编码新型冠状病毒P.1突变株抗原的DNA分子、DNA疫苗及应用的制作方法

编码新型冠状病毒p.1突变株抗原的dna分子、dna疫苗及应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种编码新型冠状病毒p.1突变株抗原的dna分子、dna疫苗及应用。


背景技术：

2.sars
‑
cov
‑
2是具有包膜结构的单股正链rna病毒，极易发生突变。目前根据gisaid数据库公布的新冠病毒谱系信息，全球共出现700余种突变，其中传播能力较强，分布广泛的突变株共有6种，即：b.1.1.7突变株、p.1突变株、b.1.351突变株、b.1.2突变株、b.1突变株、b.1.525突变株、b.1.617突变株。突变株p．1突变基因组含有至少16个特定的位点突变，其中spike蛋白含有11个突变，包括引起疫苗传染性增强的n501y突变，以及具有抗体抵抗的e484k突变。综上，急需开发出针对突变株更为有效的疫苗。
3.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的之一在于提供一种编码新型冠状病毒p.1突变株抗原的dna分子，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
5.本发明的目的之二在于提供包括上述dna分子的生物材料。
6.本发明的目的之三在于提供上述生物材料的应用。
7.本发明的目的之四在于提供包括上述dna分子的新型冠状病毒p.1突变株dna疫苗。
8.本发明的目的之五在于提供上述dna疫苗的制备方法。
9.本发明的目的之六在于提供上述dna疫苗的应用。
10.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：本发明提供了编码新型冠状病毒p.1突变株抗原的dna分子，所述dna分子具有如seq id no.1所示的核苷酸序列，或与seq id no.1所示的核苷酸序列具有至少90%一致性的核苷酸序列。
11.本发明还提供了生物材料，所述生物材料包括：（a）重组表达载体，包括上述的dna分子；（b）细胞，包括上述的dna分子或（a）所述的重组表达载体；（c）多肽，由上述的dna分子编码。
12.进一步的，所述重组表达载体包括真核表达载体，所述真核表达载体包括pvax1。
13.优选地，所述细胞包括hek293、cho、cos
‑
7细胞株、dh5α、top10、bl21、dh10b等细胞。
14.本发明还提供了上述的dna分子或生物材料在如下（a）或（b）中的应用：（a）制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的疫苗；（b）制备预防和/或治疗新型冠状病毒引起的相关疾病的药物。所述相关疾病包括
不限于新型冠状病毒引起的肺部损伤、大脑损伤，肝肾损伤、心脏损伤。
15.进一步的，所述新型冠状病毒包括p.1突变株、野生株、b.1.1.7突变株、b.1.351突变株、b.1.2突变株、b.1突变株、b.1.525突变株或b.1.617突变株。
16.本发明还提供了新型冠状病毒p.1突变株dna疫苗，包括上述的dna分子。
17.进一步的，所述dna分子存在于重组表达载体中，所述重组表达载体包括pvax1。
18.进一步的，所述dna疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂；和/或，至少一种对新型冠状病毒有治疗作用的药物。
19.优选地，所述佐剂包括铝佐剂和/或tlrs 配体和/或金属离子如mn2

、zn2

和/或细胞因子和/或趋化因子佐剂等。
20.本发明还提供了上述的dna疫苗的制备方法，将包括上述的dna分子的重组载体导入宿主细胞并进行培养，提取宿主细胞中的重组载体，得到dna疫苗。
21.此外，本发明还提供了上述的dna疫苗的应用，包括如下（i）
‑
（iii）：（i）调整机体的免疫功能；（ii）抗新型冠状病毒感染；（iii）防止免疫病理损伤；所述新型冠状病毒包括p.1突变株、野生株、b.1.1.7突变株、b.1.351突变株、b.1.2突变株、b.1突变株、b.1.525突变株或b.1.617突变株。
