改善植物再生的制作方法

改善植物再生
1.本发明涉及植物育种领域，特别涉及从细胞和其它组织进行的植物再生。更具体而言，本发明提供了使用hyperphyllin或其衍生物改善植物愈伤组织和苗(shoot)形成及再生的方法和手段。
2.植物再生涉及在确定的物理和化学条件下对细胞、组织和器官进行体外培养。很早就知道在植物中存在再生。在植物中，分化的细胞能够在适当的培养条件下再生成完整的组织阵列。再生可以涉及直接或间接的器官发生。在直接再生中，体外器官由外植体组织直接诱导而成；在间接再生中，新生器官通常由中间组织(愈伤组织)形成。植物愈伤组织是未分化的结构，其可以产生新的组织。植物叶片、苗、根和胚可以从生长的愈伤组织以多种方式产生。
3.通常，在整个植物再生过程中可以识别三个阶段。首先，外植体组织的体细胞可以响应激素信号以获得类似分生组织细胞的特征，这一过程被称为“去分化”。其次，在激素平衡的影响下，重新程序化和确定具有有机生成能力的愈伤组织细胞以用于特定的器官形成。第三再生阶段(形态发生)与外源性供应的激素无关。由此可见，在体外再生中，外源性激素处理是触发早期发育事件的关键因素。
4.然而，获得能再生为完整植物的去分化细胞(愈伤组织)对许多植物物种来说并不总是可行的。已知甜菜难以发生去分化和植物再生。这些困难是例如通过农杆菌介导的转化程序获得转基因甜菜的主要障碍。数十年来，育种者和研究人员正在致力于开发更有效的用于难以形成愈伤组织的植物的转化和再生的方案。通常，此类植物表现出基因型变异，导致不同品系之间愈伤组织和苗形成率的巨大差异(ivic
‑
haymes&smigocki(2005)，“identification of highly regenerative plants within sugar beet(beta vulgaris l.)breeding lines for molecular breeding.”in vitro cellular and developmental biology
‑
plant，41(4)，483
‑
488；mishutkina&gaponenko(2006)，“sugar beet(beta vulgaris l.)morphogenesis in vitro：effects of phytohormone type and concentration in the culture medium，type of explants，and plant genotype on shoot regeneration frequency.”russian journal of genetics，42(2)，150
‑
157；tomita et al.(2013)，“evaluation of the potential for somatic embryogenesis in sugar beet(beta vulgaris l.)breeding lines and improvement of regeneration efficiency.”plant biotechnology，30(5)，479
‑
487.)。通常，某些基因型的再生根本是不可行的。kishchenko等2005年(production of transgenetic sugarbeet(beta vulgaris l.)plants resistant to phosphinothricin.”cell biology international，29(1)，15
‑
19.)和kagami等2005年(“sugar beet(beta vulgaris l.).”agrobacterium protocols：volume 1，335
‑
347.)公开了众所周知的甜菜转化方案，然而这些方案表现出很强的基因型依赖性。
5.chaudhury等(1993.“amp1
‑
a mutant with high cytokinin levels and altered embryonic pattern，faster vegetative growth，constitutive photomorphogenesis and precocious flowering.”the plant journal，4(6)，907
‑
916.)
首先描述了拟南芥(arabidopsis thaliana)的amp1(改变的分生组织程序1)突变体，它在植物发育的三个不同方面具有改变的表型；空间模式、光形态发生的生长和开花的开始期。amp1(at3g54720)属于m28b肽酶家族的zn
2
依赖性金属蛋白酶(helliwell et al.，2001.“the arabidopsis amp1 gene encodes a putative glutamate carboxypeptidase.”the plant cell，13(9)，2115
‑
2125.)。amp1拮抗地调节拟南芥中胚和分生组织的发育，并参与苗顶端分生组织的发育。amp1突变体表现出扩大的苗顶端分生组织(vidaurre et al.，2007.“amp1 and mp antagonistically regulate embryo and meristem development in arabidopsis.”development，134(14)，2561
‑
2567.)。mordhorst等(1998.“somatic embryogenesis in arabidopsis thaliana is facilitated by mutations in genes repressing meristematic cell divisions.”genetics，149(2)，549
‑
563.)显示了amp1突变体促进了拟南芥中体细胞胚发生。2016年，poretska等作者(“the small molecule hyperphyllin enhances leaf formation rate and mimics shoot meristem integrity defects associated with amp1 deficiency.”plant physiology，pp
‑
01633.)证明了小分子hyperphyllin(hp)及其三种衍生物(a1、a2和a3)增强了叶形成率，并模拟了amp1突变表型。hp处理拟南芥导致了生物相互作用相关基因表达和胁迫反应的变化。尽管amp1和hp处理之间似乎存在相互作用，功能性关系尚未被完全了解。
6.令人惊讶的是，发明人发现通过将化学品hp或其衍生物应用于甜菜叶组织外植体，即使从顽固基因型诱导愈伤组织也得到了显著的促进。所得愈伤组织可以再生为正常苗，并且产生的植株表现出正常的表型。诱导的愈伤组织足够健壮以适合转化和基因编辑。现有技术描述了化学品hp在拟南芥中模拟amp1突变体的效果，仅具有扩大的苗顶端分生组织。尽管amp1突变体表现出增强的再生能力，但在拟南芥和任何其它作物中都从未显示出化学品hp诱导的愈伤组织形成中如此有利的增强效应。
