一种细胞培养方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及细胞的培养及其在以工业规模生产抗体或者多肽中的用途。
2.本发明提供一种细胞培养的方法，适合用于常用的哺乳动物细胞培养，优选如cho细胞，293t细胞培养。在用于通过在哺乳动物细胞培养系统中重组表达抗体或者多肽时，尤其是以工业规模来生产时，本发明的细胞培养方法可以提高获得抗体或多肽的纯度。


背景技术：

3.随着生物技术领域的快速发展，哺乳动物细胞广泛地用于包括单抗药物、诊断试剂等生物制品的生产，对人类医疗健康起着重要作用。市场上绝大多数的全长单抗都是用哺乳动物细胞生产的，主要是cho细胞(中国仓鼠卵巢细胞，chinese hamster overy)或者cho衍生的工程细胞，超过70％已经上市的治疗性蛋白是由cho细胞表达生产的。相对于其他细胞表达系统，cho细胞和具有与人类的翻译后修饰类似，历史背景清晰，细胞稳健，生长迅速等优势。
4.在生产过程中，由于生产周期长，所产生的抗体长时间在细胞培养液中与各种代谢产物，酶等接触反应，使抗体聚集或降解，导致最终收获时，抗体单体纯度的比例降低，目前提高抗体纯度的方法一般为通过多步纯化去除聚集体或片段来到达目的，但也因此抗体的损失率也显著提高。
5.而通过细胞培养工艺以提高抗体纯度比例是一种较优的方式，可以减少抗体纯化的损失率，且条件温和，不会对抗体造成较大不良的影响，但目前关于提高抗体纯度的方法报道非常少，通过细胞培养工艺来提高抗体纯度比例是一个较大的挑战。
6.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种在细胞培养中提高抗体和/或多肽的纯度的培养方法。
8.在某些实施例中，本发明提供一种在抗体表达阶段在细胞培养液中添加含镧离子的化合物的培养方法。
9.在某些实施例中，本发明提供一种在抗体表达阶段在细胞培养液中添加含镧离子的化合物以及含铜离子的化合物的培养方法。
10.一种提高抗体纯度的细胞培养方法，包括如下步骤：
11.在培养哺乳动物细胞优选cho或者293t细胞抗体表达阶段，在细胞培养液中添加含有镧离子的化合物以提高cho或者293t细胞表达的抗体纯度。
12.在一个实施方式中，包括在抗体表达阶段在细胞培养液中添加含镧离子的化合物的培养方法，其中所述含有镧离子的化合物是氯化镧或硝酸镧或硫酸镧中的一种或者多种的混合，其中所述添加的含有镧离子的化合物镧离子的浓度是5～50μm。
13.在一个实施方式中，在抗体表达阶段在细胞培养液中添加含镧离子的化合物的培养方法，其中所述含有镧离子的化合物是氯化镧或硝酸镧或硫酸镧中的一种或者多种的混合，其中所述添加的氯化镧的浓度是10～20μm。
14.在一个实施方式中，在抗体表达阶段在细胞培养液中除添加含镧离子的化合物外还添加有含有铜离子的化合物，含有铜离子的化合物是氯化铜或硝酸铜或硫酸铜中的一种或者多种的混合，其中所述添加的含有铜离子的化合物铜离子的浓度是10～500μm。
15.在一个实施方式中，在抗体表达阶段在细胞培养液中除添加含镧离子的化合物外还添加有含有铜离子的化合物，含有铜离子的化合物是氯化铜或硝酸铜或硫酸铜中的一种或者多种的混合，其中所述添加的硫酸铜的浓度是50～100μm。
16.在一个实施方式中，在抗体表达阶段在细胞培养液中添加10～20μm的氯化镧和50～100μm的硫酸铜。
17.在一个实施方式中，其中所述抗体表达阶段是指在开始补料培养后细胞密度达到0.2～9*107cells/ml，优选开始补料培养后细胞密度达到1.0～5.0*107cells/ml，更优选开始补料培养后细胞密度达到1.5～2.5*107cells/ml。
18.在一个实施方式中，所述细胞培养液可以是含有cd opticho
tm agt
tm
培养基、cellvento
tm cd-220培养基、dynamis培养基或advance培养基中的一种或多种的混合。
19.在一个实施方式中，在所述细胞培养过程中，在细胞培养液中添加糖类物质，维持细胞培养液中的糖浓度为2g/l～6g/l。所述糖类物质可以为葡萄糖。
20.在一个实施方式中，在所述细胞培养过程中，包括从细胞库中活化cho或者293t细胞，以3.0～5.0
×
105cells/ml的活细胞密度接种于125ml的摇瓶，置于37℃，8％co2的培养箱中，转速设置120～130rpm。
21.在一个实施方式中，在所述细胞培养过程中，包括在培养的第3天开始进行补料，补料补充的是feed c培养基，并维持糖浓度2g/l～6g/l。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
23.图1为对比例1和实施例2～9的各组活细胞密度结果统计图；
24.图2为对比例1和实施例2～9的各组细胞分泌的抗体表达量结果统计图；
