富含磷脂的乳脂肪球膜、其制备方法及其在促进脑发育及缓解认知功能下降中的应用与流程

乳脂肪球膜磷脂，分离效率高，便于工业化生产。
6.本发明所提供的从新鲜生乳中分离制备乳脂肪球膜的方法，包括如下步骤：
7.s1、从新鲜生乳中分离得到乳脂肪提取物；
8.s2、将所述乳脂肪提取物进行冷却结晶，然后搅拌后过0.65～0.80μm孔径的滤网， 得到乳脂肪球膜提取物；
9.s3、向所述乳脂肪球膜提取物中加入乙醇进行超声破碎并离心ⅰ；取上清液去除 溶剂后加入冷丙酮，经离心ⅱ去除非极性脂质，去除残余的所述冷丙酮后得到富含磷 脂的乳脂肪球膜提取物。
10.本发明中，所述新鲜生乳指的是取奶时间24h内的荷斯坦牛乳、娟姗牛乳、水牛 乳、牦牛乳、山羊乳、绵羊乳、驴乳和/或骆驼乳。
11.本发明提供了两种分离所述乳脂肪提取物的方法：
12.第一种方法包括如下步骤：
13.将所述新鲜生乳加热后置于超声处理装置中进行处理，上层即为所述乳脂肪提取 物；
14.所述处理过程中在所述超声处理装置的侧室中加入20～25℃的水，以降低加工过 程中乳的升温速率；
15.所述超声处理装置内设有1～2块垂直板式换能器；
16.所述处理的条件如下：
17.控制所述垂直换能器的频率为1～2mhz，时间为5～30min。
18.第二种方法包括如下步骤：
19.采用3～5层纱布过滤所述新鲜生乳，收集滤液；采用离心机分离所述滤液得到脂 肪粗提物；所述离心的速率为3000～4000rpm/min，时间为15～30min；
20.向所述脂肪粗提物中加入pbs磷酸盐缓冲液，混匀后采用所述离心机进行离心洗 涤，以洗掉脂肪球表面杂蛋白，得到所述乳脂肪提取物。可重复2～3次；
21.所述乳脂肪粗提物与所述pbs磷酸盐缓冲液的体积比为1：9～12。
22.所述pbs磷酸盐缓冲液的配方为0.01～0.018m na2hpo4和nah2po4，0.12～0.15mnacl，调至ph为6.8～7.5。
23.上述的方法中，步骤s2中，所述冷却结晶的步骤如下：
24.将所述乳脂肪提取物冷却至0～4℃，贮存15～25h；
25.所述搅拌的转速为600～900rpm，时间为15～30min。
26.上述的方法中，步骤s3中，所述乙醇的ph值为4.5～6.5，采用2n hcl调节ph；
27.所述离心ⅰ的条件为：
28.离心力为15000～20000g，离心时间为10～20min，重复1～3次；
29.所述冷丙酮的加入量为所述乳脂肪球膜提取物体积的8～10倍；
30.所述离心ⅱ的条件为：
31.离心力为6000～8000g，离心时间为15～20min。
32.上述的方法中，步骤s3之后，所述方法还包括如下步骤a或b：
33.a：所述富含磷脂的乳脂肪球膜提取物进行低温喷雾干燥或冷冻干燥得到富含脂 肪球膜磷脂的乳脂肪球膜粉；
34.b：在碱性条件下，采用磷脂酶a1或磷脂酶a2水解所述非极性脂质，经纯化得 到鞘磷脂浓缩物；
35.所述鞘磷脂浓缩物与所述富含磷脂的乳脂肪球膜提取物混合后，经低温喷雾干燥 或冷冻干燥得到富含脂肪球膜磷脂(鞘磷脂含量较高)的乳脂肪球膜粉；
36.所述磷脂酶a1的加入量为所述非极性脂质的质量的0.5～0.8％，所述水解的条件 如下：
37.温度为30～60℃，ph为7.5～8.5，时间为2～10h；
38.所述磷脂酶a2的加入量为所述非极性脂质的质量的0.65～0.85％，所述水解的条 件如下：
39.温度为35～65℃，ph为7.5～8.5，时间为3～12h。
