动物模型和治疗性分子的制作方法

动物模型和治疗性分子
1.背景
2.本发明尤其涉及被工程化以包含伴侣动物的外源dna的啮齿动物和细胞、它们在医学和疾病研究中的用途、用于产生啮齿动物和细胞的方法、以及由这样的动物及其衍生物产生的抗体和抗体链。
3.将人类dna插入到啮齿动物中已经在以下中公开：例如murphy等人第111卷第14期,5153
‑
5158,doi:10.1073/pnas.1324022111；macdonald等人第111卷第14期,5147
‑
5152,doi:10.1073/pnas.1323896111；和lee等人,nature biotechnology第32卷,第356
‑
363页,出版年：2014,doi:,doi:10.1038/nbt.2825。该方法被设计成制备用于人类治疗用途的抗体产品。然而，尚未开发出产生适用于在其他物种诸如伴侣动物中使用的抗体的啮齿动物模型。
4.本发明涉及啮齿动物、细胞、由其产生的抗体及其部分，包括用于在伴侣动物中使用的随后修饰的抗体，以及用于制备这样的啮齿动物、细胞、抗体和抗体链的方法。
5.发明陈述
6.本发明涉及
7.一种啮齿动物或啮齿动物细胞，该啮齿动物或啮齿动物细胞具有包含以下的基因组：
8.i)一个或更多个伴侣动物igh v区基因、一个或更多个伴侣动物igh d区基因和一个或更多个伴侣动物igh j区基因；和
9.ii)任选地一个或更多个伴侣动物iglκv区基因和一个或更多个伴侣动物iglκj区基因；和/或一个或更多个伴侣动物iglλv区基因和一个或更多个伴侣动物iglλj区基因
10.其中啮齿动物或啮齿动物细胞能够表达形成抗体链的一个或更多个伴侣动物可变区基因
11.并且其中伴侣动物的物种不是啮齿动物。
12.一种啮齿动物或啮齿动物细胞，该啮齿动物或啮齿动物细胞具有包含以下的基因组：
13.i)一个或更多个伴侣动物iglκv区基因和一个或更多个伴侣动物iglκj区基因；和/或一个或更多个伴侣动物iglλv区基因和一个或更多个伴侣动物iglλj区基因，和
14.ii)任选地一个或更多个伴侣动物igh v区基因、一个或更多个伴侣动物或宿主igh d区基因和一个或更多个伴侣动物或宿主igh j区基因
15.其中啮齿动物或啮齿动物细胞能够表达形成抗体链的一个或更多个伴侣动物可变区基因
16.并且其中伴侣动物的物种不是啮齿动物。
17.一种用于产生啮齿动物或啮齿动物细胞的方法，该方法包括将以下插入到啮齿动物细胞基因组中
18.i)一个或更多个伴侣动物igh v区基因、一个或更多个伴侣动物igh d区基因和一个或更多个伴侣动物igh j区基因；和/或
19.ii)一个或更多个伴侣动物iglκv区基因和一个或更多个伴侣动物iglκj区基因；和/或
20.一个或更多个伴侣动物iglλv区基因和一个或更多个伴侣动物iglλj区基因
21.其中啮齿动物或啮齿动物细胞能够表达一个或更多个伴侣动物基因以与啮齿动物或伴侣动物的恒定区组合形成抗体链。
22.一种用于产生对期望的抗原特异性的抗体链或抗体的方法，该方法包括用期望的抗原对如本文公开的啮齿动物进行免疫，并且回收单独的抗体链或作为完整抗体的一部分的抗体链，或回收产生单独的抗体链或作为完整抗体的一部分的抗体链的细胞。
23.一种用于产生对期望的抗原特异性并且来源于单个物种的伴侣动物的抗体链或抗体的方法，该方法包括对如本文公开的包含伴侣动物基因的啮齿动物进行免疫，并且然后用来自相同的伴侣动物的伴侣动物的恒定区替换抗体链的啮齿动物恒定区，合适地通过工程化编码抗体链或抗体的核酸进行。
24.一种用于制备抗体或其部分的方法，该方法包括提供：
25.(i)编码根据本发明获得的抗体或其部分的核酸；或
26.(ii)序列信息，编码根据本发明获得的抗体或其部分的核酸可以根据该序列信息被表达以允许产生抗体。
27.一种用于产生抗体链或其部分的方法，该抗体链具有伴侣动物可变区，该方法包括在细胞中表达编码抗体链或其部分的核酸，
28.其中编码抗体链的可变区的dna的序列通过用抗原对本发明的啮齿动物进行免疫使得抗体链被产生获得或可获得，
29.任选地包括以下随后步骤：
30.纯化和/或分离抗原受体链，和
31.任选地，然后将抗原受体链配制成药学上可接受的制剂，该药学上可接受的制剂适用于施用到伴侣动物，优选地与可变区相同的伴侣动物。
32.一种抗体或抗体链或其部分，该抗体或抗体链或其部分从根据本发明的啮齿动物或细胞获得或可获得。
33.一种抗体或抗体链或其部分，该抗体或抗体链或其部分根据本发明获得或可获得，用于在治疗伴侣动物中使用。
34.一种治疗伴侣动物的方法，该方法包括将抗体或抗体链或其部分递送到有相应需要的伴侣动物，其中抗体或抗体链或其部分已经被修饰为完全伴侣动物抗体。
35.一种药物组合物，所述药物组合物包含具有λ轻链或其功能片段或功能衍生物的犬科动物(canine)、猫科动物(feline)或马科动物(equine)抗体、以及药学上可接受的赋形剂或载体，分别用于或适合用于预防或治疗犬、猫或马的疾病。
36.一种具有λ轻链或其功能片段或功能衍生物的犬科动物、猫科动物或马科动物抗体，分别用于预防或治疗犬、猫或马的疾病。
37.一种犬科动物、猫科动物或马科动物λ轻链或其功能片段或功能衍生物，分别用于预防或治疗犬、猫或马的疾病。
38.一种表达或编码犬科动物、猫科动物或马科动物λ轻链的啮齿动物或细胞，诸如啮齿动物细胞。
39.一种用于治疗或预防伴侣动物诸如犬、马或猫的疾病的方法，该方法包括递送有效量的适用于伴侣动物的如本文公开的抗体或其功能片段或功能衍生物或者组合物。
40.附图
41.图1
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犬科动物免疫球蛋白重链基因座，跨越基因座覆盖有细菌人工染色体
42.图2
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犬科动物免疫球蛋白κ基因座，跨越基因座覆盖有细菌人工染色体
43.图3
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犬科动物免疫球蛋白λ基因座，跨越基因座覆盖有细菌人工染色体
44.图4
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猫科动物免疫球蛋白重链基因座，跨越基因座覆盖有细菌人工染色体
45.图5
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猫科动物免疫球蛋白κ基因座，跨越基因座覆盖有细菌人工染色体
46.图6
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猫科动物免疫球蛋白λ基因座，跨越基因座覆盖有细菌人工染色体
47.bac在图1
‑
6中示出以进一步图示犬科动物和猫科动物基因的组二者如何位于公开可得的bac中，以及根据本发明然后如何将这样的基因掺入到啮齿动物基因座中。
48.图7
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等位基因变化。非参考v基因等位基因的流行率基于三个类别按品种绘制。在参考等位基因无功能的情况下有功能的等位基因，以及在参考是假基因的情况下为orf的那些等位基因，被分类为“获得(gain)”。在参考等位基因不是假基因的情况下为假基因的等位基因，以及有功能并且成为orf的那些等位基因，被分类为“损失(loss)”。没有功能变化的等位基因被分类为“无(none)”。黑色十字线代表每种变化类型的预期值。
49.图8
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犬科动物免疫球蛋白κ基因座的自比对(self
‑
alignment)。绿色框(a)代表与自身比对的上游v基因。红色框(c)代表与自身比对的下游v基因。蓝色框(b)代表上游v基因与下游v基因的比对。
50.图9
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犬科动物和人类免疫球蛋白基因座的比对。(a)完整的基因座。(b)比对的放大部分，对应于(a)中的红色框。
51.图10
–
犬科动物bac 1插入到鼠(murine)igh基因座
52.图11
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小鼠igh的缺失位点
53.图12
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小鼠igh缺失结果
54.图13
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犬科动物bac 1插入到鼠iglλ基因座
55.图14
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小鼠igk的缺失位点
56.图15
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通过pcr分析确认的由嵌合重链基因座表达的嵌合转录物
57.图16：强种系犬科动物
‑
人类ig同源性，tcr同源性较不保守
58.图17：种系ig v同源性比较显示出犬和猫之间的强相关性
59.图18
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bac重组工程(recombineering)过程。a：未修饰的5’(上)和3’(下)修饰载体，线性化位点以红色示出。b：线性化的载体与bac同源臂，准备用于gibson组装(assembly)。c：组装的载体，准备用于消化以释放载体片段。消化位点以红色示出。d：纯化的载体片段，准备用于重组工程。e：重组工程沿虚线在片段和未修饰的bac之间发生。f：重组工程化的bac，准备用于s
‑
rmce。
60.图19：s
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rmce过程和筛选。a：重组工程化的bac通过cre重组酶的作用插入到着落垫(landing pad)中。b：可以使用引物对p1 p2和p3 p4筛选成功的bac插入。c：通过pb酶的作用切除3’修饰dna(切除点通过虚线指示)。可以用引物对p5 p6筛选成功的切除。
61.图20：ky9小鼠v0.5中的嵌合igh和igl基因座
62.图21：ky9小鼠v0.5产生高度多样的抗体库(antibody repertoires)
63.图22：ky9 v0.5中与健康犬相比的克隆型(clonotype)丰度
64.图23：ky9 v0.5中相对于基线(健康犬)的ighd和ighj使用
65.图24：ky9 v0.5中的iglj使用
66.图25：ky9 v0.5小鼠中观察到的n和p核苷酸添加
67.图26：不同区域的突变率显示出关于ky9 v0.5小鼠中体细胞高频突变的证据。
68.详细描述
69.在一个方面中，本发明涉及一种啮齿动物或啮齿动物细胞，该啮齿动物或啮齿动物细胞具有包含以下的基因组：
70.i)一个或更多个伴侣动物igh v区基因、一个或更多个伴侣动物igh d区基因和一个或更多个伴侣动物igh j区基因；
71.ii)任选地包含一个或更多个伴侣动物iglκv区基因和一个或更多个伴侣动物iglκj区基因；和/或一个或更多个伴侣动物iglλv区基因和一个或更多个伴侣动物iglλj区基因
72.其中啮齿动物或啮齿动物细胞能够表达与抗体恒定区组合以形成抗体链的伴侣动物可变区基因
73.并且其中伴侣动物的物种不是啮齿动物。
74.本发明还涉及：
75.一种啮齿动物或啮齿动物细胞，该啮齿动物或啮齿动物细胞具有包含以下的基因组：
76.i)一个或更多个伴侣动物iglκv区基因和一个或更多个伴侣动物iglκj区基因；和/或一个或更多个伴侣动物iglλv区基因和一个或更多个伴侣动物iglλj区基因，和
77.ii)任选地包含一个或更多个伴侣动物igh v区基因、一个或更多个伴侣动物igh d区基因和一个或更多个伴侣动物igh j区基因
78.其中啮齿动物或啮齿动物细胞能够表达与抗体恒定区组合以形成抗体链的一个或更多个伴侣动物可变区基因
79.并且其中伴侣动物的物种不是啮齿动物。
80.通过说明性实例的方式，不对本发明有约束，将来自犬的免疫球蛋白重(igh)链可变(v)区基因、igh d区基因和igh j区基因插入到小鼠中允许与恒定区组合产生抗体重链，该抗体重链包含起源于犬科动物dna在小鼠中的表达的抗体可变区。恒定区可以是啮齿动物免疫球蛋白(ig)恒定区，导致具有犬科动物可变区和啮齿动物恒定区的嵌合重链的产生。关于这样的嵌合抗体链的可变区的信息或包含这样的嵌合抗体链的可变区的核酸可以被用于产生完全犬科动物抗体，例如用于在犬中的治疗用途。包含犬科动物dna的啮齿动物还可以用作用于理解疾病和测试药物的动物模型。
81.除非另有指定，用于小鼠的所有核苷酸坐标是对应于dec 2011grcm38/mm10组装(assembly)(组装登录号gca_000001635.2)的那些。
82.为了避免疑问，提及的小鼠基因组中的插入点与lee等人nature biotechnology,nature biotechnology 32,356
‑
363(2014)中详细描述的那些相同。
83.犬基因组版本(build)是canfam3.1(组装登录号
‑
gca_000002285.2)，于2011年9月产生并且于2016年5月最近一次更新。
84.猫基因组版本是feliscatus8.0(组装登录号
‑
gca_000181335.3)，于2014年11月产生。
85.本发明的啮齿动物优选地是小鼠或大鼠，并且优选地是小鼠。
86.本发明的伴侣动物合适地选自犬、猫、马、鸟、兔、山羊、爬行动物、鱼和两栖动物。犬是本发明的优选的伴侣动物。猫是本发明的优选的伴侣动物。马是本发明的优选的伴侣动物。为了避免疑问，人类不是伴侣动物。
87.在一个方面中，啮齿动物是小鼠，并且伴侣动物是犬。
88.在一个方面中，啮齿动物是小鼠，并且伴侣动物是猫。
89.在一个方面中，啮齿动物是小鼠，并且伴侣动物是马。
90.来自伴侣动物的ig重链(igh)基因组基因座包含多个v区、d区和j区基因。v区、d区和j区基因一起表达产生抗体的重链的可变区。igh v、d和j基因天然地与重链恒定区组合表达。ig轻链基因座(igl)(可以是λ或κ)包含多个v和j基因区段(segment)，该多个v和j基因区段当一起表达时形成抗体的轻链的可变区。igl v区和j区基因天然地与κ或λ轻链的轻链恒定区组合表达。本发明的啮齿动物或啮齿动物细胞能够表达形成抗体链的一个或更多个伴侣动物vdj区或vj区基因。伴侣动物基因在啮齿动物基因组中与恒定区可操作地连接以允许抗体链表达。伴侣动物ig基因可以与外源恒定区基因(来自除啮齿动物之外的物种)一起位于啮齿动物基因组中，或可以位于啮齿动物基因组中与啮齿动物基因组中天然存在的啮齿动物恒定区呈功能排列(诸如位于啮齿动物基因组中天然存在的啮齿动物恒定区的上游)，使得v区基因与恒定区的表达可以发生。
91.啮齿动物或啮齿动物细胞基因组可以包含一个或更多个伴侣动物igh v区和igh d区和igh j区基因但不包含轻链伴侣动物dna，或者可以包含一个或更多个伴侣动物igl v区和igl j区基因但不包含重链伴侣动物dna。啮齿动物或细胞基因组还可以包含来自重链和κ链(但不是λ)，或重链和λ链(但不是κ)的伴侣动物基因，或者包含来自所有三个基因座(重、κ和λ)的伴侣动物基因。
92.在一个方面中，插入的伴侣动物dna包含至少50％诸如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的伴侣动物重链可变(v)基因，并且在一个方面中，包含所有的伴侣动物v基因。
93.在一个方面中，插入的伴侣动物dna包含至少50％诸如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的伴侣动物重链多变(diversity，d)基因，并且在一个方面中，包含所有的伴侣动物d基因。
94.在一个方面中，插入的伴侣动物dna包含至少50％诸如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的伴侣动物重链连接(j)基因，并且在一个方面中，包含所有的伴侣动物j基因。
95.在一个方面中，插入的伴侣动物dna包含至少50％诸如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的伴侣动物轻链可变(v)基因，并且在一个方面中，包含所有的伴侣动物轻链v基因。
