葡萄球菌属的生产阿洛酮糖的微生物和使用微生物制备阿洛酮糖的方法与流程

2021-10-26 19:09:00 来源：中国专利 TAG：

本申请涉及一种生产阿洛酮糖的微生物和一种用于使用微生物来制备阿洛酮糖的方法。

背景技术

D-阿洛酮糖是D-果糖的C3差向异构体并且是在自然中的存在量非常少的被认为是稀有糖的单糖。D-阿洛酮糖的甜度约为食糖的甜度的70％，但其热值几乎为零。D-阿洛酮糖具有抑制血糖水平升高、脂质合成等功能，并且因此它作为可用于功能性食物的新食物成分而受到许多关注。

由于这些特性，阿洛酮糖被考虑作为食糖的替代甜味剂用于各种食物。然而，阿洛酮糖在自然中的存在量非常小，并且因此越来越需要可以有效制造阿洛酮糖的方法。

作为常规已知的阿洛酮糖的生产方法，已知的化学方法是通过使用钼酸根离子的催化作用或通过用乙醇和三乙胺加热D-果糖来从D-果糖生产阿洛酮糖。这种化学方法具有缺点，诸如阿洛酮糖生产的产率低和制造成本高。

为了解决此类问题，已研究了用于使用来源于微生物的差向异构酶从果糖生产阿洛酮糖的生物方法。从用于使用具有来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的D-阿洛酮糖3-差向异构基因的基因修饰的微生物生产阿洛酮糖的技术开始，最近还报道了用于通过从自然环境或食物中分离出微生物菌株并且使用这些微生物菌株来从D-果糖生产阿洛酮糖的方法(韩国专利公开号10-2011-0035805、韩国专利公开号10-1804778、韩国专利公开号10-2017-0067070和韩国专利公开号10-2016-00817220)。已经开发了用于生产阿洛酮糖的生物技术，但因为用作生物催化剂的微生物的热稳定性低或生产成本高，所以迫切需要发掘新的可以生产阿洛酮糖的微生物资源。

在此背景下，作为开发即使在高温环境下也可生产阿洛酮糖的微生物的辛勤研究的结果，已经确认属于葡萄球菌(Staphylococcus)属的微生物可以生产阿洛酮糖，并且因此本申请已经完成。

技术实现要素：

技术问题

本申请提供了一种用于阿洛酮糖生产的组合物，其包含属于葡萄球菌属的微生物。

本申请提供了一种用于通过使用组合物来制备阿洛酮糖的方法。

技术方案

将如下详细描述技术方案。同时，本申请中所公开的每个描述和实施方案也可应用于其他描述和实施方案。即，本申请中所公开的各种元件的所有组合都落入本申请的范围内。此外，本申请的范围不受以下具体描述的限制。

本申请的一个方面可以提供一种用于阿洛酮糖生产的组合物，其包含属于葡萄球菌属的微生物或属于葡萄球菌属的微生物的培养物。

具体来说，属于葡萄球菌属的微生物可以是选自由以下组成的组中的任一种：阿涅蒂斯葡萄球菌(Staphylococcus agnetis)、骆驼葡萄球菌(Staphylococcus argensis)、银白色葡萄球菌(Staphylococcus argenteus)、阿尔莱特葡萄球菌(Staphylococcus arlettae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耳葡萄球菌(Staphylococcus auricularis)、头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、山羊葡萄球菌(Staphylococcus caprae)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、产色葡萄球菌(Staphylococcus chromogenes)、科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)、调料葡萄球菌(Staphylococcus condiment)、弯毛葡萄球菌(Staphylococcus cornubiensis)、海豚葡萄球菌(Staphylococcus delphini)、德氏葡萄球菌(Staphylococcus devriesei)、土壤葡萄球菌(Staphylococcus edaphicus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、马胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)、粪葡萄球菌(Staphylococcus faecalis)、猫葡萄球菌(Staphylococcus felis)、弗氏葡萄球菌(Staphylococcus fleurettii)、鸡葡萄球菌(Staphylococcus gallinarum)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、中间葡萄球菌(Staphylococcus intermedius)、克氏葡萄球菌(Staphylococcus kloosii)、leei葡萄球菌、缓慢葡萄球菌(Staphylococcus lentus)、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、卢特拉葡萄球菌(Staphylococcus lutrae)、lyticans葡萄球菌、马赛葡萄球菌(Staphylococcus massiliensis)、microti葡萄球菌(Staphylococcus microti)、苍蝇葡萄球菌(Staphylococcus muscae)、尼泊尔葡萄球菌(Staphylococcus nepalensis)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)、petrasii葡萄球菌、皮氏葡萄球菌(Staphylococcus pettenkoferi)、鱼发酵葡萄球菌(Staphylococcus piscifermentans)、假中间葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius)、假路邓葡萄球菌(Staphylococcus pseudolugdunensis)、rostri葡萄球菌、解糖葡萄球菌(Staphylococcus saccharolyticus)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、施氏葡萄球菌(Staphylococcus schleiferi)、施韦策葡萄球菌(Staphylococcus schweitzeri)、松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)、猿猴葡萄球菌(Staphylococcus simiae)、模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)、斯氏葡萄球菌(Staphylococcus stepanovicii)、琥珀葡萄球菌(Staphylococcus succinus)、小牛葡萄球菌(Staphylococcus vitulinus)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)和木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)，但不限于此。