25.图3为对比例1和实施例2～9的各组细胞分泌的抗体纯度结果统计图。
具体实施方式
26.定义
[0027]“抗体”：如本文所使用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，或免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有与抗原特异性结合(免疫反应)的抗原结合位点的分子，诸如fab或f(ab
′
)2片段。在某些实施例中，抗体为所属领域的普通技术人员已知的典型天然抗体，例如包含四条多肽链两条重链和两条轻链的糖蛋白。在某些实施例中，抗体为单链抗体。举例来
说，在一些实施例中，单链抗体包含重链和/或轻链的两个或两个以上成员已例如经由肽键共价连接的典型天然抗体的变异体。在某些实施例中，单链抗体为具有由重链和轻链组成的两条多肽链结构的蛋白质，所述链是例如通过链间肽连接子稳定，所述蛋白质能特异性结合抗原。
[0028]
补料：如本文所使用，术语“补料”是指在细胞培养过程中向细胞培养液中补加培养基和糖等营养物。
[0029]
细胞培养液：如本文所使用，术语“细胞培养液”是指在培养基中接种培养细胞后的液体。
[0030]
补料分批培养：如本文所使用，术语“补料分批培养”是指在培养过程开始后某一时间将额外组分提供到培养物中的培养方法。所提供的组分通常包含细胞在培养过程中耗尽的营养成分。另外或其他，所述额外组分可包括常用的商业补料培养基，例如feed c培养基。补料分批培养通常在某一时间点停止，并收集培养基中的细胞和/或组分并任选纯化。
[0031]
细胞密度：如本文所使用，术语“细胞密度”是指定体积培养基中存在的细胞数量。
[0032]
抗体表达阶段:如本文所使用，术语“抗体表达阶段”是指细胞培养密度达到(0.2～9)*107cells/ml，细胞培养即可是采用连续补料培养，补料分批培养等培养方式培养。
[0033]“μm”：如本文所使用，术语“μm”是指摩尔浓度μmol/l。
[0034]
下面结合具体实施例的方式对本发明的技术方案做进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围之内。
[0035]
提高抗体纯度的细胞培养方法包括如下步骤s110～s120：
[0036]
s110、将cho细胞接种到培养基中进行细胞培养。
[0037]
具体地，cho细胞为携带gs基因且在gs基因的下游插入了外源基因表达载体的细胞。cho细胞能够表达外源性蛋白，例如单克隆抗体等。
[0038]
进一步地，外源性基因表达载体选自纳武单抗表达载体、贝伐珠单抗表达载体和cd40抗体表达载体中的至少一种。
[0039]
具体地，培养基可以是cd opticho
tm agt
tm
培养基、cellvento
tm cd-220培养基、dynamis培养基或advance培养基中的一种或多种的混合。
[0040]
本实施方式中，dynamis培养基具体为dynamis tm agt
tm medium，购自赛默飞世尔公司，货号为a2617504。s120、在细胞培养过程中细胞表达阶段，向细胞培养液中一次性添加5～50μm的含镧离子的化合物，继续补料培养至结束。
[0041]
在一个实施方式中，在细胞表达阶段向细胞培养液中一次性添加氯化镧，氯化镧的添加量为5～50μm，继续补料培养至结束。
[0042]
在一个实施方式中，在细胞表达阶段向细胞培养液中一次性添加氯化镧，氯化镧的添加量为10～20μm，继续补料培养至结束。
[0043]
在另一个实施方式中，优选的在细胞的表达阶段向细胞培养液中一次性添加5～50μm的含镧离子的化合物和10～500μm的含铜离子的化合物，继续补料培养至结束。
[0044]
在另一个实施方式中，优选的在细胞的表达阶段向细胞培养液中一次性添加5～50μm的氯化镧和10～500μm的硫酸铜，继续补料培养至结束。
[0045]
在另一个实施方式中，在细胞表达阶段向细胞培养液中一次性添加氯化镧和硫酸
铜；氯化镧的添加量为10～20μm，硫酸铜的添加量为50～100μm，继续补料培养至结束。
[0046]
通过在细胞培养的表达阶段向细胞培养液中一次性添加含有镧离子的化合物和含有铜离子的化合物，以提高抗体纯度比例是一种较优的方式，可以减少抗体纯化的损失率，且条件温和，不会对抗体造成较大不良的影响。
[0047]
在一个实施方式中，还包括在细胞培养过程中，在培养的第3天开始进行补料，补料培养基为feed c培养基，每次补料按总体积的5％～10％的体积比进行补料。
[0048]
在一个实施方式中，还包括在细胞培养过程中，维持细胞培养液中的糖浓度为2g/l～6g/l。糖具体为葡萄糖。在培养过程中维持细胞培养液中的糖浓度，提高抗体的表达量和工艺的稳定性。
[0049]
具体地，在补料后，每天取样进行细胞计数并检测糖含量，如果培养基中糖浓度不够，则补充糖分，保证细胞正常生长。
