一种乳源多肽及其嵌合肽在用于制备促进脂肪细胞能量代谢药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及多肽和细胞代谢领域，具体地说涉及一种乳源多肽及其嵌合肽在用于制备促进脂肪细胞能量代谢药物中的应用。


背景技术：

2.肥胖是一种因长期能量摄入大于消耗，多余能量以脂肪形式存储于体内而引发的代谢性疾病。肥胖患者常伴有2型糖尿病、心血管疾病、高血脂、高血压、肿瘤等严重并发症，因而危害巨大。过去四十年间，全球肥胖人口从1.05亿上升至6.41亿，使肥胖成为一个全球性的严重公共卫生问题。我国的肥胖问题同样严峻，肥胖人口总数（9000万）已位列全球第一，可预见庞大的肥胖群体将严重加剧我国医疗和经济负担。因此，寻找有效、健康的肥胖防治方法已迫在眉睫。
3.人和哺乳动物体内主要存在两种脂肪细胞：白色脂肪细胞（white adipocytes）和棕色脂肪细胞（brown adipocytes），棕色脂肪可以通过线粒体解偶联蛋白1（ucp1）将脂质以热量形式释放，而白色脂肪细胞受外界因素（如寒冷、β3肾上腺素受体激动剂等）则会发生棕色化样变，同样可以将脂质以热量形式释放。因此，近年来从促进脂肪细胞自身代谢角度实现肥胖防治的研究策略成为科研人员关注的热点。然而，棕色脂肪的含量与活性均在新生儿期达到顶峰，成人体内虽有一定数量的活性bat分布，但其含量却难以满足肥胖治疗要求。因此，如何提高成人体内棕色脂肪的含量与活性、促进白色脂肪棕色化样变是激活脂肪能量代谢用于肥胖治疗的关键。
4.近年来则发现，半脱脂母乳的摄入，能够显著提高8岁、13岁儿童肩胛区的体温，而该区域是人体棕色脂肪的主要分布区域；奶粉制品也具有促进棕色脂肪细胞分化成熟、增加ucp
‑
1表达等作用，提示某些母乳成分可能作用于棕色脂肪，而介导母乳的肥胖防治作用。多肽是母乳中主要活性物质之一。鉴于已见诸多多肽在调控脂肪细胞能量代谢、缓解模型动物肥胖表型方面的功能报道。因此从乳源多肽角度、寻找影响促进脂肪生成和能量代谢活性的新成份，有可能为肥胖防治提供新靶标。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明的目的是提供一种八个氨基酸的乳源多肽及其在用于制备促进脂肪细胞能量代谢药物中的应用；本发明还有一个目的是提供一种含有前述乳源多肽的分离的嵌合多肽；本发明还有一个目的是提供前述嵌合多肽在用于制备促进脂肪细胞能量代谢药物中的应用；本发明还有一个目的是提供包含前述一种或多种嵌合多肽的组合物，及该组合物在用于制备促进脂肪脂肪细胞代谢药物中的应用。
6.技术方案：一种分离的乳源多肽，其为seq id no.1所示的氨基酸序列： vkeamapk，其可用于制备促进脂肪细胞能量代谢药物，更具体地说，其能显著促进白色脂肪细胞和棕色脂肪细胞的代谢能力，细胞基础代谢能力、atp产生、质子漏水平均显著增强，其
中质子漏代表细胞的产热活性。
7.所述乳源多肽vkeamapk来自牛乳β
‑
酪蛋白113
‑
120位氨基酸，可通过本领域技术人员熟知的化学合成方法制备获得，例如通过小分子多肽的液相合成/固相合成方法获得。本领域技术人员可在其基础上进行必要的修饰，包括但不限于特定基团的保护/去保护，c端和/或n端和/或侧链的酰基化、烷基化、酰胺化、酯基化，以及其他特殊偶联或螯合修饰。另外，还可以从小分子多肽在跨膜转运的角度对其进行加工，其中就包括与穿膜肽连接。
8.本发明提供了一种分离的嵌合多肽，包括如x1‑
grkkrrqrrr
‑
x2‑
vkeamapk
‑