属于葡萄球菌属的微生物可以更具体地是选自由以下组成的组中的任一种：肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、小牛葡萄球菌、表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、溶血葡萄球菌、中间葡萄球菌、腐生葡萄球菌、科氏葡萄球菌、苍蝇葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、产色葡萄球菌、山羊葡萄球菌、耳葡萄球菌、鸡葡萄球菌、阿尔莱特葡萄球菌、马胃葡萄球菌、克氏葡萄球菌、海豚葡萄球菌和巴氏葡萄球菌，更具体地是肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌或小牛葡萄球菌，但不限于此。

在本申请中，D-阿洛酮糖(下文称为阿洛酮糖)是D-果糖的差向异构体并且通过差向异构酶从果糖制备。在本申请中，D-阿洛酮糖(D-allulose)可与阿卢糖(psicose)互换使用。

在本申请中，用作底物的果糖可以从通过转化酶分解的糖或从高果糖玉米糖浆获得，或者可以作为商业产品购买，但不限于此。

本申请的属于葡萄球菌属的微生物具有将D-果糖转化为D-阿洛酮糖的活性。属于葡萄球菌属的微生物通过使用其代谢系统来从D-果糖生产D-阿洛酮糖。这种转化反应可以在微生物内或者通过分泌的物质在微生物外进行，但只要属于葡萄球菌属的微生物是可从果糖生产阿洛酮糖的属于葡萄球菌属的微生物，它就落在本申请的范围内，而不受阿洛酮糖生产过程的限制。

同时，本申请的属于葡萄球菌属的微生物不仅可以指野生型微生物，还可以指包括自然或非自然发生的突变的突变型微生物。具体来说，非自然发生的突变可能是使用紫外线辐照、辐射(伽马射线、X射线)或化学诱变剂使野生型微生物或自然突变的微生物发生突变。属于葡萄球菌属的微生物只要具有能够从果糖生产阿洛酮糖的属于葡萄球菌属的微生物的特性，其就落在本申请的范围内，即使微生物的遗传性状与属于葡萄球菌属的野生型微生物的遗传性状不同。

本申请的属于葡萄球菌属的微生物表现出耐热性，因此即使在高温环境下，例如在50℃或更高的温度下，也能够生产阿洛酮糖，并且因此具有增加阿洛酮糖生产的产率的优势。

本申请的属于葡萄球菌属的微生物表现出将果糖转化为阿洛酮糖的活性，并且只要属于葡萄球菌属的微生物具有可在工业上使用的阿洛酮糖转化率，就可以落在本申请的范围内。

在本申请中，转化率可以表述为反应12小时产生的阿洛酮糖浓度/初始果糖浓度(1重量％)，并且本申请的属于葡萄球菌属的微生物的转化率可以为0.1％或更多，具体地0.3％或更多、0.5％或更多、0.9％或更多、1.6％或更多、2.3％或更多、3.4％或更多、5.3％或更多、10.4％或更多或24.5％或更多，但转化率不限于此。

在本申请中，转化率可以通过本领域已知的方法来测量，并且方法不限于具体方法。例如，在本申请中，在pH 7.5和55℃下进行12小时的转化成阿洛酮糖的反应的结果被测量为转化率，但反应条件(例如，pH、温度、时间等)可由本领域的技术人员适当地选择以测量转化率。

特别地，已知属于葡萄球菌属的微生物不具有病原性，并且因此具有能够用于各种食物的优势。

因此，本申请的属于葡萄球菌属的微生物可以是非病原的，但不限于此。具体来说，称为非病原微生物的属于葡萄球菌属的微生物可以是骆驼葡萄球菌、头状葡萄球菌、德氏葡萄球菌、粪葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、人葡萄球菌、路邓葡萄球菌、microti葡萄球菌、鱼发酵葡萄球菌、施韦策葡萄球菌、模仿葡萄球菌、琥珀葡萄球菌、阿尔莱特葡萄球菌、耳葡萄球菌、山羊葡萄球菌、肉葡萄球菌、产色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、海豚葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、中间葡萄球菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、苍蝇葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、腐生葡萄球菌、小牛葡萄球菌、沃氏葡萄球菌或木糖葡萄球菌，但不限于此。

