一种含多肽的羊胎酶解物的制备方法及其应用与流程

1.本发明属于酶工程技术领域，尤其涉及一种含多肽的羊胎酶解物的制备方法及其应用。


背景技术：

2.羊胎历来被视为大补之品。集速疗和养元于一体，具有养血安神、丰肌泽肤、延年益寿等功效，自古以来被人视为珍宝。我国传统医学所称的羊胎，是指从妊娠3至4个月的母羊腹中取出的骨骼尚未发育的羊水胎，因其含有多种对人体有益的生物成分，要比产后羊胎盘的营养高，中医一直用其作为人体滋补品。
3.现代医学研究证实羊胎中富含孕育生命所必需的所有原始生命物质，包括蛋白质、氨基酸、微量元素、磷脂、脂多糖、维生素，以及参与免疫功能和维持机体正常运转相关的多种活性多肽，其营养成分比例最接近人体的需求。但由于羊胎中活性物质的分子链较长，用传统加工方法制备的羊胎制剂的活性物质的分子链也较长，很难被人体吸收，所以将其水解制成小分子易吸收的羊胎肽也是近年来食品科学与营养学方面的研究热点，目前已有一些酶法制备羊胎肽的研究。
4.如中国专利授权号cn 102485030b公开的“一种利用酶解制作羊胎保健火锅底料的方法”其操作是将羊胎剪碎、匀浆，而后加入动物蛋白水解酶酶解，再通过发酵培养脱苦，最后喷雾干燥制成胎盘粉。但该专利仅将胎盘用作普通食品使用，对于胎盘肽生物活性利用度低，且生产工序繁琐。又如中国专利授权号cn 102327290b公开的“一种羊胚胎及羊胎生物制品及其制备方法”其操作是∶先将羊胚胎及羊胎超微粉碎、细胞破壁，再将羊胚胎及羊胎的提取和酶解(木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的混合酶)，然后采用葡聚糖凝胶对羊胎及羊胎原液进行分级精制从而得到氨基酸、小分子多肽和各种分子量蛋白的精制羊胎素。该方法生产周期长，原料消耗量大，技术要求及生产成本非常高，工业化生产不易实现。


技术实现要素：

5.本发明要解决的问题是：提供一种能改善睡眠、改善更年期综合征、制备工艺流程简单的羊胎酶解物及其制备方法和应用。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种含多肽羊胎酶解物的制备方法，包括如下步骤：
8.(1)取羊胎匀浆或干粉，加水搅拌；
9.(2)加热至50～60℃，调ph值8～9，加碱性蛋白酶反应0.5～12小时，再加风味蛋白酶反应0.5～12小时；
10.(3)将步骤(2)所得酶解液加热至80～100℃，反应25～45min，过滤，滤液干燥，即得。
11.进一步地，步骤(1)所述羊胎干粉与水的质量比为8～12:1，优选地，为10:1。
12.进一步地，步骤(2)的温度为55℃；
13.和/或，步骤(2)中，调ph值到8；
14.和/或，步骤(2)中，反应时间为2小时。
15.进一步地，步骤(2)所述碱性蛋白酶的质量为羊胎干物质质量的0.5％～2％；优选地，为1％～2％；
16.风味酶的质量为羊胎干物质质量的0.2％～2％；优选地，为1％～2％。
17.进一步地，所述步骤(1)、(2)之间还包括如下步骤：
18.(1.1)加热至35～45℃，调ph值6～9，加胰蛋白酶反应0.5～12小时。
19.进一步地，步骤(1.1)的温度为40℃；
20.和/或，步骤(1.1)中，调ph值到7.5；
21.和/或，步骤(1.1)中，反应时间为2小时。
22.进一步地，胰蛋白酶的质量为羊胎干物质质量的0.5％～2％；优选地，为1％～2％。
23.前述的方法所制备得到的羊胎酶解物。
24.如前述的羊胎酶解物，它包括如下质量百分比的活性成分：
25.多肽60％～72％，多糖7.2％～10％，黄酮1.9％～3.2％；
26.优选地，包括如下质量百分比的活性成分：多肽61.8％～71.3％，多糖8.1％～9.6％，黄酮1.9％～3.0％。
27.前述的羊胎酶解物在制备改善睡眠或改善更年期综合征的食品或药品中的用途。
28.本发明具有如下有益效果：
29.本发明的方法工艺流程简单，无需进行各种分子量的分级精制；本发明方法制备得到的酶解物富含小分子多肽、多糖、黄酮、氨基酸，能显著改善睡眠和更年期综合征。