40.在所述乳脂肪球膜的基础上，本发明进一步提供了一种婴幼儿配方乳粉，其制备 方法包括如下步骤：
41.s1、将所述乳脂肪球膜提取物或所述乳脂肪球膜粉溶于水中，然后加入低聚半乳 糖、乳清蛋白粉、水溶性维生素和矿物质，搅拌均匀得到溶液水相；
42.s2、将所述溶液水相预热至45～55℃进行浓缩，然后进行巴氏杀菌，冷却至室温 后进行冷藏；
43.s3、采用离心泵以注射的方式将植物油和脂溶性维生素的混合物添加至所述溶液 水相中得到油水混合体系，所述油水混合体系中油相的质量含量为15～40％；
44.s4、采用内联混合机混合所述油水混合体系，经喷雾干燥即得到所述婴幼儿配方 乳粉。
45.步骤s1中，1l所述水中所述乳脂肪球膜提取物或所述乳脂肪球膜粉的添加量为 5～20g，所述低聚半乳糖的添加量为22～30g，低聚果糖的添加量为2～4g，所述乳清 蛋白粉的添加量为25～35g，所述水溶性维生素的添加量为2～3g，所述矿物质的添加 量为1～2.5g。
46.步骤s2中，浓缩至固形物含量为30％～45％；
47.步骤s3中，所述离心泵的压力为8～10
×
105pa，所述油水混合体系中油相的质量 含量为15％～25％；
48.步骤s4中，所述内联混合机的工作参数如下：
49.剪切速率为6
×
104～15
×
104s
‑1，搅拌时间为2～10min；
50.所述喷雾干燥的条件如下：
51.入口温度为50℃，真空度为
‑
0.06mpa。
52.本发明方法制备的乳脂肪球膜实现了对人乳脂肪球表面组成蛋白和磷脂等的模 拟，且在包裹油脂的过程中采用了注射法、低剪切速率的内联混合机，将乳脂充分乳 化制备富含磷脂的乳脂肪球膜脂质体，形成的乳脂肪球大小与人乳脂肪球组成、大小 和结构相近，实现了人乳脂肪球的进一步模拟，添加到婴幼儿配方乳粉更好地满足婴 幼儿的消化吸收和健康需求；同样的，还可以添加到孕产妇配方乳粉和中老年配方乳 粉。
53.采用上述方法制备的富含磷脂的乳脂肪球膜具有促进脑发育、降低认知功能和缓 解阿尔兹海默症的作用，不仅可以促进神经行为发育，抑制神经炎症，提高认知功能， 而且可以预防或缓解阿尔兹海默症，在制备具有促进脑发育、改善认知功能、缓解阿 兹海默症
的功能食品或保健品中具有良好的应用前景。
附图说明
54.图1为人乳脂肪球(a)和调制乳粉(b)的激光共聚焦图。
55.图2为mfgm干预对健康及肥胖母鼠仔鼠断奶前大脑重量和神经行为发育的影 响，其中，图2a为出生第0天脑组织重量；图2b为仔鼠平面翻正达标率及实验示意 图；图2c为仔鼠悬崖回避达标率及实验示意图。
56.图3为mfgm干预对健康及肥胖母鼠仔鼠断奶前海马组织脑源性神经营养因子 (bdnf)的表达。
57.图4为mfgm干预对健康及肥胖母鼠成年子代水迷宫测试和新物体识别结果的 影响，其中，图4a为定位航行实验中找到平台的潜伏期；图4b为空间探索实验中大 鼠的运动轨迹；图4c为空间探索实验中在目标象限运动时间；图4d为空间探索实验 中穿过平台区域的次数；图4e为新物体识别指数。
58.图5为mfgm干预对健康及肥胖母鼠仔鼠成年后海马组织bdnf的表达。
59.图6为mfgm干预对app/ps1小鼠海马组织病理的影响。
60.图7为mfgm干预对app/ps1小鼠脑组织aβ和tau蛋白表达的影响。
具体实施方式
61.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
62.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