96.在一个方面中，插入的伴侣动物dna包含至少50％诸如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的伴侣动物轻链连接(j)基因，并且在一个方面中，包含所有的伴侣动物轻链j基因。
97.在一个方面中，啮齿动物基因组包含所有的igh v区、d区和j区基因以及来自伴侣动物的间插序列(intervening sequence)。
98.在一个方面中，啮齿动物基因组包含所有的iglκv区和j区基因以及来自伴侣动物的间插序列。
99.在一个方面中，啮齿动物基因组包含所有的iglλv区和j区基因以及来自伴侣动物的间插序列。
100.啮齿动物或啮齿动物细胞基因组可以包含至少4个、5个、10个、15个或20个伴侣动物igh v区基因，诸如至少30个、40个、50个、60个、70个、80个v区基因。在一个优选的方面中，这些是犬科动物v区基因。在一个优选的方面中，啮齿动物基因组包含至少83个犬科动物ig重链v区基因。
101.啮齿动物或啮齿动物细胞基因组可以包含来自伴侣动物的至少1个、2个、3个、4个、5个或6个ighd区基因，优选地为犬科动物基因。
102.啮齿动物或啮齿动物细胞基因组可以包含来自伴侣动物的至少1个、2个、3个、4个、5个或6个ighj区基因，优选地为犬科动物基因。
103.啮齿动物或啮齿动物细胞基因组可以包含至少10个、15个、16个、17个、18个或19个伴侣动物iglκv区基因。在一个优选的方面中，这些是犬科动物κv区基因。在一个优选的方面中，啮齿动物基因组包含至少19个犬科动物轻链κv区基因。
104.啮齿动物或啮齿动物细胞基因组可以包含来自伴侣动物的至少1个、2个、3个、4个或5个iglκj区基因，优选地为犬科动物基因。
105.啮齿动物或啮齿动物细胞基因组可以包含至少5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个或至少160个伴侣动物iglλv区基因。在一个优选的方面中，这些是犬科动物λv区基因。在一个优选的方面中，啮齿动物基因组包含至少160个犬科动物轻链λv区基因。
106.啮齿动物或啮齿动物细胞基因组可以包含来自伴侣动物的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个iglλj区基因，优选地为犬科动物基因。
107.在另一个方面中，啮齿动物或啮齿动物细胞基因组可以包含来自猫的至少4个、5个、10个、15个或20个igh v区基因，诸如至少23个v区基因。
108.在另一个方面中，啮齿动物或啮齿动物细胞基因组可以包含来自猫的至少4个、5个、10个或11个伴侣动物igh d区基因。
109.在另一个方面中，啮齿动物或啮齿动物细胞基因组可以包含来自猫的至少1个、2个、3个、4个或5个伴侣动物igh j区基因。
110.在另一个方面中，啮齿动物或啮齿动物细胞基因组可以包含来自猫的至少4个、5个、10个、15个iglκv区基因。
111.在另一个方面中，啮齿动物或啮齿动物细胞基因组可以包含来自猫的至少1个、2个、3个、4个、5个或6个伴侣动物igκj区基因。
112.在另一个方面中，啮齿动物或啮齿动物细胞基因组可以包含来自猫的至少5个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、100个或更多，诸如113个iglλv区基因。
113.在另一个方面中，啮齿动物或啮齿动物细胞基因组可以包含来自猫的至少1个、2
个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个伴侣动物igλj区基因。
114.在纯合子在两个等位基因处均具有插入的情况中，上文任何方面中提及的伴侣动物基因的数目还可以进一步增加，并且在一个方面中是加倍的。
115.在一个方面中，插入的伴侣动物dna包含少于100％的伴侣动物重链可变(v)区基因，诸如少于90％、少于80％、少于70％或少于60％的伴侣动物重链v区基因。这适用于重、κ和λ基因座。降低插入的伴侣动物总dna的大小降低了所需的插入步骤的数目。对于任何免疫球蛋白基因座少于100％的伴侣动物基因的插入可以基于对v区的合理选择。
116.优选的v区基因是那些在天然存在的伴侣动物抗体中具有最高代表性的v区基因，例如在犬中这些将是：
117.ighv：4
‑
1,3
‑
38,3
‑
9,3
‑
67,3
‑
41
118.iglv：1
‑
136,1
‑
55,1
‑
138,8
‑
93,1
‑
149
119.igkv：2s16,2
‑
8,2
‑
11
120.特别地，我们优选，上文的igκ和/或igλ区段存在于啮齿动物基因组中，优选地分别在不存在犬科动物κ和/或λ基因区段的完整库的情况下存在于啮齿动物基因组中。
121.在另一个方面中，并且当2个不同的v区基因编码相同的氨基酸序列时，优选地基于由v区基因编码的氨基酸序列随后变化的可能性，诸如通过aid活性，来选择v区基因。那些对这样的氨基酸变化更易感的序列是优选的，诸如那些更可能经历非同义突变的核酸序列，例如其中遗传密码中的单个突变导致编码的氨基酸的变化的核酸序列。
122.优选地，插入到基因组中的v区、d区和j区基因来自相同的伴侣动物。优选地，插入的igh vdj区基因或igl vj区基因全部是犬科动物的，或全部是猫科动物的，或全部是马科动物的。优选地，基因全部是犬科动物的。
123.在一个方面中，插入的伴侣动物基因全部来自相同品种的伴侣动物，例如，来自相同品种的犬。
124.在一个方面中，一个或更多个伴侣动物基因位于基因组中啮齿动物恒定区的上游，合适地对于插入的伴侣动物重链可变区基因位于一个重链恒定区或更多个重链恒定区的上游，和/或合适地对于插入的伴侣动物轻链可变区基因位于轻链恒定区的上游，使得啮齿动物或啮齿动物细胞能够产生由插入的可变区基因和啮齿动物恒定区的表达产生的嵌合抗体链。
125.优选地，来自伴侣动物的重链v区、d区和j区基因位于啮齿动物基因组中啮齿动物重链恒定区的上游。
126.优选地，来自伴侣动物的轻链κv区、j区基因位于啮齿动物基因组中啮齿动物κ轻链恒定区的上游。
127.对恒定区诸如啮齿动物恒定区上游的可变区的位置的任何提及，意指编码抗体的可变区和恒定区的两个基因组部分的合适的相对位置，该合适的相对位置允许嵌合抗体链在啮齿动物中体内表达。以这种方式，插入的伴侣动物dna和啮齿动物恒定区彼此呈功能排列用于抗体或抗体链产生。
128.在一个方面中，插入的伴侣动物dna，诸如一个或更多个可变vdj区或vj区基因，位于啮齿动物基因组中与天然存在的重链恒定区或轻链恒定区的位点不同的位点处，诸如在不同的染色体上。在这种情况下，vdj区或vj区基因的插入伴随有来自啮齿动物或来自伴侣
动物的恒定区，并且优选地还伴随有来自啮齿动物或来自伴侣动物的3’增强子。一种优选的实施方案是使用啮齿动物恒定区和啮齿动物3’增强子与伴侣动物vdj或vj区，诸如犬科动物恒定区和犬科动物3’增强子。在一个方面中，一个或更多个伴侣动物基因位于基因组中与来自相同伴侣动物的恒定区呈功能排列，使得啮齿动物能够产生由插入的伴侣动物vdj区或vj区基因和伴侣动物恒定区的表达产生的抗体链。可选地，一个或更多个伴侣动物基因位于基因组中，与来自除该伴侣动物之外的其他动物(诸如不同的伴侣动物)的恒定区或诸如来自啮齿动物的恒定区呈功能排列。
129.在伴侣动物基因与恒定区缔合地插入到啮齿动物基因组的情况下，那么将理解的是，插入可以在啮齿动物细胞的基因组中的任何合适位置处，并且可以不靶向啮齿动物ig基因座处，因为内源恒定区基因对于抗体链产生不是必需的。可以在随机位置处插入到啮齿动物基因组中。
130.本发明还涉及包含编码完全伴侣动物抗体的基因组dna的啮齿动物。完全伴侣动物抗体可以通过将伴侣动物恒定区插入啮齿动物基因组中，与插入的伴侣动物v区、(d)区和j区基因呈功能排列来产生，或者，在鉴定出具有伴侣动物可变区和啮齿动物恒定区的合适的嵌合抗体之后，通过用伴侣动物恒定区替换啮齿动物恒定区来产生。优选地，伴侣动物恒定区选自igg恒定基因和/或等位基因中的任一种，优选地来自与人类igg1或igg4具有最大同源性(诸如功能同源性)的相同伴侣动物物种的igg。对于用于犬的抗体，优选地使用犬科动物igga或iggd。
131.因此，本发明特别地设想了在内源啮齿动物ig基因座处具有与伴侣动物恒定区缔合的伴侣动物基因的插入(编码“完全”伴侣动物抗体链)(诸如包含伴侣动物λv和j和c基因的dna或诸如包含伴侣动物v j和cκ基因的dna，或包含v、d、j和c重链基因区段的伴侣动物dna)的细胞和啮齿动物。优选地，来自伴侣动物的轻链λv区和j区基因位于基因组中，与来自相同的伴侣动物的λ链恒定区呈功能排列，诸如在来自相同的伴侣动物的λ链恒定区的上游。以这种方式，产生了具有来自伴侣动物的λ恒定区的λ抗体链。因此，本发明涉及啮齿动物或啮齿动物细胞，其中基因组包含一个或更多个伴侣动物iglλv区基因、一个或更多个伴侣动物iglλj区基因和一个或更多个伴侣动物λ恒定区，并且细胞或啮齿动物可以表达具有伴侣动物可变区和恒定区二者的λ抗体链。
132.在一个方面中，上文描述的伴侣动物vjcλ抗体链被插入到啮齿动物例如小鼠λ基因座中，优选地在最后一个啮齿动物c基因和3’增强子之间。
133.在一个方面中，啮齿动物或啮齿动物细胞包含位于啮齿动物细胞κ基因座处例如在κ基因座内或啮齿动物κ恒定区的上游或下游的一个或更多个伴侣动物iglλv区基因、一个或更多个伴侣动物iglλj区基因和一个或更多个伴侣动物λ恒定区。优选地，插入是在iglκ基因座恒定区的上游。在一个方面中，啮齿动物或啮齿动物细胞基因组包含在啮齿动物κ恒定区上游的伴侣动物轻链λv区和j区基因的插入，使得伴侣动物iglλv区和j区基因与啮齿动物iglκ恒定区一起表达。合适地，插入将伴侣动物基因定位在与天然啮齿动物κ基因大约相同的位置处，潜在地使它们缺失或置换它们，例如，从最后插入的3’λj基因到啮齿动物κ恒定区基因的距离与从最后一个啮齿动物κ3’j基因到κ恒定区的距离相同或基本上相同。在一个方面中，插入伴侣动物λ轻链dna是在啮齿动物免疫球蛋白κ基因座的边界(上游或下游)的1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb或10kb内。小鼠κ轻链以比小鼠λ轻链更高的
水平天然地表达，并且将伴侣动物dna插入在该κ基因座处可以提供高水平表达的伴侣动物λ链v区基因。
134.在一个方面中，啮齿动物基因组对于在1个或2个或所有3个免疫球蛋白基因座处插入的伴侣动物基因是纯合的。
135.在另一个方面中，啮齿动物基因组对于在1个、或2个或3个免疫球蛋白基因座处插入的伴侣动物基因是杂合的。
136.特别地，啮齿动物基因组对于在κ基因座处插入的伴侣动物基因可以是杂合的。
137.在一个方面中，插入的dna能够通过同种型转换与不同的啮齿动物恒定区一起表达。
138.在一个方面中，插入的伴侣动物dna能够通过反转换(trans
‑
switching)与不同的啮齿动物恒定区一起表达。
139.在一个方面中，伴侣动物是犬，并且啮齿动物基因组包含犬科动物κ可变区基因，其中所有的犬科动物κ可变区基因在啮齿动物基因组中位于与可变区基因一起表达的恒定区的上游，诸如啮齿动物κ恒定区的上游或诸如犬科动物κ恒定区的上游。
140.在另一个优选方面中，伴侣动物是马，并且啮齿动物基因组包含马科动物κ可变区基因，其中在啮齿动物基因组中的所有的马科动物κ可变区基因位于与可变区基因一起表达的恒定区的上游，诸如啮齿动物κ恒定区的上游或诸如马科动物κ恒定区的上游。
141.在一个方面中，伴侣动物dna被插入位于野生型基因座处的啮齿动物野生型恒定区处，合适地在啮齿动物恒定区和宿主vdj或vj区之间。在一个方面中，igh可变区基因被插入在重链j区的下游且在emu增强子的上游。
142.在一个方面中，啮齿动物是小鼠，并且igh可变区基因被插入在小鼠重链j区的下游且在emu增强子的上游。在一个方面中，igh v区基因的插入在小鼠12号染色体上的小鼠基因组的位置11466435处进行。在一个方面中，iglλv区基因的插入在16号染色体上的小鼠基因组的位置19047551处进行。在一个方面中，一个iglκv区基因或更多个iglκv区基因的插入在6号染色体上的小鼠基因组的位置70674755处进行。
143.在一个方面中，啮齿动物是小鼠，并且基因组至少包含犬科动物v4
‑
1、v3
‑
2、v3
‑
3和v3
‑
4 igh可变区基因。
144.在一个方面中，啮齿动物是小鼠，并且基因组至少包含犬科动物v4
‑
1、v7
‑
2、v3
‑
3、v2
‑
4、v2
‑
5、v2
‑
6、v2
‑
7、v2
‑
8、v2
‑
9、v2
‑
10和v2
‑
11 iglκ可变区基因。
145.在一个方面中，一种啮齿动物或啮齿动物细胞是小鼠或小鼠细胞，并且一个或更多个或所有的犬科动物κv基因4
‑
s17、2
‑
s16、3
‑
s15、2
‑
s14、2
‑
s13和2
‑
s12位于啮齿动物的κ恒定区的上游。
146.在一个方面中，啮齿动物是小鼠，并且基因组至少包含犬科动物v3
‑
1、v3
‑
2、v3
‑
3、v3
‑
4、v4
‑
5和v4
‑
6 iglλ可变区基因。
147.在一个方面中，啮齿动物是小鼠，并且基因组包含一个或一些或所有的小鼠igh v区基因优选地从v1
‑
85到v5
‑
2的缺失。
148.在一个方面中，啮齿动物是小鼠，并且基因组包含一个或一些或所有的小鼠iglκv区基因优选地从v3
‑
1到v2
‑
137的缺失。
149.在一个方面中，啮齿动物是小鼠，并且小鼠重链d区和j区基因被保留在基因组中
插入的伴侣动物重链可变区基因的上游。
150.在一个方面中，啮齿动物基因组被修饰以降低或防止具有来自啮齿动物的可变区和恒定区二者的完全啮齿动物抗体的表达。这可以通过所有或部分的啮齿动物vdj区的倒位，或通过基因组的内源啮齿动物vdj或vj区的缺失或到基因组的内源啮齿动物vdj或vj区中的插入。在一个方面中，啮齿动物vdj或vj区或其部分缺失。在一个方面中，所有或一定数目的啮齿动物v区基因缺失，诸如至少50％，优选地至少75％或至少90％，或所有的啮齿动物igh基因和/或啮齿动物iglκvj区基因和/或啮齿动物λvj基因缺失。在一个方面中，啮齿动物iglλ基因不从啮齿动物基因组缺失。
151.在一个方面中，啮齿动物κ基因座的一个或两个等位基因通过在啮齿动物κ基因座处插入伴侣动物dna全部或部分缺失或失活。
152.在一个方面中，啮齿动物κ基因座例如通过插入或通过缺失或通过倒位全部或部分失活。
153.在一个方面中，啮齿动物λ基因座例如通过插入或通过缺失或通过倒位全部或部分失活。
154.在一个方面中，啮齿动物重链基因座例如通过插入或通过缺失或通过倒位全部或部分失活。
155.一个或更多个伴侣动物可变区基因合适地被插入在啮齿动物恒定区的上游，后者包含编码整个恒定区或足以允许形成能够特异性识别抗原的有效嵌合抗体所需的恒定区部分所需要的所有dna。因此本文中对具有啮齿动物恒定区的嵌合抗体或抗体链的提及不限于具有完整恒定区或完整恒定区基因座的抗体链，还包括具有这样的恒定区或恒定区基因座的部分的嵌合抗体或链，该部分足以提供在啮齿动物中天然地存在的抗体中观察到的一个或更多个效应物功能。效应物功能包括与fc受体相互作用和/或与补体结合的能力。本教导还适于本发明的啮齿动物和细胞和方法，其中可变区dna位于宿主基因组中，使得它与形成抗体链或其部分的所有或部分的啮齿动物恒定区形成嵌合抗体链。
156.优选地，啮齿动物基因组包含所有的伴侣动物λ恒定区dna和间插区。
157.与伴侣动物可变区一起表达的啮齿动物恒定区优选地为位于野生型基因座处的啮齿动物野生型恒定区，如适用于伴侣动物重链或轻链vdj或vj。
158.在一个方面中，至少一种啮齿动物增强子或其他控制序列，诸如转换区(switch region)，维持与啮齿动物恒定区呈功能排列。以这种方式，增强子或其他控制序列的作用可以在细胞或转基因啮齿动物中全部或部分发挥。
159.在一个方面中，一个或更多个啮齿动物控制序列，诸如emu增强子序列，维持在啮齿动物mu恒定区的上游，合适地关于距恒定区的距离，在它的天然位置中。
160.在一个方面中，一个或更多个啮齿动物控制序列，诸如一个或更多个增强子序列，维持在啮齿动物恒定区的下游，合适地，关于距恒定区的距离，在它的天然位置中。
161.在一个方面中，啮齿动物smu转换序列维持在啮齿动物mu恒定区的上游，合适地关于距恒定区的距离，在它的天然位置中。
162.在这样的位置中，啮齿动物增强子或转换序列与一个或更多个宿主(即，其自身的)恒定区序列在体内合适地可操作。