在本申请中，非病原微生物是指不给包括人在内的个体带来疾病症状的微生物，并且是指对应于国际公认的生物安全1级的安全菌株。具体来说，非病原微生物意指除了在属于葡萄球菌属的微生物中对应于生物安全2级或更高级的阿涅蒂斯葡萄球菌、银白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、弯毛葡萄球菌、猫葡萄球菌、弗氏葡萄球菌、猪葡萄球菌、卢特拉葡萄球菌、马赛葡萄球菌、尼泊尔葡萄球菌、petrasii葡萄球菌、皮氏葡萄球菌、假中间葡萄球菌、rostri葡萄球菌、施氏葡萄球菌、猿猴葡萄球菌和斯氏葡萄球菌菌株的所有菌株。

本申请的属于葡萄球菌属的非病原微生物不对包括人的个体产生不利影响，同时具有生产阿洛酮糖的能力。

在本申请中，已经确认属于葡萄球菌属的各种微生物，特别是非病原微生物，不仅具有将果糖转化为阿洛酮糖的活性，而且通过对微生物的16S rRNA的分析，它们之间具有遗传关联性。

在本申请中，“16S rRNA”是指16S核糖体RNA，即原核生物核糖体的30S亚单位的rRNA组分，其长度为约1,500个核苷酸。已知16S rRNA序列是通常用于鉴定原核生物的序列，因为16S rRNA序列是最高度保守的，同时在一些部分中表现出高碱基序列多样性，特别是多样性很少出现在同一物种中，而多样性出现在不同物种之间。换句话说，可以通过比较16S rRNA序列的同源性来确定遗传关联性。可以理解，随着16S rRNA序列的同源性(相似性)越来越高，原核生物的遗传性状也越来越相似。在本申请中，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定碱基序列彼此相关的程度，并且可以表述为百分比。

术语同源性和同一性常常可互换使用。

保守的多核苷酸序列同源性或同一性是通过标准的序列比对算法来确定的，并且所使用的程序所建立的默认空位罚分可以一起使用。实质上，在中等或高度严格的条件下，同源或相同序列能够大体上与全序列或与全长的至少约50％、60％、70％、80％或90％或更多杂交。在杂交中，还可以想到在多核苷酸中含有简并密码子而不是密码子的多核苷酸。

可以例如使用如Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444中的默认参数和已知的计算机算法诸如“FASTA”程序来确定任何两个多核苷酸序列是否具有同源性、相似性或同一性。另选地，可以使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定任何两个多核苷酸序列是否具有同源性、相似性或同一性，如在EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277)(5.0.0或后续版本)的Needleman程序中所执行的。还包括了GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research 12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.等人,J MOLEC BIOL 215:403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop编,Academic Press,San Diego,1994；以及CARILLO等人(1988)SIAM J Applied Math 48:1073)。例如，国家生物技术信息中心的BLAST、Clustal omega程序(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)或ClustalW可被用来确定同源性、相似性或同一性。

多核苷酸的同源性、相似性或同一性可以通过比较其序列信息来确定，例如使用GAP计算机程序诸如Needlema等人(1970),J Mol Biol.48:443进行，例如，如Smith和Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中所已知。简而言之，多核苷酸的同源性、相似性或同一性被定义为通过GAP程序将两个序列中较短序列中的符号(即，核苷酸或氨基酸)的总数除以类似比对符号的数目所获得的值。GAP程序的默认参数可包括：(1)一进制记数系统(unary numeral system)比较矩阵(包含对于同一性为1且对于非同一性为0的值)和Gribskov等人,(1986)Nucl.Acids Res.14:6745(或EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵)的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff编,Atlas Of Protein Sequence And Structure,National Biomedical Research Foundation,第353-358页(1979)中所公开；(2)每个空位的罚分为3.0并且对于每个空位的每个符号的额外罚分0.10(或空位开放罚分为10，空位延伸罚分为0.5)；以及(3)末端空位没有罚分。因此，如在本申请中所用，术语“同源性”或“同一性”是指序列之间的相关性。

本申请的用于阿洛酮糖生产的组合物可包含一种、两种或更多属于葡萄球菌属的微生物或其培养物，但不限于此。

本申请的用于阿洛酮糖生产的组合物包含表现出将果糖转化为阿洛酮糖的活性的属于葡萄球菌属的微生物或其培养物并且因此可以生产阿洛酮糖。

在本申请中，“培养”是指在适当的人工控制环境条件下使微生物生长，并且“培养物”是指通过培养微生物所获得的产物并且可以包含微生物或微生物分泌的所有物质。

在本申请中，属于葡萄球菌属的微生物的培养可以通过本领域广泛已知的方法进行。具体来说，培养可以在批量、批量注入或重复批量注入过程中以分批、连续或分批进料的方式进行，但不限于此。