63.下述实施例中乳脂肪球膜中磷脂(pc、pe、sm、pi、ps和lpc)含量的检测方 法如下：
64.通过正相lc系统与sciex三重四极杆api300 lc
‑
ms/ms系统连接装置进行检 测，将来自正相lc运行的大约10ml洗脱液导入电喷雾离子源。使用4500v的正离 子喷射电压或
‑
5000v的负离子喷射电压产生离子，检测值在50和1000mz之间。
65.流动相a为：乙腈
‑
水(5:5，v:v)，10mm甲酸铵，0.1％甲酸；流动相b为：异 丙醇
‑
乙腈(9:1，v:v)，10mm甲酸铵，0.1％甲酸；用ben c18柱(1.7μm，2.1mm id*100 mm)，柱温60℃；洗脱条件：0min，70％b；28min，85％b；28.1min，70％b；30min， 70％b；流速为0.3ml/min。
66.实施例1、富含脂肪球膜磷脂的乳脂肪球膜粉的制备
67.一、取自取奶24h内的2l新鲜生荷斯坦牛乳；
68.二、根据生牛乳的温度，将其水浴加热或降温至20℃，然后倒入超声处理装置 中，并将25℃的水放入侧室中，降低加工过程中乳的升温速率；
69.三、将生乳用1块垂直板式换能器，以1mhz的频率，189w/l的功率，处理30 min，得到上层的乳脂肪提取物；
70.四、将步骤三得到的乳脂肪提取物在4℃贮存20h，冷却结晶后立即用搅拌器进 行搅拌，搅拌器转速为600rpm，搅拌时间为30min；
71.五、将步骤四得到的搅拌产物，过0.71μm孔径的滤网，得到乳脂肪球膜提取物；
72.六、将步骤五得到的乳脂肪球膜提取物，加入一定量的乙醇超声破碎并离心，乙 醇ph值为4.5，离心力为20000g，离心时间为10min，重复2次。取上清液旋蒸掉 溶剂后，加入脂质8倍体积的冷丙酮，在8000g离心20min，除去非极性脂质，氮吹 除去残余的冷丙酮后，
得到富含脂肪球膜磷脂的乳脂肪球膜提取物。
73.本实施例制备的乳脂肪球膜中磷脂主要包括鞘磷脂(sm)、磷脂酰胆碱(pc)、 溶血磷脂酰胆碱(lpc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰肌醇(pi)、磷脂酰丝氨酸(ps)。 其中，sm的含量最高，为2.30mg/g，其次为pc，含量为1.80mg/g，此外lpc、pe、 pi和ps的含量分别为0.48mg/g、0.45mg/g、0.30mg/g和0.28mg/g。
74.实施例2、富含磷脂的乳脂肪球膜粉的制备
75.一、取自取奶24h内的4l新鲜生牦牛乳；
76.二、根据生牛乳的温度，将其水浴加热或降温至23℃，然后倒入超声处理装置 中，并将25℃的水放入侧室中，降低加工过程中乳的升温速率；
77.三、将生乳用1块垂直板式换能器，以2mhz的频率，157w/l的功率，处理20 min，得到上层的乳脂肪提取物；
78.四、将步骤三得到的乳脂肪提取物在4℃贮存20h，冷却结晶后立即用搅拌器进 行搅拌，搅拌器转速为700rpm，搅拌时间为20min；
79.五、将步骤四得到的搅拌产物，过0.71μm孔径的滤网，得到乳脂肪球膜提取物；
80.六、将步骤五得到的乳脂肪球膜提取物，加入一定量的乙醇超声破碎并离心，乙 醇ph值为6.5，离心力为15000g，离心时间为20min，重复2次。取上清液旋蒸掉 溶剂后，加入脂质9倍体积的冷丙酮，在8000g离心20min，除去非极性脂质，氮吹 除去残余的冷丙酮后，得到富含脂肪球膜磷脂的乳脂肪球膜提取物。