x3所示的线性氨基酸序列，其中，x1选自氢原子、n端修饰基团、包含或不包含n端修饰基团的y残基或cy残基，x2选自肽键、ppq、ppqq的任意一种，x3选自羟基或c端修饰基团。
9.更进一步地，所述分离的嵌合多肽包括如下的肽链：seq id no.2: grkkrrqrrrvkeamapk；分子式c
93
h
175
n
41
o
22
s，平均分子量2.25 kda，平均等电点ph 12.471。
10.seq id no.3: cygrkkrrqrrrvkeamapk；分子式c
105
h
189
n
43
o
25
s2，平均分子量2.52 kda，平均等电点ph 11.911。
11.seq id no.4: ygrkkrrqrrrvkeamapk；分子式c
102
h
184
n
42
o
24
s，平均分子量2.42 kda，平均等电点ph 12.187。
12.seq id no.5: grkkrrqrrrppqvkeamapk；分子式c
108
h
197
n
45
o
26
s，平均分子量2.57 kda，平均等电点ph 12.471。
13.seq id no.6: grkkrrqrrrppqqvkeamapk；分子式c
113
h
205
n
47
o
28
s，平均分子量2.70 kda，平均等电点ph 12.471。
14.上述嵌合多肽可采用前述化学合成方法制备获得，且本领域技术人员可在其基础上进行必要的修饰，包括但不限于特定基团的保护/去保护，c端和/或n端和/或侧链的酰基化、烷基化、酰胺化、酯基化，以及其他特殊偶联或螯合修饰。
15.其中，所述n端修饰基团选自包括但不限于乙酰基、磺酰基的任意一种；所述c端修饰基团选自包括但不限于氨基或烷基氨基。
16.上述五条肽链都包含前述的乳源多肽序列vkeamapk和不同的穿膜肽序列，这些穿膜肽序列大多包含连续的精氨酸（r, arg）和/或连续的赖氨酸（k, lys），这些碱性氨基酸通过寡肽的方式相联接，联接穿膜肽的嵌合多肽生理状态下稳定、无毒，不会引起免疫反应。
17.本发明基于seahorse细胞能量代谢物分析表明上述的嵌合多肽能显著促进白色脂肪细胞和棕色脂肪细胞的代谢能力，细胞基础代谢能力、atp产生、质子漏水平均显著增强，其中质子漏代表细胞的产热活性。
18.ucp1蛋白是参与脂肪组织产热调节和能量代谢的一种解偶联蛋白，目前已被广泛用于能量代谢的实验验证、肥胖症治疗等领域。利用western blot验证经前述嵌合多肽处理后白色脂肪细胞和棕色脂肪细胞中ucp1蛋白的表达，表现出对嵌合多肽剂量的依赖，较高浓度的处理效果更显著。
19.荧光定量pcr进验证了经前述嵌合多肽处理后白色脂肪细胞和棕色脂肪细胞中ucp1 mrna含量显著上调，ppar
ɑ
、pgc1
ɑ
和dio2表达增加，提示细胞代谢能力增强。其中ppar
ɑ
、pgc1
ɑ
和dio2是脂肪细胞代谢的重要标志物。
20.在以上研究的基础上，本发明还提供一种组合物，其包括前述seq id no.2
ꢀ‑ꢀ
seq id no.6任意一个或多个嵌合多肽，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。该组合物和能预测具有前述任意一个嵌合多肽的生物活性，可用于制备促进脂肪细胞代谢药物，也可同于制备治疗肥胖症的药物。
21.有益效果：本发明提供了一种小分子乳源多肽在脂肪细胞能量代谢领域新用途的研究成果，对脂肪细胞能量代谢其重要作用的解偶联蛋白及相关标志物进行了全面的验证，确定了较高剂量的嵌合多肽可促进白色脂肪细胞和棕色脂肪细胞的能量代谢。本发明将小分子乳源多肽与具有穿膜特性的肽链相组合，其仍具备前述的显著性效果，对研究脂肪细胞代谢和治疗肥胖症生物制剂的产业化实施具有重要意义。
