类黄酮与动物健康和生产性能的制作方法

类黄酮与动物健康和生产性能
1.本技术要求2019年2月21日提交的欧洲专利申请19382127.9的权益。
技术领域
2.本发明涉及柚皮苷(naringin)、其苷元形式(aglycone form)、柚皮素(naringenin)或其混合物在调节反刍动物和/或猪的某些特定基因受体的表达中的用途，这对摄食行为、摄入模式和动物行为具有积极影响。


背景技术：

3.植物化学物质是在蔬菜和可食用水果中发现的化学物质。它们在植物中起着重要的作用，充当保护分子使植物免受有害物剂(昆虫、细菌)或压力情况(uv、温度、缺水)的伤害。另外，植物化学物质在人和动物中显示出生物活性和健康效应。
4.类黄酮(flavonoid)是已被深入研究的多酚类，并且柑橘类水果被认为是类黄酮的主要来源，含有这些植物化学物质中的多种。这些化合物中的一些具有抗炎、抗氧化和抗菌特性。由于其令人关注的功能，正在研究来自不同来源的类黄酮在动物生产中的不同应用。ca(西班牙英明公司(interquim,s.a.,spain))是来自苦橙(bitter orange，citrus aurantium)的提取物，苦橙的主要类黄酮是柚皮苷。柚皮苷是一种分类为新橙皮糖苷型的糖基化的黄烷酮(flavanone)，其具有附接至其作为黄烷酮的基本结构的新橙皮糖(鼠李糖基
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α
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1,2葡萄糖)。其他含有柚皮苷的提取物在调节肥育肉牛的瘤胃(rumen)ph以及降低来自饲喂高精料饮食的肉牛的体外甲烷产生方面显示出有益的效果。柚皮苷的特性可能影响瘤胃微生物群，从而增加消耗乳酸的细菌如埃氏巨型球菌(megasphaera elsdenii)的浓度，进而产生更高瘤胃ph，并抑制产甲烷古菌群落(pct申请号wo2013156574)。也已改变瘤胃挥发性脂肪酸(vfa)组合物，从而增加丙酸的摩尔比例。因为丙酸是饲喂高淀粉饮食的反刍动物中摄食量的重要调节剂，会影响饱腹感和饥饿感，所以补充类黄酮可能影响饲喂高精料饮食的公牛的进食模式。此外，该补充可减少甲烷产生，且同时减少瘤胃ph波动可增加小公牛的营养素利用效率。
5.然而，柑橘类黄酮可以调节进食及动物行为的机制尚且未知。柚皮苷为一些柑橘类水果中负责典型苦味的类黄酮，因此另一种可能的机制可能与人及动物可感知的五种基本味道(甜味、咸味、苦味、酸味及鲜味)之一的苦味相关。最新研究表明味觉受体(包括苦味受体(tas2r))皆在胃肠道中表达，包括反刍动物和猪。因此，苦味受体可以调节动物的进食模式，从而减小饱餐大小、改良消化上皮健康参数且因此增加动物福利(animal welfare)。营养胃肠道可以对动物行为具有影响，从而调节性行为和攻击行为以及经口非营养行为，因为在消化道与中枢神经系统之间存在连接，其也称为肠
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脑轴，其中消化性微生物为关键参与者。
6.迄今已在本领域中提出若干种解决方案，以便改良动物行为且因此改良动物福利。然而，仍难以获得在动物中具有长期作用的天然物质，因为动物似乎习惯于这些物质且因此随着时间其积极作用消失。
7.因此，本领域需要新的方法，这些方法能够提供对参与肠
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脑轴的一些特异性基因受体的基因表达的靶向调节，这些基因受体也即苦味受体和免疫力受体，其积极影响摄食行为、胃肠微生物、炎症反应和动物行为。
8.此外，本发明的目的为提供替代性动物饲料组合物，该饲料组合物包含天然来源的化合物且能够安全用于畜牧业并有效改良进食行为及其对消化干扰、动物行为及因此动物福利的影响。
9.在本发明及其特定实施方案中，以上问题已得到解决。
附图说明
10.图1表示饲喂补充或未补充ca的高精料饮食的公牛的非对抗互动。
11.图2表示饲喂补充或未补充ca的高精料饮食的公牛的对抗互动。
12.图3表示饲喂补充或未补充ca的高精料饮食的公牛的性互动。
13.图4表示处理168天后饲喂补充或未补充bioflavex ca的高精料饮食的holstein公牛的瘤胃中相对基因表达比率。
14.图5表示在饲喂对应于t1：基础饮食和t2：t1 苦橙提取物(300g/tm)的两种饮食7天后仔猪空肠中tas2r的相对基因表达比率。
15.图6表示处理168天后饲喂补充或未补充bioflavex ca的高精料饮食的holstein公牛的十二指肠中相对基因表达比率。


技术实现要素：

16.在第一方面，本发明涉及一种用于靶向调节反刍动物和/或猪中至少一种苦味受体和/或至少一种肠
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脑轴受体的基因表达的非治疗方法，所述方法包括施用柚皮苷、柚皮素或其混合物。
17.在第二方面，本发明涉及一种柚皮苷、柚皮素或其混合物，所述柚皮苷、柚皮素或其混合物用于调节反刍动物和/或猪中至少一种免疫相关基因的基因表达。
具体实施方式
18.本发明涉及柚皮苷、其苷元形式柚皮素或其混合物在调节反刍动物和/或猪的某些特定基因受体的表达中的用途，这对摄食行为、摄入模式和动物行为具有积极影响。
19.在第一方面，本发明涉及一种用于靶向调节反刍动物和/或猪中至少一种苦味受体和/或至少一种肠
‑
脑轴受体的基因表达的非治疗方法，所述方法包括施用柚皮苷、柚皮素或其混合物。
20.如本文所使用的术语“基因表达的靶向调节”意指包括基因表达的减少以及所述基因表达的扩增。
21.本发明的作者现在已经发现，柚皮苷、柚皮素或其混合物施用于反刍动物和/或猪，显著改变参与味知觉、炎症和肠
‑
脑串扰(crosstalk)机制的反刍动物的瘤胃上皮中或猪的肠中某些基因的表达。这种效应解释了反刍动物和/或猪的进食模式和动物行为方面观察到的差异。
22.此外，还令人惊讶地发现，补充有柚皮苷、柚皮素或其混合物的反刍动物改变了其
进食模式(减少了饱餐大小并且花费更多的时间进食草料)，并改善了瘤胃壁健康参数。此外，还观察到补充有柚皮苷、柚皮素或其混合物的反刍动物减少了争斗行为和性互动。
23.苦味受体
24.在本发明的一个实施方案中，所述苦味受体选自由以下组成的组：tas2r7、tas2r16、tas2r38和tas2r39。
25.味觉受体最初发现于位于舌头和口腔不同部位中的味蕾中。最近，许多研究描述了在包括呼吸系统和胃肠道的整个身体中存在的基本味觉(甜味、苦味、鲜味、酸味和咸味)的味觉受体。这种外周味觉系统将具有以下功能：品尝消化道的管腔内容物，并调节营养转运蛋白的表达、营养素的摄取并且还调节参与调节胃肠功能、摄食和饱腹感的胃肠激素和神经递质的释放。
26.苦味分子触发厌食激素和肽的释放，如胆囊收缩素(cck)、神经肽y(npy)和肽yy(pyy)。这将是一个合乎逻辑的反应，因为苦味往往与毒素的存在有关，并且被认为具有负值。因此，消化道中厌食反应(anorexygenic response)的激活将是对这种味道的适应性反应。进食和动物(社交和性)行为可能是相关的。已经描述了一些营养策略集中在增加进食时间，减少动物的攻击行为和异常行为。
27.本发明的作者发现，在视频扫描过程期间，补充有柚皮苷、柚皮素或其混合物的公牛投入更多的时间进食精料或反刍。参见例如，实例1中公开的动物行为(表7和表8)。因此，投入更多时间在摄食活动上的动物有较少的时间进行其他行为，如攻击行为和性互动。这时，消化道中的苦味受体在调节进食行为和动物行为方面起着重要作用。此外，令人惊讶的是，类黄酮的补充改变了瘤胃壁中(如实例1(表11)中可以看出)以及十二指肠上皮中(如实例3(图6)中可以看出)分析的所有苦味受体(tas2r7、tas2r16、tas2r38和tas2r39)的基因的表达。虽然柚皮苷有一种特有的苦味，但它被酶快速去糖基化为柚皮素，并且瘤胃微生物群落也能将柚皮苷降解为柚皮素。与柚皮苷相反，柚皮素作为一种重要的苦味掩蔽分子，并且该特性在食品工业中是众所周知的，其主要用于饮料(us 8,685,436)。已经描述了一些黄烷酮如何作为人苦味受体tas2r39的实际拮抗剂，可能通过作用于苦味受体的单个结合袋的顺位机制(orthosteric mechanism)降低受体反应。实例1和实例3显示在补充柑橘类黄酮的公牛中分析的四种苦味受体(tas2r7、tas2r16、tas2r38和tas2r39)的基因表达降低。这些结果与柚皮素作为苦味掩蔽分子的功能一致，同时作为不同苦味受体的拮抗剂。这种所分析的苦味受体的基因表达的减少可能与饲喂的公牛中观察到的更长的进食时间有关。因此，在公牛中补充柑橘类黄酮调节了进食模式，作用是调节瘤胃壁和十二指肠中表达的苦味受体，从而改变参与饥饿感和饱腹感的激素和生物活性肽的释放。因此，柑橘类黄酮可能在瘤胃中充当苦味掩蔽分子，并且补充这些类黄酮的公牛花更多的时间进食，表现出较少的激动剂和性互动。