用于培养的培养基必须以适当的方式满足特定菌株的要求，并且培养属于葡萄球菌属的微生物的培养基条件是已知的。

具体来说，可用于培养基的糖源包括：糖和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，如大豆油、葵花籽油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇，如甘油和乙醇；以及有机酸，如乙酸。这些物质可以单独使用或作为混合物使用，但使用糖源的方式不限于此。

可以使用的碳源可以是原糖或葡萄糖、含有大量原糖的糖蜜和特别纯化的葡萄糖，但不限于此，并且可以以各种方式使用其他碳源。

可使用的氮源包括蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浆、豆粕和尿素或无机化合物，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源也可以单独使用或作为混合物使用，但使用氮源的方式不限于此。

可以使用的磷源可以包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。

培养基可含有生长所需的金属盐，如硫酸镁或硫酸亚铁。除了这些物质之外，可以使用必要的生长物质，如氨基酸和维生素。可以使用适合于培养基的前体。上述原材料可以在培养过程期间以适合于培养物的方式分批或连续加入。

在培养微生物期间可以使用碱性化合物(如氢氧化钠、氢氧化钾和氨)或酸性化合物(如磷酸或硫酸)以适当的方式调整培养物的pH。可以使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制起泡。可以将氧气或含氧气体(例如，空气)注入到培养物中以维持有氧状态。

本申请的用于阿洛酮糖生产的组合物除了属于葡萄球菌属的微生物或微生物的培养物外，可以还包含果糖，其是参与阿洛酮糖生产的底物和/或酶，但不限于此。

本申请的用于阿洛酮糖生产的组合物可以还含有任意合适的赋形剂，其通常在用于阿洛酮糖生产的组合物中使用。此类赋形剂可包括例如防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂，但不限于此。

本申请的用于阿洛酮糖生产的组合物可还含有金属离子或金属盐。由于金属离子或金属盐包含在本申请的用于阿洛酮糖生产的组合物中，所以组合物可以表现出将果糖转化为阿洛酮糖的活性。金属离子或金属盐可能是通过属于葡萄球菌属的微生物从果糖生产阿洛酮糖的过程中所需的，例如，它可能是介导转换过程的酶的作用所需的，但不限于此。至于本申请的用于阿洛酮糖生产的组合物中所含的金属离子或金属盐，可以适当地选择本领域技术人员已知的金属离子或金属盐，只要组合物可表现出将果糖转化为阿洛酮糖的活性即可。在一个实施方案中，金属离子可以是二价阳离子，具体来说，选自由Ni、Mg、Ni、Co、Mn、Fe和Zn组成的组的一种或多种金属的离子。更具体地，本申请的用于阿洛酮糖生产的组合物可以还含有金属盐。更具体地，金属盐可以是选自由以下组成的组的一种或多种：NiSO4、MgSO4、MgCl2、NiCl2、CoSO4、CoCl2、MnCl2、MnSO4、FeSO4和ZnSO4。

本申请的另一个方面可以提供属于葡萄球菌属的微生物或属于葡萄球菌属的微生物的培养物用于阿洛酮糖生产的用途。

“属于葡萄球菌属的微生物”和“属于葡萄球菌属的微生物的培养物”如上所述。

本申请的另一个方面还提供一种用于制备阿洛酮糖的方法，其包括将组合物与果糖接触以将果糖转化为阿洛酮糖。

具体来说，属于葡萄球菌属的微生物可以是选自以下组成的组的任一种：阿涅蒂斯葡萄球菌、骆驼葡萄球菌、银白色葡萄球菌、阿尔莱特葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、耳葡萄球菌、头状葡萄球菌、山羊葡萄球菌、肉葡萄球菌、产色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、调料葡萄球菌、弯毛葡萄球菌、海豚葡萄球菌、德氏葡萄球菌、土壤葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、粪葡萄球菌、猫葡萄球菌、弗氏葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、猪葡萄球菌、中间葡萄球菌、克氏葡萄球菌、leei葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、路邓葡萄球菌、卢特拉葡萄球菌、lyticans葡萄球菌、马赛葡萄球菌、microti葡萄球菌、苍蝇葡萄球菌、尼泊尔葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、petrasii葡萄球菌、皮氏葡萄球菌、鱼发酵葡萄球菌、假中间葡萄球菌、假路邓葡萄球菌、rostri葡萄球菌、解糖葡萄球菌、腐生葡萄球菌、施氏葡萄球菌、施韦策葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、猿猴葡萄球菌、模仿葡萄球菌、斯氏葡萄球菌、琥珀葡萄球菌、小牛葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌，但不限于此。