附图说明
22.图1为实施例2关于seahorse检测嵌合多肽对白色脂肪细胞能量代谢影响的试验数据图表；图2为实施例2关于seahorse检测嵌合多肽对棕色脂肪细胞能量代谢影响的试验数据图表；图3为实施例3关于western blot检测嵌合多肽对白色脂肪细胞ucp1蛋白表达影响的试验数据图表，右图为western blot结果的灰度值统计；图4为实施例3关于western blot检测嵌合多肽对棕色脂肪细胞ucp1蛋白表达影响的试验数据图表，右图为western blot结果的灰度值统计；图5为实施例4关于荧光定量pcr检测嵌合多肽对白色脂肪细胞代谢能力调节相关基因表达影响的试验数据图表；图6为实施例4关于荧光定量pcr检测嵌合多肽对棕色脂肪细胞代谢能力调节相关基因表达影响的试验数据图表。
具体实施方式
23.下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明。
24.实施例1除非特别说明，本实施例的肽链均委托上海科肽生物有限公司合成，纯度>98%。本实施例提供了一种分离的乳源多肽，其氨基酸序列为vkeamapk，该乳源多肽可促进白色脂肪细胞和棕色脂肪细胞的能量代谢。
25.作为一种实施方式，在乳源多肽的n端连接穿膜序列grkkrrqrrr，获得了如seq id no.2所示的嵌合多肽grkkrrqrrrvkeamapk；分子式c
93
h
175
n
41
o
22
s，平均分子量2.25 kda，平均等电点ph 12.471。
26.作为另一种实施方式，在乳源多肽的n端连接穿膜序列cygrkkrrqrrr，获得了如seq id no.3所示的嵌合多肽cygrkkrrqrrrvkeamapk；分子式c
108
h
197
n
45
o
26
s，平均分子量2.52 kda，平均等电点ph 12.471。
27.作为另一种实施方式，在乳源多肽的n端连接穿膜序列ygrkkrrqrrr，获得了如seq id no.4所示的嵌合多肽ygrkkrrqrrrvkeamapk；分子式c
102
h
184
n
42
o
24
s，平均分子量2.42 kda，平均等电点ph 12.187。
28.作为另一种实施方式，在乳源多肽的n端连接穿膜序列grkkrrqrrrppq，获得了如seqidno.5所示的嵌合多肽grkkrrqrrrppqvkeamapk；分子式c
105
h
189
n
43
o
25
s2，平均分子量2.57kda，平均等电点ph11.911。
29.作为另一种实施方式，在乳源多肽的n端连接穿膜序列grkkrrqrrrppq，获得了如seqidno.6所示的嵌合多肽grkkrrqrrrppqqvkeamapk；分子式c
113
h
205
n
47
o
28
s，平均分子量2.70kda，平均等电点ph12.471。
30.本领域技术人员在不脱离本发明保护范围的基础上，可进行必要的修饰，包括但不限于特定基团的保护/去保护，c端和/或n端和/或侧链的酰基化、烷基化、酰胺化、酯基化，以及其他特殊偶联或螯合修饰。通常地，可基于上述五条肽链，在n端添加羧基，c端添加羟基或氨基进行修饰。