30.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
31.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
32.图1：实施例1的多肽分子量检测图谱。
33.图2：实施例3的多肽分子量检测图谱。
具体实施方式
34.实施例1、本发明羊胎酶解物的制备
35.将100克羊胎冻干粉，加水1000毫升，加热至40℃，用2mol/l的氢氧化钠调ph＝7.5，加入2克胰蛋白酶，反应2小时；之后升温至55℃，再用2mol/l的氢氧化钠调ph值至8，恒温搅拌下加入2克碱性蛋白酶反应2小时；之后加入2克风味蛋白酶反应2小时；再升温至90℃，恒温反应半小时，使酶失活，过滤。上清液于真空度0.06～0.10mpa，温度40～65℃减压浓缩，再在真空度0.06～0.10mpa，温度
‑
50～
‑
40℃下冷冻真空干燥，即得固态羊胎多肽干粉，收率60％。
36.经测定，其中：多肽含量61.8％(质量比)，多糖含量9.1％(质量比)；黄酮类物质含量2.1％(质量比)。
37.实施例2、本发明羊胎酶解物的制备
38.将100克羊胎冻干粉，加水1000毫升，加热至40℃，用2mol/l的氢氧化钠调ph值至7.5，加入0.5克胰蛋白酶，反应2小时；升温至55℃，再用2mol/l的氢氧化钠调ph值至8，恒温搅拌下加入0.5克碱性蛋白酶反应2小时；之后加入0.2克风味蛋白酶反应2小时；再升温至90℃，恒温反应半小时，使酶失活，过滤。上清液喷雾干燥(进口温度180℃，出口温度85℃)，即得固态羊胎多肽干粉，收率26％。
39.经测定，其中：多肽含量62.6％(质量比)，多糖含量8.1％(质量比)；黄酮类物质含量1.9％(质量比)。
40.实施例3、本发明羊胎酶解物的制备
41.将500克新鲜羊胎，打浆，加水至1000毫升，加热至55℃，用2mol/l的氢氧化钠调ph值至8，恒温搅拌下加入1克碱性蛋白酶反应2小时；之后加入1克风味蛋白酶反应2小时；再升温至90℃，恒温反应半小时，使酶失活，过滤。上清液喷雾干燥(进口温度180℃，出口温度85℃)，即得固态羊胎多肽干粉。收率48％。
42.经测定，其中：多肽含量71.3％(质量比)，多糖含量8.9％(质量比)；黄酮类物质含量2.96％(质量比)。
43.以下通过试验例的方式进一步说明本发明的有益效果。
44.试验例1、本发明羊胎酶解物氨基酸成分分析
45.取实施例1的羊胎酶解物15g，按照国家标准gb 5009.124
‑
2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》对其中的氨基酸成分进行分析，结果如表1所示。
46.表1本发明羊胎酶解物中氨基酸成分分析
[0047][0048]
从表1可见：本发明羊胎酶解物氨基酸成分丰富且含量高，酶解物中共19种氨基酸，含量高达56.33％(克/每100克酶解物)
[0049]
试验例2、本发明羊胎酶解物多肽分子量检测
[0050]
分别取实施例1和3的羊胎酶解物，按照国家标准《gb 31645
‑
2018食品安全国家标准胶原蛋白肽》中的高效体积排阻色谱法对其多肽含量进行分析，结果如图1～2所示，部分检测峰如表2～表3所示。
[0051]
表2实施例1羊胎酶解物分子量检测结果
[0052] 保留时间mnmwmp面积％面积111.1301451415143186453056180.35213.4806509678149983821720.44314.3923666374129999579421.10415.11523742405200018051282.07
516.20813141364108472935038.38617.3336516735771645897018.91718.8472582762474138518947.55819.413411061801843768321.19