28.在猪的情况下，当添加柑橘类黄酮到断奶仔猪的饲料中时，与未补充的动物相比，所有分析的苦味受体(tas2r7、tas2r16、tas2r38和tas2r39)在空肠处的基因表达更高，如从实例2，图5中可以看出。
29.如本文所使用的术语“类黄酮”是指在花瓣中产生黄色或红色/蓝色色素的一类水溶性植物色素。术语“黄烷酮”是指一种类黄酮。黄烷酮通常在位置七处被二糖糖基化，以给出“黄烷酮糖苷”。
30.肠
‑
脑轴受体
31.在本发明的另一个实施方案中，所述肠
‑
脑轴受体选自由以下组成的组：ffar2、ffar3、ppyr1和cckbr。
32.肠
‑
脑轴已经被提议作为消化系统和大脑之间的通信网络，并且可能影响人和其他动物的行为。已经提出，瘤胃可能参与了肉牛中消化系统和大脑之间的串扰，并且改变动物的攻击行为和性行为可能与该行为调节有关。他们观察到饮食改变了饲喂高精料饮食的牛的瘤胃中的不同基因(ffar3、ppyr1、adra2c、occluding和tnfα)的表达，该瘤胃可能参与肠
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脑轴。这些作者提出，瘤胃在消化系统和大脑之间的串扰，以及改变动物的攻击行为和性行为中可能起着重要的作用。令人惊讶的是，本发明的结果显示与神经递质相关的受体的基因表达明显下降，如补充类黄酮的公牛中的cckbr(作为cck和胃泌素受体)和ppyr(作为npy和pyy受体)，如在实例1(表11)和实例3(图6)中可以看出。这些结果与在这些动物的瘤胃壁和十二指肠中分析的苦味受体的表达的降低一致，因为这些受体参与这些厌食分子的释放。
33.在本发明的另一个实施方案中，该至少一种所述受体的基因表达降低。在本发明的一个优选实施方案中，至少一个所述受体的基因表达降低至少20％，优选地，降低至少30％，更优选地，降低至少40％。
34.如在以下的实例中所示，本发明人惊讶地发现，通过向反刍动物施用根据本发明的饲料组合物，相对于那些未饲喂这样的组合物的反刍动物，苦味受体和肠
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脑轴受体的表达显著降低。
35.如本文所使用的，术语“反刍动物”是指反刍亚目的任何偶蹄动物哺乳动物。所述哺乳动物反刍并且有四个区室的胃，其中之一是瘤胃。该组尤其包括，牛、水牛、绵羊、鹿、骆驼、山羊和羚羊。术语“牛”应理解为包括奶牛、小牛和公牛。在本发明的另一个实施方案中，第一方面的反刍动物是牛、水牛、绵羊、鹿、骆驼、山羊或羚羊。在本发明的一个优选实施方案中，所述反刍动物是牛。
36.如本文所使用的，术语“猪”是指猪科家族的任何哺乳动物。所述猪科是结实的动物，具有小眼睛，粗糙、有时稀疏的毛发。所有的猪科都具有呈圆形软骨盘的鼻口末端，用来挖掘食物。一些物种具有獠牙。猪科是杂食性的，并且通常是群居的。该群组尤其包括猪、野猪或家猪、肉猪和公猪。在本发明的另一个实施方案中，第一个方面的猪是野猪或家猪、肉猪或公猪。
37.在本发明的另一个实施方案中，将所述量的柚皮苷、柚皮素或其混合物作为与饲料的混合物施用，其中所述饲料组合物包含至少0.005％w/w的柚皮苷、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物。
38.在本发明的一个优选实施方案中，当将饲料组合物施用于反刍动物时，所述饲料组合物包含至少0.01％w/w的柚皮苷、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物。
39.在本发明的另一个优选实施方案中，当将饲料组合物施用于猪时，所述饲料组合物包含至少0.0075％w/w的柚皮苷、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物。
40.柚皮苷是介于黄烷酮柚皮素和二糖新橙皮糖之间的一种黄烷酮
‑7‑
o
‑
糖苷。类黄
酮柚皮苷天然存在于柑橘类水果中，尤其是在葡萄柚中，其中柚皮苷是造成水果苦味的原因。在商业葡萄柚汁生产中，柚苷酶可以用于去除柚皮苷产生的苦味。在人中，柚皮苷被肠道中存在的柚苷酶代谢为苷元柚皮素(不是苦味)。柚苷酶是一种多酶复合物，该多酶复合物具有α
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l
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鼠李糖苷酶和β
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d
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葡萄糖苷酶活性中心。这发生在两个步骤中，首先，柚皮苷被柚苷酶的α
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l
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鼠李糖苷酶活性水解成鼠李糖和洋李甙(prunin)。形成的洋李甙然后被柚苷酶的β
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d
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葡萄糖苷酶活性水解成柚皮素和葡萄糖(参见方案1)。柚苷酶是广泛存在于自然界中的一种酶，并且它是由许多微生物(主要是真菌、酵母和细菌)产生。虽然葡萄糖苷可以被肠道乳糖酶
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根皮苷水解酶或小肠上皮细胞β
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葡萄糖苷酶裂解，但不存在人α
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l
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鼠李糖苷酶或芦丁糖苷酶，并且含有类黄酮的鼠李糖的生物利用度完全取决于肠道菌群对它们的裂解。在猪的肠道中也可以发现这些酶。然而，在反刍动物中，它们在瘤胃中。
[0041][0042]
方案1.通过柚苷酶水解柚皮苷以给出柚皮素。
[0043]
柚皮素具有黄烷酮的骨架结构，在4'、5和7碳处具有三个羟基基团。它可以以糖苷配基(aglycol)形式(柚皮素)或其糖苷形式(柚皮苷)发现，该柚皮苷添加了经由糖苷键附接至碳7处的二糖新橙皮糖。
[0044]
该等摩尔量的柚皮素、或柚皮苷与柚皮素的混合物意味着，例如，考虑到分子量，以％w/w计，柚皮素相当于柚皮苷的量。例如，0.01％w/w的柚皮苷将相当于0.0053％w/w的柚皮素。
[0045]
在本发明的另一个优选实施方案中，所述饲料组合物以糊状或颗粒状的形式施用。
[0046]
饲喂方式不限于任何特定的饲喂方式，并且本发明的饲料组合物可以通过顶施于配合饲料上方来给予，或在本饲料组合物与配合饲料混合后饲喂。
[0047]
根据本发明的饲料组合物的形状不限于任何特定形状，并且可以是常规饲料组合物的任何形式，例如粉末状或糊状和颗粒状。此外，所述饲料组合物可以根据通常用于生产配合饲料和饲料补充剂的方法来生产。
[0048]
根据本发明的组合物可以含有其它饲料成分，例如维生素、酶、矿物盐、研磨的谷物、含蛋白质的组分、含碳水化合物的组分、小麦次粉(wheat middlings)和/或麸皮粉。
[0049]
本发明的饲料组合物可以是任何种类的动物饲料，其可能的组合物为本领域技术人员所熟知，根据特定动物的营养需求和特定年龄时间段而设计。例如，仔猪饲料典型地含有谷物，如玉米、小麦、大豆、大麦或燕麦；不同的蛋白质来源，例如像鱼粉、大豆粕或动物血浆；氨基酸，如甲硫氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、精氨酸、组氨酸或亮氨酸；以及满足仔猪生长所需的维生素和矿物质(美国国家研究委员会(u.s.national research council),nrc,2012)。
[0050]