7.因此，本发明的第一方面是hyperphyllin或其衍生物在用于诱导植物愈伤组织形成的方法中的用途。
8.本发明提供了用于从植物细胞诱导愈伤组织形成的方法，包括在hyperphyllin或其衍生物存在下孵育植物细胞(图1)。
9.hyperphyllin是n
‑
[4
‑
氨基
‑2‑
氯苯基]
‑
2,4
‑
二氯苯甲酰胺，如下所示。
[0010][0011]
除hyperphyllin外，还可以在本发明的方法中使用其衍生物。优选的衍生物是苯环1和2的一个或两个的一个或多个位置，特别是在相对于酰胺官能团的邻位和/或对位被取代的苯甲酰苯胺。取代基可以特别选自卤素，例如cl或f；氨基，例如nh2；取代氨基
‑
nhr和
‑
nr2，其中r可以例如是c1
‑
4烷基如甲基或乙基和烷基基团，例如c1
‑
4烷基如甲基或乙基和烷基基团。最优选地，衍生物选自以下所示的式a1、a2和a3的化合物。
[0012][0013]
可以例如通过在含有hyperphyllin或其衍生物的培养基中孵育植物细胞，或者通过将hyperphyllin或其衍生物例如经由轰击、电穿孔或微注射直接引入植物细胞中，实现孵育步骤中存在hyperphyllin或其衍生物。优选地，在含有hyperphyllin或其衍生物的培养基中诱导愈伤组织形成。
[0014]
原则上，使用仅一个植物细胞诱导愈伤组织形成是足够的。因此，如果以下使用复数“植物细胞”，该词汇不可被理解为可能需要的最少数量的植物细胞。
[0015]
适合诱导愈伤组织的植物细胞包括胚系植物细胞和体细胞系植物细胞。如何提供这些植物细胞的方式对于根据本发明的方法并不重要。植物细胞可以以分离形式使用或作为植物组织的部分来使用。例如，从植物分离的外植体可以提供胚系或体细胞系植物细胞。将细胞从外植体中分离或直接将外植体用于诱导愈伤组织。植物的哪一部分符合获得外植体的条件取决于特定的植物物种。通常，可以从植物的下胚轴、苗、叶、芽、花、叶柄和根中获得合适的植物细胞。
[0016]
令人惊讶的是，发现即使在顽固的植物物种或植物基因型中，hyperphyllin及其衍生物也适用于诱导愈伤组织形成。
[0017]
可以使用本领域已知的任何培养基进行孵育步骤，特别是通常用于诱导愈伤组织形成的培养基。取决于所讨论的植物，培养基的组成可以变化。原则上，可以在培养基中加入数种类型的基础盐混合物，但优选地培养基包括改良murashige和skoog(ms)培养基、white培养基或木本植物培养基，最优选ms培养基。前期研究表明当植物生长激素和细胞分裂素以合适的量和浓度单独或彼此组合在ms培养基中存在时有利于愈伤组织的诱导。根据本发明，也可以优先将这些组分添加到培养基中。示例性的植物生长激素包括萘乙酸(naa)、吲哚
‑3‑
乙酸(iaa)和吲哚
‑3‑
丁酸(iba)。示例性的细胞分裂素包括6
‑
苄基氨基嘌呤(bap)和6
‑
呋喃氨基嘌呤(激动素)。
[0018]
培养基中hyperphyllin或其衍生物的浓度范围为约5μm至约200μm，优选约10μm至约100μm，更优选约20μm至约80μm，最优选约30μm至约50μm。为了达到期望的愈伤组织形成的增强，培养基中hyperphyllin或其衍生物的浓度范围优选为约20μm至约80μm内，更优选约30μm至约50μm。此外，可以添加更多本领域公知的用于诱导愈伤组织的添加剂。例如，根据本发明用于诱导愈伤组织形成的培养基可以包括ms盐、蔗糖、bap和hyperphyllin。
[0019]
根据本发明的另一个方面，已经发现在hyperphyllin或其衍生物存在的情况下，根据上述方法获得的愈伤组织令人惊讶地非常适合生成苗和最终的完整植物，即使是对于顽固的植物物种或植物基因型。因此，使用本发明的方法可以改善顽固的植物物种或植物基因型的间接再生。
[0020]
因此，本发明提供了生产植物苗的方法，包括
[0021]
(i)根据上述方法诱导愈伤组织形成以产生愈伤组织，和
[0022]
(ii)在适宜诱导苗形成的条件下培养愈伤组织。
[0023]
可以使用任何公知的培养基进行培养步骤以生长愈伤组织和诱导苗形成。取决于所讨论的植物，这些条件可以变化。原则上，数种类型的基础盐混合物可以用于培养愈伤组织，但最优选地，培养基包括改良murashige和skoog培养基、white培养基或木本植物培养基。为了便于苗诱导，培养基中可以使用一种或多种添加剂。培养基可以补充植物生长调节剂，如植物生长激素和细胞分裂素。可以提供加强生长的维生素，如gamborg b5维生素。氮、磷和钾的富集也被证明是有帮助的。例如，用于培养愈伤组织以产生苗形成的培养基可以包括ms盐、蔗糖、bap和卡那霉素。
[0024]
根据本发明的另一个方面，hyperphyllin或其衍生物特别是通式a1、a2或a3的衍生物对愈伤组织形成的有益效果可以利用于生产转基因植物的方法以及生产遗传修饰的植物的方法。研究发现，在顽固的植物物种或植物基因型中，利用hyperphyllin或其衍生物，特别是通式a1、a2或a3的衍生物，可以提高转化效率。当愈伤组织形成步骤中存在hyperphyllin或其衍生物，特别是通式a1、a2或a3的衍生物时，从已转化或基因编辑且可能具有修饰基因组的修饰植物细胞的植物的再生得到显著改善。
[0025]
因此，本发明提供了一种用于生产转基因植物的方法，包括以下步骤：
[0026]
(a)根据上述方法诱导愈伤组织形成以产生愈伤组织
[0027]
(b)将至少一种感兴趣的核苷酸序列或至少一种感兴趣的多肽引入步骤(a)中待使用的植物细胞和/或步骤(a)中获得的愈伤组织的细胞，
[0028]
(c)根据上述方法培养从步骤(a)和(b)中获得的愈伤组织以产生植物苗，和
[0029]
(d)再生转基因植物。
[0030]
诱导愈伤组织形成的步骤(a)包括在hyperphyllin或其衍生物，特别是通式a1、a2或a3的衍生物存在下孵育植物细胞。合适的植物细胞和条件如上定义。
[0031]
在步骤(b)中，通过将核酸分子引入细胞以引起核酸序列的稳定或瞬时存在(优选核酸序列的稳定或瞬时表达)或通过以引起瞬时存在的方式将多肽引入细胞对细胞进行转化。例如dna序列的稳定存在意味着所述dna序列稳定地整合到细胞的基因组中。稳定表达是指例如稳定整合到细胞基因组的dna序列的表达。现在单子叶植物细胞和双子叶植物细胞的转化都是常规的，且选择最合适的转化技术将由实验人员决定。方法的选择随着待转化植物的类型而变化；本领域技术人员将认识到对给定植物类型的特定方法的适用性。合适的方法可以包括但不限于：植物原生质体的电穿孔；脂质体介导的转化；聚乙二醇(peg)介导的转化；使用病毒的转化；植物细胞的微注射；植物细胞的微抛射(projectile)轰击；真空渗透；和农杆菌介导的转化。