属于葡萄球菌属的微生物可以更具体地是选自由以下组成的组的任一种：肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌、小牛葡萄球菌、表皮葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、溶血葡萄球菌、中间葡萄球菌、腐生葡萄球菌、科氏葡萄球菌、苍蝇葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、产色葡萄球菌、山羊葡萄球菌、耳葡萄球菌、鸡葡萄球菌、阿尔莱特葡萄球菌、马胃葡萄球菌、克氏葡萄球菌、海豚葡萄球菌和巴氏葡萄球菌，更具体地是肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌或小牛葡萄球菌，但不限于此。

本申请的制备方法可以另外包括从糖和葡萄糖获得果糖，但不限于此。用于从糖和葡萄糖获得果糖的方法，特别是使用酶的生产方法，在本领域是已知的。

本申请的制备方法具有污染物排放较少和产率增加的优势，因为通过这种制备方法，即使在高温环境下也可将果糖转化为阿洛酮糖。

具体来说，将果糖转化为阿洛酮糖时的温度可以是40℃至70℃，具体地50℃至70℃。培养可以连续进行，直到产生所需量的阿洛酮糖，并且培养时间可以具体地为5至120小时，更具体地10至30小时，但不限于此。在本申请的制备方法中，果糖向阿洛酮糖的转化可以在5.0至9.0的pH，具体地6.0至8.0的pH下进行。

本申请的制备方法可还包括回收由属于葡萄球菌属的微生物转化的阿洛酮糖，但不限于此。

具体来说，可以通过压碎属于葡萄球菌属的微生物来回收阿洛酮糖，或者可以从属于葡萄球菌属的微生物的培养物中分离出阿洛酮糖，但回收方法不限于具体方法，只要可回收通过属于葡萄球菌属的微生物转化的阿洛酮糖即可。

阿洛酮糖的分离可以通过本领域已知的常规方法进行。作为这种分离方法，可以使用诸如离心、过滤、离子交换色谱法和结晶的方法。例如，可将培养物低速离心以除去生物质，并且可以对获得的上清液进行离子交换色谱法以分离出阿洛酮糖，但分离方法不限于此。

本申请的制备方法可还包括提纯阿洛酮糖，但不限于此。纯化可以通过常规使用的方法进行，并且其非限制性实例可以包括渗析、沉淀、吸附、电泳、离子交换色谱法和分馏结晶。纯化可以通过仅一种方法或两种或多种方法的组合来进行。例如，可以通过色谱法对产生了阿洛酮糖的反应混合物进行纯化，并且通过色谱法分离糖可以使用待分离的糖与附着至离子交换树脂的金属离子之间的弱结合强度的差异来进行。

本申请的制备方法可还包括在本申请的阿洛酮糖纯化步骤之前或之后进行脱色或脱盐或脱色和脱盐两者。通过进行脱色和/或脱盐，可以获得含有阿洛酮糖而无杂质的更纯的反应混合物。

有益效果

本申请的属于葡萄球菌属的微生物具有即使在高温环境下也生产阿洛酮糖的效果。

附图说明

图1为确认由海豚葡萄球菌KCTC3592生产阿洛酮糖的图；

图2为说明非病原葡萄球菌菌株的系统树的图；并且

图3为说明20种非病原葡萄球菌菌株的系统树的图。

具体实施方式

进行本发明的最佳模式将如下详细描述。同时，本申请中所公开的每个描述和实施方案也可应用于其他描述和实施方案。即，本申请中公开的各种元件的所有组合都落在本申请的范围内。此外，本申请的范围不受以下具体描述的限制。