163.在一个另外的方面中，伴侣动物v区、d区或j区基因的一个或更多个启动子元件或
其他控制元件在基因组中被优化以与啮齿动物的转录机制相互作用。
164.在一个方面中，啮齿动物或啮齿动物细胞基因组包含与伴侣动物v区、d区或j区缔合的一个或更多个伴侣动物启动子或增强子，和/或其他控制元件。在一个方面中，一个或更多个伴侣动物控制区，诸如启动子或增强子或转换区，分别地替换一个或更多个啮齿动物启动子或增强子或转换区。伴侣动物控制序列合适地维持与恒定区呈功能排列，使得一个或更多个控制序列的作用可以在细胞或转基因啮齿动物中全部或部分发挥作用。
165.在一个方面中，至少一个或更多个插入的伴侣动物v、d或j基因区段与来自相同的伴侣动物的调控序列诸如重组信号序列(rss)缔合，任选地其中调控序列指导一个v、d或j基因区段或更多个v、d或j基因区段的成功重组。
166.在本文中，“相同的”伴侣动物不限于获取伴侣动物v、d或j基因区段的精确的伴侣动物。在一个方面中，“相同的”伴侣动物是指与从获取伴侣动物v、d或j基因区段的伴侣动物相同的品种或物种。在一个方面中，它是精确地相同的伴侣动物。
167.在一个方面中，至少一个或更多个插入的伴侣动物v、d或j基因区段与调控序列直接地顺式或反式缔合，或在一侧或两侧上与调控序列侧接，任选地其中一个或更多个基因区段直接地侧接调控序列。
168.在一个方面中，调控序列包括在单独v基因区段之前的启动子，和/或单独v基因区段内的剪接位点，和/或在v基因区段的下游、在d基因区段的侧翼或在j基因区段的上游的用于v(d)j重组的重组信号序列。
169.在一个方面中，插入的伴侣动物的v、d或j序列侧接来自相同的伴侣动物的rss序列。例如，犬科动物rss序列可以与犬科动物v、d和/或j序列一起使用。将理解的是，这可以通过将来自伴侣动物的基因组片段插入到啮齿动物基因组中来提供。在一个另外的方面中，本发明提供了一种在啮齿动物细胞中用伴侣动物基因座全部或部分替换内源免疫球蛋白可变区基因座的方法，该方法包括：获得克隆的基因组片段或合成序列，该克隆的基因组片段或合成序列全部或部分包含伴侣基因座，所述伴侣基因座包含至少一个v或d(对于重链)或j基因区段以及至少一个缔合的调控序列；以及将伴侣动物dna插入到啮齿动物的基因组中，合适地在内源小鼠免疫球蛋白基因座处，优选地对应于插入的伴侣动物dna的性质的重链或轻链啮齿动物基因座处。
170.在一个方面中，插入的伴侣动物dna包含来自伴侣动物的至少5kb、至少10kb、至少15kb、20kb或更多的基因组dna。
171.在另一个方面中，伴侣动物基因座在啮齿动物基因组中的重建可以被设计成使在啮齿动物中进行的遗传操作步骤的数量最小化，同时插入适于获得可接受的伴侣动物抗体谱的伴侣动物dna的子集。单个v区基因可以插入啮齿动物基因组中，在种系序列的背景之外(out of the context of the germline sequence)，例如，不在种系构型(gemline configuration)中，或者例如，仅代表伴侣动物基因组中基因的子集。已经插入啮齿动物或啮齿动物细胞基因组中的伴侣动物v区、d区或j区基因可以与天然存在的侧翼伴侣动物dna的1
‑
10kb，诸如1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb或10kb缔和，其适当地位于伴侣动物基因组中的上游和/或下游。这可以包含伴侣动物基因组中存在的调节元件，并可以有利于可变区v区、d区和j区基因的表达。
172.在一个方面中，本发明的啮齿动物细胞是啮齿动物es细胞、啮齿动物造血干细胞
或能够发育成能够产生包含由伴侣动物dna编码的可变区的抗体链的库的啮齿动物的其他细胞，所述抗体链，诸如嵌合抗体重链或嵌合抗体轻链，或由具有可变区和恒定区的伴侣动物可变区编码的完全伴侣动物抗体链或抗体。
173.在一个方面中，本发明的细胞是啮齿动物es细胞或诱导性多能干细胞(ips细胞)。
174.在一个方面中，细胞是分离的啮齿动物细胞。
175.在一个方面中，细胞是分离的啮齿动物b细胞。
176.优选地，啮齿动物细胞是啮齿动物es细胞或ips细胞。这样的细胞适用于将伴侣动物dna插入以产生如本文描述的表达抗体链的啮齿动物。
177.es细胞可以是小鼠细胞株129或c57bl，诸如株c57bl/6n、c57bl/6j、129s5或129sv株，或为具有包含129或c57bl基因组dna的杂交基因组的细胞。
178.本发明还涉及从如本文描述的细胞生长或以其他方式来源于如本文描述的细胞的细胞系，包括永生化细胞系。
179.本发明的细胞或细胞系或基因组可以包含种系构型或在重排后随后在体内成熟的伴侣动物v、(d)或j基因。
180.本发明还涉及表达通过用抗原对本发明的啮齿动物进行免疫可获得的抗体链(诸如嵌合抗体重链)的细胞或细胞系。
181.本发明还涉及表达具有伴侣动物可变区的抗体或抗体链的细胞或细胞系，所述伴侣动物可变区优选地与伴侣动物恒定区缔合，其中该抗体或抗体链的可变区的核酸序列可以通过用抗原对本发明的啮齿动物进行免疫并且从啮齿动物或啮齿动物细胞获得抗体或抗体链或者抗体或抗体链的序列来鉴定或已经被如此鉴定。
182.表达的抗体链优选地为完全犬科动物抗体或抗体链，或完全马科动物抗体或抗体链，或完全猫科动物抗体或抗体链，其中来自伴侣动物的可变区与来自相同的伴侣动物的恒定区(而不是啮齿动物恒定区)缔合，在本发明的细胞或细胞系或啮齿动物中表达。
183.表达抗体链或抗体的细胞或细胞系可以是cho细胞，或适用于产生用于动物用途的治疗剂的其他哺乳动物细胞系。
184.细胞可以通过与肿瘤细胞融合而永生化，以提供产生抗体的细胞和细胞系，或通过直接细胞永生化制备。
185.本发明还涉及用于在本发明中使用的载体。在一个方面中，这样的载体是包含所有或部分的伴侣动物ig基因座的细菌人工染色体(bac)。将理解的是，其他克隆载体可以在本发明中使用，并且因此本文中提及bac可以被认为通常是指任何合适的载体。载体可以包含一个或更多个可选择的标志物和/或一个或更多个位点特异性重组位点。在一个方面中，载体包含2个或更多个，诸如3个异种特异性(heterospecific)和不相容位点特异性重组位点。在一个方面中，位点特异性重组位点可以是loxp位点或其变体，或frt位点或其变体。在一个方面中，载体包含一个或更多个转座子itr(末端反向重复)序列。
186.包含犬科动物dna的合适的bac从奥克兰儿童医院研究所bacpac资源中心(the bacpac resources center of the children’s hospital oakland research institute)可得，为chori
‑
82bac文库。
187.包含猫科动物dna的合适的bac从amplicon express可得，为fcab文库。
188.包含马科动物dna的合适的bac从奥克兰儿童医院研究所bacpac资源中心可得，为
chori
‑
241bac文库。
189.本发明涉及一种用于产生啮齿动物或啮齿动物细胞的方法，该方法包括将一个或更多个伴侣动物igh v区基因、一个或更多个伴侣动物igh d区基因和一个或更多个伴侣动物igh j区基因插入到啮齿动物细胞基因组中，其中啮齿动物或啮齿动物细胞能够表达与恒定区组合以形成抗体链的一个或更多个伴侣动物可变区基因。
190.本发明还涉及一种用于产生啮齿动物或啮齿动物细胞的方法，该方法包括将一个或更多个伴侣动物igl v区基因和一个或更多个伴侣动物igl j区基因插入到啮齿动物细胞基因组中，其中啮齿动物或啮齿动物细胞能够表达与恒定区组合以形成抗体链的一个或更多个伴侣动物可变区基因。
191.优选地，该方法涉及分别插入轻链和重链伴侣动物vdj区和vj区基因二者，使得抗体被产生，其中轻链和重链二者具有来源于伴侣动物dna的表达的可变区。
192.本发明还包括一种用于产生啮齿动物或啮齿动物细胞的方法，该方法包括将多个伴侣动物dna片段顺序地插入到啮齿动物细胞基因组中，其中插入的片段在啮齿动物细胞中形成连续插入，即它们直接连接在一起而不具有间插序列。
193.在一个方面中，插入过程在其中起始盒(initiation cassette)已经插入到细胞(诸如es细胞)的基因组的位点处开始。在一个方面中，起始盒被插入到啮齿动物重链基因座中，用于在伴侣动物重链dna的插入中使用。相似地，起始盒可以被插入啮齿动物轻链基因座中，用于在伴侣动物轻链vj dna的插入中使用。起始盒可以位于啮齿动物重链和κ链的最后一个j区和c区之间。起始盒可以位于啮齿动物κigl基因座的下游，并且在与啮齿动物κigl基因座相同的染色体上，用于在iglλ伴侣动物基因的插入中使用。
194.起始盒合适地包含啮齿动物基因组中独特的连续基因座，在该基因座处可以进行伴侣动物dna的插入。
195.在一个方面中，将第一个dna片段插入到起始盒中之后，可以将第二个dna片段插入到第一个dna片段的一部分中。可以在先前插入的dna片段的至少一部分中进行随后的插入。
196.在一个方面中，该方法包括通过同源重组将起始盒靶向插入到啮齿动物基因组中，通过位点特异性重组将第一个dna序列插入到起始盒的至少一部分中，将第二个dna序列插入到第一个dna序列的至少一部分中，以及任选地将另外的一个或更多个dna序列插入到先前dna序列的至少一部分中，以在包含伴侣动物dna的靶中建立连续的dna片段。可以通过位点特异性重组，例如通过重组酶介导的盒式交换(rmce)，将dna片段插入到较早的片段的至少一部分中。该方法可以包括同源重组(例如用于插入起始盒的起始步骤)和位点特异性重组诸如rmce重组(例如用于一个或更多个随后插入事件)二者。位点特异性重组酶系统是本领域熟知的，并且可以包括cre
‑
lox和flp/frt或其组合。
197.在一个方面中，插入的伴侣动物dna对于每一个重链或轻链区使用2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个或更多个单独的插入以逐步骤的方式在细胞诸如es细胞的基因组中构建。伴侣动物dna片段被逐一地合适地插入到相同或基本上相同的细胞基因座例如es细胞基因座处，以形成完整vdj或vj区或其部分。
198.本发明还涉及包含过程中的中间物(intermediate)的细胞和啮齿动物，其基因组可以仅包含部分伴侣动物vdj或vj区，诸如仅伴侣动物可变区基因dna。
199.用于将外源dna靶向插入内源小鼠基因座处的方法是本领域熟知的，使得插入的v、d和j基因可以与宿主恒定区一起表达。参见murphy等人,第111卷第14期,5153
‑
5158,doi:10.1073/pnas.1324022111；macdonald等人第111卷第14期,5147
‑
5152,doi:10.1073/pnas.1323896111；和lee等人,nature biotechnology第32卷，第356
‑
363页,2014,doi:,doi:10.1038/nbt.2825。
200.特别地，用于产生转基因啮齿动物的方法包括通过连续重组酶介导的盒式交换(sequential recombinase mediated cassette exchange)(srmce)逐步骤插入多个dna片段，在对应的啮齿动物哺乳动物恒定区的上游或甚至下游插入如本文公开的伴侣动物vdj区或vj区基因。
201.在一个方面中，在进行到任何多步骤克隆过程的下一个步骤前，确认正确的插入事件。
202.在一个方面中，伴侣动物是犬，啮齿动物是小鼠，并且天然地位于犬中犬科动物κ恒定区的下游的犬科动物iglκv区基因被插入在啮齿动物中啮齿动物κ恒定区的上游，优选地在天然地存在于在犬科动物iglκ恒定区的上游的犬科动物iglκv基因的上游，并且与该犬科动物iglκv基因在相同的方向上。
203.在一个方面中，啮齿动物能够产生多样的至少1
×
106种有不同功能的嵌合免疫球蛋白序列组合。
204.在一个方面中，携带一个或更多个嵌合基因座的啮齿动物和细胞诸如es细胞被用于制备嵌合体，其中宿主胚胎由rag
‑
1缺陷背景或防止成熟宿主b淋巴细胞和t淋巴细胞的产生的其他合适的遗传背景产生。这使所有b细胞和t细胞能够来源于注射的es细胞。
205.在一个方面中，优选的啮齿动物是小鼠，并且本发明的细胞是小鼠细胞或es细胞。在另一个方面中，优选的啮齿动物是大鼠，并且本发明的细胞是大鼠细胞或es细胞。
206.本发明的es细胞可以被用于使用本领域熟知的技术产生动物，这包括将es细胞注射到胚泡中，随后将嵌合胚泡植入到雌性中以产生后代，该后代可以繁殖以产生杂合后代，该杂合后代然后杂交繁殖(interbred)以产生具有需要的插入的纯合重组体。在一个方面中，宿主胚泡是rag缺陷的。
207.本发明涉及嵌合啮齿动物，该嵌合啮齿动物通过将本发明的es细胞注射到胚泡中，随后将嵌合胚泡植入到雌性啮齿动物中以产生后代而产生。
208.在一个方面中，啮齿动物或啮齿动物细胞是小鼠或小鼠细胞，并且小鼠adam6a和adam6b基因存在于小鼠基因组中，并且先前尚未从igh基因座缺失然后重新插入，例如，其中小鼠adam6基因座先前尚未从小鼠igh基因座缺失并且然后被引入回igh基因座以提高生育力。
209.在一个方面中，啮齿动物adam6a和adam6b基因位于插入的一个或更多个伴侣动物v、d和j基因的5’位置处。
210.在一个方面中，啮齿动物的igh d和j基因存在于啮齿动物基因组中。在一个方面中，啮齿动物igh d和j基因尚未从啮齿动物基因组缺失。在一个方面中，啮齿动物igh d和j基因位于插入的一个或更多个伴侣动物v、d和j基因的5’位置处。
211.在一个方面中，本发明中使用的犬科动物等位基因是每个犬科动物基因的参考等位基因。这些是canfam3.1的那些
‑
参见组装登录号
‑
gca_000002285.2，于2011年9月产生并
且于2016年5月最近一次更新。
212.出乎意料地，我们已经从来自跨越19个品种的107只犬的基因组数据确定，存在最小的品种变异，并且参考等位基因(来自拳师犬(boxer dog))跨越样品被发现76％次，并且其中非参考等位基因随着参考等位基因通常被发现为杂合子。这意指由包含犬科动物参考等位基因的啮齿动物产生的抗体群体将广泛适用于跨越不同的犬科动物品种使用。
213.因此，本发明涉及如本文公开的啮齿动物细胞或啮齿动物，其中已经插入的至少90％、至少95％和优选地所有的伴侣基因区段是来自canfam3.1的犬科动物参考等位基因。
214.优选地，啮齿动物或啮齿动物细胞包含不是以下基因区段中的一个或更多个的参考等位基因(不是“*01等位基因”)的等位基因：igkv2
‑
s13、iglv1
‑
57、iglv1
‑
68、iglv1
‑
72、iglv1
‑
88、iglv1
‑
96、iglv8
‑
60、iglv8
‑
90、iglv8
‑
120。优选地，啮齿动物或啮齿动物细胞基因组包含这些非参考等位基因中的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或所有9个。
215.本发明还涉及一种抗体链或其部分，该抗体链或其部分如本文公开地获得或可获得的，具有来源于疾病治疗中的犬科动物参考等位基因的表达的可变区，特别是在除参考基因组的品种之外的犬科动物品种中。在一个方面中，至少50％、60％、70％、80％、90％或100％的插入的v基因区段是犬科动物v基因参考等位基因，和/或至少50％、60％、70％、80％、90％或100％的插入的d基因区段是犬科动物d基因参考等位基因，和/或至少50％、60％、70％、80％、90％或100％的插入的j基因区段是犬科动物j基因参考等位基因，以及它们的组合。优选地，至少90％诸如100％的插入的犬科动物基因区段等位基因是该基因区段的参考等位基因。
216.本发明还涉及在啮齿动物中插入如本文公开的犬科动物v、d和j区段以产生抗体或抗体链或其部分，用于在不同的犬科动物品种中预防或治疗疾病中使用，以及涉及在啮齿动物中插入如本文描述的犬科动物v、d和j区段以产生抗体链或其部分用于在不同的犬科动物中预防或治疗疾病中使用的用途。
217.本发明还涉及一种啮齿动物，该啮齿动物具有如本文描述的来自拳师犬品种的一个或更多个或所有的犬科动物v、d和j区段。本发明还提供了抗体或其片段在与犬科动物基因区段中使用的品种不同的犬科动物品种中预防或治疗疾病的用途，该抗体或其片段从具有如本文描述的犬科动物基因组基因区段的任何啮齿动物获得或可获得，该抗体至少部分地由犬科动物dna表达。
218.例如，在插入的犬科动物dna来自拳师犬的情况下，用途是在除拳师犬之外的犬科动物物种中。
219.本发明还涉及：