[0032]
根据本发明的一个实施方式，将至少一种感兴趣的核苷酸序列或至少一种感兴趣的多肽引入待用于诱导愈伤组织形成的步骤(a)的植物细胞中。应理解在此情况下步骤(b)在步骤(a)之前进行。根据本发明的另一实施方式，将至少一种感兴趣的核苷酸序列或至少一种感兴趣的多肽引入步骤(a)中获得的愈伤组织的细胞。应理解在此情况下步骤(b)在步骤(a)之后进行。此外，可以将感兴趣的核苷酸序列或感兴趣的多肽同时引入待用于愈伤组织形成的细胞和步骤(a)产生的愈伤组织细胞中。根据此实施方式，方法包括以下步骤：
[0033]
(i)将至少一种感兴趣的核苷酸序列或至少一种感兴趣的多肽引入植物细胞中，
[0034]
(ii)诱导步骤(i)中获得的细胞以形成愈伤组织，和
[0035]
(iii)将至少一个感兴趣的核苷酸序列或至少一个感兴趣的多肽引入步骤(ii)中获得的愈伤组织的细胞中。
[0036]
使用本领域公知的任何合适的方法，可以进行引入至少一种感兴趣的核苷酸序列或至少一种感兴趣的多肽的步骤。如上所述的许多方法可用于将感兴趣的核酸或多肽转移到植物细胞中。例如，如lindsey&gallois，1990，journal of experimental botany和kischenko et al.，2005，cell biology international，ishida et al.，2007，(“agrobacterium
‑
mediated transformation of maize.”nature protocols，2(7)，1614
‑
1621，用于玉米)，或如purewheat technology from japan tobacco company(用于小麦)所述，示例性载体介导的引入dna分子的方法是农杆菌介导的转化。其它也适用于引入rna分子或多肽的技术包括粒子轰击和电穿孔。
[0037]
根据本发明的感兴趣的核苷酸序列可以是dna或rna序列，例如mrna、sirna、mirna、trna等。更特别的是，感兴趣的核苷酸序列可以编码赋予至少一种表型性状的多肽。优选地，多肽赋予的表型性状可以选自对生物胁迫的抗性/耐受性，包括病原体抗性/耐受性，其中病原体可以是病毒、细菌、真菌或动物病原体；对非生物胁迫的抗性/耐受性，包括寒冷抗性/耐受性、干旱抗性/耐受性、渗透抗性/耐受性、热胁迫抗性/耐受性、冷或霜冻胁迫抗性/耐受性、氧化胁迫抗性/耐受性、重金属胁迫抗性/耐受性、盐胁迫或积水抗性/耐受性、倒伏抗性/耐受性、落粒抗性/耐受性，或对一种或多种除草剂(如草甘膦、草铵膦、2,4
‑
d、麦草畏、als抑制剂等)的抗性/耐受性。至少一种感兴趣的表型性状也可以选自又一感兴趣的农艺性状的修饰，包括产量增加、开花时间改变、种子颜色改变、胚乳组成改变、营养含量修饰，或感兴趣的途径的代谢工程化。此外，感兴趣的核苷酸序列可以编码基因编辑机制的组分或可以是基因编辑机制的组分，例如grna、crrna、tracrrna、sgrna、核酸酶、去武装的核酸酶、切口酶、去武装的切口酶、碱基编辑器、tale识别结构域或锌指识别结构域或包含此类识别结构域的融合蛋白等。
[0038]
如本文使用的，核酸(分子)或核苷酸(序列)或多核苷酸是指dna和rna。dna还包括cdna和基因组dna。核酸分子可以是单链或双链的，并且可以是化学合成的或通过体外甚至体内生物表达而产生的。
[0039]
显然，只要rna分子的核苷酸序列通过参考相应的dna分子的核苷酸序列进行限定时，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(t)均应替换为尿嘧啶(u)。参考rna或dna分子从本技术的上下文是清楚的。
[0040]
根据本发明的感兴趣的多肽可以是转录因子、基因编辑机制的蛋白质组分(如核酸酶、切口酶、碱基编辑器、tal效应子或锌指效应子的识别结构域)，或可以是赋予表型性状的多肽，其可以选自对一种或多种除草剂(如草甘膦、草铵膦、2,4
‑
d、麦草畏、als抑制剂、颜色标记物、荧光标记物等)的抗性/耐受性；对生物胁迫的抗性/耐受性，包括病原体抗性/耐受性，其中病原体可以是病毒、细菌、真菌或动物病原体；对非生物胁迫的抗性/耐受性，包括寒冷抗性/耐受性、干旱抗性/耐受性、渗透抗性/耐受性、热胁迫抗性/耐受性、冷或霜冻胁迫抗性/耐受性、氧化胁迫抗性/耐受性、重金属胁迫抗性/耐受性、盐胁迫或积水抗性/耐受性、倒伏抗性/耐受性、落粒抗性/耐受性等。感兴趣的多肽可以是化学合成的或通过体外甚至体内的生物表达而产生的。
[0041]
在上述用于生产转基因植物的方法的步骤(c)和(d)中，包括已转化的植物细胞的
修饰的愈伤组织再生为完整(可育)的植物。因此，在步骤(c)中，愈伤组织在适合诱导苗形成的条件下培养，并在步骤(d)中最终再生为完整的植物。
[0042]
再生技术依赖于组织培养生长培养基中某些植物激素的操纵，偶尔依赖于可以与期望的感兴趣的核苷酸序列一起引入的抗微生物剂和/或除草剂标记物。evans et al.，protoplasts isolation and culture，handbook of plant cell culture，pp.124
‑
176，macmillilan publishing company，new york，1983和binding，regeneration of plants，plant protoplasts，pp.21
‑
73，crc press，boca raton，1985描述了从培养的原生质体的植物再生。再生也可以从植物愈伤组织、外植体、原生质体、未成熟或成熟胚、胚样组织、分生组织、器官或其部分获得。此类再生技术通常如klee(1987)ann.rev.of plant phys.38:467486中所描述。为了从如未成熟胚的转基因组织中获得完整的植物，它们可以在一系列含有营养物质和激素的培养基中在受控的环境条件下生长，该过程被称为组织培养。一旦生成了完整植物并产生种子，开始对子代进行评价。
[0043]
此外，本发明还提供了一种用于生产遗传修饰的植物的方法，包括以下步骤：
[0044]
(a)根据上述方法诱导来自至少一个植物细胞的愈伤组织形成以产生愈伤组织，
[0045]
(b)通过以下修饰步骤(a)中待使用的植物细胞的基因组和/或步骤(a)中获得的所述愈伤组织的细胞的基因组：将优选识别所述细胞基因组中的预定位点的单链dna断裂(ssb)诱导酶或双链dna断裂(dsb)诱导酶，以及任选修复核酸分子，和/或与优选识别所述细胞基因组中的预定位点的ssb诱导酶或催化受损的ssb或dsb诱导酶融合的碱基编辑器引入所述细胞，
[0046]
其中所述基因组的修饰选自
[0047]
i.至少一个核苷酸的替换；
[0048]
ii.至少一个核苷酸的缺失；
[0049]
iii.至少一个核苷酸的插入；或
[0050]
iv.i.
