一种催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法与流程

1.本发明涉及生物制造技术领域，尤其是涉及一种利用微生物发酵香紫苏醇生产香紫苏内酯，提高香紫苏醇利用率和香紫苏内酯产量的方法。


背景技术：

2.香紫苏内酯(sclareolide)是一种类倍半萜类物质，是从salvia sclarea的花中分离出来的一种不溶于水，易溶于有机溶剂的白色结晶状粉末，具有抗菌和细胞毒性的作用，因其具有特殊的香味而被用于香精香料等行业，是一种优良的烟草增香矫味剂。添加到食品中能够增大和提高食品的感官，而广泛用于食品工业。此外在没有心血管刺激作用情况下，当减少身体脂肪时，香紫苏内酯能够帮助增进变瘦身体的质量，因此已经广泛用于减肥产品。目前香紫苏内酯的主要用途是用来合成龙涎香的替代品
‑
降龙涎香醚。
3.目前，香紫苏内酯的获得主要是依靠化学方法，比如以香紫苏醇为底物经过一系列的氧化还原反应而获得，或者是从salvia sclarea的花中提取获得。现在化学合成所使用的传统方法有铬酸酐氧化法，即用铬酸酐氧化香紫苏醇来合成，尽管工艺操作容易，但是收率较低，此外在生产过程中产生的含铬废水对环境污染较大，现在基本不再采用。而目前开发的比如瑞士芬美意公司的臭氧化法；西班牙专利中提出用高碘酸钠和四氧化锇在四氢呋喃中氧化香紫苏醇的方法；美国reynolds公司的高锰酸钾两部氧化法及中国上海香料所开发出了高锰酸钾低温氧化工艺等均是用化学试剂对香紫苏醇进行氧化而获得香紫苏内酯。但是这些化学试剂的残留以及较差的立体选择性等原因极大的限制了香紫苏内酯的应用。因此新型的香紫苏内酯的生产方法的开发极大的引起了研究者们的关注，比如生物合成法。然而目前有关微生物催化合成香紫苏内酯的文献报道相对较少。
4.目前，利用微生物发酵来生产香紫苏内酯仍有一些亟待解决的问题，比如菌株转化效率较差的问题。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法。本发明在发酵体系中添加助溶剂，可以提高底物香紫苏醇在发酵体系中溶解进而提高香紫苏醇的转化率和香紫苏内酯的产量。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法，所述方法包括如下步骤：
8.(1)子囊菌纲filobasidium属的真菌经过种子培养，制得种子液；
9.(2)按照发酵培养基的体积的5％
‑
10％的量将步骤(1)所得种子液接入含有香紫苏醇及所需营养物质的发酵培养基中，置于恒温摇床中25
‑
30℃培养60
‑
84 h，制得含香紫苏内酯的发酵液；
10.所述发酵培养基中含有助溶剂。
11.步骤(1)中，所述真菌已于2021年4月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通
微生物中心登记保藏，保藏编号为cgmcc no.22187。
12.步骤(1)中，所述真菌的its序列如seq id no.1所示；所述真菌的18s 序列如seq id no.2所示。
13.步骤(1)中，种子培养的方法为经过二级培养：
14.将保藏于甘油管的菌株接种到一级种子培养基中，接种量为一级种子培养基体积的5％，25℃恒温摇床培养36h后得到一级种子菌液；将培养好的一级种子菌液接种到二级种子培养基中，接种量为二级种子培养基体积的5％，25℃恒温摇床培养24h，制得二级种子菌液，所述二级种子菌液的od
600nm
＝11
‑
16。
15.一级种子培养基的组成为：葡萄糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l， ph＝5。
16.二级种子培养基的组成为：葡萄糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l， ph＝5。
17.步骤(2)中，发酵培养基的组成为：
18.30g/l香紫苏醇，4
‑
9g/l蛋白胨，2
‑
8g/l酵母粉，0.5
‑
2g/l nh4cl，0.5
‑
2g/lnano3，0.1
‑
1g/l mgso4·
7h2o，0.5
‑
2g/l kh2po4，1
‑
4g/l葡萄糖，助溶剂。
19.步骤(2)中，发酵培养基中助溶剂与香紫苏醇的添加比例为1:50～10:1。
20.所述助溶剂为二氧六环(logp值为
‑
1.1)、pluronicf
‑