在本发明的另一个实施方案中，将柚皮苷、柚皮素或其混合物以每kg动物体重0.001至0.01g柚皮苷的日剂量、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物施用。在本发明的一个优选实施方案中，将柚皮苷、柚皮素或其混合物以每kg动物体重0.002至0.003g柚皮苷的日剂量、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物施用。
[0051]
在本发明的另一个实施方案中，柚皮苷、柚皮素或其混合物呈天然植物提取物的形式。
[0052]
在本发明的另一个优选实施方案中，所述天然植物提取物是苦橙提取物。在本发明的另一个优选实施方案中，所述苦橙提取物另外包含至少一种黄烷酮糖苷，该黄烷酮糖苷选自由以下组成的组：新橙皮苷、异柚皮苷、枸橘苷、橙皮苷及其混合物。
[0053]
在本发明的另一个优选实施方案中，所述苦橙提取物是包含以下的混合物：20％至35％w/w的柚皮苷、10％至20％w/w的新橙皮苷和0.5％至5％w/w的枸橘苷，优选地，所述苦橙提取物包含21％至30％w/w的柚皮苷、11％至18％w/w.的新橙皮苷和1％至5％w/w的枸橘苷，更优选地，所述苦橙提取物包含25％至27％w/w的柚皮苷、11％至15％w/w的新橙皮苷和1％至3％w/w的枸橘苷。在特定情况下，所述天然植物提取物是可商购的
[0054]
因此，根据本发明，本发明的柚皮苷、柚皮素或其混合物可以从植物，更具体地从柑橘类植物获得。根据本发明的所有产品都是天然来源并且容易获得的产品。
[0055]
如本文所使用的，术语“柑橘”是指柑橘属植物。所述柑橘类植物的实例包括柚子(citrus maxima，pomelo)、枸橼(citrus medica，citron)、柑橘(citrus reticulata，mandarin orange)、苦橙(citrus aurantium，bitter orange)、波斯青柠(citrus latifolia，persian lime)、柠檬(citrus limon，lemon)、葡萄柚(citrus paradisi，grapefruit)、甜橙(citrus sinensis，sweet orange)、枸橘(citrus trifoliata，trifoliate orange)等。
[0056]
从植物中分离类黄酮的方法在现有技术中是熟知的。在特定情况下，苦橙提取物可以通过本领域技术人员熟知的一般方法(例如提取、过滤、浓缩、沉淀、澄清和最终干燥)从研磨的柑橘类水果(尤其是苦橙)中获得。提取过程可以在二元烷醇/水体系中进行，其中该烷醇选自甲醇、乙醇、丙醇等。优选地使用甲醇。作为说明性的、非限制性的实例，用300ml的甲醇提取50g的干苦橙。将悬浮液离心以分离残余物，并且将母液真空浓缩至50ml的最终体积。将所得液体在室温下静置五天，过滤以分离不溶物质，浓缩，再次通过硅藻土床过滤并喷雾干燥。
[0057]
在一个具体实施方案中，所述黄烷酮(flavanone)可以从柑橘类植物的果实中获得。例如，柚皮苷是一种糖基化的黄烷酮，从一些柠檬的水果(例如，葡萄柚和苦橙)的皮中获得。它也在水果的果肉和植物的叶子、花和种子中发现。根据本发明的用于分离类黄酮的说明性、非限制性方法是例如在文件us 2421063 a和us 2421062 a中描述的那些方法，其中描述了从植物材料中回收柚皮苷的方法。此外，橙皮苷可以根据文件us 2442110 a、us 2348215 a和us 2400693 a中描述的方法获得。同样，可以根据文件us 3375242 a中描述的方法获得新橙皮苷。us 3375242 a描述了一种生产新橙皮苷的方法，其中柚皮苷与异香兰素反应以产生新橙皮苷查尔酮。然后将该查尔酮环化以产生新橙皮苷。
[0058]
此外，本发明组合物的黄烷酮(flavonone)可以容易地获得，因为它们是可商购的。例如，如伴随本发明的实例中所示，异柚皮苷、新儿茶素(neoeritrocin)和枸橘苷购自indofine化学公司(indofine chemical company,inc)(美国)。此外，如上所述，根据本发明的所述天然植物提取物是可商购的
[0059]
在本发明的另一个实施方案中，所述苦橙提取物以0.005g/kg动物体重至0.02g/kg动物体重的日剂量施用，优选地所述苦橙提取物以0.01g/kg动物体重的日剂量施用。
[0060]
在本发明的另外的实施方案中，包含向反刍动物和/或猪施用柚皮苷、柚皮素或其混合物持续至少5天。在本发明的一个优选实施方案中，包含向猪施用柚皮苷、柚皮素或其混合物持续至少10天。在另一个优选的实施方案中，包含向反刍动物施用柚皮苷、柚皮素或其混合物持续至少15天。
[0061]
免疫相关基因
[0062]
在第二方面，本发明涉及一种柚皮苷、柚皮素或其混合物，所述柚皮苷、柚皮素或其混合物用于调节反刍动物和/或猪中至少一种免疫相关基因的基因表达。
[0063]
如本文所使用的术语“基因表达的调节”意指包括基因表达的减少以及所述基因表达的扩增。还应理解的是，基因表达的这种调节还可导致反刍动物和/或猪中至少一种免疫相关基因的产生的调节。因此，任何免疫相关基因的基因表达的减少将导致所述基因产生的减少和炎症的进一步调节。
[0064]
此外，本发明的作者发现补充柑橘类黄酮明显降低了公牛瘤胃壁中与炎症相关的受体的基因表达。炎症已被认为可能通过肠
‑
脑轴串扰在动物福利和行为中起重要作用。炎症可能参与血清中血清素水平的降低，因为生产犬尿碱的氨基酸色氨酸的使用增加。血清素是一种在肠
‑
脑轴内起重要作用的神经递质，并且与情绪调节和攻击行为的减少有关。此外，选择性血清素再摄取抑制剂(其增加细胞外血清素)与人中性欲降低和性问题有关。il
‑
25由多种细胞(包括免疫和非免疫细胞(上皮细胞和内皮细胞))产生，并且它可以加强过敏性炎症。防御素
‑
β是一种抗微生物肽，并且对哺乳动物的先天性和适应性免疫过程具有调
节作用。因此，实例1(参见表11)和实例3显示补充柑橘类黄酮降低了这些促炎分子的基因表达，并且这可能导致瘤胃壁和十二指肠中炎症反应和炎症的减少。此外，柚皮素作为一种有效的抗氧化剂，其抗炎作用符合现有技术。此外，如表7和8中所列，所获得的结果表明，补充柑橘类黄酮的公牛的攻击行为和性互动减少，瘤胃基因表达数据将支持瘤胃炎症的减少可能是该反应的关键参与原因。
[0065]
总之，精料摄入调节(投入进食的时间)与瘤胃壁中的炎症和其他肠脑串扰机制一起参与改善动物行为和动物福利，并补充柑橘类黄酮。
[0066]
如本文所使用的术语“动物福利”包括三个要素：动物的正常生理功能(除其他之外，这意味着确保动物健康和营养良好)、其情绪状态(包括没有负面情绪，如疼痛和慢性恐惧)、以及其表达某些正常行为的能力。尽管如此，就动物福利而言，并非所有行为都同等重要。从实践的角度来看，给定行为重要的最明确迹象是在被阻止进行该行为时动物是否显示出压力反应或表现出异常行为。母猪产前筑巢行为或猪的觅食行为是这种重要行为的例子。这三个原则不一定互相矛盾；事实上，它们通常是互补的。
[0067]
在第二方面的一个实施方案中，该免疫相关基因选自由以下组成的组：il
‑
6、il
‑
8、il
‑
10、il
‑
25和β
‑
防御素。
[0068]
在第二方面的另一个实施方案中，该至少一种所述受体的基因表达降低。在本发明的一个优选实施方案中，至少一个所述受体的基因表达降低至少20％，优选地，降低至少30％，更优选地，降低至少40％。
[0069]
如在以下的实例中所示，本发明人惊讶地发现，通过向反刍动物施用根据本发明的饲料组合物，相对于那些未饲喂这样的组合物的反刍动物，免疫相关基因的表达显著降低。
[0070]
在第二方面的另一个实施方案中，所述反刍动物是牛、水牛、绵羊、鹿、骆驼、山羊或羚羊。在本发明的一个优选实施方案中，所述反刍动物是牛。
[0071]
在第二方面的另一个实施方案中，所述猪是野猪或家猪、肉猪或公猪。
[0072]
在第二方面的另一个实施方案中，将所述产品作为与饲料的混合物施用，其中所述饲料组合物包含至少0.005％w/w的柚皮苷、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物。该产品意指包括柚皮苷、柚皮素或其混合物。
[0073]
在第二方面的一个优选实施方案中，当将饲料组合物施用于反刍动物时，所述饲料组合物包含至少0.01％w/w的柚皮苷、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物。
[0074]
在第二方面的另一个优选实施方案中，当将饲料组合物施用于猪时，所述饲料组合物包含至少0.0075％w/w的柚皮苷、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物。