31.实施例2seahorse检测嵌合多肽对脂肪细胞能量代谢的影响1.实验方法取对数生长期的人白色和棕色脂肪前体细胞种植于seahorse细胞培养板中，采用dmem/f12培养基培养至细胞长满培养板，继续融合24h后开始诱导细胞分化。其中白色脂肪细胞以含有5mg/l胰岛素、0.5mmibmx、1mm地塞米松、1μm罗格列酮和10�s的dmem培养基作为诱导剂i，诱导培养细胞4天，然后改用含有5mg/l胰岛素和5�s的dmem培养基作为诱导剂ii，继续诱导培养细胞4天；而棕色脂肪则在上述诱导剂i基础上增加1nmt3（三碘甲状腺原氨酸）诱导培养4天后转为诱导剂ii继续培养两天。
32.白色脂肪细胞于诱导分化第8天，棕色脂肪细胞诱导分化第6天，分别加入不同浓度的seqidno.6所示的嵌合多肽grkkrrqrrrppqqvkeamapk（10μm和50μm），3小时后利用seahorse仪器检测细胞能量代谢能力变化。
33.2.实验结果如图1、图2所示，与对照组（vehicle）相比，前述的嵌合多肽在10μm和50μm均展现出对白色和棕色脂肪细胞代谢能力的促进作用，以50μm作用能力更强，尤其在棕色脂肪细胞代谢能力各个水平的增强均具有显著意义；细胞基础代谢能力（basal）、atp产生（atpproduction）、质子漏水平（protonleak）分别上调2.2和1.5、2.3和1.2、1.7和1.1以及2.3和4.9倍。
34.实施例3westernblot检测嵌合多肽对脂肪细胞ucp1蛋白表达的影响1.实验方法参考实施例2的方法处理细胞后收集蛋白样品，采用ripa裂解液抽提总蛋白，采用bca法对上述蛋白进行定量，根据计算获得的蛋白浓度，采用1x上样缓冲液（loadingbuffer）调整样品浓度至一致，方便后期上样。采用10%sds
‑
page胶开展垂直电泳，电泳结束后采用湿转的方法将分离的蛋白转移至pvdf膜上。转膜结束后与1:2000稀释的ucp1抗体（abcam/ab155117）于4度孵育过夜，次日清洗后与抗兔的二抗（1:5000稀释）进行孵育，最后采用化学发光法显色蛋白条带。
35.2.实验结果由图3、图4所示，grkkrrqrrrppqqvkeamapk嵌合多肽处理后可显著上调白色和棕色脂肪细胞中ucp1蛋白表达，并展示出一定的剂量依赖性；灰度值统计分析显示上述表达差异具有统计学意义，其中50μm浓度处理效果更为显著。ucp1是脂肪通过解偶联作用将脂
质以热量代谢掉的主要效应蛋白，ucp1蛋白表达量的提高与脂肪细胞代谢水平呈正相关。
36.实施例4 荧光定量pcr检测嵌合多肽对脂肪细胞代谢能力调节相关基因表达的影响1.实验方法参考实施例2的方法处理细胞后收集样品，每孔加入700 ul trizol裂解细胞，然后依次加入氯仿、酒精逐步纯化细胞总rna，采用nanodrop检测抽提rna的浓度，控制a
260
/a
280 > 1.7以保障抽提地抽提rna纯度，rna于
‑
80度冰箱保存。取500 ng总rna利用takara逆转录试剂盒将rna转录为cdna，利用sybrgreen法对脂肪细胞能量代谢调控相关基因进行定量分析，具体采用384板于abi q6定量pcr仪器开展定量pcr实验，以在脂肪细胞中恒定表达的ppia基因作为内参，采用2
‑△△
ct
法计算基因表达差异。
37.2. 实验结果由图5、图6所以，与对照组（vehicle）相比，grkkrrqrrrppqqvkeamapk嵌合多肽处理后白色和棕色脂肪细胞中ucp1 mrna含量显著上调，尤其在高剂量嵌合多肽（50μm）作用下白色和棕色脂肪细胞中ucp1 mrna跟别上调3.6和4.7倍；能量代谢调控相关基因ppar
ɑ
和pgc1
ɑ
表达同样增加，提示细胞代谢能力增强。
38.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。