为了实现上述目标，本申请提供一种用于阿洛酮糖生产的组合物，其包含属于葡萄球菌属的微生物或属于葡萄球菌属的微生物的培养物。

实施例

下面，将参照实施例更详细地描述本申请。然而，这些实施例仅为了进行示意性的说明，并且本申请的范围不限于这些实施例。

实施例1：由属于葡萄球菌属的微生物生产阿洛酮糖的确认

为了确认属于葡萄球菌属的微生物生产阿洛酮糖的能力，选择了32种属于葡萄球菌属的非病原微生物，并确认其中20种属于葡萄球菌属的微生物是否从D-果糖生产阿洛酮糖。

具体来说，肉葡萄球菌的2个种(KCTC3580、KACC13250)、木糖葡萄球菌的2个种(KCTC3342、KACC16180)、小牛葡萄球菌的4个种(KACC15803、KACC15804、KACC15805、KACC13211)、海豚葡萄球菌(KCTC3592)、马胃葡萄球菌(KCTC3589)、表皮葡萄球菌(KCTC1917)、科氏葡萄球菌(KCTC3574)、产色葡萄球菌(KCTC3579)、山羊葡萄球菌(KCTC3583)、沃氏葡萄球菌(KCTC3340)、缓慢葡萄球菌(KCTC3577)、苍蝇葡萄球菌(KCTC3576)、腐生葡萄球菌(KCTC3345)、巴氏葡萄球菌(KCTC13167)、中间葡萄球菌(KCTC3344)、阿尔莱特葡萄球菌(KCTC3588)、克氏葡萄球菌(KCTC3590)、溶血葡萄球菌(KCTC3341)、鸡葡萄球菌(KCTC3585)和耳葡萄球菌(KCTC3584)分配自韩国菌种保藏中心(KTCT)和韩国农业微生物菌种保藏中心(KACC)。

将每种微生物接种到胰酶大豆肉汤(蛋白胨17g/L、大豆胨3g/L、阿卢糖10g/L、NaCl 5g/L、K2HPO4 2.5g/L、琼脂15g/L)中，其中加入1％的阿洛酮糖，并且在30℃或37℃下培养18小时。此后，将培养的微生物回收，用0.85％(重量/体积)NaCl洗涤，然后用于进行全细胞转化反应。

向浓度为20％(重量/重量)的微生物中加入50mM磷酸二氢钾缓冲液(pH7.5)，其中加入1％(重量/重量)的D-果糖并将其悬浮，并且在55℃下对悬浮液进行12小时的转化反应。

对转化反应产物的上清液进行HPLC分析，以确认阿洛酮糖的生产。HPLC分析使用水作为流动相溶剂并且使用配备有Aminex HPX-87C柱(BIO-RAD)的HPLC(Agilent，USA)的折射率检测器(Agilent 1260RID)，在温度80℃并且流速0.6mL/min下进行。将阿洛糖转化率计算为反应后产生的阿洛酮糖的重量与反应前的底物(D-果糖)的重量之比(阿洛酮糖浓度(12小时反应)/初始果糖浓度(1重量％))。

因此，确认了20种属于葡萄球菌属的微生物全部都从D-果糖生产阿洛酮糖(表1和图1)。

[表1]

实施例2：属于葡萄球菌属的微生物的16S rRNA相似性的确认

实施例2-1：属于葡萄球菌属的非病原微生物的16S rRNA相似性的确认

本实施例中归类为属于葡萄球菌属的非病原(生物安全1级)微生物的微生物为如下：骆驼葡萄球菌、头状葡萄球菌、德氏葡萄球菌、粪葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、人葡萄球菌、路邓葡萄球菌、microti葡萄球菌、鱼发酵葡萄球菌、施韦策葡萄球菌、模仿葡萄球菌、琥珀葡萄球菌、阿尔莱特葡萄球菌、耳葡萄球菌、山羊葡萄球菌、肉葡萄球菌、产色葡萄球菌、科氏葡萄球菌、海豚葡萄球菌、表皮葡萄球菌、马胃葡萄球菌、鸡葡萄球菌、溶血葡萄球菌、中间葡萄球菌、克氏葡萄球菌、缓慢葡萄球菌、苍蝇葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、腐生葡萄球菌、小牛葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和木糖葡萄球菌。

基于除粪葡萄球菌(其16s rRNA序列未被鉴定)之外的属于葡萄球菌属的非病原微生物中31种微生物的16s rRNA序列，使用Clustal omega程序(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)分析了菌株之间的序列同源性。从NCBI数据库确认相应菌株的代表性16s rRNA序列。

因此，确认了在所有情况下，在菌株之间，被认为是非病原微生物的属于葡萄球菌属的微生物的16s rRNA序列的同源性为92.78％或更多(图2)。属于葡萄球菌属的31种微生物的同源性在大多数情况下为95％或更多，并且在骆驼葡萄球菌的情况下同源性为92.78％至95.21％。

此结果支持了归类为非病原微生物的属于葡萄球菌属的微生物全部都具有高度遗传关联性。

实施例2-2：20种属于葡萄球菌属的非病原微生物的16S rRNA相似性的确认

基于属于葡萄球菌属的20种微生物(上文实施例1中确认了其生产阿洛酮糖的能力)的16s rRNA序列，使用Clustal omega程序(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)分析了序列同源性。经由NCBI数据库确认相应菌株的代表性16s rRNA序列。

因此，已经确认了属于葡萄球菌属的20种微生物(已确认了其生产阿洛酮糖的能力)的16s rRNA序列的同源性为95.97％或更多。

从上文实施例中，已经确认了属于葡萄球菌属的非病原微生物在物种之间全部都具有高度遗传关联性，并且具有这种高度遗传关联性的属于葡萄球菌属的微生物表现出从果糖产生阿洛酮糖的活性。