220.(i)一种啮齿动物，该啮齿动物具有如本文描述的来自拳师犬品种的犬科动物v、d和j区段；优选地具有为参考等位基因的一个或更多个拳师犬基因区段；
221.(ii)一种啮齿动物，该啮齿动物具有如本文描述的来自除拳师犬之外的犬品种的犬科动物v、d和j区段，优选地具有与拳师犬相同的一个或更多个v、d和/或j基因区段(即，该犬具有参考等位基因)；
222.(iii)一种细胞，诸如b细胞、杂交瘤、cho或其他合适的细胞，该细胞表达来自(i)或(ii)中的这样的啮齿动物的抗体或抗体链，其中所述抗体包含由犬科动物v、d和j dna(或对于轻链，是犬科动物v和j dna)表达，优选地由参考等位基因表达的至少一些氨基酸；
223.(iv)一种完全犬科动物抗体或抗体链，该完全犬科动物抗体或抗体链包含上文(iii)中的抗体的抗体可变区，该完全犬科动物抗体或抗体链可以例如通过将编码犬科动物可变区的dna与编码犬科动物恒定区的dna一起表达而产生；
224.(v)一种表达细胞，诸如cho细胞，该表达细胞包含编码所有或部分的这样的完全犬科动物抗体的dna，
225.优选地，拳师犬v、d和j基因区段来自chori
‑
82bac文库。
226.在另一个方面中，本发明提供了抗体或抗体链，以及具有犬科动物可变区的抗体或抗体链在不同的犬科动物品种中预防或治疗疾病的用途，其中抗体或链从如本文公开的啮齿动物获得或可获得，其中用于产生犬科动物可变区的v基因区段是犬科动物参考等位基因，并且优选地其中抗体或抗体链在至少50％，诸如60％或至少70％的不同的犬科动物品种中有效，例如在疾病的治疗或预防中生物学有效。优选地，来自重链和/或轻链的犬科动物v基因区段来自拳师犬。优选地，d和j基因区段也是拳师犬基因区段。
227.本发明涉及：
228.一种用于产生对期望的抗原特异性的抗体链的方法，该方法包括用期望的抗原对如本文公开的啮齿动物进行免疫，并且回收单独的抗体链或作为完整抗体的一部分的抗体链，或回收产生单独的抗体链或作为完整抗体的一部分的抗体链的细胞(参见例如harlow,e.&lane,d.1998,第5版,antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor lab.press,plainview,ny；以及pasqualini和arap,proceedings of the national academy of sciences(2004)101:257
‑
259)。合适地，免疫原性量的抗原被递送。本发明还涉及一种用于检测靶抗原的方法，该方法包括用识别抗体的一部分的第二检测剂检测如上文产生的该抗体。
229.一种用于产生对期望的抗原特异性并且来源于单个物种的伴侣动物的抗体链或抗体的方法，该方法包括对如本文公开的包含伴侣动物基因的啮齿动物进行免疫，并且然后合适地通过工程化编码抗体的核酸，用来自相同的伴侣动物的伴侣动物的恒定区替换抗体链的啮齿动物恒定区。这可以通过标准克隆技术在dna水平用适当的伴侣动物恒定区dna序列替换非人类哺乳动物恒定区
‑
参见例如sambrook,j和russell,d.(2001,第三版)molecular cloning:a laboratory manual(cold spring harbor lab.press,plainview,ny)或通过直接核酸合成完成。
230.一种用于产生抗体链或其部分的方法，该抗体链具有伴侣动物可变区，该方法包括在细胞中表达编码抗体链或其部分的dna，
231.其中编码抗体链的可变区的dna的序列从用抗原对本发明的啮齿动物进行免疫使得抗体链被产生获得，或通过用抗原对本发明的啮齿动物进行免疫使得抗体链被产生可获得的，
232.任选地包括以下随后步骤：
233.纯化和/或分离抗原受体链，和
234.任选地然后将抗原受体链配制成适用于施用到伴侣动物中的药学上可接受的制剂。
235.一种抗体或抗体链或其部分，或编码抗体链或其部分的核酸，其已经从根据本发明的啮齿动物或细胞获得或可获得。
236.本发明还涉及包含犬科动物可变结构域和啮齿动物恒定结构域的来源于来自如本文公开的啮齿动物的b细胞，如由该b细胞可获得或获得的杂交瘤细胞的免疫球蛋白分子的一部分或全部，以及包含犬科动物可变结构域和啮齿动物恒定结构域的从该杂交瘤细胞可获得或获得的免疫球蛋白分子的一部分或全部。本发明还涉及通过单细胞测序鉴定犬科动物可变区并且制备合成载体以表达具有对应的犬科动物恒定区的完全抗体链。本发明还涉及通过pcr获得这些序列并且通过合适的分子生物学技术诸如但不限于桥式pcr和gibson克隆将它们连接到适当的恒定区。
237.本发明的另一个方面涉及使用高通量细胞筛选来鉴定在本发明的啮齿动物中生成的感兴趣的抗体，如通过引用并入本文的wo2015/040401中所公开的，并且涉及使用其中公开的方法鉴定的抗体。例如，合适的抗体可以从表达抗体和/或抗体链(也称为感兴趣的蛋白质或poi)的库的细胞群体获得或可获得，该抗体和抗体链包含伴侣动物可变区和啮齿动物恒定区，用于产生细胞的方法如下：
238.a)提供表达poi的库的细胞群体；
239.b)分选细胞群体以产生分选的单细胞群体，每个细胞包含编码各自的poi的核酸；
240.c)扩增经分选的单细胞群体所包含的核酸，以产生编码poi的经扩增核酸的经分选的库；
241.d)修饰来自步骤(c)的经分选的扩增的编码poi的核酸，以产生经分选的表达盒库，每个表达盒包含编码poi的核苷酸序列和一个或更多个用于表达poi的调节元件；和
242.e)将poi表达盒从所述盒库转移到经分选的宿主细胞群体，同时维持poi表达盒分选并产生表达经分选的poi库的经分选的宿主细胞库，其中经分选的宿主细胞库能够稳定地表达poi库
243.其中poi是免疫球蛋白链或其部分，并且其中在步骤(a)中，细胞是从一种或更多种动物中分离的细胞，其包括b细胞、生发中心细胞、记忆b细胞、抗体分泌细胞、浆细胞或浆母细胞，并且其中步骤(c)使用pcr进行。
244.本发明还涉及一种抗体或抗体链或其部分，该抗体或抗体链或其部分根据本发明获得或可获得，用于在治疗伴侣动物中使用。
245.本发明还涉及一种治疗伴侣动物的方法，该方法包括将根据本发明获得或可获得的合适的抗体或抗体链或其部分递送到有相应需要的伴侣动物。特别地，本发明涉及一种医学治疗的方法，该方法包括向有相应需要的伴侣动物递送抗体链或抗体或其部分，其中抗体的至少一个可变区已经通过用抗原对包含伴侣dna v(d)j区基因的本发明的啮齿动物进行免疫获得或以其他方式鉴定出。
246.在一个方面中，本发明涉及具有啮齿动物恒定区和伴侣动物可变区的嵌合伴侣动物抗体和抗体链，以及所述抗体和链的功能片段和功能衍生物，以及所述抗体、链和片段在医学包括诊断以及体外或离体研究中的用途。功能抗体片段和衍生物可以包括能够与抗原特异性结合的片段。功能抗体片段可以是例如fab、fab’、f(ab)2、fv、scfv片段、双抗体(diabodies)、线性抗体或单链抗体分子。在一个方面中，片段至少包括cdr3，例如λcdr3。功能衍生物可以是已经被修饰的抗体或其片段，例如通过附接到另一种剂诸如免疫粘附分子、成像剂、治疗剂和细胞毒性剂进行修饰。合适的实例是本领域熟知的，例如参见wo2012024650a2，该文献通过引用并入本文。在一个另外的方面中，本发明涉及“完全”伴侣
动物抗体和抗体链(其中“完全”反映了抗体的可变区和恒定区二者由相同物种的伴侣动物基因表达的事实)，以及所述抗体和链的片段和功能衍生物，以及所述抗体、链和片段在医学包括诊断以及体外或离体研究中的用途。
247.用于产生单克隆抗体和多克隆抗体二者的方法是本领域熟知的，并且本发明涉及响应于本发明的啮齿动物中的抗原攻击而产生的嵌合或完全伴侣动物抗体的多克隆抗体和单克隆抗体二者。
248.在一个另外的方面中，本发明涉及如本文描述的啮齿动物作为用于测试药物和疫苗的模型的用途。因此，本发明涉及一种用于鉴定或验证药物或疫苗的方法，该方法包括将疫苗或药物递送到本发明的哺乳动物并且监测免疫应答、安全性谱、对疾病的效果中的一项或更多项。
249.在又一个另外的方面中，本发明中产生的嵌合抗体或抗体链可以被适当地在dna水平操纵，以产生具有抗体样性质或结构(诸如来自不存在恒定区的重链或轻链的伴侣动物可变区，例如结构域抗体)的分子；或具有来自相同或不同物种的重链或轻链的任何恒定区的伴侣动物可变区的分子；或具有非天然存在的恒定区的伴侣动物可变区的分子；或与任何其他融合配偶体在一起的伴侣动物可变区的分子。本发明涉及来源于根据本发明鉴定出的嵌合抗体的所有这样的嵌合抗体衍生物。
250.本发明还涉及一种试剂盒，该试剂盒包含如本文公开的抗体或抗体衍生物，以及用于使用这样的抗体的说明或合适的实验室试剂，诸如缓冲液、抗体检测试剂。
251.本发明还涉及一种用于制备抗体或其部分的方法，该方法包括提供：
252.(i)编码根据本发明获得的抗体或其部分的核酸；或
253.(ii)序列信息，编码根据本发明获得的抗体或其部分的核酸可以根据该序列信息被表达以允许产生抗体。
254.本发明还涉及嵌合抗体，该嵌合抗体包含伴侣动物可变区和啮齿动物恒定区(任选地，cγ或cμ)，其中抗体由对应于细胞(任选地，b细胞、es细胞或杂交瘤)的嵌合重链基因座的核苷酸序列的核苷酸序列编码，该基因座包含啮齿动物恒定区核苷酸序列和通过伴侣动物v区、伴侣动物d区和伴侣动物j区的体内重排产生的重排的vdj核苷酸序列，伴侣动物v区选自犬科动物igh v4
‑
1、v3
‑
2、v3
‑
3、v3
‑
4、v3
‑
5 igh可变区基因。
255.任选地，j区是犬科动物jh1、jh2、jh3、jh4、jh5或jh6的任何一个。
256.任选地，d区是犬科动物dh1、dh2、dh3、dh4、dh5和dh6的任何一个。
257.在一个方面中，抗体包括本文实施例和附图中举例说明的任何组合。任选地，体内重排是在来自与恒定区序列相同的啮齿动物物种(例如，小鼠b细胞或es细胞)的细胞(例如，b细胞或es细胞)中。本发明还涉及非人类脊椎动物或哺乳动物细胞(例如，b细胞或es细胞或杂交瘤)，其基因组包含本段中如上文描述的嵌合重链基因座。
258.本发明还涉及非人类脊椎动物或哺乳动物(例如，小鼠或大鼠)，其基因组包含本段中如上文描述的嵌合重链基因座。
259.可以分离本发明的抗体，在一个方面中从表达它们的细胞或生物体分离。
260.本发明还涉及抗体链的部分。特别地，该部分至少包含抗体的可变区。这可以由细胞表达，特别是用于抗体产生。该部分可以包含抗体的fab区，或可以至少包含cdr区。
261.本发明涉及一种用于产生抗体或抗体链的方法，该方法包括用从伴侣动物可获得
的抗原对如本文描述的啮齿动物进行免疫，该伴侣动物与存在于啮齿动物基因组中的伴侣动物dna的来源相同。例如，犬科动物抗原可以被用于对如本文公开的包含犬科动物v、d和j基因的啮齿动物进行免疫。
262.因此，本发明还涉及用来自伴侣动物的抗原进行免疫的啮齿动物，该伴侣动物对应于存在于啮齿动物基因组中的伴侣动物dna的来源。
263.不需要使用完全相同的伴侣动物。例如，从一个品种获取的犬科动物抗原可以被用于对包含来自不同品种的犬科动物dna的啮齿动物进行免疫。还可以使用来自相同的犬科动物品种的抗原。
264.在一个可选方案中，抗原可以来自已知感染伴侣动物的病原体，诸如细菌或病毒。例如，来自在犬中感染并且引起疾病的病原体的抗原可以被用于对包含犬科动物v、d和j基因的如本文公开的啮齿动物进行免疫。
265.因此，本发明涉及用在伴侣动物中引起疾病的抗原进行免疫的啮齿动物，该伴侣动物对应于存在于啮齿动物基因组中的伴侣动物dna的来源。
266.在一个另外的方面中，抗原可以是与人类中的疾病相关的人类抗原的伴侣动物等同物，并且优选地其已经被验证为用于在人类中预防或治疗疾病的靶。
267.在一个方面中，本发明提供了通过如本文描述地用抗原对啮齿动物进行免疫而获得或可获得的抗体链或其片段。
268.本发明还涉及编码所述抗体、抗体链或其部分的核酸，诸如dna或rna。特别地，该部分可以是抗体链的可变部分，即由啮齿动物内的伴侣动物dna编码该部分。
269.本发明还涉及部分或完全表达犬科动物抗体链，或部分或完全表达犬科动物抗体链的部分例如可变区的细胞，诸如b细胞，或杂交瘤，或表达细胞系(例如cho细胞)，其dna或蛋白序列从如本文描述的啮齿动物可获得或已经获得。
270.将理解的是，在已经从免疫的啮齿动物鉴定出感兴趣的抗体后，本领域的标准是能够鉴定出编码来自b细胞的该抗体的dna序列并且由该序列表达抗体或其部分，或事实上从由于遗传密码子冗余而可以表达相同的蛋白的另一种dna序列表达抗体或其部分。特别地，犬科动物可变区可以与犬科动物恒定区一起表达，以产生完全犬科动物抗体链或抗体。
271.因此本发明还提供了一种用于获得完全犬科动物抗体的方法，该方法包括以下步骤：
272.如本文描述地用抗原对啮齿动物进行免疫，该啮齿动物具有至少一个重链犬科动物免疫球蛋白v基因区段、至少一个犬科动物重链d基因区段和至少一个犬科动物重链j基因区段和/或具有至少一个轻链犬科动物免疫球蛋白v基因区段和至少一个犬科动物重链j基因区段；
273.选择由啮齿动物产生的具有由犬科动物dna编码的抗体可变区的一种抗体链或更多种抗体链；和
274.在表达细胞系中表达抗体可变区dna，以表达抗体或抗体链或其部分，优选地其中抗体或抗体链或其部分是完全犬科动物的，并且例如包含犬科动物可变区和犬科动物恒定区；
275.任选地纯化抗体、抗体链或其部分；和
276.任选地进一步将抗体或其链或部分与适于允许向有相应需要的伴侣动物施用的
药学上可接受的赋形剂一起配制。
277.本发明还涉及这样的抗体或抗体链或其片段在伴侣动物中的疗法中的用途。
278.上文的方法同样适用于其他优选的伴侣动物，诸如猫和马。猫科动物抗原可以被用于等同的猫科动物/啮齿动物模型，并且马科动物抗原可以被用于等同的马科动物/啮齿动物模型，并且本发明的所有其他方面可以同样适用于猫和马。
279.本发明涉及一种用于产生交叉反应性抗体或抗体链的方法，该方法包括用来自所述啮齿动物的感兴趣抗原和来自伴侣动物的对应抗原对包含伴侣动物dna的如本文公开的啮齿动物进行免疫，其中啮齿动物包含编码所述抗原的基因的基因敲除。由所述免疫的啮齿动物产生的抗体群体可以包括能够与啮齿动物抗原和伴侣动物抗原二者结合，即交叉反应性的抗体。
280.因此，在一个另外的方面中，本发明涉及来源于如本文描述的啮齿动物的交叉反应性抗体或抗体片段，该啮齿动物包含伴侣动物dna、被用感兴趣的啮齿动物抗原和来自伴侣动物的对应抗原进行免疫，其中该啮齿动物具有编码所述抗原的基因的基因敲除。
281.在一个方面中，用啮齿动物抗原，或直接地用其蛋白或肽片段，或用编码相关抗原或其片段的载体，或用表达期望的抗原的等基因细胞系，和来自伴侣动物的对应抗原，顺序或同时对啮齿动物进行免疫。
282.在一个方面中，啮齿动物是小鼠，并且伴侣动物是犬、猫或马。
283.交叉反应性抗体在药物发现领域中非常重要。交叉反应性抗体可以通过使用抗体对其有反应的其他物种作为模型而无需抗体修饰，被快速地验证为用于抗体在其中有反应的物种的药物候选物。
284.本发明还涉及犬科动物抗原用于对如本文要求保护的啮齿动物进行免疫的用途，并且涉及用于对如本文要求保护的啮齿动物进行免疫的犬科动物抗原，其中犬科动物抗原具有人类中的家族基因或蛋白等同物，优选地其是治疗上经验证的，意指针对人类等同物抗原的抗体已经被证明在疾病的治疗中是有效的。本发明首次公开了犬科动物ig可变区和人类ig可变区之间的强同源性。参见图16。[强种系犬科动物
‑
人类ig v同源性，tcr v同源性较不保守]。该信息表明，包含犬科动物可变区dna的啮齿动物模型可能能够使用犬科动物调控序列，例如，而不需要小鼠调控序列，并且这是因为人源化小鼠能够在小鼠中使用人类调控序列。事实上，我们现在已经实验地验证了插入的犬科动物基因组dna的控制序列和rss序列可以被啮齿动物识别并且用于在啮齿动物中表达嵌合抗体。
[0285]
基于犬科动物和人类的进化趋异(evolutionary divergence)，本发明人的这些发现是出乎意料的和未预期的。
[0286]
熟知的是，在分配的系统发育内，小鼠和人类比任一种(例如)食肉动物，包括猫、犬和马亲缘上更接近。这可能是在具有人类dna v、d和j基因区段插入物的嵌合小鼠模型中使用人类调控序列在所述模型中是成功的原因。在此基础上，对于进化上更多样的动物，诸如人类和犬，同样是不可预测的。事实上，先前在小鼠中使用犬科动物基因区段的尝试使用了鼠调控序列(例如trianni
–
us2017306352)。
[0287]
在一个方面中，本发明涉及啮齿动物，其中插入的(伴侣动物)ighj4和ighj6是存在于成熟b细胞抗体群体中的主要jh基因区段。优选地，啮齿动物包含犬科动物v、d和j基因区段，并且j4和j6是犬科动物j4和j6基因区段。在本发明的一个方面中，啮齿动物能够使用