22.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明利用不同优化算法对新型冠状病毒p.1突变株spike蛋白的编码dna序列进行优化，得到具有如seq id no.1所示的核苷酸序列或与seq id no.1所示的核苷酸序列具有至少90%一致性的核苷酸序列的dna分子。该dna分子能够高效转录并表达新型冠状病毒p.1突变株spike抗原，并且具有免疫原性，能够诱导特定的体液免疫和细胞免疫应答。
23.基于上述编码新型冠状病毒p.1突变株抗原的dna分子的有益效果，本发明还提供了包括上述dna分子的dna疫苗。该dna疫苗不仅在哺乳动物细胞内能够有效转录和表达，同样也具有良好的免疫原性，对于体液免疫应答，该dna疫苗在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体，并且对野生、b.1.351、p.1、b.1.617等病毒有较好的中和活性；对于细胞免疫应答，该dna疫苗不仅能够诱导出高水平的抗原特异性ifn
‑
γ反应、抗原特异性cd4tnfα t细胞亚群和cd8ifnγ t细胞亚群的产生，而且能够诱导高活性的抗原特异性ctl反应。
24.基于此，本发明提供的dna疫苗能够调整机体的免疫功能，有效预防新型冠状病毒及其突变株，尤其是p.1突变株的感染，同时也能治疗由新型冠状病毒及其突变株，尤其是p.1突变株引发的疾病。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
26.图1为本发明实施例提供的新冠野生株、p.1突变株候选dna疫苗抗原蛋白表达结
果；图2为本发明实施例提供的新冠野生株、p.1突变株候选dna疫苗初次免疫后第14天抗原特异性抗体结果；图3为本发明实施例提供的新冠野生株、p.1突变株候选dna疫苗加强免疫后第7天抗原特异性抗体结果；图4为本发明实施例提供的新冠野生株、p.1突变株候选dna疫苗加强免疫后第7天中和抗体结果；图5为本发明实施例提供的新冠野生株、p.1突变株候选dna疫苗初次免疫后第14天抗原特异性elisopt结果；图6为本发明实施例提供的新冠野生株、p.1突变株候选dna疫苗加强免疫后第7天抗原特异性cd4tnfα t细胞亚群结果；图7为本发明实施例提供的新冠野生株、p.1突变株候选dna疫苗加强免疫后第7天抗原特异性cd8tfnα t细胞亚群结果；图8为本发明实施例提供的新冠野生株、p.1突变株候选dna疫苗加强免疫后第7天抗原特异性cd8ifnγ t细胞亚群结果；图9为本发明实施例提供的新冠野生株、p.1突变株候选dna疫苗加强免疫后第7天抗原特异性体内ctl结果。
具体实施方式
27.除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本技术中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
28.一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
29.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.根据本发明的一个方面，本发明利用不同优化算法对新型冠状病毒p.1突变株spike蛋白的编码dna序列进行优化，得到具有如seq id no.1所示的核苷酸序列或与seq id no.1所示的核苷酸序列具有至少90%一致性的核苷酸序列的dna分子。该dna分子能够高效转录、更有利于在真核表达系统表达新型冠状病毒p.1突变株spike抗原，并且具有良好的免疫原性，能够诱导特定的体液免疫和细胞免疫应答。
31.可以理解的是，在本发明中，“一致性”指的是核苷酸序列之间的相似性，包括与本发明所述的seq id no.1所示的核苷酸序列具有至少90%（例如可以为，但不限于90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更高）一致性的核苷酸序列。
