天然光敏剂竹红菌素纳米杀菌乳液的制备方法与流程

1.本发明属于食品杀菌技术领域，具体涉及天然光敏剂竹红菌素纳米杀菌乳液的生产技术。


背景技术：

2.随着人类食品生产加工技术的不断发展，各式各样的食物不断出现，但与之而来的是各种食源性细菌的不断发现。食源性细菌主要由致泻性大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、单核细胞增生性李斯特菌、副溶血性弧菌等细菌组成，食源性细菌在食品中尤其是生鲜上广泛传播，会致使各种疾病的产生。目前，对于食源性细菌的抑制，现有的技术主要采用高温、高压、紫外光照射、抗菌素、金属离子等方式。这些技术一方面受制于使用条件的严苛，另一方面会对杀菌食品造成营养、成分等破坏。因此人们需要寻找到其他更加安全可靠的杀菌方式。
3.近年来，采用光动力灭活作为非传统杀菌方式引起了人们的广泛关注。光动力灭活是利用特定波长的光源照射光敏剂，使光敏剂获得能量后发生能量跃迁，从基态转化为激发态，而光敏剂周围的氧气会发生一系列光化学反应，从而产生单线态氧、自由基等活性氧物质，活性氧物质会破坏细菌的细胞结构，造成细菌的死亡。但是由于光敏剂的水溶性较差，且在高温、光照下的稳定性较差，这极大地限制了光敏剂在光动力灭活中的应用。因此需要采用合适的传递方式，以达到有效保存光敏剂的作用。
4.纳米乳液是将内相(油相)与外相(水相)混合，采用合适的乳化剂，使用高压均质法所制备的分散体溶液，粒径一般在粒径为50～500nm。纳米乳液具有尺寸小、生物利用度高、透光性好等特点，同时纳米乳液的稳定性受到内相外相比、油相类型、乳化剂类型和各项含量影响。


技术实现要素：

5.本发明目的是克服传统技术存在的缺点，提供一种稳定性好、能够对金黄色葡萄糖球菌有效抑制的天然光敏剂竹红菌素纳米杀菌乳液的制备方法。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种天然光敏剂竹红菌素纳米杀菌乳液的制备方法，先将光敏剂溶于中链甘油三酯(mct)得到油相，将乳化剂溶于去离子水中得到水相，再将两者混合搅拌均匀制备初乳液，之后采用高速剪切
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高压均质技术制备得到天然光敏剂竹红菌素纳米杀菌乳液；所述的光敏剂是竹红菌素，占中链甘油三酯质量的1％～ 3％，所述的乳化剂是大豆卵磷脂，占去离子水质量的2％～5％；油相占总乳液质量的10％。
8.乳化剂的作用是根据其分子结构的疏水端与亲水端的存在，能够有效地包覆内相，并使内相隔绝外相，使乳液形成液滴。乳化剂种类对于乳液液滴的形成至关重要，因此关系到乳液的稳定性。本发明采用大豆卵磷脂作为乳化剂，能够达到体系稳定，形成粒径小的目的，同时，大豆卵磷脂是一种无毒且对人体有益的物质，制备的乳液副作用小。
9.进一步地，本发明所用的天然光敏剂竹红菌素是从竹黄粉末中提取的，提取方式为长期浸出法，提取步骤为：以竹黄为原料，将竹黄打成粉末，置于索氏提取器中，加入丙酮，75℃～85℃加热回流，循环10h；将产物置于旋蒸瓶中，以40℃旋蒸30min以回收丙酮；剩余产物置于烧杯中，加入石油醚，边加热边搅拌至沸腾，保持30min，冷却后用布氏漏斗抽吸过滤，重复3次，得到初产物；在初产物的烧杯中加入体积比1:1～1.5的甲苯和石油醚，以50℃重结晶30min，并在70℃干燥24h得到竹红菌素。通过实践证明，索氏提取器中加热温度过低，则竹红菌素从竹黄粉末中不可能完全浸出。而加热温度过高时，则竹红菌素结构会被破坏。选择75℃～85℃对索氏提取器中丙酮浸泡的竹黄粉末加热可以提供最佳的加热环境，使竹红菌素最大限度地从竹黄中提取出。
10.进一步地，本发明的两相混合搅拌方式以300r/min转速，55℃～65℃的温度下进行10min～15min。转速选择300r/min是通过反复试验确定的，在该速率下能够保证两相完全混合。选择55℃～65℃的温度下进行10min～15min则能保证两相有适合的热力学环境和充足的时间结合，从而提高乳化效果。