‑
iii.的任和组合，
[0051]
(c)根据上述方法培养从步骤(a)和(b)获得的愈伤组织以产生植物苗，和
[0052]
(d)再生遗传修饰的植物。
[0053]
通过上述方法进行诱导愈伤组织形成的步骤(a)。因此，在hyperphyllin或其衍生物的存在下诱导愈伤组织形成；而hyperphyllin或其衍生物可以加入培养基中或直接加入植物细胞中。
[0054]
在步骤(b)中，通过以下完成细胞基因组的修饰：优选识别所述细胞基因组中的预定位点的单链dna断裂(ssb)诱导酶或双链dna断裂(dsb)诱导酶和/或与优选识别所述细胞基因组中的预定位点的ssb诱导酶或催化受损的ssb或dsb诱导酶融合的碱基编辑器。
[0055]
可以在诱导愈伤组织形成之前和/或之后进行修饰基因组的步骤。因此，根据本发明的第一方面，如步骤(b)所述对植物细胞的基因组进行修饰，然后将得到的修饰的植物细胞用于后续诱导愈伤组织形成的步骤(a)。根据本发明的另一方面，首先进行诱导愈伤组织形成的步骤(a)，随后在步骤(b)中，通过单链dna断裂(ssb)诱导酶或双链dna断裂诱导酶和/或通过与催化受损的ssb或dsb诱导酶融合或与ssb诱导酶融合的碱基编辑器，对所得愈伤组织的至少一个细胞进行修饰。此外，可能对待用于愈伤组织形成的步骤的植物细胞的基因组和由诱导愈伤组织形成的步骤所得的愈伤组织细胞的基因组进行修饰。根据本发明
2012/001527、wo 2012/093833、wo 2012/104729、wo 2012/138927、wo 2012/138939)。wo2012/138927进一步描述了单体(致密)talen和具有多种催化结构域以及它们的组合的talen。
[0064]
最近，描述了一种新型可定制内切核酸酶系统，即所谓的crispr/cas系统。在其自然环境中的crispr系统描述了一种分子复合物，其包括至少一种与cas核酸酶或可以产生特异性dna双链断裂的另一crispr核酸酶如cpf1核酸酶(zetsche et al.“cpf1 is a single rna
‑
guides endonuclease of a class 2crispr
‑
cas system”，cell，163，pp.1
‑
13，october 2015)、mad7核酸酶或csm1核酸酶组合的小的和单独的非编码rna。目前，crispr系统被分为2类，包括5种类型crispr系统，例如ii型系统使用cas9作为效应子，并且v型系统使用cpf1作为效应子(makarova et al.，nature rev.microbiol.，2015)。在人工crispr系统中，合成的非编码rna和crispr核酸酶和/或任选修饰后作为切口酶或缺乏任何核酸酶的功能的修饰的crispr核酸酶，可以与至少一种合成的或人工的引导rna或组合crrna和/或tracrrna功能的grna组合(makarova等，2015，同上)。自然系统中crispr/cas介导的免疫应答需要crispr
‑
rna(crrna)，其中此控制crispr核酸酶的特异性激活的引导rna的成熟在迄今已经被表征的多种crispr系统之间显著不同。首先，入侵的dna(也称为间隔区)整合在crispr基因座近端的两个相邻重复区域之间。ii型crispr系统编码cas9核酸酶以作为干扰步骤的关键酶，该系统同时包含crrna和反式激活rna(tracrrna)作为引导基序。这些杂交并形成双链(ds)rna区域，其被rnaseiii识别并可以被剪切以形成成熟的crrna。然后这些反过来与cas分子结合以便将核酸酶特异性地引导向靶核酸区域。重组grna分子可以同时包括可变dna识别区域和cas相互作用区域，因此可以独立于特定的靶核酸和期望的cas核酸酶特异性地设计。
[0065]
作为进一步的安全机制，pam(原型间隔区相邻基序)必须存在于靶核酸区域中；这些是直接跟在cas9/rna复合物识别dna后的dna序列。已经将化脓性链球菌cas9的pam序列描述为ngg或nag(标准iupac核苷酸代码，jinek et al，“a programmable dual
‑
rna
‑
guided dna endonuclease in adaptive bacterial immunity”，science 2012，337：816
‑
821)。金黄色葡萄球菌cas9的pam序列为“nngrrt”或
“″
nngrr(n)”。其它变体crispr/cas9系统是已知的。因此，脑膜炎奈瑟菌cas9在pam序列nnnngatt处进行切割。嗜热链球菌cas9在pam序列nnagaaw处进行切割。最近，已经描述了弯曲杆菌crispr系统的另一pam基序nnnnryac(wo 2016/021973 a1)。对于cpf1核酸酶，已经描述了没有tracrrna的cpf1
‑
crrna复合物有效地识别和切割由富含t的短pam处理的靶dna，与由cas9系统识别的常见的富含g的pam形成对比(zetsche等，同上)。再者，通过使用修饰的crispr多肽，可以获得特异性的单链断裂。cas切口酶与各种重组grna的组合使用也可以通过双dna切割的方式诱导高特异性的dna双链断裂。此外，通过使用两种grna，可以优化dna结合的特异性，从而优化dna的切割。其它crispr效应子，如最初所述用于细菌的casx和casy效应子，同时是可用的并代表其它可以用于基因组工程化目的的效应子(burstein et al.，“new crispr
‑
cas systems from uncultivated microbes”，nature，2017，542，237
‑
241)。
[0066]
dsbi/ssbi酶的切割位点涉及dna或rna上诱导断裂的确切位置。该切割位点可以包含或不包含(重叠在)dsbi/ssbi酶的识别位点，因此可以说dsbi/ssbi酶的切割位点位于或靠近其识别位点。dsbi/ssbi酶的识别位点，有时也称为结合位点，是dsbi/ssbi酶(特异
性)识别并决定其结合特异性的核苷酸序列。例如，talen或znf单体具有分别由其rvd重复序列或zf重复序列决定的识别位点，而其切割位点由其核酸酶结构域(例如foki)决定并通常位于识别位点之外。在二聚talen或zfn的情况中，该切割位点位于各自单体的两个识别/结合位点之间，这一发生切割的插入dna或rna区域被称为间隔区。
[0067]
本领域的技术人员或能够选择识别dsbi/ssbi酶(其特定识别位点和在预选/预定位点处或其附近的切割位点诱导dsb或ssb)，或能够对此类dsbi/ssbi酶进行工程化。或者，使用任何常规的转化方法或通过与其基因组中具有dsbi/ssbi酶识别位点的生物体杂交，可以将dsbi/ssbi酶识别位点引入到目标基因组中，然后可以在该dsbi/ssbi酶的切割位点处或其附近引入任何所需的核酸。