32.可选地，优化还包括将新型冠状病毒p.1突变株基因信号肽替换为高效表达信号肽，以此提高该dna序列在宿主内的表达效率。
33.本发明还提供了与上述dna分子相关的生物材料：（a）重组表达载体，包括本发明提供的dna分子。其中载体可以为真核表达载体，其可通过整合进细胞基因组而转化靶细胞，通过细胞转录和翻译机制生成该dna分子编码的蛋白。可选地，载体可具有表达信号，诸如强启动子、强终止密码子，启动子与克隆基因之间距离的调节，以及转录终止序列和ptis的插入。优选地，所述真核表达载体包括pvax1，但不限于其他能够表达dna并且使细胞能够将序列翻译成由免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。
34.（b）细胞，将本发明提供的dna分子或（a）所述的重组表达载体导入宿主细胞中得到。其中，宿主细胞可以为原核细胞，例如细菌细胞，典型的可以为大肠杆菌（e.coli），或真核细胞，典型的可以为昆虫细胞、酵母、禽类细胞或哺乳动物细胞，以及其他适宜的宿主细胞。例如，所述宿主细胞包括hek293、cho、cos
‑
7细胞株、dh5a、top10、bl21、dh10b等细胞。
35.（c）多肽，由本发明提供的dna分子编码。基于该多肽，也可以提供能够与其特异性结合的抗体，例如单克隆抗体或多克隆抗体。
36.可以理解的是，本发明提供的生物材料均可作为生物模块直接应用于不同需求和场景的生产中。
37.根据本发明的另一方面，本发明还提供了上述的dna分子或生物材料在制备预防和/或治疗新型冠状病毒感染的疫苗，和/或，在制备预防和/或治疗新型冠状病毒引起的相关疾病的药物中的应用，相关疾病包括不限于例如肺部损伤、大脑损伤，肝肾损伤、心脏损伤。
38.优选地，所述新型冠状病毒包括p.1突变株、野生株、b.1.1.7突变株、b.1.351突变株、b.1.2突变株、b.1突变株、b.1.525突变株或b.1.617突变株。
39.基于上述编码新型冠状病毒p.1突变株抗原的dna分子的有益效果，本发明还提供了包括上述dna分子的dna疫苗。
40.该dna疫苗在哺乳动物细胞内能够有效转录并表达新型冠状病毒p.1突变株spike抗原，激发出更为高效地免疫反应，对于体液免疫应答，该dna疫苗在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体，并且对野生、b.1.351、p.1、b.1.617等病毒有较好的中和活性；对于细胞免疫应答，该dna疫苗不仅能够诱导出高水平的抗原特异性ifn
‑
γ反应、抗原特异性cd4tnfα t细胞亚群和cd8ifnγ t细胞亚群的产生，而且能够诱导高活性的抗原特异性ctl反应。
41.在一些实施方式中，所述dna疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂，以增加其活性成分dna分子在受试者体内产生免疫应答的能力。其中药学上可接受的佐剂例如可以选自铝佐剂和/或tlrs 配体和/或金属离子如mn2

、zn2

和/或细胞因子和/或趋化因子佐剂等。
42.在另一些实施方式中，所述dna疫苗还包括至少一种对新型冠状病毒有治疗作用
的药物，以加强该疫苗对新型冠状病毒引起的相关疾病的治疗作用。
43.本发明提供的dna疫苗其作用机理为：将新型冠状病毒p.1突变株表面抗原spike抗原编码dna首先利用不同优化算法对dna序列进行优化，其次将其野生型基因信号肽替换为高效表达信号肽后、插入真核表达载体，将其导入宿主细胞内，使其在宿主细胞高效表达病毒spike抗原，经过抗原提呈过程系统地激活抗病毒体液免疫应答及细胞免疫应答。激活的体液免疫应答所产生的抗体可以预防病毒的侵入，以及激活的细胞免疫应答可进一步清除受病毒感染的细胞，以及调节由于ade的潜在副作用引发的不良反应。
44.基于上述作用机理，本发明还提供了上述的dna疫苗的应用，包括：（i）调整机体的免疫功能；（ii）抗新型冠状病毒感染；（iii）防止免疫病理损伤。