11.进一步地，本发明采用的高速剪切技术需要在机械分散机中，以1300r/min 的转速剪切进行25min。通过实践证明，剪切转速过低时，则无法将液滴降到最低，不利于后续的高压均质技术的进行，而剪切转速过大时，则会破坏液滴的结构，不利于液滴的分散和形成。选择1300r/min的剪切转速是通过反复试验所确定的。而选择25min则能保证乳液充分分散。
12.进一步地，本发明采用的高压均质技术需要在15000psi的压力下进行10 min。可制备出稳定性高，包覆性能好的乳液。
13.与现有的杀菌技术相比，本发明制备的天然光敏剂竹红菌素纳米杀菌乳液具有以下优点：
14.1、本发明采用天然光敏剂——竹红菌素作为光动力灭活的光敏剂，能够极大地降低生产成本，且可以扩展传统中药的适用范围。
15.2、本发明采用纳米乳液作为包覆光敏剂的主要载体，能够有效地保存光敏剂，提高光敏剂的溶解性与可使用性，降低环境对于光敏剂影响。
16.3、本发明制备的纳米乳液在30℃～50℃能够稳定保存，没有明显的光敏剂降解现象发生。
17.4、本发明制备的纳米乳液能够在酸碱环境下稳定存在，而没有产生大规模凝聚现象的产生。
18.5、本发明制备的纳米乳液对金黄色葡萄糖球菌的杀菌率可以达到90％。
19.6、本发明制备的纳米乳液所采用的材料均为食品级原料，无毒无害，安全可靠，对人体无副作用，能够广泛适用于食品杀菌消毒领域。
附图说明：
20.图1是本发明实施例的制备流程图。
21.图2是本发明涉及的天然光敏剂竹红菌素的结构图。
22.图3是本发明涉及的乳化剂结构图。
23.图4是本发明实施例1制备的天然光敏剂竹红菌素纳米杀菌乳液在经过30 ml、
40ml、50ml、60ml、70ml、80ml处理后第一天和第七天的外观变化。
24.图5是本发明实施例1制备的天然光敏剂竹红菌素纳米杀菌乳液在经过 ph3、ph5、ph7、ph9处理后第一天和第七天的外观变化。
25.图6是本发明实施例1制备的天然光敏剂竹红菌素纳米杀菌乳液在关照下 10min、20min、30min、40min、50min、60min培养基金黄色葡萄糖球菌菌落数。
具体实施方式
26.以下对本发明的具体实施方法进行详细说明，显而易见地，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。同时，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
27.实施例1：
28.制备光敏剂：以竹黄为原料，打成粉末，取160g置于索氏提取器中，加入 500ml丙酮，以75ml加热，进行热回流，循环10h；将产物置于旋蒸瓶中，以40ml旋蒸30min以回收丙酮；置于烧杯中，加入200ml石油醚，以80ml 加热，边加热边搅拌至沸腾，进行30min，冷却后用布氏漏斗抽吸过滤，重复3 次，得到初产物；在初产物的烧杯中加入100ml甲苯和石油醚,以50ml重结晶 30min，并在70ml干燥24h得到竹红菌素。
29.初乳液制备：取0.1g竹红菌素粉末，加入中链甘油三酯至10g，取1.8g 卵磷脂，加入去离子水至90g；将油相与水相混合，以300r/min转速，温度为55ml下进行10min。
30.制备纳米乳液：将初乳液在机械分散机中，以1300r/min的转速剪切进行25 min，后以压力为15000psi进行10min。
31.实施例2：
32.制备光敏剂：以竹黄为原料，打成粉末，取160g置于索氏提取器中，加入 500ml丙酮，以85ml加热，进行热回流，循环10h；将产物置于旋蒸瓶中，以40ml旋蒸30min以回收丙酮；置于烧杯中，加入200ml石油醚，以80ml 加热，边加热边搅拌至沸腾，进行30min，冷却后用布氏漏斗抽吸过滤，重复3 次，得到初产物；在初产物的烧杯中加入100ml甲苯和石油醚,以50ml重结晶 30min，并在70ml干燥24h得到竹红菌素。
33.初乳液制备：取0.1g竹红菌素粉末，加入中链甘油三酯至10g，取1.8g 卵磷脂，加入去离子水至90g；将油相与水相混合，以300r/min转速，温度为55ml下进行10min。