[0050]
以下为具体实施例部分。
[0051]
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。
[0052]
实验所用材料：
[0053]
cho细胞(中国仓鼠卵巢细胞)为菲鹏生物股份有限公司通过商业渠道购买，并自行构建的细胞株(cho-k1)，所表达抗体是抗cd40抗体。
[0054]
培养基和补料培养基是直接购买的商业化培养基，具体地，基础培养基dynamis和补料培养基feed c是购自life technologies。
[0055]
氯化镧、硫酸铜购买自广州化学试剂厂，其他试剂为一般商售试剂。
[0056]
所用仪器
[0057]
细胞技术仪是采购的countstar ic 1000自动细胞计数仪，高效液相色谱仪采购安捷伦1260色谱仪，蛋白a亲和色谱柱采购poros a20um column stainless steel，2.1mmx30mm，0.1ml。
[0058]
对比例1和实施例2～9：
[0059]
细胞培养方法包括以下步骤：
[0060]
(1)准备9组细胞，各组按照相同的接种密度将cho细胞接种到含25ml培养基的125ml培养皿中，在37℃、8％co2的培养箱中培养3天，摇床转速120rpm～130rpm。
[0061]
(2)从第3天开始添加补料培养基feed c，每次加入的feed c补料培养基占培养基总体积的5％。补料培养基每两天补充一次。每天取样计数和测糖，始终维持糖浓度在2g/l～6g/l，如果测得糖浓度低于2g/l则通过计算补加葡萄糖至浓度到2g/l～6g/l。
[0062]
(3)在第7天，测得细胞密度达到(1.5～2.5)
×
107cells/ml按照表1的方案添加金属离子。
[0063]
(4)继续培养6天后收样，收集蛋白测抗体。
[0064]
表1实验设计
[0065][0066][0067]
单位μm的定义说明：化合物在培养基中的浓度。
[0068]
表2第七天细胞密度(
×
107cells/ml)
[0069]
样品编号123456789细胞密度1.891.722.101.501.592.192.501.761.83
[0070]
对各组细胞培养过程中涉及细胞活率和活细胞密度、还原纯度进行统计，具体测试方法如下：
[0071]
细胞活率和密度测定：通过台盼蓝染色法用自动细胞计数仪测定。
[0072]
countstar ic 1000自动细胞计数仪计算细胞密度：
[0073]
取20μl细胞样本与20μl 0.4％台盼蓝混匀后，取20μl加入到countstar细胞计数板上。一个样本多个视野检测：如果一个样本需要进行多视野检测，检测完一个视野后，点击next record，同时通过旋转位置旋钮将样本槽调到不同的视野后，点击start进行检测。一般3个视野可以完成对整个样本的检测。
[0074]
高效液相色谱测抗体表达量和纯度：
[0075]
选用poros a20um column stainless steel，2.1mmx30mm，0.1ml色谱柱温度；检测波长设置280nm；进样量设置20ul；色谱柱温度设置25℃；自动进样器温度设置2～8℃；流动相a：50mm磷酸盐，150mm氯化钠，ph7.0
±
0.1；流动相b：100mm甘氨酸，150mm氯化钠，ph2.5
±
0.1。
[0076]
流动相a(50mm磷酸盐，150mm氯化钠，ph7.0
±
0.1)制备：
[0077]
称取十二水合磷酸氢二钠12.53
±
0.05g，二水合磷酸二氢钠2.34
±
0.05g，量取50ml储液a(3m氯化钠)于1000ml容量瓶中，加超纯水，溶解、定容、摇匀，用0.22um微孔滤膜
过滤。
[0078]
流动相b(100mm甘氨酸，150mm氯化钠，ph2.5
±
0.1)制备：
[0079]
量取100ml储液b(1m甘氨酸ph2.5
±
0.1)，50ml储液a(3m氯化钠)于1000ml容量瓶中，加超纯水，溶解、定容、摇匀，用0.22um微孔滤膜过滤。
[0080]
收集各组细胞培养液离心得到上清样品，用0.1m磷酸缓冲液以2ml/min流速平衡hplc系统15min至基线平稳，将上清样品通过进样器上到色谱柱中，以2ml/min流速洗脱。
[0081]
实验结果：
[0082]
各组活细胞密度统计结果如图1所示。
[0083]
各组抗体表达量统计结果如图2所示。
[0084]
各组抗体纯度统计结果如图3所示。
[0085]
通过上述实验结果分析发现在抗体表达阶段在细胞培养液中添加镧离子可以提高cho细胞表达抗体的纯度，特别地当镧离子和铜离子组合使用时可以有效协同提高抗体的纯度。
[0086]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。