81.本实施例制备的乳脂肪球膜中磷脂主要包括pc、sm、lpc、pe、pi、ps。其中， pc含量最高，为7.01mg/g，其次为sm，含量为2.00mg/g，此外lpc、pe、pi和ps 的含量分别为0.42mg/g、0.18mg/g、0.12mg/g和0.11mg/g。
82.实施例3、富含磷脂的乳脂肪球膜粉的制备
83.一、取自取奶24h内的6l新鲜生山羊乳；
84.二、用4层纱布进行过滤，收集滤液，在室温下使用离心机进行离心，离心的速 率和时间分别为3000rpm/min，20min，得到脂肪粗提物；
85.三、将脂肪粗提物中加入一定量的pbs磷酸盐缓冲液，添加pbs磷酸盐缓冲液的 量按脂肪提取物：pbs磷酸盐缓冲液体积比为1:9(v/v)进行添加，pbs磷酸盐缓冲 液配方为0.018m na2hpo4和nah2po4，0.12m nacl，调至ph为7.0。充分混匀后， 使用离心机进行离心洗涤，以洗掉脂肪球表面杂蛋白，分离得到脂肪提取物。此过程 重复3次。
86.四、将步骤三得到的乳脂肪提取物在4℃贮存20h，冷却结晶后立即用搅拌器进 行搅拌，搅拌器转速为900rpm，搅拌时间为15min；
87.五、将步骤四中得到的搅拌产物，过0.71μm孔径的滤网，得到乳脂肪球膜提取 物；
88.六、将步骤五得到的乳脂肪球膜提取物，加入一定量的乙醇超声破碎并离心，乙 醇ph值为6.0，离心力为18000g，离心时间为16min，重复2次。取上清液旋蒸掉 溶剂后，加入脂质10倍体积的冷丙酮，在8000g离心20min，除去非极性脂质，氮 吹除去残余的冷丙酮后，得到富含脂肪球膜磷脂的乳脂肪球膜提取物。
89.七、将步骤六得到的富含脂肪球膜磷脂的乳脂肪球膜提取物利用磷脂酶a1对其 中甘油磷脂进行水解，加入磷脂酶a1的含量为底物的0.5％，反应温度为50℃，ph 为8.0，反应时间为7h。而其中较稳定的鞘磷脂不被水解保留下来，利用正相色谱进 行纯化，得到鞘
磷脂浓缩物。其中色谱条件为：流动相采用：乙腈
‑
异丙醇
‑
甲醇
‑
水
‑ꢀ
三氟乙酸以130:25:15:7.2:0.92(v/v)，流速为5ml/min。选用不锈钢色谱柱(内径为 250mm
×
16mm)，柱温25℃。
90.八、将步骤七的鞘磷脂浓缩物与步骤六得到的富含脂肪球膜磷脂的乳脂肪球膜提 取物混合，进行冷冻干燥后，便得到富含脂肪球膜磷脂(鞘磷脂含量较高)的脂肪球 膜粉。
91.本实施例制备的乳脂肪球膜中磷脂主要包括pc、sm、lpc、pe、pi、ps。其中， sm含量最高，为18.52mg/g，其次为pc，含量为11.20mg/g，此外lpc、pe、pi和 ps的含量分别为0.38mg/g、0.48mg/g、0.19mg/g和0.11mg/g。
92.实施例4、富含磷脂的乳脂肪球膜粉的制备
93.一、取自取奶24h内的3l新鲜生牦牛乳；
94.二、用4层纱布进行过滤，收集滤液，在室温下使用离心机进行离心，离心的速 率和时间分别为4000rpm/min，15min，得到脂肪粗提物；
95.三、将脂肪粗提物中加入一定量的pbs磷酸盐缓冲液，添加pbs磷酸盐缓冲液的 量按脂肪提取物：pbs磷酸盐缓冲液体积比为1:12(v/v)进行添加，pbs磷酸盐缓冲 液配方为0.016m na2hpo4和nah2po4，0.13m nacl，调至ph为7.2。充分混匀后， 使用离心机进行离心洗涤，以洗掉脂肪球表面杂蛋白，分离得到脂肪提取物。此过程 重复2次。
96.四、将步骤三得到的乳脂肪提取物在4℃贮存20h，冷却结晶后立即用搅拌器进 行搅拌，搅拌器转速为850rpm，搅拌时间为18min；