[0053]
注：mn，数均分子量；mw，重均分子量；mp，最高分子量。
[0054]
表3实施例3羊胎酶解物分子量检测结果
[0055][0056]
实施例1和实施例3的羊胎酶解物的峰图轮廓十分相近，使用gpc数据软件，根据相对质量校正曲线方程对实施例1和实施例3的羊胎酶解物分子量数据进行计算处理，得到实施例1和3羊胎酶解物中相对分子量小于10000的多肽含量均为61.8％，生物活性小分子多肽含量高。
[0057]
试验例3、本发明羊胎酶解物中其他有效成分含量分析
[0058]
1、多糖含量测定
[0059]
(1)苯酚试液的配制：取苯酚100g，加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g，蒸馏，于182℃下收集馏分。称取5g馏分，加蒸馏水溶解，定容于100ml容量瓶中，转入棕色瓶备用。
[0060]
(2)标准曲线制备：准确移取葡萄糖标准液0.75ml，1.5ml，2.25ml，3.0ml，3.75ml，4.5ml，分别置于25ml具塞试管中，加5％苯酚试液5.0ml混匀，快速沿管壁加浓硫酸15.0ml，混匀，加水定容，室温下放置15min，置于40℃水中10min，取出静置15min，以蒸馏水同法操作作为空白对照，在491nm处测吸光度a。计算其标准曲线回归方程。(最终所得标准曲线回归方程y＝0.0015x 0.0727，r＝0.9998，表明葡萄糖标准液在30～180ug/ml范围内线性良好。)
[0061]
(3)样品中多糖含量测定：准确称取实施例1制备的羊胎酶解物或对照羊胎0.05g，用蒸馏水溶解，稀释定容于50ml容量瓶中，摇匀，准确移取该溶液5.00ml，测其吸光度，由回归方程求出样品多糖含量，计算出羊胎酶解物中多糖含量。
[0062]
2、总黄酮含量测定方法
[0063]
(1)总黄酮的提取：将实施例1制备的羊胎酶解物冷冻干燥，磨碎，称取4.0g粉末，加8ml纯净水润湿，用30ml甲醇超声提取25min，上清液移至50ml容量瓶中，残渣再用甲醇提取2次，合并提取液并用甲醇定容，摇匀，过0.45滤膜，作为供试液。
[0064]
(2)芦丁对照品溶液配制：准确称取干燥到恒温的芦丁对照品12.0mg，置于50ml容量瓶中，加甲醇完全溶解并稀释至刻度，此时浓度为0.240mg/ml。准确吸取该溶液10.0ml于25ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀得芦丁对照品溶液。
[0065]
(3)最大吸收波长确定：准确吸取0.096mg/ml芦丁标准品溶液4.0ml于10ml比色管中，加0.3ml5％亚硫酸钠溶液，振摇6min，加0.3ml 10％硝酸铝溶液，振摇6min，加4ml 5％氢氧化钠溶液，并加甲醇至刻度，振摇并放置15min后，用分光光度计在420～540nm测定吸收值，标准品芦丁呈现最大吸收处即为测定波长。
[0066]
(4)标准曲线绘制：准确吸取0.096mg/ml芦丁标准溶液0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0于10ml比色管中，加0.3ml 5％亚硫酸钠溶液，振摇6min，加0.3ml 10％硝酸铝溶液，振摇6min，加4ml 5％氢氧化钠溶液，并加甲醇至刻度，振摇并放置15min后，以标准试验品做空白，用1cm比色皿于最大吸收波长处测吸光值。以浓度对吸光度进行回归，计算得出回归方程为y＝25.625x 0.0237，r＝0.9990，表明在0.0048～0.0479mg/ml范围内线性良好。
[0067]
(5)总黄酮含量测定：将供试液测吸光度，按回归方程计算总黄酮量；总黄酮含量：(mg/100g)＝(c*v)/m2*100，其中c为试液中总黄酮浓度；v是试液定容体积(ml)；m2为样品质量。
[0068]
3、粗蛋白质含量测定
[0069]
按照国家标准《gb 50095