45.下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
46.实施例1：dna疫苗的构建过程1.新冠病毒候选dna疫苗的制备方法1.1.质粒的构建根据p.1突变株序列（epi_isl_811149，gisaid），结合经验优化获得seq id no.1所示核苷酸序列，将如seq id no.1 所示核苷酸序列插入pvax1载体的banh i与xho i位点间，得到新冠病毒p.1突变株质粒（pp.1）。
47.根据新冠野生型序列（mn908947.3，ncbi），优化获得seq id no.2所示核苷酸序列，将如seq id no.2所示核苷酸序列插入pvax1载体的banh i与xho i位点间，得到新冠病毒野生株质粒（pwt）。pwt野生株疫苗是本公司前期针对野生株的产品，目前即将进入iii期临床，具有非常优秀的免疫效果。
48.1.2.dna疫苗序列转化从
‑
80℃冰箱中取100 μl dh10b感受态细胞悬液，冰上解冻。加入质粒dna溶液（体积不超过10 μl）轻轻摇匀，冰上放置30 min。42℃水浴中热击70秒，迅速置于冰上冷却5 min。向管中加入0.9ml的lb液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃振荡培养45min，使细菌恢复正常生长状态。将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含适当抗生素的筛选平板上，正面向上放置，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12
‑
16h。挑选形状均匀的单克隆菌体，使用无菌移液器头将克隆扎取后置入5ml 含有50mg/ml卡那霉素的lb选择培养基中37℃过夜培养。
49.1.3.dna疫苗质粒提取将上述菌液按照1:1000加入到200
‑
400ml含有卡那霉素（50mg/ml母液，1:1000使用）的lb选择培养基中，37℃ 200rpm培养12
‑
16h。用endofreen plasmid maxi kit（qiagen，德国）进行质粒提取：将上述培养12
‑
16h的菌液8000rpm 4℃离心10min后弃上清收集菌体，加入10ml buffer p1重悬菌液后加入10ml buffer p2轻轻颠倒4
‑
6次混匀，室温孵育5min充分裂解。向混液中加入10ml buffer p3，轻轻颠倒4
‑
6次混匀终止裂解后，全部转移至qiafilter cartridge中，室温孵育10min，加入栓塞过滤上清。将滤液转移至干净无内毒素50ml离心管中，加入2.5ml buffer er，轻轻颠倒10次混匀后放于冰上孵育30min。取
出qiagen
‑
tip 500加入10ml buffer qbt平衡柱子，将上述液体转移至柱子中，利用重力流进行吸附质粒，用30ml buffer qc洗涤2次，再用15ml buffer qn进行洗脱。每管样品用10.5ml异丙醇沉淀，4℃，4000g离心30min。弃上清，加入70%乙醇洗涤1次，4℃，4000g离心10min。弃上清，晾干沉淀，每样加入500μl无内毒素水进行重悬质粒，得到dna疫苗质粒。
50.实施例2：新冠病毒候选dna疫苗哺乳动物细胞抗原蛋白表达鉴定为了验证实施例1构建的质粒是否在哺乳动物细胞内可以有效表达，因此通过提取抗原蛋白，western blot方法进行鉴定。
51.1.蛋白提取将新冠野生株质粒（pwt）和p.1突变株质粒（pp.1）转染到hek293t细胞株中，转染48小时结束后，去除转染后的培养液，用预冷的pbs洗一遍，弃去pbs，加入150μl裂解液（使用前按1：100加入edta及蛋白酶抑制剂）混匀后吹打10次。置于12,000rpm 4度离心5分钟。吸出上清至1.5ml离心管中，每样取出50μl上清液，加入12.5μl 5
×
蛋白上样缓冲液，置于沸水中煮沸10min后，瞬离备用。
52.2.样品上样及sds
‑