基于以上描述，本领域技术人员将理解，本公开可以在不改变其技术精神或基本特征的情况下以不同的具体形式实施。因此，应当理解，上文实施方案不是限制性的，而是在所有方面中是说明性的。本公开的范围是由所附权利要求书而不是其前面的描述所限定的，并且因此，所有落在权利要求书的边界或界限或此类边界或界限的等效物内的所有改变和修改都旨在由权利要求书所涵盖。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 葡萄球菌属的生产阿洛酮糖的微生物和使用微生物制备阿洛酮糖的方法

<130> OPA20030-PCT

<150> KR 10-2019-0026633

<151> 2019-03-08

<160> 31

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1477

<212> RNA

<213> 鸡葡萄球菌

<400> 1

aggatgaacg ctggcggcgt gcctaataca tgcaagtcga gcgaacagat aaggagcttg 60

ctcctttgac gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctacc tataagactg 120

gaataactcc gggaaaccgg ggctaatgcc ggataacata tagaaccgca tggttctata 180

gtgaaagatg gttttgctat cacttataga tggacccgcg ccgtattagc tagttggtaa 240

ggtaatggct taccaaggcg acgatacgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg 300

gaactgagac acggtccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatggg 360

cgaaagcctg acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggg tttcggctcg taaaactctg 420

ttattaggga agaacatatg tgtaagtaac tgtgcacatc ttgacggtac ctaatcagaa 480

agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg 540

aattattggg cgtaaagcgc gcgtaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccacggc 600

tcaaccgtgg agggtcattg gaaactggga aacttgagtg cagaagagga aagtggaatt 660

ccatgtgtag cggtgaaatg cgcagagata tggaggaaca ccagtggcga aggcgacttt 720

ctggtctgta actgacgctg atgtgcgaaa gcgtggggat caaacaggat tagataccct 780

ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct 840

gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga aactcaaagg 900

aattgacggg gacccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga 960

accttaccaa atcttgacat cctttgacca ctctagagat agagctttcc ccttcggggg 1020

acaaagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1080

cccgcaacga gcgcaaccct taagcttagt tgccatcatt aagttgggca ctctaggttg 1140

actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1200

tttgggctac acacgtgcta caatggacaa tacaaagggc agctaaaccg cgaggtcatg 1260

caaatcccat aaagttgttc tcagttcgga ttgtagtctg caactcgact acatgaagct 1320

ggaatcgcta gtaatcgtag atcagcatgc tacggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca 1380

caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagc cggtggagta accatttatg 1440

gagctagccg tcgaaggtgg gacaaatgat tggggtg 1477

<210> 2

<211> 1493

<212> RNA

<213> 海豚葡萄球菌

<400> 2

agagtttgat cctggctcag tatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60

gaacagataa ggagcttgct cctttgacgt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt 120

aacctaccta taagactgga ataactccgg gaaaccgggg ctaatgccgg ataacatgtt 180

gaaccgcatg gttctacagt gaaagacggt cttgctgtca cttatagatg gacccgcgcc 240

gtattagcta gttggtgggg taacggccta ccaaggcgac gatacgtagc cgacctgaga 300

gggtgatcgg ccacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtag 360

ggaatcttcc gcaatgggcg aaagcctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggtct 420

tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaaatgtg taagtaactg tgcacatctt 480

gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 540

gtggcaagcg ttatccggaa ttattgggcg taaagcgcgc gtaggcggtt ttttaagtct 600

gatgtgaaag cccacggctc aaccgtggag ggtcattgga aactggaaaa cttgagtgca 660

gaagaggaaa gtggaattcc atgtgtagcg gtgaaatgcg cagagatatg gaggaacacc 720

agtggcgaag gcggctttct ggtctgcaac tgacgctgat gtgcgaaagc gtggggatca 780

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg 840

tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc 900

aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacgggga cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960

ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaaat cttgacatcc tttgacaact ctagagatag 1020

agctttcctc ttcggaggac aaagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1080

tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg aacttagttg ccatcattaa 1140

gttgggcact ctaagttgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa 1200

tcatcatgcc ccttatgatt tgggctacac acgtgctaca atggacaata caaagggcag 1260

cgaaaccgcg aggtcaagca aatcccataa agttgttctc agttcggatt gtagtctgca 1320

actcgactac atgaagctgg aatcgctagt aatcgtagat cagcatgcta cggtgaatac 1380

gttcccgggt cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca cccgaagccg 1440