[0075]
在第二方面的另一个优选实施方案中，所述饲料组合物以糊状或颗粒状的形式施用。
[0076]
在第二方面的另一个实施方案中，将所述产品以每kg动物体重0.001至0.01g柚皮苷的日剂量、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物施用。在第二方面的一个优选实施方案中，将该产品以每kg动物体重0.002至0.003g柚皮苷的日剂量、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合
物施用。
[0077]
在第二方面的另一个实施方案中，所述产品呈天然植物提取物的形式。在第二方面的另一个优选实施方案中，所述天然植物提取物是苦橙提取物。在另一个优选实施方案中，所述苦橙提取物另外包含至少一种黄烷酮糖苷，该黄烷酮糖苷选自由以下组成的组：新橙皮苷、异柚皮苷、枸橘苷、橙皮苷及其混合物。
[0078]
在第二方面的另一个优选实施方案中，所述苦橙提取物是包含以下的混合物：20％至35％w/w的柚皮苷、10％至20％w/w的新橙皮苷和0.5％至5％w/w的枸橘苷，优选地，所述苦橙提取物包含21％至30％w/w的柚皮苷、11％至18％w/w.的新橙皮苷和1％至5％w/w的枸橘苷，更优选地，所述苦橙提取物包含25％至27％w/w的柚皮苷、11％至15％w/w的新橙皮苷和1％至3％w/w的枸橘苷。
[0079]
在第二方面的另一个实施方案中，所述苦橙提取物以0.005g/kg动物体重至0.02g/kg动物体重的日剂量施用，优选地所述苦橙提取物以0.01g/kg动物体重的日剂量施用。
[0080]
在第二方面的另外的实施方案中，包含向反刍动物和/或猪施用所述产品持续至少5天。在第二方面的一个优选实施方案中，包含向猪施用所述产品持续至少10天。在另一个优选的实施方案中，包含向反刍动物施用所述产品持续至少15天。
[0081]
在第二方面的另外的实施方案中，涉及用于治疗或预防在反刍动物和/或猪中具有炎症反应的疾病的柚皮苷、柚皮素或其混合物。
[0082]
反刍动物中细菌引起的主要炎症性神经疾病是：李斯特菌病、化脓性软脑膜炎和脑膜脑炎、脑和脊髓脓肿、基底脓胸和神经结核。
[0083]
本发明的其他方面和实施方案在以下条款中描述：
[0084]
条款1.
‑
一种用于靶向调节反刍动物和/或猪中至少一种苦味受体和/或至少一种肠
‑
脑轴受体的基因表达的非治疗方法，所述方法包括施用柚皮苷、柚皮素或其混合物。
[0085]
条款2.
‑
根据条款1所述的方法，其中所述苦味受体选自由以下组成的组：tas2r7、tas2r16、tas2r38和tas2r39。
[0086]
条款3.
‑
根据条款1所述的方法，其中所述肠
‑
脑轴受体选自由以下组成的组：ffar2、ffar3、ppyr1和cckbr。
[0087]
条款4.
‑
根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述至少一种所述受体的基因表达降低。
[0088]
条款5.
‑
根据前述条款中任一项所述的方法，其中该至少一种所述受体的基因表达降低至少20％。
[0089]
条款6.
‑
根据前述条款中任一项所述的方法，其中该至少一种所述受体的基因表达降低至少30％。
[0090]
条款7.
‑
根据前述条款中任一项所述的方法，其中该至少一种所述受体的基因表达降低至少40％。
[0091]
条款8.
‑
根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述反刍动物是牛、水牛、绵羊、鹿、骆驼、山羊或羚羊。
[0092]
条款9.
‑
根据前述条款中任一项所述的方法，其中所述反刍动物是牛。
[0093]
条款10.
‑
根据条款1至7中任一项所述的方法，其中所述猪是野猪或家猪、肉猪或
公猪。
[0094]
条款11.
‑
根据前述条款中任一项所述的方法，其中将所述量的柚皮苷、柚皮素或其混合物作为与饲料的混合物施用，其中所述饲料组合物包含至少0.005％w/w的柚皮苷、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物。
[0095]
条款12.
‑
根据前一项条款所述的方法，其中当将饲料组合物施用于反刍动物时，所述饲料组合物包含至少0.01％w/w的柚皮苷、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物。
[0096]
条款13.
‑
根据条款11所述的方法，其中当将饲料组合物施用于猪时，所述饲料组合物包含至少0.0075％w/w的柚皮苷、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物。
[0097]
条款14.
‑
根据条款11至13中任一项所述的方法，其中所述饲料组合物以糊状或颗粒状的形式施用。
[0098]
条款15.
‑
根据前述条款中任一项所述的方法，其中将柚皮苷或柚皮素或其混合物以每kg动物体重0.001至0.01g柚皮苷的日剂量、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物施用。
[0099]
条款16.
‑
根据前述条款中任一项所述的方法，其中将柚皮苷或柚皮素或其混合物以每kg动物体重0.002至0.003g柚皮苷的日剂量、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物施用。
[0100]
条款17.
‑
根据前述条款中任一项所述的方法，其中柚皮苷、柚皮素或其混合物呈天然植物提取物的形式。
[0101]
条款18.
‑
根据前一项条款所述的方法，其中所述天然植物提取物是苦橙提取物。
[0102]
条款19.
‑
根据前一项条款所述的方法，其中所述苦橙提取物另外包含至少一种黄烷酮糖苷，该黄烷酮糖苷选自由以下组成的组：新橙皮苷、异柚皮苷、枸橘苷、橙皮苷及其混合物。
[0103]
条款20.
‑
根据条款18至19中任一项所述的方法，其中所述苦橙提取物是包含20％至35％w/w的柚皮苷、10％至20％w/w的新橙皮苷和0.5％至5％w/w的枸橘苷的混合物。
[0104]
条款21.
‑
根据条款18至20中任一项所述的方法，其中所述苦橙提取物包含21％至30％w/w的柚皮苷、11％至18％w/w.的新橙皮苷和1％至5％w/w的枸橘苷。
[0105]
条款22.
‑
根据条款18至21中任一项所述的方法，其中所述苦橙提取物包含25％至27％w/w的柚皮苷、11％至15％w/w的新橙皮苷和1％至3％w/w的枸橘苷。
[0106]
条款23.
‑
根据条款18至22中任一项所述的方法，其中将所述苦橙提取物以每kg动物体重0.005g至每kg动物体重0.02g的日剂量施用。
[0107]
条款24.
‑
根据条款18至23中任一项所述的方法，其中将所述苦橙提取物以每kg动物体重0.01g的日剂量施用。
[0108]
条款25.
‑
根据前述条款中任一项所述的方法，该方法包括向反刍动物和/或猪施用柚皮苷、柚皮素或其混合物持续至少5天。
[0109]
条款26.
‑
根据前一项条款所述的方法，该方法包括向猪施用柚皮苷、柚皮素或其混合物持续至少10天。
[0110]
条款27.
‑
根据条款25所述的方法，该方法包括向反刍动物施用柚皮苷、柚皮素或
其混合物持续至少15天。
[0111]
条款28.
‑
用于下列用途的柚皮苷、柚皮素或其混合物，所述柚皮苷、柚皮素或其混合物用于调节反刍动物和/或猪中至少一种免疫相关基因的基因表达。
[0112]
条款29.
‑
根据前一项条款的用于所述用途的产品，其中所述免疫相关基因选自由以下组成的组：il
‑
6、il
‑
8、il
‑
10、il
‑
25和β
‑
防御素。
[0113]
条款30.
‑
根据条款28至29中任一项的用于所述用途的产品，其中该至少一种所述受体的基因表达降低。
[0114]
条款31.
‑
根据条款28至30中任一项的用于所述用途的产品，其中该至少一种所述受体的基因表达降低至少20％。
[0115]
条款32.
‑
根据条款28至31中任一项的用于所述用途的产品，其中该至少一种所述受体的基因表达降低至少30％。
[0116]
条款33.
‑
根据条款28至32中任一项的用于所述用途的产品，其中该至少一种所述受体的基因表达降低至少40％。
[0117]
条款34.
‑
根据条款28至33中任一项的用于所述用途的产品，其中所述反刍动物是牛、水牛、绵羊、鹿、骆驼、山羊或羚羊。
[0118]
条款35.