page电泳将煮沸离心后的上清样本每孔加62.5μl于sds
‑
page胶孔中，接通电源，调至恒压200v，时间设置45min进行电泳。电泳结束后取出sds
‑
page进行转膜制作。取pvdf膜在甲醇中浸泡30s激活，将pvdf膜置于1
×
转膜平衡液中1min。
53.3.转膜以正极为底面按照：eblot l1转膜垫片、pvdf膜、凝胶、eblot l1转膜垫片顺序依次叠加，每叠加一次用管子排除层间气泡。封闭：将pvdf膜从取出放入盛有1
×
tbst 5%脱脂奶粉的玻璃盒中，在摇床中90rpm室温孵育1h。洗涤：将pvdf膜放入1
×
tbst中清洗3次，每次10分钟，摇床90rpm摇动。一抗孵育：将pvdf膜放入一抗溶液（s
‑
ecd/rbd monoclonal antibody(1), 1:2000 稀释）反应，在摇床中90rpm室温孵育1h。洗涤：将pvdf膜放入1
×
tbst中清洗5次，每次10分钟，在摇床中90rpm摇动。二抗孵育：将pvdf膜放入二抗溶液中（bd pharmingen hrp anti human igg，1:5000 稀释）反应，在摇床90rpm室温孵育1h。洗涤：将pvdf膜放入1
×
tbst中清洗5次，每次10分钟，摇床90rpm摇动。显色：取化学发光液a液3ml和b液3ml以1：1比例混合后加入到pvdf膜孵育1
‑
2min，拍照。
54.结论：如图1所示，新冠野生株及p.1突变株候选dna疫苗在体外转染48小时后与空载体（pvax1）相比能够在细胞内高水平地表达抗原spike蛋白。
55.实施例3：新冠候选dna疫苗免疫原性验证为了评估实施例1制备的疫苗的免疫原性，以及免疫策略对体液免疫和细胞免疫应答的影响，从卡文斯百格公司购买了无特定病原体的6周龄c57bl/6雌性小鼠，并将其保存在艾棣维欣advaccine实验室（苏州）的动物设施中。对于dna疫苗的接种：将实施例1所述dna疫苗根据不同分组的注射剂量先后注射到股骨前肌肉，然后进行电脉冲（ep）。电脉冲（ep）装置由两组具有0.2 amp恒定电流的脉冲组成。第二脉冲组被延迟3秒。在每个组中，有两个52 ms的脉冲，脉冲之间的延迟为198 ms。将第一次初免计为0天，第14天进行第二次免疫（加强免疫）。实验分组：（1）对照组载体质粒pvax1
‑
25μg；（2）实验组野生型毒株pwt
‑
25 μg；（3）实验组p.1突变株pp.1
‑
2.5 μg；（4）实验组p.1突变株pp.1
‑
25 μg；第14，21天采集小鼠血液样品，用elisa法测定血清的特异性抗体滴度。在初次免疫后第14天和加强免疫后第
7天，处死被免疫的小鼠，以分析细胞免疫反应。
56.1.评估dna疫苗引发的抗原特异性体液免疫应答1.1.elisa检测抗体浓度使用基于elisa方法评估针对sars
‑
cov
‑
2 rbd蛋白结合抗体。将nunc 96孔elisa平板在4℃下用1
ꢀµ
g / ml sars
‑
cov
‑
2 rbd蛋白（acro biosystems，de，美国）包被过夜。将板洗涤3次，然后用含5％牛血清白蛋白（bsa）的pbs（含0.05％tween 20，即pbst缓冲液）37℃下封闭1小时。将三倍连续稀释的小鼠血清添加到每个孔中，并在37℃下孵育1小时。将板再次洗涤五次，然后在37℃加入1：8000稀释的山羊抗小鼠igg
‑
hrp（genscript，nj，cn）孵育1小时后，随后检测结合抗体。最后洗涤后，通过使用tmb底物使板显影，并用50
µ
l/孔2m h2so4终止反应。在450 nm和620 nm处读数，血清抗体滴度的终点确定为最高稀释度的倒数，样本最高稀释度比阴性对照的吸光度高2.1倍(判定标准：实验组：对照组（阴性）od450
‑
620值≧2.1，判定该od值下对应的最高稀释度为血清抗体滴度）。
57.结论：结果如图2和图3所示，新冠p.1突变株和野生株候选dna疫苗初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体。上述elisa试验中，采用新冠野生型sars