[0068]
在一些实施方式中，诱导一个或多个双链断裂或一个或多个单链断裂，然后是非同源末端连接(nhej)和/或通过同源重组机制(hdr)的同源定向断裂修复。nhej和hdr是修复断裂的两种主要且不同的途径。同源重组需要作为模板的同源序列的存在(如修复核酸分子或“供体”)，以引导细胞修复过程，而该修复的结果没有错误且是可预测的。在不存在同源重组的模板(或修复核酸分子或“供体”)序列时，该细胞通常尝试通过非同源末端连接(nhej)过程修复该断裂。
[0069]
在这一实施方式的特别优选方面，修复核酸分子被额外地引入到植物细胞中。
[0070]
如本文使用的，“修复核酸分子”是一种单链或双链dna分子或rna分子，其在切割位点附近或其处的预选位点用作基因组dna修饰的模板。如本文使用的，“用作基因组dna修饰的模板”是指通过侧翼区与位于预选位点侧翼的目标基因组中相应同源区域之间的同源重组，任选与修复核酸分子两端之一的非同源末端连接(nhej)的组合(例如，如果只有一个侧翼区)，在预选位点复制或整合该修复核酸分子。通过同源重组的整合将允许修复核酸分子精确与靶基因组连接直到核苷酸水平，而nhej可以导致修复核酸分子与基因组dna连接处的小的插入/缺失。
[0071]
在本文所述方面的各种实施方式中，基因组发生了修饰，其中该基因组至少改变了一个核苷酸。通过转基因(优选包括目标转基因的表达盒)的插入，至少一个核苷酸的替换，和/或和/或至少一个核苷酸的缺失，和/或至少一个核苷酸的插入，只要与修饰前预选基因组靶位点的核苷酸序列相比其导致至少一个核苷酸的总变化，就可以发生该基因组的修饰，从而允许该修饰的识别，例如通过本技术人员将非常了解的如测序或pcr分析等的技术。
[0072]
如本文使用的，“碱基编辑器”是指一蛋白质或其片段，其具有介导靶向碱基修饰能力，即导致目标点突变的目标碱基的转换。优选地，本发明上下文中的至少一个碱基编辑器暂时或永久融合到至少一个dsbi酶上，或任选融合到至少一个dsbi的组分上。该融合可以是共价和/或非共价的。多个出版物已经显示，使用连接到胞苷脱氨酶结构域(载脂蛋白b的mrna编辑催化多肽(apobec1)，例如源自大鼠的apobec)的crispr/cas9切口酶或非功能性核酸酶，靶向的碱基转化，主要是从胞嘧啶(c)到胸腺嘧啶(t)。通过胞苷脱氨酶，催化胞嘧啶(c)的脱氨作用，并得到尿嘧啶(u)，其具有胸腺嘧啶(t)的碱基配对特性。大多数已知的胞苷脱氨酶在rna上起作用，并且已知接受dna的少数示例需要单链(ss)dna。对dcas9靶向dna复合物的研究表明，在形成cas9引导rna
‑
dna“r
‑
loop”复合物时，置换dna链的至少9个核苷酸(nt)是未配对的(jore et al.，nat.struct.mol.biol.，18，529
‑
536(2011))。事
实上，在cas9 r
‑
loop复合物的结构中，替换dna链上原型间隔区的前11nt是无序的，这表明它们的运动并未受到高度的限制。也已经推测，在非模板链的胞嘧啶处的cas9切口酶诱导的突变可以来自于细胞胞嘧啶脱氨酶对其的可及性。可以推断，r
‑
loop中ssdna这段伸缩的子集可以作为dcas9栓系胞苷脱氨酶的有效底物，以直接、可编程地将dna中的c转化为u(komor等，同上)。最近，goudelli等((2017).programmable base editing of a
·
t to g
·
c in genomic dna without dna cleavage.nature，551(7681)，464.)描述了介导基因组dna中a
·
t向g
·
c转化的腺嘌呤碱基编辑(abe)。
[0073]
如本文使用的，“基因组的修饰”意味着基因组改变了至少一个核苷酸。通过至少一个核苷酸的替换，和/或至少一个核苷酸的缺失，和/或至少一个核苷酸的插入，只要与修饰前预选基因组靶位点的核苷酸序列相比其导致至少一个核苷酸的总变化，就可以发生这一基因组的修饰，从而允许识别的修饰，例如通过本技术人员将非常了解的如测序或pcr分析等的技术。
[0074]
如本文使用的，“识别位点”或“预选(靶)位点”或“预定(靶)位点”表示需要插入、替换和/或删除一个或多个核苷酸的基因组(例如核基因组)中的特定核苷酸序列。例如，这可以是在先前引入的外源dna或转基因中或与先前引入的外源dna或转基因连接的内源性基因座或特定核苷酸序列。该预选位点可以是预期插入一个或多个核苷酸处(之后)的特定核苷酸位置。该预选位点还可以包括一个或多个将被交换(替换)或缺失的核苷酸的序列。
[0075]
如在本技术上下文中使用时，术语“约”是指所叙述值的 /
‑
10％，优选叙述值的 /
‑
5％。例如，约100个核苷酸(nt)应理解为90和110nt之间的值，优选在95和105之间。
[0076]
如本文使用的，“侧翼区”是指修复核酸分子的区域，该修复核酸分子具有与预选位点侧翼(即上游或下游)的dna区域的核苷酸序列同源的核苷酸序列。显然，应该选择侧翼区的长度和序列同一性百分比，从而使得能够在所述侧翼区和它们在预选位点上游或下游的相应dna区域之间进行同源重组。与修复核酸分子的侧翼dna区域具有同源性的预选位点侧翼的dna区域也被称为基因组dna中的同源区域。
[0077]
为了具有足够的重组同源性，修复核酸分子的侧翼dna区域长度可以发生变化，并且长度应为至少约10nt、约15nt或约20nt。然而，侧翼区可以尽可能的长(例如，高达约100
‑
150kb，如完整的细菌人工染色体(bac))。优选地，侧翼区为约50nt至约2000nt，例如约100nt、200nt、500nt或1000nt。此外，目标dna侧翼区域不需要与同源区域(预选位点侧翼的dna区域)相同，和可以与预选位点侧翼的dna区域具有约80％至约100％的序列同一性，优选约95％至约100％的序列同一性。侧翼区越长，对同源性的要求就越不严格。此外，为了在不改变相邻dna序列的dna序列的情况下在预选位点实现靶dna序列的交换，侧翼dna序列优选地应该与预选位点侧翼的上游和下游dna区域相同。
[0078]
如本文使用的，“上游”表示核酸分子上更接近所述核酸分子5'端的位置。同样，术语“下游”表示核酸分子上更接近所述核酸分子3'端的位置。为了避免疑义，核酸分子及其序列通常表示为其5'至3'的方向(从左到右)。
[0079]