1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个或所有的不同插入的igh d区段和/或1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个或所有的插入的igh j基因区段产生啮齿动物抗体库内的抗体链。
[0288]
本发明测试的具有插入的犬科动物重链d1
‑
6和j1
‑
6基因区段的啮齿动物小鼠能够在形成抗体中使用所有的犬科动物igh j1
‑
6和d1
‑
6。
[0289]
在本发明的一个方面中，比起其他轻链j基因区段，啮齿动物更多利用iglj1。
[0290]
在本发明的一个方面中，啮齿动物包含来自犬的伴侣动物dna，并且啮齿动物具有一个或更多个以下特征：
[0291]
比起单独的ighj1、ighj2、ighj3、ighj5或ighj6的任何一个，啮齿动物表达更多的由ighj4表达的嵌合抗体重链；比起单独的ighj1、ighj2、ighj3或ighj5的任何一个，啮齿动物表达更多的由ighj6表达的嵌合抗体重链；
[0292]
比起单独的ighd1、ighd2、ighd3、ighd4或ighd6的任何一个，啮齿动物表达更多的由ighd5表达的嵌合抗体重链；
[0293]
比起单独的ighd1、ighd3、ighd4或ighd6的任何一个，啮齿动物表达更多的由ighd2表达的嵌合抗体重链；
[0294]
啮齿动物由ighd2连同ighj4一起表达抗体链；
[0295]
啮齿动物由ighd5连同ighj4一起表达抗体链；
[0296]
啮齿动物由ighd5连同ighj4一起表达的抗体链比由犬科动物ighd和ighj区段的任何其他组合表达的抗体链更多；
[0297]
比起任何其他igl j基因区段，啮齿动物表达更多的由iglj1表达的嵌合抗体轻链。
[0298]
在一个方面中，啮齿动物包含如下的插入的犬科动物重链基因区段：j1
‑
6、d1
‑
6、v4
‑
1、v3
‑
2、v3
‑
3和v3
‑
5，任选地具有v3
‑
4(其为假基因)。
[0299]
在一个方面中，啮齿动物包含如下的插入的犬科动物λ轻链基因区段；j1
‑
9，连同c1
‑
9(因此是完整的犬科动物λjc簇)，以及v3
‑
2、v3
‑
3、v3
‑
4、v4
‑
5、v4
‑
6，以及任选地v3
‑
1和v3
‑
7(二者是假基因)。
[0300]
本发明的啮齿动物合适地能够通过n和/或p添加，和/或对插入的伴侣动物v、d和j基因区段进行体细胞高频突变来修饰插入的伴侣动物v、d和j基因区段。
[0301]
本发明还提供了抗体重链或抗体的vh结构域的hcdr3，其中重链或抗体的vh结构域包含啮齿动物aid模式体细胞高频突变和/或小鼠dtd模式突变。例如，可以提供这种模式，其中vh结构域在包含啮齿动物aid和/或啮齿动物tdt(例如内源aid或tdt)的啮齿动物中产生。小鼠是优选的啮齿动物。
[0302]
在本发明的一个方面中，嵌合抗体链的可变区与将由用于产生抗体的v、d和j基因区段的种系序列预测的氨基酸序列不同。因此，存在某种程度的体细胞高频变异和/或n/p添加。
[0303]
我们已经出乎意料地发现，当使用实施例4的rna测序方法在相似的深度询问(interrogate)两种样品时，使用如本文描述的包含犬科动物v、d和j基因区段或v和j区段的啮齿动物产生的嵌合抗体群体的多样性比基因区段来源于其的野生型犬的观察到的抗体多样性大。图21显示出，在来自包含犬科动物重链v、d和j基因区段或轻链v和j区段的啮齿动物的经测序的文库内仅发现一次的抗体核苷酸序列比在犬自身中观察到的多得多。
[0304]
因此，本发明涉及如本文描述的表达嵌合抗体链群体的任何啮齿动物，其中每种抗体由至少一个伴侣动物基因区段的表达产生，并且其中该群体与在对应伴侣动物中观察到的抗体群体更多样或至少一样多样。换言之，在啮齿动物中产生的抗体群体的多样性大于或至少与伴侣动物的抗体库中观察到的一样大。
[0305]
优选地，在具有犬科动物dna v、d和j基因区段或轻链v和j区段的小鼠中产生的抗体群体的多样性大于或至少与在犬的抗体库中观察到的一样大。
[0306]
合适地，通过重链群体或轻链群体或二者中存在的独特抗体序列的数目来评估群体多样性。
[0307]
本发明还涉及包含其中至少65％或至少70％是独特的嵌合抗体链群体的啮齿动物，诸如其中65％
‑
80％之间的嵌合抗体序列是独特的啮齿动物，诸如其中65％
‑
75％相对于例如在实施例4中如通过5’race确定的序列是独特的啮齿动物。
[0308]
啮齿动物可以是本文公开的任何啮齿动物，例如在一个方面中，啮齿动物包含如下的插入的犬科动物重链基因区段：j1
‑
6、d1
‑
6、v4
‑
1、v3
‑
2、v3
‑
3和v3
‑
5，任选地具有v3
‑
4(其为假基因)。在一个方面中，啮齿动物包含如下的插入的犬科动物λ轻链基因区段；j1
‑
9，连同c1
‑
9(因此是完整的犬科动物λjc簇)，以及v3
‑
2、v3
‑
3、v3
‑
4、v4
‑
5、v4
‑
6，以及任选地v3
‑
1和v3
‑
7(二者是假基因)。在一个方面中，啮齿动物包含犬科动物重链插入物和轻链插入物二者。
[0309]
本发明还涉及如本文公开的包含伴侣动物dna的任何啮齿动物(例如小鼠)在产生嵌合抗体链或抗体的库中的用途，该嵌合抗体链或抗体的库比在伴侣动物自身中观察到的更多样或至少与伴侣动物本身中观察到的一样多样，并且还涉及如本文公开的包含伴侣动物dna的啮齿动物，诸如小鼠，用于产生嵌合抗体链或抗体的库，该嵌合抗体链或抗体的库比在伴侣动物自身中观察到的更多样或至少与伴侣动物本身中观察到的一样多样。
[0310]
因此，本发明的可优选的方面是：
[0311]
一种用于产生抗体或抗体链的方法，该方法包括用从伴侣动物获得或可获得的抗原对如本文公开的啮齿动物进行免疫，该伴侣动物与存在于啮齿动物基因组中的伴侣动物dna的来源相同，其中抗原可以是蛋白抗原、表达抗原的细胞或编码抗原的核酸。
[0312]
一种用于产生抗体或抗体链的方法，该方法包括用来自感染伴侣动物物种的病原体诸如细菌或病毒的抗原对如本文公开的啮齿动物进行免疫，该伴侣动物物种是存在于啮齿动物基因组中的伴侣动物dna的来源。
[0313]
如本文公开的啮齿动物，该啮齿动物用来自伴侣动物的抗原进行免疫，该伴侣动物对应于存在于啮齿动物基因组中的伴侣动物dna的来源。
[0314]
如本文公开的啮齿动物，该啮齿动物用在伴侣动物中引起疾病的抗原进行免疫，该伴侣动物对应于存在于啮齿动物基因组中的伴侣动物dna的来源。
[0315]
如本文公开的啮齿动物，该啮齿动物用与人类抗原的伴侣动物抗原等同物进行免疫，该人类抗原与人类中的疾病相关。
[0316]
如本文公开的啮齿动物，其中啮齿动物包含来自犬的伴侣动物dna，并且啮齿动物具有一个或更多个或所有的以下特征：
[0317]
比起单独的ighj1、ighj2、ighj3、ighj5或ighj6的任何一个，啮齿动物表达更多的由ighj4表达的嵌合抗体重链；
[0318]
比起单独的ighj1、ighj2、ighj3或ighj5的任何一个，啮齿动物表达更多的由ighj6表达的嵌合抗体重链；
[0319]
比起单独的ighd1、ighd2、ighd3、ighd4或ighd6的任何一个，啮齿动物表达更多的由ighd5表达的嵌合抗体重链；
[0320]
比起单独的ighd1、ighd3、ighd4或ighd6的任何一个，啮齿动物表达更多的由ighd2表达的嵌合抗体重链；
[0321]
啮齿动物由ighd2连同ighj4一起表达抗体链；
[0322]
啮齿动物由ighd5连同ighj4一起表达抗体链；
[0323]
啮齿动物由ighd5连同ighj4一起表达的抗体链比由犬科动物ighd和ighj区段的任何其他组合表达的抗体链更多；
[0324]
比起任何其他igl j基因区段，啮齿动物表达更多的由iglj1表达的嵌合抗体轻链。
[0325]
如本文公开的啮齿动物，该啮齿动物包含如下的插入的犬科动物重链基因区段：j1
‑
6、d1
‑
6、v4
‑
1、v3
‑
2、v3
‑
3和v3
‑
5，任选地具有v3
‑
4。
[0326]
如本文公开的啮齿动物，该啮齿动物包含如下的插入的犬科动物λ轻链基因区段：j1
‑
9、c1
‑
9、v3
‑
2、v3
‑
3、v3
‑
4、v4
‑
5、v4
‑
6，以及任选地v3
‑
1和v3
‑
7。
[0327]
如本文公开的啮齿动物，该啮齿动物能够通过n和/或p添加修饰插入的伴侣动物v、d和j基因区段，和/或该啮齿动物显示出体细胞高频突变。
[0328]
如本文公开的啮齿动物，该啮齿动物表达嵌合抗体链群体，其中每种抗体链由至少一个伴侣动物基因区段的表达产生，并且其中嵌合抗体群体比在对应的野生型伴侣动物中观察到的抗体群体更多样。
[0329]
如本文公开的啮齿动物，该啮齿动物包含其中至少65％或至少70％是独特的嵌合抗体链群体，任选地其中该啮齿动物是犬。
[0330]
如本文公开的啮齿动物，其中65％
‑
80％之间的嵌合抗体序列是独特的，诸如其中65％
‑
75％是独特的啮齿动物。
[0331]
如本文公开的包含伴侣动物dna的任何啮齿动物(例如小鼠)在产生嵌合抗体链或抗体的库中的用途，所述嵌合抗体链或抗体的库比伴侣动物自身中观察到的更多样。
[0332]
如本文公开的啮齿动物，诸如小鼠，用于产生嵌合抗体链或抗体的库，所述嵌合抗体链或抗体的库比在伴侣动物自身中观察到的更多样。
[0333]
如本文公开的啮齿动物，其中一个或更多个插入的伴侣动物v、d或j基因区段与来自相同伴侣动物的调控序列缔合，任选地其中调控序列包括在单独v基因区段之前的启动子和/或剪接位点，和/或用于v(d)j重组的重组信号序列。
[0334]
如本文公开的啮齿动物，其中插入的伴侣动物的v、d或j序列的侧翼是来自相同伴侣动物的rss序列，并且不使用宿主啮齿动物rss序列。
[0335]
如本文公开的啮齿动物，该啮齿动物包含来自一个品种的犬科动物dna，用于在产生抗体或抗体链或其部分中使用，用于在不同的犬科动物品种中治疗或预防疾病中使用。
[0336]
如本文公开的包含来自一个品种的犬科动物dna的啮齿动物在产生用于在治疗不同的犬科动物品种中使用的抗体链或其部分的用途。
[0337]
如本文公开的啮齿动物，其中一个或更多个或所有的犬科动物v、d和j区段来自拳
师犬。
[0338]
在另一个方面中，插入啮齿动物基因组中的伴侣动物dna不含非免疫球蛋白基因或不含功能性非免疫球蛋白基因(后者允许包含非功能性非免疫球蛋白基因)。如果非免疫球蛋白基因位于伴侣动物的基因组内，可以在插入前将其切除。因此，本发明涉及具有如本文描述的插入的伴侣动物dna的啮齿动物基因组，但是其不包含伴侣动物非免疫球蛋白基因或不包含功能性伴侣动物非免疫球蛋白基因。
[0339]
例如，我们已经在犬科动物ig基因座中鉴定出，在犬科动物λ基因区段中有三个基因不编码免疫球蛋白基因，并且因此优选地这些基因在插入前被切除，而不插入啮齿动物基因组中。因此，在一个方面中，本文公开的犬科动物化(caninised)啮齿动物不包含下列犬科动物基因的任何一个或两个或三个或全部：znf280b、prame、rpia和pcbp2。在插入前切除非免疫球蛋白基因降低了实现期望iglλv基因的插入所需的插入物的大小。如本领域技术人员所理解的，这使得插入更容易，并降低了非ig基因在啮齿动物或啮齿动物细胞中引起任何不想要的干扰的可能性。因此，在一个方面中，插入的伴侣动物dna不是基因组克隆，而是可以包含“编辑的”基因组克隆，其中一个或更多个基因已经缺失。在另一个方面中，本发明涉及本文公开的用于产生转基因啮齿动物的任何方法，其中插入啮齿动物中的dna不包含非免疫球蛋白基因，例如，不包含znf280b、prame、rpia和pcbp2中的任何一种或更多种。
[0340]
在另一个方面中，本发明涉及本文公开的包含伴侣动物dna的啮齿动物或细胞，其中基因组另外包含一个或更多个啮齿动物基因敲除。本发明还涉及具有如本文描述的插入的伴侣动物dna的啮齿动物，其中基因组另外包含基因敲除，并且其中啮齿动物已经用由敲除的基因编码的或由该基因的伴侣动物同源物编码的抗原进行免疫。合适的同源物在核酸水平或蛋白质水平具有60％或更多的同源性，诸如在核酸水平或蛋白质水平具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的同源性。
[0341]
因此，本发明还包括一种用于产生针对感兴趣的特定抗原的抗体的方法，该方法包括对啮齿动物进行免疫，该啮齿动物包含具有如本文公开的插入的伴侣动物基因的基因组，并且包含对编码感兴趣的抗原的基因或其伴侣动物同源物的敲除。
[0342]
本发明还涉及如本文公开的表达多特异性抗体或抗体链，例如双特异性抗体或抗体链的啮齿动物或啮齿动物细胞。用于产生双特异性抗体的方法和各种形式在“the making of bispecific antibodies”,brinkmann等人,mabs.2017feb
‑
mar；9(2):182
‑
212中描述，该文献在关于产生双特异性抗体及其功能部分的不同方法时通过引用并入本文。多特异性抗体可以是其中描述的任何形式，诸如无fc双特异性(fc
‑
less bispecific)的形式，串联单链可变片段(scfv2,tafv)和三抗体(triplebodies)的形式，双抗体和双抗体衍生物的形式，fab融合蛋白的形式。多特异性抗体可以包含接枝到scfv上的另外的抗原结合位点，可以是具有来自两种不同抗体的重链和轻链的不对称igg，可以是具有不对称fc区的双特异性igg，可以是附加的igg或修饰的igg，或者可以是对称的基于fc和ch3的双特异性抗体，也如brinkmann等人所描述的。
[0343]
本发明的啮齿动物或啮齿动物细胞可以包括单个未重排的伴侣动物轻链可变区基因区段(或两个伴侣动物轻链可变区基因区段)，该区段重排形成表达单条轻链(或表达两条轻链中的一条或两条)的重排的伴侣动物轻链可变区基因(或两个重排的轻链可变区
基因)。重排的伴侣动物轻链可变结构域能够与伴侣动物选择的多于一种亲和力成熟的伴侣动物重链配对，其中重链可变区与不同的表位特异性地结合。轻链可以是κ链或λ链。
[0344]
例如，本发明涉及
[0345]
一种啮齿动物或啮齿动物细胞，该啮齿动物或啮齿动物细胞包含以下：
[0346]
(a)用单个伴侣动物轻链vj基因区段或2个伴侣动物轻链vj基因区段进行的对所有或基本上所有内源啮齿动物κ免疫球蛋白轻链可变区基因区段的内源啮齿动物κ免疫球蛋白轻链可变区基因座的替换，其中每个伴侣动物基因区段可操作地连接到内源啮齿动物轻链恒定基因；和
[0347]
(b)用多于一个伴侣动物重链可变区基因区段进行的对一些或所有或基本上所有的内源啮齿动物重链可变区基因基因座的替换，其中伴侣动物重链可变区基因区段可操作地连接到内源啮齿动物重链恒定基因，并且伴侣动物重链可变区基因区段能够重排并形成重排的伴侣动物/啮齿动物嵌合重链基因。
[0348]
基本上所有的替换意味着优选地90％或更多，诸如95％或更多的相应啮齿动物基因座已经被替换。该替换可以是功能替换，因为相关的啮齿动物基因座可以失去活性，使得没有啮齿动物抗体链或少于10％的啮齿动物抗体链从该基因座表达，优选地其中从该失去活性的基因座的表达少于1％。
[0349]
在一个方面中，啮齿动物缺乏能够重排和形成分别编码啮齿动物κ和/或λ可变区的基因的内源啮齿动物κ和/或λ免疫球蛋白轻链可变区基因座，或者缺乏因此分别适于防止啮齿动物κ和/或λ可变区形成的部分，或者包含分别适于防止啮齿动物κ和/或λ可变区形成的突变(例如缺失或插入或替换)。
[0350]
本发明不仅涉及伴侣动物，还涉及家畜。本文公开的涉及伴侣动物dna的本发明的任何公开内容或方面，同样可以理解为涉及家畜dna。家畜包括在农业环境中饲养以产生例如劳力和商品，诸如肉、蛋、奶、毛皮(fur)、皮革和毛(wool)的家养动物。这样的动物的实例包括但不限于牛、山羊、猪、鹿和绵羊。
[0351]
此外，本发明同样涉及来自包括鸡、火鸡和其他养殖鸟类在内的家禽的dna的用途。本文描述的伴侣动物dna的所有方面同样适用于这样的家禽。
[0352]
犬科动物κcdr3
[0353]
在本发明的另一个方面，我们已经鉴定出，某些犬科动物igk cdr3序列的表达强烈优先于其他序列。三个最优选的序列共计构成所有序列的27.55％，并且每个序列为9个氨基酸长(不包括cdr3侧翼的保守氨基酸)。为了清楚和避免疑问，第一个氨基酸对应于位置105，并且最后一个(在这种情况下是第9个)氨基酸对应于位置117
‑
参考imgt独特编号系统(lefranc,m.