127(logp值3)、曲拉通 (logp值4.61)、吐温80(logp值9.39)、大豆油、环糊精(logp值
‑
6.57)、二甲基硅油(logp值
‑
0.327)中的一种或多种。
21.步骤(2)中，发酵培养基起始ph为4
‑
9，培养温度25
‑
30℃。
22.本发明发酵过程优选为：香紫苏醇30g/l，蛋白胨5g/l，酵母粉5g/l，葡萄糖4g/l，nh4cl 2g/l，nano
3 2g/l，kh2po
4 2g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，助溶剂(不同添加比例)，ph＝5的液体培养基中，25℃培养2
‑
3d，取发酵液离心，取1ml离心上清液加入10ml的乙酸乙酯进行萃取，萃取液再稀释10倍后利用gc
‑
ms定性定量检测，色谱条件为：载气为：高纯he；流速1ml/min；rtx
‑
5ms (0.2um x 0.25mm x 30m)色谱柱；进样口温度280℃；梯度升温程序：180℃， 2min；5℃/min升至280℃维持1min；接口温度250℃，离子源温度200℃。
23.优选方案，一种助溶剂为pluronicf
‑
127，其与底物香紫苏醇的添加比例为 1:10，添加方式是助溶剂和对应的底物及无菌水在用高速匀浆机处理后添加入培养基中的方法。
24.本发明有益的技术效果在于：
25.本发明二级培养的种子液中二级种子不仅可以进一步提高菌株的活力，同时可以使得菌株尽量处于同一生长水平，保证发酵的平行性较好。
26.由于底物不溶于水，因此这极大的阻碍了发酵液中菌体和底物的接触，进而影响底物的转化。本发明通过促进发酵过程中底物与菌株的接触，从而促进了菌株对底物香紫苏醇的转化。促进底物转化的助溶剂大致分为两类：
27.1类是不容于水的助溶剂(大豆油、二甲基硅油)，这类助溶剂作用是将香紫苏醇溶解于助溶剂内，然后进行双相发酵，该发酵过程中，菌体在水相中(即培养基)生长，底物溶解于助溶剂内。在摇床的搅拌作用下菌株在有机相和水相双相的界面转化底物，相比于对照(不添加任何助溶剂)来说该类方法极大的促进了菌体与底物的接触，从而促进底物的转化。
28.2类是可溶于水的助溶剂(二氧六环、环糊精、pluronic、吐温80、曲拉通)，这类助溶剂属于表面活性剂类，既有亲水性又有亲脂性，因此该类助溶剂可以很好的将底物分散
于培养基内，同时利用高速匀浆机的切割力将底物切割成纳米级的颗粒，再借助该类助溶剂可以很好的将底物悬浮于发酵液中，进而加大了底物和菌体的接触。
附图说明
29.图1为不同助溶剂添加量下，发酵液中香紫苏内酯的转化率图。
具体实施方式
30.下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
31.本发明选用的子囊菌纲filobasidium属的真菌已于2021年4月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)登记保藏，保藏编号为cgmcc no.22187。其its序列如seq id no.1所示；18s序列如seq idno.2所示。
32.实施例1：
33.利用菌株cgmcc22187发酵香紫苏醇生产香紫苏内酯方法，具体步骤为：
34.(1)按照一级种子培养基体积5％的接种量将菌株保藏于甘油管的22187菌株接种到一级种子培养基中，25℃恒温摇床培养36h至od
600nm
＝16；将培养好的一级种子菌液按二级种子培养基体积5％的接种量接入二级种子培养基中， 25℃恒温摇床培养24h至od
600nm
＝12，制得二级种子菌液；进一步提高菌株的活力，同时可以使得菌株尽量处于同一生长水平，保证发酵的平行性较好。
35.一级种子培养基：葡萄糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，ph＝5。
36.二级种子培养基：葡萄糖20g/l，蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，ph＝5。
37.(2)然后将培养好的二级种子菌液按发酵培养基体积5％的接种量接入含有不同助溶剂的香紫苏醇的发酵培养基中，于25℃恒温培养箱中200rpm下培养2
‑
3d。发酵培养基：香紫苏醇30g/l，蛋白胨5g/l，酵母粉5g/l，葡萄糖 4g/l，kh2po
4 2g/l，nh4cl 2g/l，nano