‑
cov
‑
2 rbd蛋白作为体外包被抗原，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pwt有利，然而本发明提供的p.1突变株dna疫苗甚至取得了更优的技术效果，如前所述，pwt是拥有非常优秀免疫效果的前期产品，更说明了本发明疫苗的良好免疫原性和广谱性。
58.1.2．假病毒中和抗体检测将1
×
10
4 /孔的huh
‑
7细胞接种在含有10% fbs的dmem中的96孔板中。在感染前将接种的细胞培养八小时。为了检测中和抗体滴度，将小鼠血清（从1:40稀释开始）在dmem培养基中按1:2连续稀释，总共稀释九个稀释度。随后，将稀释的血清样品与sars
‑
cov
‑
2各变异假病毒在37℃下孵育30分钟后将混合物加入到huh
‑
7细胞中进行感染。进一步孵育12小时后，用新鲜的dmem培养基（含2% fbs）替换上清液。再培养48小时后去除细胞上清液，使用萤火虫荧光素酶测定试剂盒（promega）和酶标仪检测裂解后细胞内的绝对荧光素发光值，并通过将与同板中的病毒对照孔进行标准化来计算相对值。中和抗体滴度使用graphpad prism 9计算，并定义为血清稀释度的倒数（减去细胞对照孔中的背景rlu后，rlu与病毒对照孔中的rlu相比减少了50%）。
59.结论：结果如图4所示，新冠p.1突变株候选dna疫苗加强免疫后第7天，对野生、b.1.351、p.1、b.1.617等病毒均能够有良好的中和活性，说明p.1突变株候选dna疫苗有良好的广谱保护的潜力。
60.2.进一步评估dna疫苗引发的抗原特异性细胞应答预测并合成了s抗原特异性表位肽的多肽库（s peptide），并用该肽库刺激疫苗免疫后的小鼠脾细胞。
61.2.1.免疫细胞特异性刺激检测细胞免疫反应我们通过elispot分析，研究dna疫苗是否可以促进细胞免疫。分别在初次免疫后14天分离脾细胞，进行ifn
‑
γ阳性细胞elispot实验。
62.2.2分离脾细胞在初次免疫后第14天，无菌环境中进行，将小鼠安乐死，取出脾脏，研磨成单细胞
悬液；离心收获细胞，红细胞裂解液重悬后裂解，含fbs的pbs终止裂解；过滤，对制备好的单细胞悬液计数；将单细胞悬浮在补充有10％fbs，1％青霉素/链霉素的rpmi1640培养基中。
63.2.3 ifn
‑
γ elispot实验通过使用小鼠ifn
‑
γ elispot试剂盒（dakewe，sz，中国）进行ifn
‑
γelispot测定。将通过上述方法分离的每只小鼠的脾脏细胞悬液以250,000的密度接种到每个包被有抗ifn
‑
γ抗体的孔中，并在37℃的co2培养箱中用sars
‑
cov
‑
2 rbd肽库刺激20小时，每孔中肽库浓度为10μg/ml（终浓度）（溶于rpmi 10％fbs）。根据产品说明书进行操作。培养基和pma/iono分别作为阴性和阳性对照。阳性斑点通过ispot reader（aid，德国stra
ß
berg）进行定量检测。通过减去阴性对照孔来计算每百万个细胞的斑点形成单位（sfu）。
64.结论：ifn
‑
γelispot结果如图5所示，新冠p.1突变株和野生株候选dna疫苗免疫后均能有效诱导出高水平的抗原特异性ifn
‑
γ反应。上述试验elispot试验中，采用新冠野生型sars
‑
cov
‑
2 rbd蛋白作为体外刺激肽，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pwt有利，然而本发明提供的p.1突变株dna疫苗甚至取得了更优的技术效果，如前所述，pwt是拥有非常优秀免疫效果的前期产品，更说明了本发明疫苗的良好免疫原性和广谱性。
65.3.进一步评估疫苗引发的抗原特异性细胞免疫应答的影响，尤其是cd4和cd8 t细胞功能的影响，在加强免疫后7天分离脾细胞，进行流式细胞仪检测实验。
66.分离脾细胞：在加强免疫后7天，无菌环境中进行，将小鼠安乐死，取出脾脏，研磨成单细胞悬液；离心收获细胞，红细胞裂解液重悬后裂解，含fbs的pbs终止裂解；过滤，对制备好的单细胞悬液计数；将单细胞悬浮在补充有10％fbs，1％青霉素/链霉素的rpmi1640培养基中。