‑
根据条款28至34中任一项的用于所述用途的产品，其中所述反刍动物是牛。
[0119]
条款36.
‑
根据条款28至35中任一项的用于所述用途的产品，其中所述猪是野猪或家猪、肉猪或公猪。
[0120]
条款37.
‑
根据条款28至36中任一项的用于所述用途的产品，其中将所述产品作为与饲料的混合物施用，其中所述饲料组合物包含至少0.005％w/w的柚皮苷、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物。
[0121]
条款38.
‑
根据前一项条款的用于所述用途的产品，其中当将饲料组合物施用于反刍动物时，所述饲料组合物包含至少0.01％w/w的柚皮苷、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物。
[0122]
条款39.
‑
根据条款37的用于所述用途的产品，其中当将饲料组合物施用于猪时，所述饲料组合物包含至少0.0075％w/w的柚皮苷、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物。
[0123]
条款40.
‑
根据条款37至39中任一项的用于所述用途的产品，其中所述饲料组合物以糊状或颗粒状的形式施用。
[0124]
条款41.
‑
根据条款28至40中任一项的用于所述用途的产品，其中将所述产品以每kg动物体重0.001至0.01g柚皮苷的日剂量、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物施用。
[0125]
条款42.
‑
根据条款28至41中任一项的用于所述用途的产品，其中将该产品以每kg动物体重0.002至0.003g柚皮苷的日剂量、或等摩尔量的柚皮素、或如果两者都存在等摩尔量的柚皮苷和柚皮素的混合物施用。
[0126]
条款43.
‑
根据条款28至42中任一项的用于所述用途的产品，其中所述产品呈天然植物提取物的形式。
[0127]
条款44.
‑
根据前一项条款的用于所述用途的产品，其中所述天然植物提取物是苦
橙提取物。
[0128]
条款45.
‑
根据前一项条款的用于所述用途的产品，其中所述苦橙提取物另外包含至少一种黄烷酮糖苷，该黄烷酮糖苷选自由以下组成的组：新橙皮苷、异柚皮苷、枸橘苷、橙皮苷及其混合物。
[0129]
条款46.
‑
根据条款44至45中任一项的用于所述用途的产品，其中所述苦橙提取物是包含20％至35％w/w的柚皮苷、10％至20％w/w的新橙皮苷和0.5％至5％w/w的枸橘苷的混合物。
[0130]
条款47.
‑
根据条款44至46中任一项的用于所述用途的产品，其中所述苦橙提取物包含21％至30％w/w的柚皮苷、11％至18％w/w的新橙皮苷和1％至5％w/w的枸橘苷。
[0131]
条款48.
‑
根据条款44至47中任一项的用于所述用途的产品，其中所述苦橙提取物包含25％至27％w/w的柚皮苷、11％至15％w/w的新橙皮苷和1％至3％w/w的枸橘苷。
[0132]
条款49.
‑
根据条款44至48中任一项的用于所述用途的产品，其中将所述苦橙提取物以每kg动物体重0.005g至每kg动物体重0.02g的日剂量施用。
[0133]
条款50.
‑
根据条款44至49中任一项的用于所述用途的产品，其中将所述苦橙提取物以每kg动物体重0.01g的日剂量施用。
[0134]
条款51.
‑
根据条款28至50中任一项的用于所述用途的产品，其包括向反刍动物和/或猪施用所述产品持续至少5天。
[0135]
条款52.
‑
根据前一项条款的用于所述用途的产品，其包括向猪施用所述产品持续至少10天。
[0136]
条款53.
‑
根据条款51的用于所述用途的产品或组合物，其包括向反刍动物施用所述产品持续至少15天。
[0137]
具体实施方案
[0138]
现在将参考以下实例更详细地描述本发明，这绝不应理解为限制本发明的范围。
[0139]
实例1：类黄酮对饲喂高精料饮食的公牛的性能、动物行为和瘤胃基因表达的影响
[0140]
材料与方法
[0141]
动物、饲喂、圈养和实验设计
[0142]
此研究根据西班牙实验动物保护指南(2月1日关于保护用于实验或其他科学目的的动物的皇家法令53/2013；西班牙官方通告(bolet
í
n oficial del estado)，2013)进行。将144头荷斯坦公牛(164.8
±
5.91kg体重(bw)且135
±
7.2日龄)在农场(granja l’alzina，l’alzina，lleida)的商业条件下进行育肥。动物被随机分配到八个完全覆盖的围栏(12x 6m)中的一个，这些围栏铺满草料，并配备了一个立体进料器(1.50m长，0.40m宽，1.50m高和0.35m深)。如verd
ú
等人(2017)所描述的，每个围栏的进料器都会连续称重精料，并记录这些数据以计算围栏的精料消耗量。
[0143]
围栏还配备了一个饮水器(0.30m长，0.30m宽，0.18m深)和一个记录每天围栏耗水量的水表。草料在单独的草料喂料器(3.60m长、1.10m宽、0.32m深)中随意提供，并且每次更换草料都要记录，以估计总草料消耗。由于草料也被用于垫料，这些数据只是估计。
[0144]
饲料消耗和生产性能(performance)
[0145]
动物以饮食形式饲喂商业精料，配制以满足动物的营养需求(nrc,2001)。在该研究的前112天，动物被饲喂生长(growing)精料配方，并且在112天后与该研究结束之间，动
物被饲喂肥育(finishing)精料。精料的成分和营养组合物在表1中示出。在整个研究中，动物可以随意获取小麦草料(3.5％cp，1.6％乙醚提取物、70.9％ndf和6.1％灰分；以dm为基础)和新鲜的水(fresh water)。
[0146]
表1.饲料精料的成分和营养素组合物
[0147][0148][0149]
dm：干物质；ufc：肉类饲料作物单位；cp：粗蛋白；ndf：中性洗涤纤维；tdn：总消化营养素；pdie：肠消化的蛋白质(proteing digested intestine，当瘤胃可发酵能量有限时
在小肠中消化的蛋白质)
‑
能量；pdin：肠消化的蛋白质(proteinn digested intestine，当瘤胃可发酵氮有限时在小肠中消化的蛋白质)
‑
氮；nfc：非纤维碳水化合物。
[0150]
动物被随机分配到8个围栏之一，并分配到两个处理(对照(c)或补充(bf)0.04％的富含柚皮苷>20％的完整果实(ca，英明公司(interquim,s.a.)，巴塞罗那，西班牙)的苦橙提取物(苦橙))之一(每个处理4个围栏)。
[0151]
在整个研究中，在14天的12个实验阶段中，每14天对动物单独称重，在前8个阶段期间(从1到112天)动物消耗生长精料，并且在最后4个时间段期间(从113到168天)和在屠宰前几天期间，动物消耗肥育精料(参见表1)。168天的研究之后，公牛被运输至位于农场15km的屠宰场(escorxador del grup alimentari guissona,guissona，西班牙)。在两周内屠宰动物，每周4个栏，两个栏来自c，两个栏来自bf公牛。在屠宰前等待的时间小于6h。在装载前称量动物。按照商业实践且遵循关于在屠杀或屠宰时保护动物的eu法规1099/2009来屠宰这些动物。记录每只动物的温屠体重量(hcw)。
[0152]
动物行为
[0153]
在研究的第15、30、43、57、71、85、94、112、127、141、155、和170日进行可视扫描程序以研究每个栏中动物的一般活动(站立、躺卧、进食、饮水、和反刍)及社会行为(非对抗、对抗、及性互动)。所记录的社会行为活动描述于表2中。在8:00至10:30h am同時对2个栏进行可视观测，如mach等人(2008)、rotger等人(2006)、robles等人(2007)、及mart
í
等人(2010)所述。以5min间隔使用10s的3次扫描取样对一般活动进行评分，且在5min三次连续取样时间段期间对社会行为进行评分。在每个栏内连续重复两次15min的该扫描程序，每扫描日在不同栏内随机开始。该方法描述了动物在固定时间间隔所表现的行为。
[0154]
表2.所记录的社会行为类别的描述。
[0155]
[0156][0157]
屠体品质
[0158]