gtggagtaac cattttggag ctagccgtcg aaggtgggac aaatgattgg ggt 1493

<210> 3

<211> 1470

<212> RNA

<213> 沃氏葡萄球菌

<400> 3

gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc gaacagataa ggagcttgct 60

cctttgacgt tagcggcgga cgggtgagta acacgtggat aacctaccta taagactggg 120

ataacttcgg gaaaccggag ctaataccgg ataacatatt gaaccgcatg gttcaatagt 180

gaaaggcggc tttgctgtca cttatagatg gatccgcgcc gtattagcta gttggtaagg 240

taacggctta ccaaggcaac gatacgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactgga 300

actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatgggcg 360

aaagcctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggtct tcggatcgta aaactctgtt 420

atcagggaag aacaaatgtg taagtaactg tgcacatctt gacggtacct gatcagaaag 480

ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttatccggaa 540

ttattgggcg taaagcgcgc gtaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag cccacggctc 600

aaccgtggag ggtcattgga aactggaaaa cttgagtgca gaagaggaaa gtggaattcc 660

atgtgtagcg gtgaaatgcg cagagatatg gaggaacacc agtggcgaag gcgactttct 720

ggtctgtaac tgacgctgat gtgcgaaagc gtggggatca aacaggatta gataccctgg 780

tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc 840

agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa 900

ttgacgggga cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960

cttaccaaat cttgacatcc tttgaccgct ctagagatag agtcttcccc ttcgggggac 1020

aaagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 1080

cgcaacgagc gcaaccctta agcttagttg ccatcattaa gttgggcact ctaagttgac 1140

tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgatt 1200

tgggctacac acgtgctaca atggacaata caaagggcag ctaaaccgcg aggtcaasca 1260

aatcccataa agttgttctc agttcggatt gtagtctgca actcgactac atgaagctgg 1320

aatcgctagt aatcgtagat cagcatgcta cggtgaatac gttcccgggt cttgtacaca 1380

ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca cccgaagccg gtggagtaac catttatgga 1440

gctagccgtc gaaggtggga caaatgattg 1470

<210> 4

<211> 1553

<212> RNA

<213> 腐生葡萄球菌

<400> 4

tttatggaga gtttgatcct ggctcaggat gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa 60

gtcgagcgaa cagataagga gcttgctcct ttgacgttag cggcggacgg gtgagtaaca 120

cgtgggtaac ctacctataa gactgggata acttcgggaa accggagcta ataccggata 180

acatttggaa ccgcatggtt ctaaagtgaa agatggtttt gctatcactt atagatggac 240

ccgcgccgta ttagctagtt ggtaaggtaa cggcttacca aggcgacgat acgtagccga 300

cctgagaggg tgatcggcca cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca 360

gcagtaggga atcttccgca atgggcgaaa gcctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg 420

aagggtttcg gctcgtaaaa ctctgttatt agggaagaac aaatgtgtaa gtaactgtgc 480

acgtcttgac ggtacctaat cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 540

tacgtaggtg gcaagcgtta tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgta ggcggtttct 600

taagtctgat gtgaaagccc acggctcaac cgtggagggt cattggaaac tgggaaactt 660

gagtgcagaa gaggaaagtg gaattccatg tgtagcggtg aaatgcgcag agatatggag 720

gaacaccagt ggcgaaggcg actttctggt ctgtaactga cgctgatgtg cgaaagcgtg 780

gggatcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt 840

tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta 900

cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg tggagcatgt 960

ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaaatctt gacatccttt gaaaactcta 1020

gagatagagc cttccccttc gggggacaaa gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct 1080

cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttaagc ttagttgcca 1140

tcattaagtt gggcactcta ggttgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga 1200

cgtcaaatca tcatgcccct tatgatttgg gctacacacg tgctacaatg gacaatacaa 1260

agggcagcta aaccgcgagg tcatgcaaat cccataaagt tgttctcagt tcggattgta 1320

gtctgcaact cgactacatg aagctggaat cgctagtaat cgtagatcag catgctacgg 1380

tgaatacgtt cccgggtctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc 1440

gaagccggtg gagtaaccat ttatggagct agccgtcgaa ggtgggacaa atgattgggg 1500

tgaagtcgta acaaggtagc cgtatcggaa ggtgcggctg gatcacctcc ttt 1553

<210> 5

<211> 1468

<212> RNA

<213> 表皮葡萄球菌

<400> 5

gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc gaacagacga ggagcttgct 60

cctctgacgt tagcggcgga cgggtgagta acacgtggat aacctaccta taagactggg 120

ataacttcgg gaaaccggag ctaataccgg ataatatatt gaaccgcatg gttcaatagt 180

gaaagacggt tttgctgtca cttatagatg gatccgcgcc gcattagcta gttggtaagg 240

taacggctta ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactgga 300

actgagacac ggtccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatgggcg 360

aaagcctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggtct tcggatcgta aaactctgtt 420

attagggaag aacaaatgtg taagtaacta tgcacgtctt gacggtacct aatcagaaag 480