为了在预选位点进行靶序列修饰，必须选择侧翼区，从而上游侧翼区的3'端和/或下游侧翼区的5'端与预定位点的末端对齐。因此，上游侧翼区的3'端决定了预定位点的5'端，而下游侧翼区的5'端决定了预定位点的3'端。
[0080]
如本文使用的，所述预选位点位于所述切割(和/或识别)位点之外或远离所述切
割(和/或识别)位点，意味着预期进行基因组修饰的位点(预选位点)不包括ssbi或dsbi酶的切割位点和/或识别位点，即预选位点不与切割(和/或识别)位点重叠。因此，在这一方面的外部/远离是指切割(和/或识别)位点的上游或下游。
[0081]
生产遗传修饰的植物的上述方法的步骤(c)和(d)如上文所述的在生产转基因植物的上下文中进行。因此，经过基因编辑并可能具有修饰基因组的修饰植物细胞被再生为完整(可育)的植物。
[0082]
本发明的另一方面仍然涉及单倍体和双单倍体植物胚和植物的生产。已经发现，hyperphyllin及其衍生物对愈伤组织形成的有益效果也可以用于生产单倍体和双单倍体植物胚。因此，本发明提供了一种生产单倍体植物胚的方法，该方法包括以下步骤：
[0083]
(a)根据上述方法诱导未成熟的雄性配子体或小孢子得到的愈伤组织形成，以产生愈伤组织，
[0084]
(b)根据上述方法培养步骤(a)中获得的愈伤组织以产生植物苗，和
[0085]
(c)任选进行染色体的加倍。
[0086]
然后以这一方式获得的单倍体或双单倍体植物胚可以再生为成熟植物。因此，本发明提供了一种生产单倍体或双单倍体植物的方法，该方法包括以下步骤：
[0087]
(a)根据上述方法诱导未成熟的雄性配子体或小孢子得到的愈伤组织形成，以产生愈伤组织，
[0088]
(b)根据上述方法培养从步骤(a)中获得的愈伤组织以产生植物苗，
[0089]
(c)任选进行染色体的加倍，和
[0090]
(d)再生单倍体或双单倍体植物。
[0091]
单倍体是含有配子染色体数目的植物(孢子体)。在几种植物物种中发现了自发的单倍体个体。然而，自发证据是罕见事件，导致应用有限。因此，人工单倍体诱导是育种中潜在应用的必要条件。诱导方案差异很大，不仅在物种间，而且在同一物种的基因型间。
[0092]
在本发明的方法中，未成熟的雄性配子体或小孢子被用作生产单倍体和双单倍体的起始材料。在步骤(a)中，在促进如上所述愈伤组织生长的条件下，诱导愈伤组织的形成。该方法依赖于未成熟雄性配子体和小孢子将其发育途径从配子体(导致花粉粒成熟)转化为孢子体的能力，导致单倍体水平的细胞分裂后形成愈伤组织和胚。这一过程可以由几个因素进行诱导。最广泛使用的触发因素是温度预处理、蔗糖和氮饥饿以及渗透性胁迫。除胁迫处理外，培养基成分也有显著影响。取决于所涉及的植物，本技术人员可以在各种公知的适合从未成熟的雄性配子体或小孢子诱导愈伤组织形成的方法中进行选择。
[0093]
在步骤(b)中，在上述详细描述的条件下培养愈伤组织，以诱导苗形成。
[0094]
由于单倍体植物中没有一组同源染色体，不能发生减数分裂，因此没有种子成形。因此，可以在上述方法的步骤(c)中完成染色体补体的复制，以用于生产单倍体和双单倍体植物胚和植物。各种技术已经应用了几十年，并且是本技术人员所熟知的。最常用的应用是抗微管药物，如秋水仙碱(最初提取自秋水仙)的处理，其通过与微管蛋白结合抑制微管聚合。虽然秋水仙碱以毫摩尔浓度使用时是剧毒，和已知在动物体内比在植物组织中更高效，但它仍然是应用最广泛的倍增剂。其它选择是黄草消(oryzalin)、谷硫磷(amiprophosmethyl，apm)、氟乐灵和拿草特，所有这些均用作除草剂且微摩尔浓度下有效。
[0095]
抗微管药物可以应用于上述方法的各个阶段，如并入小孢子预处理培养基中。在
发育后期处理植物的优点是，只有已经测试过的单倍体再生体在适应环境后在体外(例如在苗培养阶段)或体内进行处理。处理的浓度和持续时间必须始终与两种效应相关：加倍植物的百分比和存活百分比。
[0096]
本发明适用于任何植物物种，无论是单子叶植物还是双子叶植物。优选地，可以受本发明方法和用途处理的植物选自大麦(hordeum vulgare)、球茎大麦(hordeum bulbusom)、双色高粱(sorghum bicolor)、甘蔗(saccharum officinarium)、包括玉米(zea mays)在内的玉蜀黍属物种(zea spp.,)、小米(setaria italica)、小粒稻(oryza minuta)、水稻(oryza sativa)、澳洲野生稻(oryza australiensis)、高秆野生稻(oryza alta)、小麦(triticum aestivum)、硬粒小麦(triticum durum)、黑麦(secale cereale)、黑小麦(triticale)、苹果(malus domestica)、紫短柄草(brachypodium distachyon)、海滨大麦(hordeum marinum)、节节麦(aegilops tauschii)、钩吻胡萝卜(daucus glochidiatus)、包括甜菜(beta vulgaris)在内的甜菜属物种(beta spp.)、小胡萝卜(daucus pusillus)、daucus muricatus、胡萝卜(daucus carota)、巨桉(eucalyptus grandis)、美花烟草(nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(nicotiana tomentosiformis)、烟草(nicotiana tabacum)、本氏烟草(nicotiana benthamiana)、番茄(solanum lycopersicum)、马铃薯(solanum tuberosum)、中果咖啡(coffea canephora)、葡萄(vitis vinifera)、erythrante guttata、螺旋狸藻(genlisea aurea)、黄瓜(cucumis sativus)、marus notabilis、arabidopsis arenosa、深山南芥(arabidopsis lyrata)、拟南芥(arabidopsis thaliana)、喜马拉雅鼠耳芥(crucihimalaya himalaica)、卵叶须弥芥(crucihimalaya wallichii)、弯曲碎米荠(cardamine nexuosa)、北美独行菜(lepidium virginicum)、荠菜(capsella bursa pastoris)、olmarabidopsis pumila、筷子芥(arabis hirsute)、欧洲油菜(brassica napus)、甘蓝(brassica oleracea)、芜菁(brassica rapa)、萝卜(raphanus sativus)、芥菜(brassica juncacea)、黑芥(brassica nigra)、芝麻菜亚种sativa(eruca vesicaria subsp.sativa)、甜橙(citrus sinensis)、麻风树(jatropha curcas)、毛果杨(populus trichocarpa)、蒺藜状苜蓿(medicago truncatula)、山下鹰嘴豆(cicer yamashitae)、cicer bijugum、鹰嘴豆(cicer arietinum)、网状鹰嘴豆(cicer reticulatum)、cicer judaicum、木豆(cajanus cajanifolius)、蔓草虫豆(cajanus scarabaeoides)、菜豆(phaseolus vulgaris)、大豆(glycine max)、棉花(gossypium sp.)