在屠宰后，登记每只动物的温屠体重量(hcw)。通过将hcw除以屠宰前记录的体重(bw)来计算屠宰率。且根据eu法规第1208/81号和第1026/91号描述的(s)europ类别，对屠体的形态进行分类，其中“e”对应于极好形态，“u”对应于非常好形态，“r”对应于良好形态，“o”对应于一般形态，且“p”对应于差形态。脂肪覆盖率根据eu法规第1208/81号进行分类，该法规利用编号1.2.3.4.5的分类体系，其中5说明胸腔中有极高脂肪覆盖程度及大量脂肪沉积，且1经分类为低程度且无脂肪覆盖。
[0159]
瘤胃及肝脏宏观评估及样品收集
[0160]
在屠宰场宏观评估每只动物的瘤胃及肝脏。瘤胃根据可视评估的颜色分类为1至5，“5”为黑色瘤胃且“1”为白色瘤胃(gonz
á
lez等人,2001)。他们也根据lesmeister等人(2004)分成各区域以检查溃疡、光秃区、和成群乳突的存在(nocek等人,1984)。肝脓肿根据brown等人(1975)分类。
[0161]
另外，对各瘤胃部位的1
‑
cm2切片进行取样且在取样后用冷却pbs冲洗2次并立即在rna
‑
later(英杰公司(invitrogen)，马德里，西班牙)中温育以保留rna完整性。在4℃下用rna later温育24小时后，除去液体并将组织冷冻在
‑
80℃下，直至进行进一步rna提取及后续基因表达分析。
[0162]
生物和化学分析
[0163]
对各瘤胃部位的1
‑
cm2切片进行取样且在取样后以冷却磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)冲洗2次并立即在rna
‑
later(英杰公司(invitrogen)，马德里，西班牙)中温育以保留rna完整性。在4℃下用rna later温育24小时后，除去液体并将组织冷冻在
‑
80℃下，直至进行进一步rna提取及后续基因表达分析。
[0164]
在研究期间，在第0、42、84、126、和168日收集精料样品并分析其干物质(dm)(在103℃下24h)、灰分(在550℃下4h)；用kjeldahl方法(方法981.10；aoac,1995)分析粗蛋白(cp)；根据van soest等人(1991)使用亚硫酸钠和α
‑
淀粉酶分析酸性洗涤纤维(adf)及中性洗涤纤维(ndf)；且通过soxhlet使用先前酸水解(方法920.39；aoac,1995)分析醚提取物(ee)。
[0165]
每个样品的柚皮苷被确定为bf组的ca标记物，且将其用作品质对照分析以通过用于柚皮苷定量的英明公司(interquim s.a.)的实验室内部方法(使用通过英明公司(interquim s.a.)开发的hlpc)(paniagua等人,2018)保证将产品正确添加到饲料中。
[0166]
对于基因表达分析，使用trizol(英杰公司(invitrogen))自瘤胃壁组织提取总rna。使用primescript rt试剂盒(宝生物公司(takara)，法兰克福，德国)遵循制造商说明书将经分离mrna逆转录为cdna。通过nanodrop仪器(赛默飞世尔公司(thermofisher)，马德里，西班牙)在260、280、和230nm下评估rna纯度。通过定量pcr(qpcr)使用编码核糖体蛋白
亚基9(rps9)的基因作为持家基因来进行编码以下项的基因的表达的定量：1)编码以下神经递质的产生、表达、和周转的基因：游离脂肪酸受体2(ffar2)及游离脂肪酸受体3(ffar3)、胰多肽受体1(ppyr1)；胆囊收缩素b受体(cckbr)，2)编码促炎症性细胞因子或细胞因子il
‑
25(il25)和由肠细胞释放的抗微生物肽β
‑
防御素的基因，及3)苦味受体2型成员7、16、38和39(tas2r7、tas2r16、tas2r38和tas2r39)，遵循vandesompele等人(2002)检查该持家基因与编码β
‑
肌动蛋白(actb)、经泛表达的转录蛋白(uxt)及甘油醛3
‑
磷酸脱氢酶(gapdh)的基因相比的稳定性。单独优化各组引物的qpcr条件。通过在0.8％dna琼脂糖凝胶中在预期分子量下的单带判断鉴定及熔解曲线中的单峰来评估扩增的特异性。通过扩增各基因扩增子的系列1:10稀释液来计算效率。将交点(cq)的标准曲线相对于浓度的对数作图以获得效率，该效率使用公式10
1/斜率
计算，其可接受范围为1.8至2.2。使用20μl总反应体积，其含有50ng cdna、10μl sybr premix extaq(tlirnaseh)(宝生物公司(takara)，法兰克福，德国)及对于各基因而言经优化的引物浓度。qpcr反应周期如下：在95℃下的10min初始变性步骤，随后40个在95℃下10s、在各基因的经优化的退火温度下15s、在72℃下30s、及在72℃下10min最终延伸的周期。使用所得cq值，通过使用参考基因(持家基因)及对照组校准物进行相对定量来计算所选基因的相对表达。
[0167]
使用用硝基对苯二甲酸酯化的100％聚乙二醇组成的半毛细管管柱(15m
×
0.53mm i.d.，0.5
‑
μm膜厚，trb
‑
ffap；teknokroma公司(teknokroma)，巴塞罗那，西班牙)、经键合且经交联相(方法编号5560)使用cp
‑
3800
‑
gc(瓦里安公司(varian,inc.)，加州核桃溪市)分析瘤胃挥发性脂肪酸(vfa)浓度。
[0168]
结果
[0169]
动物健康
[0170]
来自对照组(c组)的两只动物由于跛行问题而未能完成该研究，且在第168日前去除。来自ca处理组(bf组或bf公牛)且完成该研究的一只动物由于长期健康问题也从数据库中去除。来自这些动物的所有数据均从数据库去除。
[0171]
摄取量及水消耗量、生产性能及屠体品质
[0172]
贯穿该研究在处理组(表3)之间，无论是生长期(表4)或肥育期(表5)期间，精料摄取量均未出现统计学差异。同样，在整个该研究期间(表3)，无论是生长期(表4)或肥育期(表5)，草料消耗的估算值均未显示统计学差异。贯穿该研究(表3)，无论是生长期(表4)或肥育期(表5)期间，水消耗量均未受到处理影响。
[0173]
表3.饲喂补充ca的高精料饮食的holstein公牛在0d至168日龄的生产性能、精料摄取量、及进食行为
[0174][0175]1对照＝未补充，ca＝补充0.04％ca的精料。
[0176]2t＝处理作用；时间＝时间作用(14天的时间段)；t x时间＝处理
×
时间交互作用。
[0177]3adg＝平均日增重
[0178]4sem＝对数转换数据均值的标准误差
[0179]
表4.饲喂补充ca的高精料饮食的holstein公牛在4至9个月的生产性能、精料摄取量、及进食行为
[0180]
[0181][0182]1对照＝未补充，ca＝补充0.04％ca的精料。
[0183]2t＝处理作用；时间＝时间作用(14天的时间段)；t x时间＝处理
×
时间交互作用。
[0184]
表5.饲喂补充ca的高精料饮食的holstein公牛在9至11个月的生产性能、精料摄取量、及进食行为
[0185][0186]1对照＝未补充，ca＝补充0.04％ca的精料。
[0187]2t＝处理作用；时间＝时间作用(14天的时间段)；t x时间＝处理
×
时间交互作用。
[0188]
生长期的平均日增重(adg)显示在表4中。在该期期间发现经分析生产参数的非统计学差异。然而，在肥育期期间，bf公牛(1.41
±
0.019kg/d)的adg大于(p<0.05)c组(1.36
±
0.019kg/d)，且该参数的cv为bf组(36.28
±
1.831％)小于(p<0.05)c公牛(42.83
±
1.831％)(表5)。另外，最终bw的cv为bf公牛(8.24
±
0.308％)大于(p＝0.01)c公牛(7.04
±
0.308％)。在研究结束时饲料转化率(fcr)倾向于(p＝0.10)为bf公牛(5.11
±
0.108kg/kg)小于c公牛(5.36
±
0.108kg/kg)，但bw(437.9
±
1.85kg)及精料摄取量(7.13
±
0.126kg/d)不受处理影响(表3)。已在肥育期期间对于fcr(p＝0.05)发现处理与时间之间的交互作用(表5)。
[0189]
总之，在该肥育期期间，bf公牛的adg更好，而精料摄取量无增加。因此，bf公牛在该肥育期期间更有效率，尽管fcr改良仅一个数值。然后，假设补充类黄酮的公牛可能减小饱餐大小，这可解释在肥育期期间的精料效率改良及这些bf动物表现更大adg。
[0190]
屠体品质数据呈现于表6中。最终bw(451.51
±
3.154kg)、屠宰率(52.94％
±
0.326)、屠体形态及脂肪评分未受处理影响。
[0191]
表6.饲喂补充ca的高精料饮食的holstein公牛的屠体品质。
[0192][0193][0194]1对照＝未补充，ca＝补充0.04％ca的精料。