97.五、将步骤四得到的搅拌产物，过0.71μm孔径的滤网，得到乳脂肪球膜提取物；
98.六、将步骤五得到的乳脂肪球膜提取物，加入一定量的乙醇超声破碎并离心，乙 醇ph值为5.5，离心力为17000g，离心时间为18min，重复2次，取上清液旋蒸掉 溶剂后，加入脂质8倍体积的冷丙酮，在8000g离心20min，除去非极性脂质，氮吹 除去残余的冷丙酮后，得到富含脂肪球膜磷脂的乳脂肪球膜提取物。
99.七、将步骤六得到的富含脂肪球膜磷脂的乳脂肪球膜提取物利用磷脂酶a2对其 中甘油磷脂进行水解，加入磷脂酶a2的含量为底物的0.80％，反应温度为37℃，ph 为8.0，反应时间为9h。而其中较稳定的鞘磷脂不被水解保留下来，利用正相色谱进 行纯化(条件同实施例3)，得到鞘磷脂浓缩物，得到鞘磷脂浓缩物。
100.八、将步骤七得到的鞘磷脂浓缩物与步骤六得到的富含脂肪球膜磷脂的乳脂肪球 膜提取物混合，进行冷冻干燥后，便得到富含脂肪球膜磷脂(鞘磷脂含量较高)的脂 肪球膜粉。
101.本实施例制备的乳脂肪球膜中磷脂主要包括pc、sm、lpc、pe、pi、ps。其中， sm含量最高，为17.00mg/g，其次为pc，含量为8.11mg/g，此外lpc、pe、pi和 ps的含量分别为1.25mg/g、1.50mg/g、0.32mg/g和0.26mg/g。
102.实施例5、富含脂肪球膜磷脂的乳脂肪球膜粉的制备
103.一、取自取奶24h内的5l新鲜生荷斯坦牛乳；
104.二、用5层纱布进行过滤，收集滤液，在室温下使用离心机进行离心，离心的速 率和时间分别为3500rpm/min，17min，得到脂肪粗提物；
105.三、将脂肪粗提物中加入一定量的pbs磷酸盐缓冲液，添加pbs磷酸盐缓冲液的 量按脂肪提取物：pbs磷酸盐缓冲液体积比为1:10(v/v)进行添加，pbs磷酸盐缓冲 液配方为0.014m na2hpo4和nah2po4，0.14m nacl，调至ph为7.5。充分混匀后， 使用离心机进行离心
洗涤，以洗掉脂肪球表面杂蛋白，分离得到脂肪提取物。此过程 重复2次。
106.四、将步骤三得到的乳脂肪提取物在4℃贮存20h，冷却结晶后立即用搅拌器进 行搅拌，搅拌器转速为750rpm，搅拌时间为20min；
107.五、将步骤四得到的搅拌产物，过0.71μm孔径的滤网，得到乳脂肪球膜提取物；
108.六、将步骤五得到的乳脂肪球膜提取物，加入一定量的乙醇超声破碎并离心，乙 醇ph值为5.0，离心力为16000g，离心时间为19min，重复2次取上清液旋蒸掉溶 剂后，加入脂质10倍体积的冷丙酮，在8000g离心20min，除去非极性脂质，氮吹 除去残余的冷丙酮后，得到富含脂肪球膜磷脂的乳脂肪球膜提取物。
109.七、将步骤六所得的富含脂肪球膜磷脂的乳脂肪球膜提取物利用磷脂酶a1对其 中甘油磷脂进行水解，加入磷脂酶a1的含量为底物的0.5％，反应温度为50℃，ph 为8.0，反应时间为7h。而其中较稳定的鞘磷脂不被水解保留下来，利用正相色谱进 行纯化(条件同实施例3)，得到鞘磷脂浓缩物，得到鞘磷脂浓缩物。
110.八、将步骤七得到的鞘磷脂浓缩物与步骤六得到的富含脂肪球膜磷脂的乳脂肪球 膜提取物混合，进行冷冻干燥后，便得到富含脂肪球膜磷脂(sm含量较高)的脂肪 球膜粉。
111.本实施例制备的乳脂肪球膜中磷脂主要包括pc、sm、lpc、pe、pi、ps。其中， sm含量最高，为16.78mg/g，其次为pc，含量为5.50mg/g，此外lpc、pe、pi和ps的含量分别为3.60mg/g、0.87mg/g、0.31mg/g和0.22mg/g。