‑
p.,immunology today,18,509(1997)pmid:9386342)。
[0354]
犬科动物κ轻链cdr3在犬中的表达数据如下
[0355][0356]
因此，啮齿动物或啮齿动物细胞(诸如啮齿动物b细胞，或表达本文公开的抗体或抗体链的细胞)优选地编码或表达9个氨基酸(不包括cdr3侧翼的保守氨基酸)的犬科动物κcdr3区。为了清楚和避免疑问，第一个氨基酸对应于位置105，并且最后一个(在这种情况下是第9个)氨基酸对应于位置117
‑
参考imgt独特编号系统(lefranc,m.
‑
p.,immunology today,18,509(1997)pmid:9386342)。
[0357]
优选的是，本发明的包含犬科动物igk dna的啮齿动物或啮齿动物细胞(诸如啮齿动物b细胞，或表达抗体或抗体链的表达细胞)编码和/或表达包含选自以下之一的序列或由选自以下之一的序列组成的犬科动物κcdr3区：
[0358]
qqslhfpptqqslhlpptgqgthsptt
[0359]
在一个方面中，编码或表达的cdr3序列包含qqslhfppt或由qqslhfppt组成。
[0360]
在一个方面中，编码或表达的cdr3序列包含qqslhlppt或由qqslhlppt组成。
[0361]
在一个方面中，编码或表达的cdr3序列包含gqgthsptt或由gqgthsptt组成。
[0362]
cdr3的qqslhfppt和qqslhlppt是优选的。
[0363]
在一个方面中，编码或表达的cdr3序列当在天然库中呈完全犬科动物抗体的形式时，或者当从该库纯化时，不包含qqslhfppt或不由qqslhfppt组成，特别地不是qqslhfppt。在一个方面中，编码或表达的cdr3序列不是wo2012024650中公开的形式。为避免疑问，编码或表达的cdr3 qqslhfppt可以在作为药物组合物一部分的κ链中，或者可以是全长κ链的片段，或者是组合形式，诸如双特异性抗体形式。
[0364]
在另一个方面中，包含犬科动物igk dna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置7处包含脯氨酸(p)残基的犬科动物κcdr3区。犬科动物κ轻链抗体链的96.68％的cdr3区包含这样的脯氨酸。
[0365]
在另一个方面中，包含犬科动物igk dna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置2处包含谷氨酰胺(q)残基的犬科动物κcdr3区。犬科动物κ轻链抗体链的97.75％
的cdr3区包含这样的谷氨酰胺。
[0366]
在另一个方面中，包含犬科动物igk dna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置9处包含苏氨酸(t)残基的犬科动物κcdr3区。犬科动物κ轻链抗体链的97.10％的cdr3区包含这样的苏氨酸。
[0367]
在一个方面中，啮齿动物基因组仅包含单个或仅两个犬科动物κ轻链可变区基因区段，所述区段可以重排以表达单个重排的伴侣动物轻链可变区基因或分别表达两条这样的轻链，其中插入基因组中的犬科动物κdna编码和/或表达包含以下或由以下组成的抗体链：
[0368]
优选的三种犬科动物κcdr3序列中的一种，或
[0369]
包含在指定位置具有上文提及的优选的氨基酸p、q或t中的一个或两个或全部的cdr3。
[0370]
在一个方面中，cdr3不是以下任何一个或更多个：
[0371]
qhyfhyprt
[0372]
qndysypyt
[0373]
qqsnkdplt
[0374]
qqsnkdplt
[0375]
qqsreypwt
[0376]
qqyynyplt
[0377]
sqsthvpvvt
[0378]
wqgthfpqt
[0379]
gqgmeipwt
[0380]
qqslhfppt
[0381]
gqntqlplt
[0382]
gqrvrspwt
[0383]
gqviqdpwt
[0384]
gqglqaplt
[0385]
gqathyple
[0386]
gqgiqnpft
[0387]
gqgtqfpft
[0388]
gqgtqfpft
[0389]
ghgkeapyt
[0390]
gqalqfplt
[0391]
ghaigfplt
[0392]
gqntqfplt
[0393]
gqgvqgpwt
[0394]
gqitqdpft
[0395]
gqgiqgpyt
[0396]
gqatqtppt
[0397]
gqtvqfplt
[0398]
gqgtlnpvvt
[0399]
gqgllappt
[0400]
gqatqfpst
[0401]
gqdtqfplt
[0402]
gqgiqdpt
[0403]
gqalqfpyt
[0404]
ghglqtpyt
[0405]
gqgtqppyt
[0406]
gqgsrvplt
[0407]
ghgtqipys
[0408]
gqgtqfpyt
[0409]
gqgiqipyt
[0410]
gqgsedppt
[0411]
gqgvqdpft
[0412]
fcqgshvpft
[0413]
qhhfgtpft
[0414]
fesnylgt
[0415]
fogahvpft
[0416]
gqylvypft
[0417]
λcdr3
[0418]
在本发明的另一个方面中，我们已经鉴定出，某些犬科动物igλcdr3序列的表达强烈优先于天然犬科动物库中的其他序列。这些序列通常为11个氨基酸长(不包括cdr3侧翼的保守氨基酸)。为了清楚和避免疑问，第一个氨基酸对应于位置105，并且最后一个(在这种情况下是第11个)氨基酸对应于位置117
‑
参考imgt独特编号系统(lefranc,m.
‑
p.,immunology today,18,509(1997)pmid:9386342)。
[0419]
犬科动物的λcdr3表达数据如下所示
[0420][0421]
关于优选的残基，它们属于如pommi
é
,c.等人,j.mol.recognit.,17,17
‑
32
(2004).pmid:14872534中定义的类别。在一个方面中，它们根据亲水性被分类，其中残基是疏水的(a、c、i、l、m、f、w、v)，中性亲水的(g、h、p、s、t、y)，或亲水的(r、n、d、q、e、k)。在另一个方面中，它们根据体积被分类，其中残基是非常小的(a、g、s)，小的(n、d、c、p、t)，中等的(q、e、h、v)，大的(r、i、l、k、m)，或非常大的(f、w、y)。在另一个方面中，它们根据其化学组成/性质(chemistry)被分类，其中残基是脂肪族的(a、g、i、l、p、v)，芳族的(f、w、y)，含硫的(c、m)，含羟基的(s、t)，碱性的(r、h、k)，酸性的(d、e)，或酰胺(n、q)。在另一个方面中，它们根据其电荷被分类，其中残基是带正电荷的(r、h、k)，带负电荷的(d、e)，或不带电荷的(a、n、c、q、g、i、l、m、f、p、s、t、w、y、v)。在另一个方面中，它们基于其是否能提供氢键和/或接受氢键被分类，其中残基是供体(r、k、w)，接受者(d、e)，供体和接受者二者(n、q、h、s、t、y)，或者既不是供体也不是接受者(a、c、g、i、l、m、f、p、v)。在另一个方面中，它们根据其极性被分类，其中它们是极性的(r、n、d、q、e、h、k、s、t、y)或非极性的(a、c、g、i、l、m、f、p、w、v)。
[0422]
位置1
[0423]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置1包含极性残基的犬科动物λcdr3区。
[0424]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置1包含不带电荷的残基的犬科动物λcdr3区。
[0425]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置1包含中性亲水状态的残基的犬科动物λcdr3区。
[0426]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置1包含能够既提供氢键又接受氢键的残基的犬科动物λcdr3区。
[0427]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置1包含非常小的残基的犬科动物λcdr3区。
[0428]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置1包含羟基残基的犬科动物λcdr3区。
[0429]
在一个方面中，在位置1的残基是上文列出的优选类别中的一个。在另一个方面中，在位置1的残基是上文列出的多于一个优选类别，诸如2个、3个、4个、5个或6个优选类别。
[0430]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置1包含丝氨酸(s)残基的犬科动物λcdr3区。
[0431]
位置4
[0432]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置4包含极性残基的犬科动物λcdr3区。
[0433]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置4包含带负电荷的残基的犬科动物λcdr3区。
[0434]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置4包含亲水残基的犬科动物λcdr3区。
[0435]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置4包含能够接受氢键的残基的犬科动物λcdr3区。
[0436]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达
在位置4包含小残基的犬科动物λcdr3区。
[0437]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置4包含酸性残基的犬科动物λcdr3区。
[0438]
在一个方面中，在位置4的残基是上文列出的优选类别中的一个。在另一个方面中，在位置4的残基是上文列出的多于一个优选类别，诸如2个、3个、4个、5个或6个优选类别。
[0439]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置4包含天冬氨酸(d)残基的犬科动物λcdr3区。
[0440]
位置6
[0441]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置6包含极性残基的犬科动物λcdr3区。
[0442]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置6包含不带电荷的残基的犬科动物λcdr3区。
[0443]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置6包含中性亲水状态的残基的犬科动物λcdr3区。
[0444]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置6包含能够既提供氢键又接受氢键的残基的犬科动物λcdr3区。
[0445]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置6包含非常小的残基的犬科动物λcdr3区。
[0446]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置6包含羟基残基的犬科动物λcdr3区。
[0447]
在一个方面中，在位置6的残基是上文列出的优选类别中的一个。在另一个方面中，在位置6的残基是上文列出的多于一个优选类别，诸如2个、3个、4个、5个或6个优选类别。
[0448]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置6包含丝氨酸(s)残基的犬科动物λcdr3区。
[0449]
位置7
[0450]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置7包含非极性残基的犬科动物λcdr3区。
[0451]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置7包含不带电荷的残基的犬科动物λcdr3区。
[0452]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置7包含疏水残基的犬科动物λcdr3区。
[0453]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置7包含既不能够提供氢键又不能够接受氢键的残基的犬科动物λcdr3区。
[0454]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置7包含大残基的犬科动物λcdr3区。
[0455]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置7包含脂肪族残基的犬科动物λcdr3区。
[0456]
在一个方面中，在位置7的残基是上文列出的优选类别中的一个。在另一个方面中，在位置7的残基是上文列出的多于一个优选类别，诸如2个、3个、4个、5个或6个优选类别。
[0457]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置7包含亮氨酸(l)残基的犬科动物λcdr3区。
[0458]
位置11
[0459]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置11包含非极性残基的犬科动物λcdr3区。
[0460]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置11包含不带电荷的残基的犬科动物λcdr3区。
[0461]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置11包含疏水残基的犬科动物λcdr3区。
[0462]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置11包含既不能够提供氢键又不能够接受氢键的残基的犬科动物λcdr3区。
[0463]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置11包含中等大小的残基的犬科动物λcdr3区。
[0464]
在另一个方面中，包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置11包含脂肪族残基的犬科动物λcdr3区。
[0465]
在一个方面中，在位置11的残基是上文列出的优选类别中的一个。在另一个方面中，在位置11的残基是上文列出的多于一个优选类别，诸如2个、3个、4个、5个或6个优选类别。
[0466]
在优选的方面，
[0467]
包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置4包含天冬氨酸(d)残基的犬科动物λcdr3区。
[0468]
包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置7包含亮氨酸(l)残基的犬科动物λcdr3区。
[0469]
包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置1包含丝氨酸(s)的犬科动物λcdr3区。
[0470]
包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置6包含丝氨酸(s)的犬科动物λcdr3区。
[0471]
包含犬科动物λdna的啮齿动物或啮齿动物细胞编码和/或表达在位置11包含缬氨酸(v)的犬科动物λcdr3区。
[0472]
在一个方面中，本发明的啮齿动物基因组仅包含单个或仅两个犬科动物λ轻链可变区基因区段，所述区段重排以表达单个重排的伴侣动物轻链可变区基因或分别表达两条这样的轻链，其中插入基因组中的犬科动物λdna编码和/或表达包含cdr3的抗体链，该抗体链在λcdr3区中具有一个或更多个上文提及的优选的氨基酸，诸如2个、3个、4个或全部5个优选的氨基酸。
[0473]
在一个方面中，cdr3不是以下中的任何一个：
[0474]
qsydddlsmnv
[0475]
gadytisgqygsv
[0476]
stwdsnlrtiv
[0477]
tawdsslnayv
[0478]
qsdftldaav
[0479]
qsydgnldggv
[0480]
ssydntligiv
[0481]
sswdnsldagv
[0482]
avydsrldvgv
[0483]
qsfdssldaai
[0484]
lvwdssaiwv
[0485]
stwdnsltyv
[0486]
qvwddsgnv
[0487]
ssfdktlngli
[0488]
qsfdstlgvhvv
[0489]
stwddslsvw
[0490]
ngasfetsfnav
[0491]
在小鼠中表达的犬科动物λ库
[0492]
在另一个方面中，我们已经鉴定，当从小鼠基因组表达时，某些氨基酸在犬科动物λ抗体链中的cdr3中表达。
[0493]
在另一个方面中，啮齿动物或啮齿动物细胞包含编码和/或表达犬科动物λcdr3区的犬科动物λdna，该λcdr3区包含以下中的一个或更多个或全部：
[0494]
在位置7或9的a；
[0495]
在位置4的d；
[0496]
在位置1的q；
[0497]
在位置8的k；
[0498]
在位置5和/或6的s；
[0499]
在位置2和/或11的v；和
[0500]
在位置3的w。
[0501]
小鼠中犬科动物λcdr3表达的数据如下：
[0502][0503]
在一个方面中，本发明的啮齿动物基因组仅包含单个或仅两个犬科动物λ轻链可变区基因区段，该区段重排以表达单个重排的伴侣动物轻链可变区基因或分别表达两条这样的轻链，其中插入基因组中的犬科动物λdna编码和/或表达包含cdr3的抗体链，该抗体链在λcdr3区具有一个或更多个上文提及的优选的氨基酸，诸如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个上文提及的优选的氨基酸。
[0504]
还优选的是啮齿动物和啮齿动物细胞，所述啮齿动物和啮齿动物细胞的基因组包含在优选的确定位置具有大于90％代表性的氨基酸，并且更优选那些具有大于95％代表性的氨基酸，诸如v11。
[0505]
还优选的是啮齿动物和啮齿动物细胞，所述啮齿动物和啮齿动物细胞的基因组包含如上文的在犬中观察到的犬科动物抗体群体中和在小鼠中的犬科动物抗体群体中的优选的氨基酸，诸如在位置6的丝氨酸。
[0506]
关于犬科动物λ轻链，本发明涉及以下中的任一项：
