌20min，接种粘红酵母，接种量为培养基c质量的0.2wt％，在温度30℃、140rpm的摇床下培养48h，得到粘红酵母菌液。
[0126]
所述发酵激活剂的制备方法如下：将20重量份酵母培养物、2重量份紫薯提取物、1重量份甘露醇、1重量份酪素、1重量份液体石蜡、1重量份聚山梨酯
‑
80、0.02重量份马富酸亚铁、0.02重量份甘氨酸铜、0.02重量份乳酸锌、0.02重量份葡萄糖酸钙混合，在500rpm下
常温搅拌15min，得到发酵激活剂。
[0127]
所述紫薯提取物的制备方法如下：s1、将紫薯洗净后去皮，切成厚度为5mm的紫薯片，置于70℃下干燥10h，用粉碎机粉碎，过150目筛，得到紫薯粉；
[0128]
s2、取50重量份上述紫薯粉，加入250重量份ph＝3的盐酸水溶液，在温度50℃、300rpm下提取2h，过滤，得滤液a和滤渣a，向滤渣a中加入滤渣a质量的90％乙醇水溶液，在65℃下提取8h，过滤，得到滤液b；
[0129]
s3合并滤液a和滤液b，置于经截留分子量为50kda的超滤膜，在0.4mpa下过滤，得滤液c，将滤液c置于40℃下减压旋转蒸发浓缩4h，将浓缩液置于60℃下干燥10h，得到紫薯提取物。
[0130]
对比例2
[0131]
与实施例6基本相同，其区别仅在于发酵激活剂制备中未添加0.02重量份马富酸亚铁、0.02重量份甘氨酸铜、0.02重量份乳酸锌、0.02重量份葡萄糖酸钙。
[0132]
所述发酵激活剂的制备方法如下：将20重量份酵母培养物、2重量份紫薯提取物、1重量份甘露醇、1重量份酪素、1重量份液体石蜡、1重量份聚山梨酯
‑
80混合，在500rpm下常温搅拌15min，得到发酵激活剂。
[0133]
所述紫薯提取物的制备方法如下：s1、将紫薯洗净后去皮，切成厚度为5mm的紫薯片，置于70℃下干燥10h，用粉碎机粉碎，过150目筛，得到紫薯粉；
[0134]
s2、取50重量份上述紫薯粉，加入250重量份ph＝3的盐酸水溶液，在温度50℃、300rpm下提取2h，过滤，得滤液a和滤渣a，向滤渣a中加入滤渣a质量的90％乙醇水溶液，在65℃下提取8h，过滤，得到滤液b；
[0135]
s3合并滤液a和滤液b，置于经截留分子量为50kda的超滤膜，在0.4mpa下过滤，得滤液c，将滤液c置于40℃下减压旋转蒸发浓缩4h，将浓缩液置于60℃下干燥10h，得到紫薯提取物。
[0136]
测试例2
[0137]
营养成分含量测定：棕榈粕处理前的粗纤维含量16.58％、粗蛋白含量为17.5％、酸溶蛋白含量5.41％、处理后结果见表2。
[0138]
1、粗纤维测定：参考国家标准gb/t 6434
‑
2006《饲料中粗纤维的含量测定过滤法》中的测试方法对本发明实施例5
‑
6和对比例2处理前后的棕榈粕进行测定，平行测试5次，取平均值。
[0139]
2、粗蛋白及酸溶蛋白测定：参考国家标准gb/t 6432
‑
2018《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》中的半微量法对本发明实施例5
‑
6和对比例2处理前后的棕榈粕进行测定，平行测试5次，取平均值。
[0140]
2、还原糖测定：发酵结束后采用dns法进行检测；平行测试5次，取平均值。
[0141]
表2营养成分含量测定
[0142]
[0143][0144]
从上述结果可知，在预处理棕榈粕的过程中添加发酵激活剂中的微量金属元素和聚山梨酯
‑
80能够进一步激活蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等多种酶活力，提高棕榈粕的酶解效率。
[0145]
测试例3
[0146]
预处理棕榈粕喂猪试验效果：
[0147]
试验设计：将360头平均体重在9.5kg的杜长大断奶仔猪随机分成9组，1个对照组和8个试验组，对照组直接饲喂基础日粮，试验组分别在基础日粮的基础上添加本发明的实施1
‑
6和对比例1
‑
2的生物预处理棕榈粕，添加比例为3％，营养水平是指代玉米和豆粕中营养物质含量的总和，预混料是由铜含量80mg/kg、铁含量120mg/kg、锌含量100mg/kg、锰含量60mg/kg、碘含量1mg/kg、维生素e含量80mg/kg、维生素k含量80mg/kg、维生素b1含量6mg/kg、生物素含量0.4mg/kg、胆碱含量80mg/kg组成；其他都按照正常的饲养与保健程序进行护理，试验周期为32天，试验过程中对平均日增重、平均日采食量、料肉比(f/g)、腹泻数等进行详细记录。表3为基础日粮的饲料成分组成及含量(单位：wt％)及表4的生长指标。
[0148]
表3：基础饲粮组成及营养水平(风干基础)
[0149][0150][0151]
表4猪的生长指标
[0152][0153]
从上述结果可知，本发明采用的处理方法得到的预处理棕榈粕可以按照3％的比例添加于全价料中，不仅有效降低生养猪的成本，同时还增加了日增重，降低了料肉比，另外，生物预处理过的棕榈粕具有益生功效，能够有效降低仔猪腹泻率。具体比较实施例1
‑
4和对比例1可知，未添加米曲霉进行酶解直接发酵得到的预处理棕榈粕用于饲喂猪的效果并不好，原因是营养物质利用效率非常低，棕榈粕表面具有大量的纤维素，没有酶解直接发酵难以降解成易消化利用的多糖、寡糖，导致猪的消化不好，生长效果不佳；采用的发酵菌液是迟缓芽孢杆菌菌液、粪肠球菌菌液、粘红酵母菌液按照质量比1:1:1组成混合物；同时采用三者菌进行发酵能够有效提高棕榈粕粗纤维的降解率，进而提高粗纤维酶解后的可溶性糖的利用率，还能够提高酸溶蛋白的含量，三者协同增效，提高棕榈粕的利用价值。比较实施例5
‑
6和对比例2，在预处理棕榈粕的过程中添加发酵激活剂中的微量金属元素和聚山梨酯
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80能够进一步激活蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等多种酶的活力，提高复合菌的发酵效率，添加紫薯提取物能够降低棕榈粕的刺激性，提高棕榈粕的风味，从而增加猪的采食量，进而提高猪的生长性能。