112.实施例6、
113.采用富含脂肪球膜磷脂的乳脂肪球膜粉制备模拟人乳脂肪球结构的婴幼儿乳粉， 原料如下：
114.脱盐乳清粉30g、富含脂肪球膜磷脂的脂肪球膜粉8g、低聚半乳糖25g、低聚果 糖20g、植物油35g、核苷酸0.2g、叶黄素0.005g、复合维生素3g、复合矿物质2g。
115.按照下述方法制备：
116.一、称取一定量的实施例1
‑
5中制备的富含脂肪球膜磷脂的脂肪球膜粉8g溶于1 l去离子水中，充分混匀。再将低聚半乳糖、乳清蛋白粉及水溶性维生素、矿物质等 原料添加到乳脂肪球膜溶液中，室温环境中搅拌均匀，得到溶液水相。
117.二、将步骤一中溶液水相预热至50℃后浓缩，至固形物含量为35％；再经过 125℃，2s的超巴氏杀菌法进行杀菌处理，然后冷却至室温于4℃贮藏。
118.三、称取植物油及脂溶性维生素，混合加热至55℃，使用压力为10
×
105pa的离 心泵以注射方式添加至步骤二所得到的水相中。使混合体系中最终油相质量占水相质 量的28％。
119.四、将步骤三得到的油水混合体系用内联混合机进行混合，控制维持较低的剪切 速率，6
×
104s
‑1，搅拌2min，使添加的脂肪在水相中充分乳化。然后将得到的乳化液 在入口温度50℃，真空度
‑
0.06mpa下进行低温真空喷雾干燥，制得模拟人乳的脂肪 球的婴幼儿乳粉。
120.实施例7、
121.采用富含脂肪球膜磷脂的乳脂肪球膜粉制备模拟人乳脂肪球结构的婴幼儿乳粉， 其包括以下原料：脱盐乳清粉30g、乳脂肪球膜粉12g、低聚半乳糖25g、低聚果糖 20g、植物油35g、核苷酸0.2g、叶黄素0.005g、复合维生素3g、复合矿物质2g。
122.一、称取一定量的实施例1
‑
5中制备的富含脂肪球膜磷脂的脂肪球膜粉12g溶于 1l去离子水中，充分混匀。再将所述的低聚半乳糖、乳清蛋白粉及水溶性维生素、 矿物质等原料添加到乳脂肪球膜溶液中，室温环境中搅拌均匀，得到溶液水相。
123.二、将步骤一中溶液水相预热至50℃后浓缩，至固形物含量为35％；再经过 125℃，2s的超巴氏杀菌法进行杀菌处理，然后冷却至室温于4℃贮藏。
124.三、称取植物油及脂溶性维生素，混合加热至55℃，使用压力为8
×
105pa的离 心泵以注射方式添加至步骤二所得到的水相中。使混合体系中最终油相质量占水相质 量的28％。
125.四、将步骤三得到的油水混合体系用内联混合机进行混合，控制维持较低的剪切 速率，7
×
104s
‑1，搅拌4min，使添加的脂肪在水相中充分乳化。然后将得到的乳化液 在入口温度50℃，真空度
‑
0.06mpa下进行低温真空喷雾干燥，制得模拟人乳的脂肪 球的婴幼儿乳粉。
126.为了证实调制乳粉中脂肪结构与人乳的相似，测定实施例7的调制乳粉和人乳中 脂肪球粒径微观结构和大小。
127.采用马尔文激光散射仪测定复溶后乳粉及人乳脂肪球粒径，结果显示实施例7的 调制乳粉(其中脂肪球膜为实施例5所制备的)和人乳脂肪球平均粒径非常接近，分 别为2.9μm和3.2μm，同时利用激光共聚焦显微镜观察调制乳粉和人乳脂肪球的微观 结构，如图1所示，可以看到本发明调制乳粉和人乳脂肪球粒径相似。
128.实施例8、母亲孕期和哺乳期干预乳脂肪球膜能够促进后代脑发育并预防成年后 高脂饮食引起的认知障碍