[0507]
犬科动物λ轻链或包含这样的链的抗体；
[0508]
包含这样的链或抗体的药物组合物；
[0509]
活性抗体片段或衍生物，诸如fab或结构域抗体或双特异性抗体，包括本文描述的任何片段或衍生物类型，
[0510]
其中犬科动物λ轻链(或抗体或药物组合物或抗体片段或衍生物)的cdr3包含上文关于啮齿动物或啮齿动物细胞列出的任何优选的氨基酸或类别。本发明还涉及这些中的任何一种在医学中的用途，诸如治疗或预防犬的疾病中的用途，并且涉及上述中的任何一种在制备用于预防或治疗犬的疾病的药物中的用途。在另一个方面中，cdr3在2个、3个、4个或5个优选的位置(考虑到天然犬科动物库偏好)，或在2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个优选的氨基酸位置(当考虑到所观察到的犬科动物cdr3在小鼠中表达的偏好时)包含优选的氨基酸类别或优选的氨基酸。
[0511]
在一个方面中，cdr3在2个优选的位置包含优选的氨基酸或氨基酸类别。在一个方面中，cdr3在3个或更多个优选的位置包含优选的氨基酸或氨基酸类别。
[0512]
在一个方面中，每个cdr3氨基酸位置包含该氨基酸位置的至少2个或至少3个或更多个优选类别中的氨基酸。
[0513]
应当理解，在这些犬科动物λcdr3位置观察到的氨基酸类别和/或特定氨基酸二者的极高度保守性表明了对具有这些序列的抗体的生物偏好，因此与适于用作犬的药物的犬科动物λ轻链的产生和使用高度相关。这是先前未理解的。
[0514]
特别地，迄今为止所有的犬科动物药物具有κ轻链。本发明允许将犬科动物λ轻链、具有这样的轻链的抗体作为药物提供。
[0515]
在另一个方面中，本发明涉及表达抗体的啮齿动物或啮齿动物细胞，诸如b细胞或任何表达细胞或细胞系，该抗体包含κ轻链或λ轻链或二者，具有任何上文优选的cdr3序列或上文提及的优选的cdr3氨基酸。轻链(κ或λ或二者)可以是完全犬科动物抗体κ或λ轻链的形式，或者是嵌合κ或λ轻链的形式，具有重排的犬科动物可变区和来自宿主啮齿动物细胞的啮齿动物恒定区。完全犬科动物κ或λ轻链可以与嵌合(犬科动物可变区、啮齿动物恒定区)重链缔和。嵌合κ或λ轻链可以与嵌合犬科动物重链或具有犬科动物可变区和犬科动物恒定区二者的完全犬科动物重链缔和。
[0516]
在另一个方面中，通过本文描述的任何方法可获得或获得的抗体包含具有如上文描述的任何优选氨基酸或氨基酸序列的轻链cdr3。
[0517]
本文的cdr3区域编号通过参考imgt系统来定义，如http://www.imgt.org/imgtscientificchart/numbering/imgtigvlsuperfamily.html中所公开的。
[0518]
本发明的另外方面包括：
[0519]
一种具有完全犬科动物重链和犬科动物轻链的犬科动物抗体，
[0520]
(i)其中轻链是具有以下之一的λ轻链：
[0521]
在位置4包含天冬氨酸(d)的λcdr3区；
[0522]
在位置7包含亮氨酸(l)的λcdr3区；
[0523]
在位置1包含丝氨酸(s)的λcdr3区；
[0524]
在位置6包含丝氨酸(s)的λcdr3区；
[0525]
在位置11包含缬氨酸(v)的λcdr3区；
[0526]
或者其中λ轻链在优选的位置包含2个、3个、4个或5个上文优选的氨基酸；
[0527]
或者其中λ轻链在上文优选的位置包含具有多于一个类别的性质的氨基酸；
[0528]
或者
[0529]
(ii)其中轻链是具有以下之一的λ轻链：
[0530]
在位置7或9包含a的λcdr3区；
[0531]
在位置4包含d的λcdr3区；
[0532]
在位置8包含k的λcdr3区；
[0533]
在位置5和/或6包含s的λcdr3区；
[0534]
在位置2和/或11包含v的λcdr3区；和
[0535]
在位置3包含w的λcdr3区
[0536]
或者其中λ轻链在优选的位置包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个上文优选的氨基酸；
[0537]
特别地，其中在犬科动物λ的位置6的氨基酸是s
[0538]
或者
[0539]
(iii)其中轻链是具有以下之一的κ轻链：
[0540]
在位置7包含脯氨酸(p)的犬科动物κcdr3区；
[0541]
在位置2包含谷氨酰胺(q)的犬科动物κcdr3区；
[0542]
在位置9包含苏氨酸(t)的犬科动物κcdr3区；
[0543]
或者其中κ轻链在优选的位置包含例如2个或3个上文优选的氨基酸；
[0544]
或者其中轻链是具有选自qqslhfppt、qqslhlppt或gqgthsptt的cdr3的κ轻链，
[0545]
任选地，其中抗体不包含以下κcdr3序列中的任一种
[0546]
qhyfhyprt
[0547]
qndysypyt
[0548]
qqsnkdplt
[0549]
qqsnkdplt
[0550]
qqsreypwt
[0551]
qqyynyplt
[0552]
sqsthvpwt
[0553]
wqgthfpqt
[0554]
gqgmeipwt
[0555]
qqslhfppt
[0556]
gqntqlplt
[0557]
gqrvrspwt
[0558]
gqviqdpwt
[0559]
gqglqaplt
[0560]
gqathyple
[0561]
gqgiqnpft
[0562]
gqgtqfpft
[0563]
gqgtqfpft
[0564]
ghgkeapyt
[0565]
gqalqfplt
[0566]
ghaigfplt
[0567]
gqntqfplt
[0568]
gqgvqgpwt
[0569]
gqitqdpft
[0570]
gqgiqgpyt
[0571]
gqatqtppt
[0572]
gqtvqfplt
[0573]
gqgtlnpwt
[0574]
gqgllappt
[0575]
gqatqfpst
[0576]
gqdtqfplt
[0577]
gqgiqdpt
[0578]
gqalqfpyt
[0579]
ghglqtpyt
[0580]
gqgtqppyt
[0581]
gqgsrvplt
[0582]
ghgtqipys
[0583]
gqgtqfpyt
[0584]
gqgiqipyt
[0585]
gqgsedppt
[0586]
gqgvqdpft
[0587]
fcqgshvpft
[0588]
qhhfgtpft
[0589]
fesnylgt
[0590]
fogahvpft
[0591]
gqylvypft
[0592]
此外，本发明涉及：
[0593]
一种药物组合物，所述药物组合物包含任何所述犬科动物抗体，所述抗体适当地与药物稀释剂、载体或赋形剂组合。
[0594]
本文公开的犬科动物抗体或药物组合物，用于医学，特别是用于治疗或预防犬的疾病，并且在一个方面中，其中犬不是拳师犬。
[0595]
本文公开的犬科动物抗体或药物组合物在制备用于治疗或预防犬的疾病的药物中的用途。
[0596]
一种治疗或预防犬的疾病的方法，该方法包括向有相应需要的犬递送本文描述的包含λ轻链、优选地包含λcdr3区的抗体。
[0597]
我们已经令人惊讶地确定，上文优选的cdr3氨基酸和cdr3序列在犬科动物抗体的群体中具有极高的代表性。这种对某些氨基酸残基的极强偏好是不可预测的。
[0598]
在一个方面中，抗体不包含以下λcdr3序列中的任一种
[0599]
qsydddlsmnv
[0600]
gadytisgqygsv
[0601]
stwdsnlrtiv
[0602]
tawdsslnayv
[0603]
qsdftldaav
[0604]
qsydgnldggv
[0605]
ssydntligiv
[0606]
sswdnsldagv
[0607]
avydsrldvgv
[0608]
qsfdssldaai
[0609]
lvwdssaiwv
[0610]
stwdnsltyv
[0611]
qvwddsgnv
[0612]
ssfdktlngli
[0613]
qsfdstlgvhvv
[0614]
stwddslsvw
[0615]
ngasfetsfnav
[0616]
优选的方法包括获得完全伴侣动物抗体诸如完全犬科动物抗体的方法，该方法包括使用本文描述的任何方法表达包含至少一个伴侣动物可变区的抗体，并且作为最后一步，用可接受的药物赋形剂配制完全伴侣动物抗体以形成药物组合物，然后任选地包装该抗体。本发明还涉及该抗体或组合物在合适的哺乳动物诸如同源伴侣动物中的用途。
[0617]
本文提及的抗体也可以指本文公开的抗体链或任何生物活性抗体片段。
[0618]
例如，本文提及的“犬科动物抗体”包括含有天然存在的犬科动物恒定区的氨基酸序列或其具有一种或更多种效应物功能的功能部分的抗体，所述恒定区或其功能部分与抗体可变区的氨基酸序列相连，所述抗体可变区可以在犬中天然表达，或者可以在插入啮齿动物诸如小鼠基因组中后通过犬科动物vdj或vj区基因的重组来表达。应当理解，本发明的犬科动物抗体因此是可从犬科动物v、(d)和j区基因的重组获得的抗体，但不对抗体的来源作出限制。
[0619]
本发明的某些优选实施方案在以下陈述中反映：
[0620]
1.一种啮齿动物或啮齿动物细胞，所述啮齿动物或啮齿动物细胞具有包含以下的基因组：
[0621]
i)一个或更多个伴侣动物igh v区基因、一个或更多个伴侣动物d区基因和一个或更多个伴侣动物j区基因；和
[0622]
(ii)任选地一个或更多个伴侣动物iglκv区基因和一个或更多个伴侣动物iglκj区基因；和/或一个或更多个伴侣动物iglλv区基因和一个或更多个伴侣动物iglλj区基因，
[0623]
其中所述啮齿动物或啮齿动物细胞能够表达形成抗体链的一个或更多个伴侣动物可变区基因
[0624]
并且其中所述伴侣动物的物种不是啮齿动物。
[0625]
2.一种啮齿动物或啮齿动物细胞，所述啮齿动物或啮齿动物细胞具有包含以下的基因组：
[0626]
i)一个或更多个伴侣动物iglκv区基因和一个或更多个伴侣动物iglκj区基因；和/或一个或更多个伴侣动物iglλv区基因和一个或更多个伴侣动物iglλj区基因，以及
[0627]
ii)任选地一个或更多个伴侣动物igh v区基因、一个或更多个伴侣动物或宿主d区基因和一个或更多个伴侣动物或宿主j区基因
[0628]
其中所述啮齿动物或啮齿动物细胞能够表达形成抗体链的一个或更多个伴侣动物可变区基因
[0629]
并且其中所述伴侣动物的物种不是啮齿动物。
[0630]
3.根据陈述1或2所述的啮齿动物或啮齿动物细胞，其中插入的伴侣动物v区基因、d区基因或j区基因中的一个或更多个与来自相同的伴侣动物的调控序列缔合。
[0631]
4.根据陈述1
‑
3所述的啮齿动物或啮齿动物细胞，其中所述啮齿动物基因组包含来自重链和至少一条轻链二者的伴侣动物基因。
[0632]
5.根据任一前述陈述所述的啮齿动物或啮齿动物细胞，所述啮齿动物或啮齿动物细胞包含至少4个、5个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个或至少80个伴侣动物
igh v区基因，任选地其中所述v区基因是犬科动物的。
[0633]
6.根据任一前述陈述所述的啮齿动物或啮齿动物细胞，所述啮齿动物或啮齿动物细胞包含至少4个、5个、10个、15个、16个、17个、18个或19个伴侣动物iglκv区基因，任选地其中所述v区基因是犬科动物的。
[0634]
7.根据任一前述陈述所述的啮齿动物或啮齿动物细胞，所述啮齿动物或啮齿动物细胞包含至少5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个或至少160个伴侣动物iglλv区基因，任选地其中所述v区基因是犬科动物的。
[0635]
8.根据任一前述陈述所述的啮齿动物或啮齿动物细胞，其中所述一个或更多个伴侣动物基因位于所述基因组中啮齿动物恒定区的上游，合适地对于插入的伴侣动物重链可变区基因在重链恒定区的上游，和合适地对于插入的伴侣动物轻链可变区基因在轻链恒定区的上游，使得所述啮齿动物或啮齿动物细胞能够产生由所述插入的可变区基因和宿主恒定区的表达产生的嵌合抗体链。
[0636]
9.根据陈述1
‑
7中任一项所述的啮齿动物或啮齿动物细胞，所述啮齿动物或啮齿动物细胞具有这样的基因组，所述基因组中所述一个或更多个伴侣动物基因位于所述基因组中与来自相同的伴侣动物的恒定区呈功能排列，使得所述啮齿动物能够产生由所述插入的伴侣动物vdj区基因或vj区基因和所述伴侣动物恒定区的表达产生的抗体链，任选地，其中所述伴侣动物基因是与来自相同的伴侣动物的所述λ恒定区呈功能排列的λ轻链v基因和j基因。
[0637]
10.根据任一前述陈述所述的啮齿动物或啮齿动物细胞，所述啮齿动物或啮齿动物细胞包含位于啮齿动物细胞κ基因座处的，诸如啮齿动物κ恒定区的下游的，一个或更多个伴侣动物iglλv区基因、一个或更多个伴侣动物iglλj区基因和一个或更多个伴侣动物λ恒定区基因。
[0638]
11.根据任一前述陈述所述的啮齿动物或啮齿动物细胞，所述啮齿动物或啮齿动物细胞包含犬科动物κ可变区基因，其中啮齿动物基因组中的所有所述犬科动物κ可变区基因位于与所述可变区基因一起表达的恒定区的上游，任选地位于宿主κ恒定区的上游。
[0639]
12.根据任一前述陈述所述的啮齿动物或啮齿动物细胞，其中所有的伴侣基因区段对应于来自canfam 3.1的犬科动物参考等位基因，或其中所述伴侣基因区段包含来自以下基因区段中的一个或更多个的非参考等位基因：igkv2
‑
s13、iglv 1
‑
57、iglv 1
‑
68、iglv 1
‑
72、iglv 1
‑
88、iglv 1
‑
96、iglv 8
‑
60、iglv 8
‑
90和iglv 8
‑
120。
[0640]
13.根据任一前述陈述所述的啮齿动物或啮齿动物细胞，其中所述啮齿动物是小鼠并且所述伴侣动物是犬，或猫或马，优选地是犬。
[0641]
14.一种用于产生根据任一前述陈述所述的啮齿动物或啮齿动物细胞的方法，所述方法包括将一个或更多个伴侣动物igh v区基因、一个或更多个伴侣动物igh d区基因和一个或更多个伴侣动物igh j区基因插入到啮齿动物细胞基因组中，其中所述啮齿动物或啮齿动物细胞能够表达与恒定区组合以形成抗体链的一个或更多个伴侣动物可变区基因。
[0642]
15.根据陈述14所述的用于产生啮齿动物或啮齿动物细胞的方法，所述方法包括将一个或更多个伴侣动物igl v区基因和一个或更多个伴侣动物igl j区基因插入到啮齿动物细胞基因组中，其中所述啮齿动物或啮齿动物细胞能够表达与恒定区组合以形成抗体
链的一个或更多个伴侣动物可变区基因。
[0643]
16.一种用于产生对期望的抗原特异性的抗体链的方法，所述方法包括用所述期望的抗原对根据陈述1
‑
13中任一项所述的啮齿动物进行免疫，并且回收单独的所述抗体链或作为完整抗体的一部分的所述抗体链，或回收产生单独的所述抗体链或作为完整抗体的一部分的所述抗体链的细胞。
[0644]
17.一种用于产生对期望的抗原特异性并且来源于单个物种的伴侣动物的抗体链或抗体的方法，所述方法包括对根据陈述1
‑
13中任一项所述的包含伴侣基因的啮齿动物进行免疫，并且然后用来自相同的伴侣动物的伴侣动物恒定区替换所述抗体链的啮齿动物恒定区，该替换合适地通过工程化编码所述抗体的核酸进行。
[0645]
18.一种用于产生抗体链或其部分的方法，所述抗体链具有伴侣动物可变区，所述方法包括在细胞中表达编码所述抗体链或其部分的dna，
[0646]
其中编码所述抗体链的可变区的dna的序列从用抗原对根据陈述1
‑
13中任一项所述的啮齿动物进行免疫使得抗体链被产生获得，或通过用抗原对根据陈述1
‑
13中任一项所述的啮齿动物进行免疫使得抗体链被产生能够获得，
[0647]
任选地，所述方法包括以下随后步骤：
[0648]
(i)纯化和/或分离抗原受体链，和
[0649]
(ii)任选地然后将抗原受体链配制成适用于施用到伴侣动物中的药学上可接受的制剂。
[0650]
19.一种抗体或抗体链或其部分，或编码抗体链或其部分的dna，所述抗体或抗体链或其部分，或编码抗体链或其部分的dna从根据陈述1
‑
13中任一项所述的啮齿动物或啮齿动物细胞或从根据陈述16
‑
18中任一项所述的方法已经获得，或能够获得。
[0651]
20.一种抗体或抗体链或其部分，所述抗体或抗体链或其部分从陈述1
‑
13中任一项所述的啮齿动物或细胞中获得或能够获得，用于治疗或预防有相应需要的伴侣动物的疾病。
[0652]
21.一种治疗伴侣动物的方法，所述方法包括将抗体或抗体链或其部分递送到有相应需要的伴侣动物，所述抗体从根据陈述1
‑
13中任一项所述的啮齿动物或细胞或从根据陈述16
‑
18中任一项所述的方法获得或能够获得。
[0653]
22.一种在啮齿动物或啮齿动物细胞中用同源或种间同源伴侣动物基因座和调控序列全部或部分替换内源免疫球蛋白可变区基因座的方法，所述方法包括：
[0654]
i)获得克隆的基因组片段或合成序列，所述克隆的基因组片段或合成序列全部或部分包含所述同源或种间同源伴侣动物基因座和调控序列；
[0655]
ii)使用同源重组以遗传修饰(i)的所述克隆的基因组片段，以产生大的靶向载体用于在所述啮齿动物或啮齿动物细胞中使用；和
[0656]
iii)将(ii)的所述载体引入到所述啮齿动物或啮齿动物细胞中，以全部或部分替换所述内源免疫球蛋白可变基因座。
[0657]
将理解的是，本文描述的特定实施方案通过说明而非作为本发明的限制的方式示出。本发明的主要特征可以在各种实施方案中被采用而不偏离本发明的范围。本领域技术人员使用不超过常规研究将认识到，或能够确定本文描述的具体程序的许多等同物。这样的等同物被认为在本发明的范围内，并且由权利要求书涵盖。在本说明书中提及的所有出
版物和专利申请指示本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每个单独出版物或专利申请被具体和单独指示通过引用并入的相同程度。当连同权利要求书和/或本说明书中的术语“包含”使用时，使用词"一个(a)"或"一个(an)"可以意指“一个(one)”，但它还与“一个或更多个”、“至少一个”、和“一个或多于一个”的含义一致。在权利要求中使用的术语“或”用于意指“和/或”，除非明确指示为仅指可选物或可选物是相互排斥的，虽然本公开内容支持仅指可选物和“和/或”的定义。在整个本技术中，术语“约”被用于指示，值包括对于设备、确定值所采用的方法的固有误差变化，或在研究受试者中存在的变化。
[0658]
如本说明书和权利要求书中使用的，词“包含(comprising)”(和包含(comprising)的任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)，“具有(having)”(和具有(having)的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(和包括(including)的任何形式，诸如“包括(include)”和包括“(include)”)，或“包含(containing)”(和“包含(containing)”的任何形式，诸如“包含(contains)”和“包含(contain)”)是包含性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。