[0195]2t＝处理作用；时间＝时间作用(14天的时间段)；t x时间＝处理
×
时间交互作用。
[0196]3屠体的形态：通过eu法规第1208/81号和第1026/91号描述的(s)europ类别，其中“e”对应于极好形态，“u”对应于非常好形态，“r”对应于良好形态，“o”对应于一般形态，且“p”对应于差形态
[0197]
动物行为
[0198]
生长期及肥育期的动物行为、一般活动及主动行为的所有术语分别显示于表7和表8中。
[0199]
一般活动。贯穿可视观测期(2:30h)，生长期(研究的0至112天)每个栏内站立、躺卧、进食草料及反刍的动物的百分比未发现统计学差异。与c组动物相比，bf公牛中进食精料的动物的百分比更大(p<0.01)，且在该生长期期间喝水的动物的比例也倾向于(p<0.10)bf公牛大于c公牛。
[0200]
对于肥育期，在可视观测期期间，每个栏内站立、躺卧、进食草料及饮水的动物的比例未发现差异。在该肥育期中，每个栏内进食精料的动物的比例倾向于(p<0.10)bf公牛大于c公牛，且在bf组中反刍的动物的比例大于(p<0.01)c公牛。
[0201]
主动行为。在生长期中，在可视扫描观测期期间，未受处理影响的唯一参数为社会行为。bf公牛的自梳理行为大于c组，且该c组所表现的经口非营养性行为多于(p＝0.01)bf组的公牛。这些结果图解显示于图1中。与对抗互动相关的所有行为在该生长期期间为统计学上有差异的(图2)，且c组的公牛更频繁的表现出这些行为。在c公牛中打斗行为大于(p<0.01)bf公牛，且c组的冲撞也大于(p<0.01)bf组。c组所表现的排挤互动大于(p<0.01)bf组。追跑及赶起互动偶然表现出，但c组大于(p<0.05)bf组。c公牛所表现的裂唇嗅行为大于(p＝0.05)bf组。另外，爬跨尝试及完成爬跨倾向于(p<0.10)c公牛大于bf组的公牛(图3)。
[0202]
在肥育期(113日至168日)期间，未观测到在各处理之间社会及经口行为的差异。c组的公牛倾向于(p<0.10)表现出较bf公牛多的自梳理行为(图1)。另外，对抗行为，如打斗及冲撞互动，c组大于(分别为p<0.001和p<0.001)bf组。此外，虽然排挤和追跑很少发生，但c组的公牛所表现的互动大于(在两种情況下均为p<.0001)bf公牛。关于性互动，c组所表现的爬跨尝试及完成爬跨大于(p<0.001)bf公牛，而裂唇嗅行为也倾向于(p<0.10)c公牛大于bf公牛。对抗及性互动结果图解显示于图2和3中。
[0203]
表7.行为，试验(研究)的1
‑
112天
[0204]
[0205][0206]1c＝对照，bf＝补充0.04％ca的精料
[0207]2t＝处理作用；时间＝时间作用(每14天进行测量)t x时间＝处理
×
时间交互作用。
[0208]3sem＝对数转换数据(一般活动)或根值(root)转换数据(社会行为)均值的标准误差。
[0209]
表8.行为，试验(研究)的112
‑
168天
[0210]
[0211][0212]1c＝对照，bf＝补充0.04％ca的精料
[0213]2t＝处理作用；时间＝时间作用(每14天进行测量)t x时间＝处理
×
时间交互作用。
[0214]3sem＝对数转换数据(一般活动)或根值转换数据(社会行为)均值的标准误差。
[0215]
在分析进食行为时，可视观测期(早晨)指示，补充类黄酮的公牛与c公牛相比精料进料器的占用率更大；该作用在生长期期间比在肥育期期间更明显。然后，在可视观测期期间，这些bf动物专心进食的时间更长。在生长期，尽管进料器占用率更大，但bf公牛的精料摄取量在数值上更小，这表明进食速率可能更小。尽管贯穿该研究发现草料进料器占用率存在非统计学差异(早晨可视扫描取样数据)，但bf公牛在肥育期期间表现出更大反刍行为。这些结果难以解释，且这可能是由于可视扫描程序未描述总每日进料器占用率及反刍活动。在生长期期间，饮水器占用率倾向于补充类黄酮的公牛更大。通常，干物质摄取量与水摄取量直接相关。
[0216]
瘤胃发酵
[0217]
瘤胃发酵vfa呈现于表10中。瘤胃中的总vfa浓度不受处理影响。在bf公牛中乙酸盐的摩尔比例大于(p<.0001)c公牛，而c公牛的丙酸盐的摩尔比例大于(p<.0001)bf公牛。因此，bf公牛的乙酸盐:丙酸盐比率大于(p<.0001)c公牛。所分析的其余vfa(丁酸盐、戊酸盐、异丁酸盐及异戊酸盐)未受处理影响。
[0218]
表10.饲喂补充或未补充bioflavex ca的高精料饮食的holstein公牛的瘤胃发酵参数vfa
[0219][0220]1对照＝未补充
[0221]2bf ca＝补充0.04％ca的精料。
[0222]
瘤胃中基因的表达
[0223]
瘤胃上皮中经研究的基因的相对表达比率呈现于表11和图4中。补充类黄酮影响了所分析的所有苦味受体(tas2r)的相对表达比率，bf公牛所表达的相对表达比率小于c公牛。c组公牛中tas2r7、tas2r16、tas2r38、及tas2r38的相对表达比率大于(分别为p＝0.002、p＝0.003、p＝0.002、及p＝0.002)bf公牛。
[0224]
在各受体类型中，与神经递质信号传导相关的受体的相对表达比率不同。ffar3倾向于(p＝0.10)c公牛大于bf公牛，而该c公牛所表达的ffar2大于(p＝0.002)bf公牛。另外，ppyr1及cckbr的相对表达比率也为c公牛大于(分别为p＝0.003及p＝0.007)bf公牛。
[0225]
另外，与炎症相关的受体像il
‑
25及β
‑
防御素的相对表达比率为c公牛大于(分别为p＝0.005、p＝0.03、及p＝0.0002)bf公牛。
[0226]
表11.处理168天后饲喂补充或未补充bioflavex ca的高精料饮食的holstein公牛的基因表达比率
[0227][0228]1对照＝未补充。
[0229]2bf ca＝补充0.04％ca的精料。
[0230]3sem源自基线10对数转换数据的统计学分析，且平均值为反向转化的值。
[0231]4苦味受体7
[0232]5苦味受体16
[0233]6苦味受体38
[0234]7苦味受体39
[0235]8游离脂肪酸受体3(gpr41)
[0236]9游离脂肪酸受体2(gpr43)
[0237]
10
胰多肽受体1
[0238]
11
胆囊收缩素受体4
[0239]
实例2：保育期(nurseryperiod)仔猪中断奶饮食的类黄酮补充对苦味受体(t2r)基因表达的作用
[0240]
材料与方法
[0241]
动物、饲喂、圈养和实验设计
[0242]
在试验中使用总共168只商用杂交仔猪([大白猪x长白猪]x皮特兰猪)。动物在断奶日获得自同一商业农场且移动至保育室(非运输)。使用bw为4
‑
7kg的雄性及雌性21
‑
d大的仔猪。使用具有动物编号的塑料耳标鉴別。对于生产性能试验，按照初始体重，将动物分布到2个区。在各区内，为了平衡体重分布，猪分布于栏内。各区因此由14只动物的6个栏组成，向这些动物随机分配实验饮食。然后在12个栏中分配猪(14只仔猪/栏/断奶批次)。每个栏具有商用未加盖料斗及奶嘴饮水器以确保隨意进食且自由取水。向栏中分配两个实验处
理(每个处理重复6次)。
[0243]
饲喂方案
[0244]
在断奶后，遵循相同规格，向所选择动物提供相同基础幼畜饲料(pre
‑
starter)饮食，但补充或不补充处于研究下的实验产品。隨意饲喂幼畜饲料饮食持续连续十四天(表1成分及表2营养素组成)。
[0245]
捣碎(in mash)产生实验饮食且将其包装并标记，准备好发送去农场。将饮食以1500kg的批次混合。
[0246]
表12.幼畜饲料饮食的组合物(％)1[0247][0248][0249]1以下每kg饮食供应：7,000iu维生素a(乙酸盐)；500iu维生素d3(胆钙化醇)；250iu维生素d(25
‑
羟胆钙化醇)；45mg的维生素e；1mg的维生素k3；1.5mg的维生素b1；3.5mg
的维生素b2；1.75mg的维生素b6；0.03mg的维生素b12；8.5mg的d
‑
泛酸；22.5mg的烟碱酸；0.1mg的生物素；0.75mg的叶酸；20mg的fe(氨基酸的螯合物)；2.5mg的cu(硫酸盐)；7.5mg的cu(甘氨酸的螯合物)；0.05mg的co(硫酸盐)；40mg的zn(氧化物)；12.5mg zn(氨基酸的螯合物)；12.5mg的mn(氧化物)；7.5的mn(甘氨酸的螯合物)；0.35mg的i，0.5的se(有机)；0.1mg的se(钠)。
[0250]
表13.实验幼畜饲料饮食的营养素组合物(％，作为饲料基础)
[0251]
[0252]