129.健康sd雌性大鼠，3～4周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，按照 spf级动物饲养标准进行饲养。自由饮食摄食，在22
±
1℃、12:12日夜循环的环境中 适应一周。经1周适应性喂养后，雌鼠分为两组，一组饲喂维持饲料，一组饲喂60％ 高脂饲料，8周造模后，将雌雄大鼠按1:1的比例合笼，自由饮食摄水，进行阴栓检查。 如果检见阴栓即记为妊娠第1天，将孕鼠提出另笼饲养。
130.将饲喂维持饲料的孕鼠分为两组，a组：维持饲料(con组)；b组：维持饲料 实施例5制备的富含脂肪球膜磷脂的乳脂肪球膜(mfgm)(400mg/kg bw) (con mfgm组)。高脂组孕鼠换用45％高脂饲料干预，并分为两组，c组：高脂饲 料(hfd组)；d组：高脂饲料 实施例5制备的富含脂肪球膜磷脂的乳脂肪球膜(400 mg/kg bw)(hfd mfgm组)。孕鼠自然分娩的当天记为仔鼠出生的第1天(pnd 1)， 所有子代出生后与其亲代母鼠同笼饲养，喂养至断奶(pnd 21)，断奶后喂养高脂饮 食至成年。
131.(1)健康母亲孕期和哺乳期干预乳脂肪球膜能够促进后代脑发育
132.在断奶前对仔鼠进行神经反射实验，评价仔鼠的神经行为发育。在pnd1和pnd21 时处死部分仔鼠，用剪刀将小鼠断头，剥离脑组织，采用elisa试剂盒测定脑组织中 肿瘤坏死因子
‑
α(tnf
‑
α)、白细胞介素
‑
1β(il
‑
1β)、白细胞介素
‑
6(il
‑
6)和脂多糖 (lps)的水平，利用western blot技术进一步验证母亲干预mfgm对后代脑发育的 作用，并探究其对脑源性神经营养因子(bdnf)表达的影响。
133.如图2a所示，在pnd 1时，con组和hfd组仔鼠的脑组织重量显著低于 con mfgm和hfd mfgm组，原因可能是mfgm促进了大脑的发育。如图2b所 示，在pnd3，con组仔鼠完成翻
正反射的动物百分数为61.90％，而hfd组仔鼠完 成翻正反射的动物百分数为4.76％，经过mfgm处理后，可以显著提升达标率。在 pnd4，hfd组仔鼠完成翻正反射的动物百分数明显低于con组大鼠，经过mfgm 处理后，可以显著提升达标率。在pnd5
‑
7，各组的仔鼠达标率没有规律的变化趋势， 但随着年龄增长，达标率均一直上升。如图2c所示，在pnd5
‑
8，con mfgm组悬 崖回避达标率高于con组，hfd mfgm组达标率也显著高于hfd组。上述结果说 明补充mfgm能够促进仔鼠神经行为发育。
134.如表1所示，在pnd 21时，与con组相比，con mfgm组仔鼠全脑组织中il
‑
6 水平稍有降低，lps水平显著降低(p<0.01)。hfd组全脑组织il
‑
6和lps水平显著 高于con组，补充mfgm后，仔鼠的脑组织il
‑
6和lps水平显著降低。在pnd 21 时，con和con mfgm组的il
‑
1β水平无显著差异，hfd组仔鼠全脑组织il
‑
1β水 平显著高于对照组，hfd mfgm组仔鼠il
‑
1β水平显著降低，说明肥胖母亲补充 mfgm能够抑制其子代大脑中炎症因子水平的增加。
135.表1 mfgm干预对高脂饮食母鼠子代脑组织中炎症因子水平的影响
[0136][0137]
如图3所示，在pnd 0和21时，con mfgm组仔鼠全脑组织中bdnf水平显 著高于con组。hfd组仔鼠全脑组织bdnf水平显著低于con组，补充mfgm后， bdnf水平显著升高。bdnf对神经元的发育和存活起重要作用，上述结果说明母亲 干预mfgm可能通过促进其子代大脑中bdnf的表达来改善脑发育。