3 2g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，不同种类的助溶剂3g/l，高速匀浆机处理20000rpm处理10min，ph＝5。
38.种子培养基和发酵培养基灭菌温度和时间分别为：115℃，20min。其中发酵培养基中的底物和2类助溶剂及一部分无菌水单独灭菌经高速匀浆机处理后加入发酵培养基中。无法高温灭菌的助溶剂采用过滤膜除菌。1类助溶剂和培养基一起灭菌。
39.取发酵液离心，然后取离心后的上清液1ml，加入10ml的乙酸乙酯进行萃取，然后将萃取液经乙酸乙酯稀释10倍后利用gc
‑
ms进行定性定量检测。
40.不同助溶剂下香紫苏内酯的产量的检测结果如表1所示。从表中可以看出无论是1类助溶剂还是2类助溶剂均可以极大的促进底物的转化率。其中1类助溶机形成的是双相发酵，因此其不仅可以促进底物的转化，而且对菌体的生长影响较小。相比于对照(不添加助溶剂)来说，2类助溶剂对菌株的生长影响略强于1类助溶剂，但是由于2类助溶剂形成的是单相发酵，可以更好的促进底物和菌体的接触，因此，即使在菌体生长略微受到影响的请款下，其转化率是大幅度增加的。
41.表1
[0042][0043]
实施例2：
[0044]
利用菌株cgmcc22187催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法，具体为：
[0045]
将实施例1中步骤(1)培养好的菌株22187的二级种子菌液直接接入液体发酵培养基(所述液体发酵培养基组成为：香紫苏醇30g/l，蛋白胨5g/l，酵母粉5g/l，葡萄糖4g/l，kh2po
4 2g/l，nh4cl 2g/l，nano
3 2g/l， mgso4·
7h2o 1g/l，pluronicf
‑
127不同的添加比例，高速匀浆机处理，ph＝5。)，其接种量为发酵培养基体积的5％，25℃发酵培养72h；测得发酵液中香紫苏内酯的转化率如图1所示。
[0046]
由图1可以看出，在pluronic添加量过低时，不能够很好的将底物香紫苏醇充分的分散在培养基中，因此造成产物产量和摩尔转化率较低，当pluronic添加量过高时，大量pluronic的存在影响着菌株的生长，同样导致产物产量和摩尔转化率较低，因此一个合适的范围对于香紫苏醇转化率的提高具有极大的帮助。
[0047]
实施例3：
[0048]
利用菌株cgmcc22187催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法，具体为：
[0049]
将实施例1中步骤(1)培养好的菌株22187的二级种子菌液直接接入液体发酵培养基(所述液体发酵培养基组成为：香紫苏醇30g/l，蛋白胨5g/l，酵母粉5g/l，葡萄糖4g/l，kh2po
4 2g/l，nh4cl 2g/l，nano
3 2g/l， mgso4·
7h2o 1g/l，pluronicf
‑
127 3g/l，直接添加，ph＝5。)，其接种量为发酵培养基体积的5％，25℃发酵培养72h；测得发酵液中香紫苏内酯的浓度为5.37 g/l，其摩尔转化率为22.05％。
[0050]
实施例4：
[0051]
利用菌株22187催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法，具体为：
[0052]
将实施例1中步骤(1)培养好的菌株22187的二级种子菌液直接接入液体发酵培养基(所述液体发酵培养基组成为：香紫苏醇30g/l，蛋白胨5g/l，酵母粉5g/l，kh2po
4 2g/l，nh4cl 2g/l，nano
3 2g/l，mgso4·
7h2o 1g/l， ph＝5。)，其接种量为发酵培养基体积的5％，25℃发酵培养72h；测得发酵液中香紫苏内酯的含量为9.95g/l，其摩尔转化率为40.87％。
[0053]
实施例5：
[0054]
利用菌株22187催化香紫苏醇生产香紫苏内酯的方法，具体为：
[0055]
将实施例1中步骤(1)培养好的菌株22187的二级种子菌液直接接入液体发酵培养基(所述液体发酵培养基组成为：香紫苏醇30g/l，蛋白胨5g/l，酵母粉5g/l，kh2po
4 2g/l，nh4cl 2g/l，nano
3 2g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，高速匀浆机处理，ph＝5)，其接种量为发酵培
养基体积的5％，25℃发酵培养72 h；测得发酵液中香紫苏内酯的含量为12.01g/l，其摩尔转化率为49.33％。