、紫云英(astragalus sinicus)、百脉根(lotusjaponicas)、夏堇(torenia fournieri)、洋葱(allium cepa)、葱(allium fistulosum)、蒜(allium sativum)、向日葵(helianthus annuus)、菊芋(helianthus tuberosus)和/或韭菜(allium tuberosum)。特别优选甜菜、玉米、小麦、大麦、黑麦、向日葵、马铃薯、双色高粱、芜菁、欧洲油菜、芥菜、甘蓝、大豆和/或棉花。
[0097]
本发明的主题也是通过上述方法获得或可获得的植物。因此，本发明的一个实施方式是通过上述转化植物细胞并从所述细胞再生植物的方法获得或可获得的转基因植物，以及其子代或部分，其中该子代或部分包含作为转基因的至少一种感兴趣的核苷酸序列。本发明的另一实施方式是通过上述修饰植物细胞的基因组并从所述细胞再生植物的方法获得或可获得的遗传修饰的植物，以及其子代或部分，其中该子代或部分包含通过本发明的方法引入的基因组的修饰。本发明的又一实施方式是通过上述生产单倍体植物胚的方法
获得或可获得的单倍体或双单倍体植物。
[0098]
本发明的进一步主题是来源于上述转基因植物或遗传修饰的植物的植物细胞或种子。源于上述转基因植物的植物细胞包含作为转基因的至少一种感兴趣的核苷酸序列，而源于上述遗传修饰的植物的植物细胞包括其基因组中的修饰。
[0099]
本发明的又一实施方式是来源于上述单倍体或双单倍体植物的植物细胞或种子。植物细胞或种子包含染色体的单倍体或双单倍体集。
[0100]
本发明将参考以下的图和实施例进行进一步描述。然而应理解本发明不限于此类实施例。
[0101]
除非实施例中另有说明，所有重组dna技术按照以下所述的标准方案进行：sambrook et al.(1989)molecular cloning：alaboratory manual，second edition，cold spring harbor laboratory press，ny和volumes 1and 2of ausubel et al.(1994)current protocols in molecular biology，current protocols，usa。植物分子研究的标准材料和方法如下所述：r.d.d.cray的plant molecular biology labfax(1993)，由bios科学出版有限公司(英国)和布莱克威尔科学出版社(英国)联合出版。标准分子生物学技术的其它参考文献包括sambrook和russell(2001)molecular cloning：alaboratory manual，third edition，cold spring harbor laboratory press，ny，volumes i and ii of brown(1998)molecular biology labfax，second edition，academic press(uk)。聚合酶链反应的标准材料和方法可以参见dieffenbach and dveksler(1995)pcr primer：a laboratory manual，cold spring harbor laboratory press，以及mcpherson等(2000)pcr
‑
basics：from background to bench，first edition，springer verlag，germany。
[0102]
本文提及或引用的所有专利、专利申请和出版物或公开披露(包括互联网上的出版物)均以引用的方式并入本文。
附图说明
[0103]
图1：示出了hyperphyllin(hp；n
‑
[4
‑
氨基
‑2‑
氯苯基]
‑
2,4
‑
二氯苯甲酰胺；cas#：42480
‑
64
‑
8)及其三种不同的衍生物a1、a2和a3的化学式。
[0104]
图2：示出了二元载体pzfn
‑
nptii
‑
70s::atgrf5(a)和pzfn
‑
nptii
‑
70s::tdt(b)的图。
[0105]
图3：证明了用浓度为30μm和50μm的hp处理的顽固基因型a中愈伤组织诱导的促进作用。上图：30μm hp显著促进顽固基因型a的愈伤组织诱导；下图：50μm hp具有相似的作用，但效率没有进一步增加。箭头表示愈伤组织形成。不含hp的dmso作为对照。
[0106]
图4：示出了不用(
‑
hp)和用hp( hp)的愈伤组织诱导效率，并证明了hp对两次重复的顽固基因型a和额外基因型b的增强作用。
[0107]
图5：示出了与不用hp的对照(
‑
hp)相比，hp(30μm)诱导的愈伤组织( hp)产生更多量的愈伤组织。
[0108]
图6：示出了不用(
‑
hp)和用hp( hp)诱导小植株从愈伤组织再生的比较。hp介导的诱导导致更多从愈伤组织再生的植物。
[0109]
图7：示出了农杆菌感染后7天，适合基因型c和顽固基因型a的hp诱导的愈伤组织的荧光成像。两种基因型均已用70s::tdt构建体进行转化(另见图2b)。亮点和扇区表明成
功的农杆菌介导的转化。
[0110]
图8：示出了一些顽固基因型(如基因型a)的hp诱导和遗传修饰的愈伤组织只能通过与再生增强基因(如atgrf5)共转化再生成完成的植物。
[0111]
图9：示出了hp衍生物a2(50μm)在顽固基因型中促进愈伤组织诱导(右列)。左列：未经hp处理的对照。
实施例
[0112]
1、二元质粒的描述
[0113]
通过以下标准克隆程序生产了二元载体(图2)pzfn
‑
nptii
‑
70s::atgrf5和pzfn
‑
nptii
‑