[0138]
(2)母亲孕期和哺乳期干预乳脂肪球膜能够预防后代成年后高脂饮食引起的认知 障碍
[0139]
仔鼠断奶后喂养高脂饮食至12周龄，通过morris水迷宫测试和新物体识别实验 评价大鼠的学习记忆能力。行为学实验结束一周后，麻醉处死性子代，断头后剥离脑 组织，利用western blot技术进一步验证母亲干预mfgm对后代脑健康的长期作用， 并探究其对bdnf表达的影响。
[0140]
如图4a和4b所示，随训练天数延长，逃避潜伏期逐渐缩短，说明大鼠空间记忆 力训练有效。测试结果显示，在定位航行实验中，hfd组仔鼠寻找平台的逃避潜伏期 与对照组相比明显延长，说明母亲的高脂饮食影响了后代的空间学习能力，给予 mfgm可明显改善后代的空间学习记忆障碍，逃避潜伏期明显缩短。如图4c和图4d 所示，在空间探索实验中，hfd组仔鼠在目标象限停留时间比con组短，穿越平台 的次数减少，说明母亲高脂饮食加速了记忆丧失。肥胖母亲补充mfgm可改善子代成 年后高脂饮食诱导的记忆障碍，显著增加目标象限停留时间和穿越平台的次数。如图 4e所示，当同样在断奶后喂养高脂饮食的情况下，con组与con mfgm组仔鼠的 新物体识别指数没有明显差异，hfd组仔鼠的新物体识别指数较对照组显著降低，说 明肥胖母亲的后代抵抗高脂饮食对认知不利影响的能力更弱；补充mfgm后，新物体 识别指数均明显高于hfd组，说明母亲孕期和哺乳期补充mfgm能够改善高脂饮食 后代成年后的记忆能力。综上结果表明，mfgm可以减轻母亲高脂饮食对后代脑健康 的长期不良影响。如图5所示，hfd组仔鼠全脑组织bdnf水平显著低于con组， 补充mfgm
后bdnf水平显著升高，说明母亲干预mfgm可能通过促进后代脑中 bdnf表达来改善神经元突触形成和递质释放，从而改善高脂饮食诱导的认知障碍。
[0141]
实施例9、乳脂肪球膜缓解阿尔兹海默症小鼠海马病变
[0142]
app/ps1小鼠和野生型c57bl/6j小鼠，6月龄，购自北京维通利华实验技术有限 公司，按照spf级动物饲养标准进行饲养。自由饮食摄食，在22
±
1℃、12:12日夜循 环的环境中适应一周后，c57bl/6j小鼠作为对照组(con组)，将app/ps1小鼠随机 分组为2组，一组饲喂普通饲料(ad组)，一组在普通饲料的基础上每天灌胃400mg/kgbw实施例5制备的富含脂肪球膜磷脂的乳脂肪球膜(ad mfgm组)，con组和 ad组给予相同体积的生理盐水，灌胃3个月。实验结束后，将小鼠麻醉后断头处死， 收集脑组织，部分组织放入4％多聚甲醛内固定后进行h&e染色。另一部分脑组织置 于
‑
80℃冰箱冻存，采用western blot技术检测mfgm干预对脑组织中ad标记物β
‑ꢀ
淀粉样蛋白(aβ)和tau蛋白的表达情况。
[0143]
如图6所示，对照组小鼠海马各区光镜下未见有病理改变，海马组织结构排列整 齐，细胞呈圆形或锥形，形态正常；ad组小鼠海马各区可见较多的神经元胞体缩小， 胞浆浓缩，核固缩，整个细胞深染成红色，神经元数量较对照组减少；经过mfgm处 理后，细胞形态显著恢复，细胞数量增加，排列整齐。
[0144]
如图7所示，ad组小鼠脑组织中aβ含量显著升高，tau磷酸化水平显著增加。 经过mfgm干预后，ad mfgm组小鼠脑组织中aβ水平显著下降，tau磷酸化水平 显著下降。说明mfgm具有被开发为防治阿尔兹海默症等神经退行性疾病药物的巨大 潜力。