[0253][0254]
处理及实验设计
[0255]
准备两个实验处理，对照(t1)或补充(t2)0.03％富含柚皮苷>20％的完整果实的苦橙提取物(苦橙)(ca，英明公司(interquim,s.a.)，巴塞罗那，西班牙))。因此，不同实验处理如下：
[0256]
t1：基础饮食
[0257]
t2：t1 苦橙提取物(300g/tm)
[0258]
肠组织取样
[0259]
在断奶后第7天处死每栏中的一只仔猪(建议在断奶后的最关键时间段)且分别在rna later及甲醛中收集来自空肠切片的组织样品，且保存以用于进一步分析。
[0260]
生物分析
[0261]
对于基因表达分析，使用trizol(英杰公司(invitrogen))自空肠组织提取总rna。使用primescript rt试剂盒(宝生物公司(takara)，法兰克福，德国)遵循制造商说明书将经分离mrna逆转录为cdna。通过nanodrop仪器(赛默飞世尔公司(thermofisher)，马德里，西班牙)在260、280、和230nm下评估rna纯度。通过定量pcr(qpcr)使用编码核糖体蛋白亚基9(rps9)的基因作为持家基因来进行编码苦味受体2型成员7、17、38及39(tas2r7、tas2r16、tas2r38及tas2r39)的基因的表达的定量，遵循vandesompele等人(2002)检查该持家基因与编码β
‑
肌动蛋白(actb)、经泛表达转录蛋白(uxt)及甘油醛3
‑
磷酸脱氢酶(gapdh)的基因相比的稳定性。单独优化各组引物的qpcr条件。通过在0.8％dna琼脂糖凝胶中在预期分子量下的单带判断鉴定及熔解曲线中的单峰来评估扩增的特异性。通过扩增各基因扩增子的系列1:10稀释液来计算效率。将交点(cq)的标准曲线相对于浓度的对数作图以获得效率，该效率使用公式10
1/斜率
计算，其可接受范围为1.8至2.2。使用20μl总反应体积，其含有50ng cdna、10μl sybr premix extaq(tlirnaseh)(宝生物公司(takara)，法兰克福，德国)及对于各基因而言经优化的引物浓度。qpcr反应周期如下：在95℃下的10min初始变性步骤，随后40个在95℃下10s、在各基因的经优化的退火温度下15s、在72℃下30s、及在72℃下10min最终延伸的周期。使用所得cq值，通过使用参考基因(持家基因)及对照组校准物进行相对定量来计算所选基因的相对表达(pfaffl,2004,eq.[3.5])。
[0262]
结果
[0263]
仔猪空肠上皮中经研究的基因的相对表达比率呈现于图5中。补充类黄酮影响了所分析的所有苦味受体(tas2r)的相对表达比率，t2仔猪所表达的相对表达比率大于t1动物。
[0264]
实例3：在饲喂高脂肥育饮食的公牛中类黄酮对十二指肠上皮基因表达的作用
[0265]
材料与方法
[0266]
与实例1中相同
[0267]
饲料消耗和生产性能
[0268]
动物以饮食形式饲喂商业精料，配制以满足动物的营养需求(fedna,2008)。在该研究的前112天，动物被饲喂生长精料配方，并且在112天后与该研究结束之间，动物被饲喂高脂肥育精料。精料的成分和营养组合物在表14中示出。在整个研究中，动物可以随意获取小麦草料(3.5％cp，1.6％乙醚提取物、70.9％ndf和6.1％灰分；以dm为基础)和新鲜的水。
[0269]
表14.饲料精料的成分和营养素组合物
[0270][0271]1该研究的0至112天。
[0272]
2 113天至研究结束。
[0273]
dm：干物质；me代谢能量；cp：粗蛋白；ndf：中性洗涤纤维；)；nfc：非纤维碳水化合
物。
[0274]
动物被随机分配到8个围栏之一，并分配到两个处理(对照(c)或补充(bf)0.04％的富含柚皮苷>20％的完整果实(ca，英明公司(interquim,s.a.)，巴塞罗那，西班牙)的苦橙提取物(苦橙))之一(每个处理4个围栏)。
[0275]
在整个研究中，在14天的12个实验阶段中，每14天对动物单独称重，在前8个阶段期间(从1到112天)动物消耗生长精料，并且在最后4个时间段期间(从113到168天)和在屠宰前几天期间，动物消耗肥育精料(参见表14)。168天的研究之后，公牛被运输至位于农场15km的屠宰场(escorxador del grup alimentari guissona,guissona，西班牙)。在两周内屠宰动物，每周4个栏，两个栏来自c，两个栏来自bf公牛。在屠宰前等待的时间小于6h。在装载前称量动物。按照商业实践且遵循关于在屠杀或屠宰时保护动物的eu法规1099/2009来屠宰这些动物。记录每只动物的温屠体重量(hcw)。
[0276]
生物和化学分析
[0277]
对各十二指肠部位的1
‑
cm2切片进行取样且在取样后以冷却磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)冲洗2次并立即在rna
‑
later(英杰公司(invitrogen)，马德里，西班牙)中温育以保留rna完整性。在4℃下用rna later温育24小时后，除去液体并将组织冷冻在
‑
80℃下，直至进行进一步rna提取及后续基因表达分析。
[0278]
对于基因表达分析，使用trizol(英杰公司(invitrogen))自瘤胃壁组织提取总rna。使用primescript rt试剂盒(宝生物公司(takara)，法兰克福，德国)遵循制造商说明书将经分离mrna逆转录为cdna。通过nanodrop仪器(赛默飞世尔公司(thermofisher)，马德里，西班牙)在260、280、和230nm下评估rna纯度。通过定量pcr(qpcr)使用编码核糖体蛋白亚基9(rps9)的基因作为持家基因来进行编码以下项的基因的表达的定量：1)编码以下神经递质的产生、表达、和周转的基因：游离脂肪酸受体2(ffar2)及游离脂肪酸受体3(ffar3)、胰多肽受体1(ppyr1)；胆囊收缩素b受体(cckbr)，2)编码促炎症性细胞因子或细胞因子il
‑
25(il25)和由肠细胞释放的抗微生物肽β
‑
防御素的基因，及3)苦味受体2型成员7、16、38和39(tas2r7、tas2r16、tas2r38和tas2r39)，遵循vandesompele等人(2002)检查该持家基因与编码β
‑
肌动蛋白(actb)、经泛表达的转录蛋白(uxt)及甘油醛3
‑
磷酸脱氢酶(gapdh)的基因相比的稳定性。单独优化各组引物的qpcr条件。通过在0.8％dna琼脂糖凝胶中在预期分子量下的单带判断鉴定及熔解曲线中的单峰来评估扩增的特异性。通过扩增各基因扩增子的系列1:10稀释液来计算效率。将交点(cq)的标准曲线相对于浓度的对数作图以获得效率，该效率使用公式10
1/斜率
计算，其可接受范围为1.8至2.2。使用20μl总反应体积，其含有50ng cdna、10μl sybr premix extaq(tlirnaseh)(宝生物公司(takara)，法兰克福，德国)及对于各基因而言经优化的引物浓度。qpcr反应周期如下：在95℃下的10min初始变性步骤，随后40个在95℃下10s、在各基因的经优化的退火温度下15s、在72℃下30s、及在72℃下10min最终延伸的周期。使用所得cq值，通过使用参考基因(持家基因)及对照组校准物进行相对定量来计算所选基因的相对表达。
[0279]
结果
[0280]
关于在十二指肠上皮中经研究的基因的mrna水平下的相对表达，数据呈现于图6中。补充类黄酮影响了除tas2r38以外的所分析的所有苦味受体(tas2r)的表达。在十二指肠中，tas2r7、tas2r16、和tas2r39的相对表达在c公牛中大于(p<0.001)在bf公牛中。在各
behavior in heifers fed high
‑
concentrate diets.j.anim.sci.85,2538
‑
2547.
[0292]
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‑
concentrate diets.j.anim.sci.84,1197
‑
1204.
[0293]
vandesompele j,de preter k,pattyn f,poppe b,van roy n,de paepe a,speleman f.accurate normalization of real
‑
time quantitative rt
‑
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