70s::tdt(两种结构均为二元的)。如图2所示，在此载体的t
‑
dna内，编码argrf5的cdna(dna：seq id no：1；氨基酸：seq id no：2)和作为荧光标记物的tdtomato(tdt)被克隆在双camv 35s启动子和胭脂碱合酶(nos)基因的终止子之间。t
‑
dna还含有新霉素磷酸转移酶ii(nptii)基因，该基因对一系列氨基糖苷类抗生素(如卡那霉素或巴龙霉素)具有抗性，并用于选择转基因植物细胞和组织。nos启动子和pag7终止子位于nptii基因的侧翼。该二元载体的骨架含有分别用于大肠杆菌质粒复制和根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)质粒复制的cole1和pvs1起点；和赋予链霉素/大观霉素抗性进行细菌选择的aada基因。
[0114]
通过标准程序，将两种质粒转化至agl
‑
1农杆菌菌株。
[0115]
2.甜菜愈伤组织诱导
[0116]
1.用多种专有基因型的微繁殖苗作为起始材料：基因型a和b难以发生愈伤组织诱导和植物再生。例如，基因型a没有表现出足够的愈伤组织诱导并且愈伤组织质量极差。因此，这样的愈伤组织永远无法转化。基因型c不太顽固。在ms盐 30 g/l蔗糖和0.25mg/l苄基腺嘌呤(bap)中繁殖苗。
[0117]
2.为了诱导脆性愈伤组织，从微繁殖苗中分离叶外植体，并在含有ms盐包括15g/l蔗糖和2mg/l bap的愈伤组织诱导培养基(cim)中28℃孵育7至8周。在培养基中加入2ml/l dmso作为对照或溶于2ml/l dmso的30μm hp或溶于2ml/l dmso的50μm hp。hp是hyperphyllin，一种化学式为n
‑
[4
‑
氨基
‑2‑
氯苯基]
‑
2,4
‑
二氯苯甲酰胺的小分子(cas#：42480
‑
64
‑
8)。
[0118]
孵育时期后，对愈伤组织的诱导和形成进行了分析。图3显示在顽固基因型a中，浓度为30μm和50μm的hp促进了愈伤组织形成。这两种浓度的诱导效率无显著差异。有无hp的愈伤组织诱导效率的定量证明了hp对不同顽固基因型(a和b)的增强作用，尽管基因型a(图4a)的效率增加高于基因型b(图4b)。在单个板上转移诱导的愈伤组织后，观察到与不用hp的对照相比，应用30μm hp可以从叶片中诱导更多量的愈伤组织(图5)。
[0119]
3.甜菜苗诱导和增殖
[0120]
3.从诱导物中收获步骤2的脆性愈伤组织，并转移至含有ms盐、30g/l蔗糖、1mg/lga3和1mg/l噻苯隆(tdz)的苗诱导培养基中。愈伤组织在24℃下以光照/黑暗周期(16h/8h)孵育1至2周。
[0121]
4.在步骤1的培养基中插入(mount)并培养再生的苗。植物在24℃下以光照/黑暗周期(16h/8h)生长。
[0122]
图6：示出了用和不用hp诱导愈伤组织的再生的小植株的比较。hp诱导的愈伤组织可以再生出更多的植物。用hp诱导的植物均表现出正常的表型。
[0123]
4、农杆菌介导的甜菜愈伤组织的转化
[0124]
a.如步骤1和2所述，诱导了甜菜愈伤组织。
[0125]
b.将脆性愈伤组织固定在含有ms盐、30g/l蔗糖、1mg/l ga3和1mg/l噻苯隆(tdz)的培养基中，24℃避光保存1周。
[0126]
c.将带有载体pzfn
‑
nptii
‑
70s::atgrf5和pzfn
‑
nptii
‑
70s::tdt的农杆菌agl
‑
1在补充有适当抗生素的培养基(5g/l胰蛋白胨 2.5g/l酵母提取物 1g/l nacl 5g/l甘露醇 0.1g/l mgso4×
7h2o 0.25g/l kh2po4 1g/l谷氨酸，ph 7.0)中于28℃下生长24h。
[0127]
d.在0.8的od600下，用农杆菌悬浮液接种愈伤组织(培养基：440mg/lcacl2×
2h2o 170mg/l kh2po4 1.9g/l kno3 180.7mg/l mgso4 1.65g/l nh4no3 2mg/lbap 40μg l乙酰丁香酮 20g/l蔗糖 2g/l葡萄糖，ph 6.0)。在21℃避光下，在包含440mg/l cacl2×
2h2o、170mg/l kh2po4、1.9g/l kno3、180.7mg/l mgso4、1.65g/l nh4no3、2mg/l bap、40μg/l乙酰丁香酮、20g/l蔗糖和2g/l葡萄糖的培养基中孵育愈伤组织和农杆菌3天。
[0128]
e.将愈伤组织传代培养至包含ms盐、30g/l蔗糖、1mg/l ga3、1mg/l tdz和500mg/l特美汀的培养基中，并在24℃避光下孵育1周。
[0129]
f.为了选择转基因愈伤组织，将样品转移至含有ms盐、30g/l蔗糖、1mg/l ga3、1mg/l tdz、500mg/l特美汀和100mg/l巴龙霉素的培养基中，并在24℃下在光照/黑暗周期(16h/8h)下孵育3周。
[0130]
g.选择转基因愈伤组织，并在相同的培养基和条件下传代培养数次。
[0131]
h.分离再生苗，并在含有ms盐、30g/l蔗糖、0.25mg/l苄基腺嘌呤(bap)和100mg/l卡那霉素的培养基中繁殖。
[0132]
i.从绿色生长苗中分离叶片外植体用于dna提取和pcr分析以证实假定的转基因系。
[0133]
j.选择的苗在培养基(ms盐 30g/l蔗糖 6.25mg/l naa)中生根并转移到温室进行种子生产。
[0134]
图7显示了来自顽固基因型的hp诱导愈伤组织可被农杆菌感染。然而，顽固基因型的愈伤组织中转基因植物的再生并不总是可能的。通常只能通过额外表达再生增强基因(如atgrf5)从hp诱导的愈伤组织中获得转基因植物(见pct/ep2018/086902)(图8)。
[0135]
此外，根据上述过程检测了不同浓度(10、30、50、100、500μm和1mm)的hp。仅30和50μm显示出强的愈伤组织诱导效果。然而，10和100μm引起至少中等的效果，而较高浓度显示没有效果(表1)。此外，还检测了浓度为30和50μm的hp衍生物a1和a2。衍生物a2在30μm时产生强的愈伤组织诱导效果(图9)，在50μm时仅产生较弱的效果。衍生物a1仅在30μm浓度下起作用(表1)。
[0136]
表1：不同hp衍生物在不同浓度下的测试(
‑
：无愈伤组织诱导效果； ：中等愈伤组织诱导效果； ：强愈伤组织诱导效果
[0137]
化学化合物浓度(溶解在2ml/ldmso中)愈伤组织诱导效果hp10μm hp30μm
hp50μm hp100μm hp500μm
‑
hp1mm
‑
hp衍生物a130μm hp衍生物a150μm
‑
hp衍生物a230μm hp衍生物a250μm