‑
2010食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》分析测定实施例1制备的羊胎酶解物中蛋白质的含量。
[0070]
4、成分含量分析结果
[0071]
表4样品成分分析
[0072] 多糖含量黄酮含量蛋白质含量羊胎酶解物(实施例1)9.1％2.10％68.38％羊胎(未检测到)2.28％62.90％
[0073]
从表4可见：羊胎经本发明方法酶解后得到的羊胎酶解物生物活性成分多糖含量显著升高，营养物质蛋白质含量也有提高。
[0074]
试验例4、羊胎酶解物改善睡眠的临床疗效观察
[0075]
失眠通常指患者对睡眠时间或质量不满足并影响白天社会功能的一种主观体验，临床上通常以阿森斯失眠量表(表5)进行评价，得分越高，失眠情况越严重。
[0076]
表5阿森斯失眠量表
[0077][0078][0079]
本试验例选取失眠患者进行羊胎酶解物的治疗一般性失眠的实验，具体如下：
[0080]
1、一般资料：选取60例失眠患者(排除有心理精神疾病的患者)，阿森斯失眠量表检查均在6分以上，其中男20例，女40例，年龄35
‑
65岁。
[0081]
2、试用方法：将患者随机分为六个组。试用组各15例，分别用实施例1、2、3所得羊胚胎多肽粉口服，每天1次，每次0.5克，晚饭前服用，连续7天；阳性对照组10例，口服未酶解的羊胎冻干粉，每天1次，每次0.5克，晚饭前服用，连续7天；对照组5例，不服药。
[0082]
3、观察指标：以阿森斯失眠量表作为观察指标，阿森斯失眠量表从入睡时间、夜间苏醒、总睡眠时间、总睡眠质量、白天情绪、白天身体功能(体力或精神：如记忆力、认知力和注意力等)、白天思睡7个方面进行评估，总分<4分为无睡眠障碍，4分～6分为可疑失眠，>6分为失眠。
[0083]
结果如表6所示，可见服用实施例1～3的羊胎酶解物的患者的阿森斯失眠量表得分有显著降低，而对照组的失眠量表得分未见明显改变。
[0084]
表6羊胎多肽干预前后阿森斯失眠量表得分比较
[0085][0086]
本试验例结果表明，羊胚胎酶解物在短时间内可以有效改善失眠者的睡眠。
[0087]
试验例5、羊胚胎多肽治疗更年期综合征的临床疗效观察
[0088]
更年期综合征是指妇女绝经前后引起的激素波动导致自主神经功能紊乱，同时伴有神经心理症状的症候群。其临床症状主要表现为潮热、潮红等，多发于45－55岁。本病可并发外阴及阴道萎缩、心悸、胸闷及骨质疏松等，严重危害患者生命健康，影响患者生活质量。
[0089]
1一般资料：选取:23例更年期综合征患者，改良kupperman评分标准表格(表7)检查均在15分以上，年龄50
‑
55岁。
[0090]
表7改良kupperman评分标准表格
[0091][0092]
*：是指在轻、中、重度评分基础上，乘因子4，2，1。
[0093]
2试用方法：将患者随机分为四组，试用组各6例，分别用实施例1,2,3所得羊胚胎
多肽粉口服，对照组5例，服用羊胎冻干粉；服用方法均为：每天1次，每次0.5克，晚饭前服用，连续15天。
[0094]
3观察指标：以改良kupperman评分标准表作为观察指标，比较4组治疗前后改良更年期综合征量表(kupperman)评分变化，包括失眠、疲倦、潮热出汗、烦躁等12项，采用0～3级评分，总分36分，得分越高则更年期综合征症状越严重。依据《中华妇产科学》拟定疗效标准：治疗后改良kupperman评分较治疗前降低≥80％为基本治愈；评分降低≥50％～＜80％为显著改善；评分降低≥20％～＜50％为好转；评分降低＜20％为无效。总有效率＝(基本治愈 显著改善 好转)/总例数
×
100％。
[0095]
表8疗效例数统计
[0096][0097]
本试验例结果表明，羊胚胎酶解物可以改善妇女更年期综合征。
[0098]
综上，本发明的羊胎酶解物的生物活性小分子多肽含量高，多糖、黄酮、蛋白、氨基酸含量高，能快速改善失眠者的睡眠，改善妇女更年期综合征，应用前景良好。