34.制备纳米乳液：将初乳液在机械分散机中，以1300r/min的转速剪切进行25 min，后以压力为15000psi进行10min。
35.实施例3：
36.制备光敏剂：以竹黄为原料，打成粉末，取160g置于索氏提取器中，加入500ml丙酮，以85ml加热，进行热回流，循环10h；将产物置于旋蒸瓶中，以40ml旋蒸30min以回收丙酮；置于烧杯中，加入200ml石油醚，以80ml 加热，边加热边搅拌至沸腾，进行30min，冷却后用布氏漏斗抽吸过滤，重复3 次，得到初产物；在初产物的烧杯中加入100ml甲苯和石油醚,以50ml重结晶 30min，并在70ml干燥24h得到竹红菌素。
37.初乳液制备：取0.2g竹红菌素粉末，加入中链甘油三酯至10g，取1.8g 卵磷脂，加入去离子水至90g；将油相与水相混合，以300r/min转速，温度为55℃下进行10min。
38.制备纳米乳液：将初乳液在机械分散机中，以1300r/min的转速剪切进行25 min，后以压力为15000psi进行10min。
39.实施例4：
40.制备光敏剂：以竹黄为原料，打成粉末，取160g置于索氏提取器中，加入 500ml丙酮，以85ml加热，进行热回流，循环10h；将产物置于旋蒸瓶中，以40ml旋蒸30min以回收丙酮；置于烧杯中，加入200ml石油醚，以80ml 加热，边加热边搅拌至沸腾，进行30min，冷却后用布氏漏斗抽吸过滤，重复3 次，得到初产物；在初产物的烧杯中加入100ml甲苯和石油醚,以50ml重结晶 30min，并在70ml干燥24h得到竹红菌素。
41.初乳液制备：取0.3g竹红菌素粉末，加入中链甘油三酯至10g，取1.8g 卵磷脂，加入去离子水至90g；将油相与水相混合，以300r/min转速，温度为55℃下进行10min。
42.制备纳米乳液：将初乳液在机械分散机中，以1300r/min的转速剪切进行25 min，后以压力为15000psi进行10min。
43.实施例5：
44.制备光敏剂：以竹黄为原料，打成粉末，取160g置于索氏提取器中，加入 500ml丙酮，以85ml加热，进行热回流，循环10h；将产物置于旋蒸瓶中，以40ml旋蒸30min以回收丙酮；置于烧杯中，加入200ml石油醚，以80ml 加热，边加热边搅拌至沸腾，进行30min，冷却后用布氏漏斗抽吸过滤，重复3 次，得到初产物；在初产物的烧杯中加入100ml甲苯和石油醚,以50ml重结晶 30min，并在70ml干燥24h得到竹红菌素。
45.初乳液制备：取0.3g竹红菌素粉末，加入中链甘油三酯至10g，取2.7g 卵磷脂，加入去离子水至90g；将油相与水相混合，以300r/min转速，温度为55℃下进行10min。
46.制备纳米乳液：将初乳液在机械分散机中，以1300r/min的转速剪切进行25 min，后以压力为15000psi进行10min。
47.实施例6：
48.制备光敏剂：以竹黄为原料，打成粉末，取160g置于索氏提取器中，加入 500ml丙酮，以85ml加热，进行热回流，循环10h；将产物置于旋蒸瓶中，以40ml旋蒸30min以回收丙酮；置于烧杯中，加入200ml石油醚，以80ml 加热，边加热边搅拌至沸腾，进行30min，冷却后用布氏漏斗抽吸过滤，重复3 次，得到初产物；在初产物的烧杯中加入100ml甲苯和石油醚,以50ml重结晶 30min，并在70ml干燥24h得到竹红菌素。
49.初乳液制备：取0.3g竹红菌素粉末，加入中链甘油三酯至10g，取3.6g 卵磷脂，加入去离子水至90g；将油相与水相混合，以300r/min转速，温度为55℃下进行10min。
50.制备纳米乳液：将初乳液在机械分散机中，以1300r/min的转速剪切进行25 min，后以压力为15000psi进行10min。
51.实施例7：