67.流式细胞仪检测实验：通过上述方法获得的来自每只小鼠的脾脏细胞悬液，37℃，5％ co2下用sars
‑
cov
‑
2 rbd肽库或pma/iono刺激，同时利用1μg/ ml的brefedlin a阻断（bd，ca，美国）6小时。对脾细胞进行胞外及细胞内细胞因子染色，将刺激的脾细胞用fvd
‑
efluor780染色，然后洗涤，并在室温下于黑暗中分别用抗小鼠cd4，cd8a抗体染色30分钟。用固定/通透缓冲液透化细胞，并用抗小鼠ifn
‑
γ和抗小鼠tnf
‑
α在4℃下进行45分钟细胞内染色。将细胞洗涤两次，并用200
µ
l pbs重悬，然后使用流式细胞仪（thermofisher，ma，美国）进行采集，然后用flowjo软件（bd，ca, 美国）进行分析。
68.结论：结果如图6
‑
8所示，新冠p.1突变株和野生株候选dna疫苗加强免疫后第7天，能够显著诱导抗原特异性cd4tnfa t细胞亚群和cd8ifnγ t细胞亚群的产生。上述试验facs试验中，采用新冠野生型sars
‑
cov
‑
2 rbd蛋白作为体外刺激肽，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pwt有利，然而本发明提供的p.1突变株dna疫苗也取得了相当的显著的技术效果，如前所述，pwt是拥有非常优秀免疫效果的前期产品，更说明了本发明疫苗的良好免疫原性和广谱性。
69.4.免疫细胞特异性刺激检测体内ctl反应由于ctl反应在抵抗病毒感染和消除病毒感染细胞方面起着关键作用，为了探索实施例1对细胞毒性t细胞功能的影响，在加强免疫后的第7天进行体内ctl检测。
70.取空白c57bl/6小鼠脾脏细胞（1.5
×
108）与10μg s peptide pool共孵育，另取空白c57bl/6小鼠脾脏细胞（1.5
×
108）不孵育多肽。37℃ 5% co2培养4h。用eflour450标记细胞，多肽孵育组（1
×
107细胞/ml 5μm，高染）,无多肽孵育对照组（1
×
107细胞/ml 0.5μm，低
染）。高染细胞与低染细胞按照1:1的比例混合，最终总细胞浓度为2
×
107细胞/ml。通过尾静脉注射，将4
×
106混合细胞注射免疫组小鼠体内，4h后取脾脏细胞，流式上机，收集样本。体内杀伤率计算公式如下。
71.其中t代表targets群，nt代表non targets群。
72.结论：结果如图9所示，新冠p.1突变株和野生株候选dna疫苗加强免疫后第7天，均能够诱导相当的高活性的抗原特异性ctl反应。
73.综上，由实施例1
‑
4的结果可知，本发明的p.1突变株dna疫苗不仅在哺乳动物细胞内能够有效转录和表达；而且具有免疫原性，表现在体液免疫和细胞免疫应答中，对于体液免疫应答，p.1突变株候选dna疫苗在初次免疫后第14天和加强免疫后第7天均能够显著激发实验动物产生抗原特异性抗体，并且对野生型新冠病毒、b.1.351突变株、p.1突变株、b.1.617突变株病毒有较好的中和活性；对于细胞免疫应答，p.1突变株候选dna疫苗不仅能够诱导出高水平的抗原特异性ifn
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γ反应、抗原特异性 cd4tnfa t细胞亚群和cd8ifnγ t细胞亚群的产生，而且能够诱导高活性的抗原特异性ctl反应。
74.值得注意的是，pwt野生株疫苗是本公司前期针对野生株的产品，目前即将进入iii期临床，具有非常优秀的免疫效果。上述试验中例如elisa、elispot和facs的检测中，均采用新冠野生型sars
‑
cov
‑
2 rbd蛋白作为体外包被抗原或者刺激肽，上述条件均对新冠野生型核酸疫苗pwt有利，然而本发明提供的p.1突变株dna疫苗也取得了显著，甚至更优的技术效果，尤其是抗体水平，更说明了本发明p.1突变株dna疫苗的良好免疫原性和广谱性。
75.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。