52.制备光敏剂：以竹黄为原料，打成粉末，取160g置于索氏提取器中，加入 500ml丙酮，以85ml加热，进行热回流，循环10h；将产物置于旋蒸瓶中，以40ml旋蒸30min以回收丙酮；置于烧杯中，加入200ml石油醚，以80ml 加热，边加热边搅拌至沸腾，进行30min，冷却后用布氏漏斗抽吸过滤，重复3 次，得到初产物；在初产物的烧杯中加入100ml甲苯和石油醚,以50ml重结晶 30min，并在70ml干燥24h得到竹红菌素。
53.初乳液制备：取0.3g竹红菌素粉末，加入中链甘油三酯至10g，取4.5g 卵磷脂，加
入去离子水至90g；将油相与水相混合，以300r/min转速，温度为55℃下进行10min。
54.制备纳米乳液：将初乳液在机械分散机中，以1300r/min的转速剪切进行25 min，后以压力为15000psi进行10min。
55.实施例8：
56.制备光敏剂：以竹黄为原料，打成粉末，取160g置于索氏提取器中，加入 500ml丙酮，以85ml加热，进行热回流，循环10h；将产物置于旋蒸瓶中，以40ml旋蒸30min以回收丙酮；置于烧杯中，加入200ml石油醚，以80ml 加热，边加热边搅拌至沸腾，进行30min，冷却后用布氏漏斗抽吸过滤，重复3 次，得到初产物；在初产物的烧杯中加入100ml甲苯和石油醚,以50ml重结晶 30min，并在70ml干燥24h得到竹红菌素。
57.初乳液制备：取0.3g竹红菌素粉末，加入中链甘油三酯至10g，取4.5g 卵磷脂，加入去离子水至90g；将油相与水相混合，以300r/min转速，温度为65℃下进行10min。
58.制备纳米乳液：将初乳液在机械分散机中，以1300r/min的转速剪切进行25 min，后以压力为15000psi进行10min。
59.实施例9：
60.制备光敏剂：以竹黄为原料，打成粉末，取160g置于索氏提取器中，加入 500ml丙酮，以85ml加热，进行热回流，循环10h；将产物置于旋蒸瓶中，以40ml旋蒸30min以回收丙酮；置于烧杯中，加入200ml石油醚，以80ml 加热，边加热边搅拌至沸腾，进行30min，冷却后用布氏漏斗抽吸过滤，重复3 次，得到初产物；在初产物的烧杯中加入100ml甲苯和石油醚,以50ml重结晶 30min，并在70ml干燥24h得到竹红菌素。
61.初乳液制备：取0.3g竹红菌素粉末，加入中链甘油三酯至10g，取4.5g 卵磷脂，加入去离子水至90g；将油相与水相混合，以300r/min转速，温度为65℃下进行15min。
62.制备纳米乳液：将初乳液在机械分散机中，以1300r/min的转速剪切进行25 min，后以压力为15000psi进行10min。
63.实施例10
64.对本发明制备的天然光敏剂竹红菌素纳米杀菌乳液稳定性考察：
65.将制备好的纳米乳液在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃处理后第一天和第七天分别对各乳液进行拍照，考察乳液是否出现分层，以及光敏剂降解的现象。结果如图4所示，可以看出30℃到50℃温度处理下光敏剂都能基本保存完好，没有降解的现象出现。
66.将制备好的纳米乳液采用盐酸和氢氧化钠溶液调整到ph3、ph5、ph7、ph9，在第一天和第七天分别对各乳液进行拍照，考察乳液是否出现分层，以及光敏剂降解的现象。结果如图5所示，可以看出各ph处理下，乳液均没有出现分层现象和光敏剂降解的现象，因此乳液能够在酸碱条件下稳定保存。
67.实施例11
68.对天然光敏剂竹红菌素纳米杀菌乳液杀菌性能考察：
69.将金黄色葡萄糖球菌单菌菌落接种于20ml lb液体培养基中，37℃，200 rpm，培养16h。用超纯水稀释菌液，使目标菌液的菌液含量达到原来的10
‑6。
70.将100μl菌接种剂与900μl制备的天然光敏剂竹红菌素纳米杀菌乳液混合1h。
71.将混合液在630nm波长的led光下进行光照0min、10min、20min、30min、 40min、50min、60min，将光照0min作为对照组。取50μl光照处理后混合液接种到lb固体培养基中，
在37℃下培养24h。结果如图6所示，可以发现，随着光照时间的增强，纳米乳液的杀菌效果不断增强，60min的光照下杀菌效果达到90％。