[0659]
如本文使用的术语“或其组合”是指在术语之前列出的项目的所有排列和组合。例如，“a、b、c或其组合”意图于包括以下至少一种：a、b、c、ab、ac、bc或abc，并且如果顺序在特定上下文中是重要的，则还包括ba、ca、cb、cba、bca、acb、bac或cab。继续这个实例，明确包括了包含一个或更多个项目或术语的重复的组合，诸如bb、aaa、abab、bbc、aaabcccc、cbbaaa、cababb等。本领域技术人员将理解，通常不存在对任何组合中的项目或术语的数目的限制，除非从上下文以其他方式明显的。
[0660]
可以与本公开内容的任何其他部分组合来阅读本公开内容的任何部分，除非从上下文以其他方式明显的。
[0661]
本文公开并且要求保护的所有组合物和/或方法，可以根据本公开内容作出并且执行，无需过度实验。虽然本发明的组合物和方法已经关于优选的实施方案被描述，对本领域技术人员将明显的是，变化形式可以被应用到本文描述的组合物和/或方法以及方法的步骤中或步骤的顺序中，而不偏离本发明的概念、精神和范围。对于本领域技术人员明显的所有这样的相似替代和修改被认为是在本发明的精神、范围和概念内，如由所附权利要求限定的。
[0662]
在以下非限制性实施例中更详细地描述了本发明。
实施例
[0663]
实施例1
‑
犬科动物ig基因座的注释
[0664]
犬是用于人类疾病的优良模型，例如，犬科动物淋巴瘤的治疗通常预测人类对该治疗的响应。然而，对它们的抗原
‑
受体(ar)基因座的不完整描述已经限制了它们的使用。本工作推进了犬科动物ar基因座的注释，开发了询问它们的进化压力的方法，并且研究了基因座的品种特异性特征。使用生物信息学方法与无偏倚rna
‑
seq(unbiased rna
‑
seq)一起完成了犬科动物ar基因的注释，并且使用这些序列查询了来自19个品种的107个全基因组序列。使用现有方法和新方法的组合来分析跨越这些基因的多样性和突变率。跨越ar基
因座的～550个基因区段(其中326个是新注释的)鉴定出>5,500个新等位基因，提供(yielding)对ar进化的见解，并确认了犬和人类之间的保守性大于小鼠与犬和人类任一种之间的保守性。本工作使我们对犬中的ar的遗传学和表达的理解达到了与小鼠和人类的相同的高标准，使它成为已经注释了所有ar基因座的仅有的三个中的第三个物种。大量基因组序列用作用于将来研究的参考，并且已经允许从已经塑造出(shaped)这些基因座的压力得出统计上有力的结论。
[0665]
1.简介
[0666]
在本研究中，对犬科动物igk和igl进行注释，并且更新了igh基因座(图1
‑
图3)。使用来自多于一百只犬的全基因组序列数据来鉴定五千个非参考等位基因，并且这些数据阐释了已经塑造出这些基因座的进化压力。跨物种比较已经提供了进一步的见解，并且将犬确认为一种更可靠的免疫模型。
[0667]
2.材料及方法
[0668]
2.1.1生物信息学注释
[0669]
遵循与das和同事相似的方法并且使用与olivieri和同事的算法等同的原理对基因座进行初始注释
1,2
。简而言之，使用人类和小鼠序列来询问犬科动物参考基因组(canfam3.1)。在鉴定出区后，对它们进行局部搜索ar基因。初始使用小鼠和人类ar基因和rss共有序列(consensi)，但是随着更多的犬科动物基因被鉴定出，这些被用来代替它们。然后基于rna
‑
seq数据的比对，验证和添加注释。
[0670]
2.1.2犬
[0671]
从26只犬取得外周血样品。样品是来自在剑桥大学兽医医院(the veterinary hospital of the university of cambridge)观察的患者的未使用的临床过量的兽医授权的血液抽取物。本研究得到了剑桥大学兽医学院伦理委员会(the ethics committee of the veterinary school of the university of cambridge)的事先批准。
[0672]
2.1.3测序
[0673]
遵循制造商的说明使用ficoll
‑
paque(ge healthcare)从外周血分离单核细胞。由wellcome trust sanger研究所的核心测序团队(core sequencing team)使用polya
‑
下拉(polya
‑
pulldown)将细胞处理成mrna，剪切，并且使用250bp成对末端读段(reads)在hiseq 2500仪器(illumina)上测序。
[0674]
2.1.4基因命名
[0675]
ar基因被分成家族，并且使用与bao和同事相同的标准被分配为有功能的、假基因或orf3。基于与人类家族的同源性分配家族编号，并且在不能够找到明显匹配的情况下给出一个新编号。所有的基因名称的分配与imgt的命名系统保持一致4。
[0676]
2.1.5非参考等位基因
[0677]
映射到来自107个犬科动物全基因组序列的ar基因座的变体调用文件由来自明尼苏达大学(the university of minnesota)的steven friedenberg善意地提供。
[0678]
2.1.6物种间和物种内基因座比对
[0679]
使用repeatmasker掩蔽(mask)序列并且使用pipmaker生成比对图
5,6
。
[0680]
2.1.7系统发育分析
[0681]
使用clustal omega比对序列，并且使用interactive tree of life可视化输出
树
7,8
。
[0682]
3.结果
[0683]
3.1.1基因编号
[0684]
在先前注释的基因座内，鉴定出三个新的ighj基因。鉴定出跨越7个基因家族的162个iglv基因，其中iglv1是最大的，具有86个成员。与其他igl基因座保持一致，发现j和c基因是成对的，总计为9对。鉴定出19个igkv基因，其中14个是igkv2，另外还有5个igkj和1个igkc基因。
[0685]
3.1.2非参考等位基因
[0686]
对来自19个品种的107只犬的全基因组序列(全部与目前的参考版本(canfam3.1)比对)询问新ar等位基因，并且鉴定出跨越三个基因座的4,074个ar等位基因。关于等位基因分布，在68,908个等位基因中发现参考等位基因被调用53,311次(77％)。在等位基因分布中没有鉴定出显著品种特异性。
[0687]
对所有新等位基因进行有功能的、假基因或orf的分配，并且反过来与参考等位基因比较。大多数(72.8％)的新等位基因具有与参考等位基因相同的功能。将新等位基因的功能作为在选择下的一种，存在比“获得”(3.4％)(其中新等位基因是有功能的)等位基因更多的“损失”(23.8％)等位基因(即新等位基因是假基因)。这并不意外，因为损失功能的方式比获得它的方式多许多，并且因此更可能的是突变将导致这种变化的方向。从有功能的变化为orf被分类为损失，并且从假(pseudo)变化为orf被分类为获得。
[0688]
跨越所有的样品和基因座，非参考v等位基因被调用13,129次。有趣地，igkv2
‑
s13和8个iglv基因仅作为非参考等位基因被发现，包括在拳师犬样品中的。这可能是参考基因组中的一个误差，但也可能是参考犬碰巧携带了该数据集中没有出现的9种罕见的等位基因。以非参考等位基因而言，如果不存在选择压力，那么数据集中的变化类型的分布将与它们在等位基因自身中的分布相同。例如，3.4％的等位基因是“获得”，因此人们将预期获得等位基因在数据集中被发现446次。
[0689]
然而，发现损失变化通常低于预期的，并且没有发现比预期更频繁的变化和获得(图7)。更进一步地，跨越品种的差异非常小，进一步加重了对具有有限品种依赖性的ar基因座的选择压力。实施了z检验，并且总体和预期的平均值之间的差异高度显著，范围从p＝2.34
×
10
‑
25
下降到p＝0(用于计算值的软件无法展示低于1
×
10
‑
250
的p值)。
[0690]
3.1.3基因座结构
[0691]
犬科动物igh基因座正好位于8号染色体反义链上的亚端粒(sub
‑
telomeric)。除了单孔类动物(monotremes)和有袋动物之外，在所有的哺乳动物观察到该端粒位置1。然而，轻链基因座在人类、小鼠和犬之间未显示出染色体位置的强保守性。
[0692]
与人类和小鼠igh基因座一样，犬科动物igh基因座具有以与恒定区相同的有义方向转录的所有功能基因区段，而一种假基因在反向转录方向上(图1)。igh基因座的结构与由bao和同事公布的相似3。然而，已经鉴定出三个新的ighj基因，并且虽然绝对比率和数目确实是匹配的，但在v基因的位置和预期的功能方面存在小差异。差异可能是由于使用了不同的参考基因组版本，而本注释使用了最新的公开可得的版本(canfam3.1)。
[0693]
犬科动物igk基因座既小(～400kbp)，又具有不寻常的结构(图2)。它在j和c基因的上游具有11个v基因，其中8个c
‑
远端的v基因全部有功能，来自igkv2家族，并且在与j和c
基因在相同的转录方向上，不同于三个c
‑
近端的基因。然而，它在其他基因的下游也具有8个v基因，并且相对于其他基因大部分是倒位的。这让人想起马科动物igl基因座，其中发现方向对v基因使用不具有影响。
[0694]
倒位和区块复制(block duplication)似乎是轻链基因座特别是igk基因座的特征。不仅人类、猪、小鼠、马和犬的igk基因座全部包含具有与c基因转录方向相反的v基因，而且犬、人类和猪基因座已经经历整个区块的倒位复制
10,11
。在猪和人类基因座中，两个区块中的基因差异足够小，使得一些或所有以与另一个区块中的它们的对相同的名称知悉
10,12
。
[0695]
虽然人类、猪和小鼠iglv基因维持它们沿基因座的转录方向，但犬科动物iglv不维持
13
。大的(2.6mbp)犬科动物igl基因座包含相对于j
‑
c簇倒位的许多v基因(图3)。倒位似乎处于一定程度的位置特异性选择压力下，而116个最接近c端的iglv基因中仅3种处于与j
‑
c基因相反的转录方向，但在最后的46个中有26个倒位的v基因。这种增加部分归因于已经发生的区块复制，其成员iglv1和iglv8的延伸序列(stretch)以重复区块内位置保守的模式显示出非常高水平的序列同一性。
[0696]
关于更广泛的趋势，犬科动物ig基因座与其他已公布的基因座保持一致。在先前注释的ighv中，发现基因与假基因比率大致为1:1，这与犬科动物igh基因座一致1。然而，两个轻链基因座看起来更接近5:1，可能反映了对重链和轻链之间的假基因的不同耐受性。此外，已经发现，在迄今为止研究的大多数物种中，基因数目与轻链中偏倚的(biased)链使用相关
14,15
。例如，小鼠igl基因座仅包含9个功能基因，这反映了它在仅5％的表达的抗体中使用
14
。另一方面，根据每一个物种中两个轻链库的相对大小，犬科动物库显示出相似的偏倚，而91％被报道为使用igk链
15
。
[0697]
3.1.4物种间和物种内基因座比对
[0698]
将基因组的区域与它们自身并且与来自其他物种的等同区域比对是已确定的绘制进化见解的方法，并且pipmaker是用于该目的的常用工具
16,17,6,18
。使用犬科动物igk、igl和tra/d基因座针对它们自身并且针对它们各自的小鼠和人类基因座实施比对。
[0699]
在igk自比对中，三种比较值得注意：上游和下游区块的自比对(图8)，以及它们彼此之间的比对(图8)。在同一性百分比图(pip)内，线指示同一性的区域，并且因此与其自身比对的序列将总是具有沿对角线延伸的实线。主对角线以外的实线指示出可能的复制事件，而空位(gap)代表由于复制积累的插入/缺失(indels)和其他突变。
[0700]
上游自比对中的多个间断(broken)对角线是被局部拷贝多次的区块的特征，在这种情况下，单个v及其侧翼序列，与犬科动物tcrb基因座中的三基因盒的区块复制相似
16
。在下游区块的自对比中，线是较短的并且有时是垂直的，这意味着局部倒位同源性。最后，上游与下游区块的同源性比较揭示了同源性程度良好，特别是c基因上游的igkv2
‑
s18和igkv
‑
s19与igkv2基因的同源性程度良好。这种模式在单个基因在c基因的上游复制多次的情况下将被观察到，然后以复刻人类igk和马科动物igl的方式发生区块倒位复制。然后除了已经较低趋异的igkv2
‑
s18和igkv
‑
s19基因之外，该下游区块可能处于降低的选择压力下，并且已经以更大的速率积累突变和局部倒位。这不是唯一可能的解释，但它确实符合提出的关于跨越其他物种和ar基因座的相似特征的解释。
[0701]
在对犬和人类igl基因座的比较中，有两件事是引人注目的：人类序列的中点附近
对角线几乎不间断，以及由在编码序列处或附近的大量的线表征的非常高度的同源性(图9a)。人类/犬pip中的对角线的进一步分析揭示了，它跨越了人类基因座包括非ar基因znf280a、znf280b和prame的区域(图9b)。这些基因的序列，以及它们周围的大部分区域，在犬和人类之间高度保守，意味着它们在犬至人类中可能具有相似的功能重要性。特异性比较显示出znf280b和prame基因在犬中可能有功能，但znf280a在该基因座处无法被可靠地鉴定(数据未示出)。进一步的研究鉴定出另一个非igl基因pcbp2，在znf280b附近。
[0702]
虽然所讨论的位置和基因不总是保守的，散布在ar基因座中的非ar基因是跨越物种的共有特征。例如，发现adam6基因在igh基因座中，在人类和小鼠的ighv和ighd基因之间，但人类直系同源物是无功能的。虽然在犬中尚未鉴定出直系同源物，但存在两种候选物。其中一种存在于在ighv3
‑
4和ighv3
‑
5之间，并且其中另一种完全在igh基因座的上游。鉴于对犬中的adam基因家族的研究有限，这个潜在的直系同源物尚未被添加到igh注释，但仍然是用于将来研究的候选物。此次在犬科动物igk或igl基因座中尚未鉴定出其他非ar基因。
[0703]
3.1.5等位基因分布
[0704]
使用犬作为模型生物体的一个决定性特征是，虽然存在高品种间异质性，但品种内同质性非常高，达到了估计品种形成已经占据了核苷酸多样性的35％损失的程度
19
。选择如此严格以至于最近的工作在某些品种中鉴定出22个长于一兆碱基的纯合性的区块，作者将其归因于育种者施加的选择压力
20
。这与人类中观察到的多样性形成对比。即使在地理上隔离的群体中，可归因于这种分离的变异是5％
‑
10％，而犬中多于四分之一的基因组变异可归因于品种而不是个体变异
21
。
[0705]
鉴于犬科动物基因组学的品种特异性的水平，非参考ar等位基因似乎没有遵循强品种特异性单体型(haplotype)或许是令人意外的。该样品中两个最具代表性的品种是拳师犬和标准贵宾犬(standard poodle)(分别为22只和20只犬)，并且它们遵循相似的模式，其中在两个品种中会发现相对频繁的小数目的非参考等位基因，并且在来自一个品种的一只犬的单条染色体上会发现罕见的等位基因。代表性较低的品种遵循相似的分布，并且鉴于单个代表性等位基因的数目，看起来非参考等位基因通常存在于杂合子中。
[0706]
更大的品种特异性群组(cohort)的大小可能揭示出在这个数据集中不明显的趋势是可能的，但目前看来，似乎塑造ar基因座的选择压力是品种无关的并且超过了品种自身的那些选择压力。可能的例外将是在进化瓶颈扩大了较不常见的等位基因流行的情况。例如，iglc1*01(参考等位基因)存在于测序的44条拳师犬染色体的19号染色体，以及6条玩具贵宾犬(toy poodle)染色体的一条上，但不存在于任何其他品种中。跨越所有品种的217个调用的等位基因的194个由另一个等位基因iglc1*02代表。虽然有可能玩具贵宾犬先前已经与拳师犬异型杂交，或存在测序错误且这事实上是拳师犬特异性等位基因，但仍然需要更大的数据集来以某种方式确定地回答这些问题的情况。
[0707]
考虑到非参考等位基因的分布，这些全部符合预期情况。没有观察到比预期的更频繁的变化，可能是由于所讨论的基因已经经受用于它们的当前状态的选择压力，并且因此偏离这一点是不利的。这可能是有效功能基因的损失，或自身反应性基因的再活化，在两种情况下，生物体的适合度被降低并且因此这将被淘汰。相似地，ar基因对生物体的适合度非常重要，并且它们的损失将以选择成本为代价。
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[0732]
实施例2
‑
嵌合ig基因座在鼠细胞中的构建
[0733]
通过bac插入修饰鼠es细胞的ig基因座，以将犬科动物重链dna引入到鼠igh基因座中，并且将犬科动物轻链免疫球蛋白dna引入到鼠iglκ和λ基因座中，如下：
[0734]
犬科动物igh插入
[0735]
通过bac插入将来自8号染色体的犬科动物dna插入到小鼠igh基因座中。插入的dna包含核苷酸72,988,807
‑
73,128,041，并且包含ighv4
‑
1至ighv3
‑
4，以及ighd1
‑
6和ighj1
‑
6。参见图1和图10。
[0736]
犬科动物iglλdna插入
[0737]
将来自26号染色体的犬科动物dna插入到小鼠16号染色体上的iglλ基因座中。插入的dna包含核苷酸27,509,860
‑
27,646,373，并且包含iglv3
‑
1至iglv4
‑
6，以及iglj1
‑
9和iglc1
‑
9。参见图2和图13。
[0738]
小鼠的坐标来自dec 2011grcm38/mm10组装且犬的坐标来自canfam3.1。
[0739]
将犬科动物dna的插入序列插入到位于小鼠基因组中在以下位置处的着落垫：
[0740]
犬科动物重链dna：插入小鼠12号染色体、紧邻位置114,666435的上游
[0741]
犬科动物κdna：插入小鼠6号染色体：紧邻位置70,674,7.55的上游
[0742]
犬科动物λdna：插入小鼠16号染色体：紧邻位置19,047,551的上游
[0743]
已经通过pcr分析确认了由嵌合重链基因座表达的嵌合转录物
‑
参见图15。
[0744]
方法如下：
[0745]
bac修饰
[0746]
来源于chori
‑
82文库的犬科动物bac直接来源于奥克兰儿童医院研究所的bac文库。
[0747]
在32℃在补充有12.5μg/ml氯霉素的luria
‑
bertani(lb)肉汤中或在lb
‑
琼脂上培养包含bac的所有细菌。通过将psim18质粒通过标准cacl2热激方案添加到细胞而赋予包含bac的细胞重组的能力，并且psim18的维持通过用75μg/ml潮霉素补充培养基来选择。
[0748]
将重组工程质粒诸如prmce38线性化并且使用gibson组装引入1kbp bac特异性同源臂。质粒包含下游重组工程所需的序列，诸如cre
‑
lox和piggbybac序列，以及用于bac
‑
工程或esc
‑
工程步骤的选择标志物。将最后的质粒限制性消化和凝胶纯化，以产生跨越bac特异性同源臂、待引入的重组工程序列和到bac的载体骨架的同源臂的片段。这些片段通过电穿孔插入到bac中，并且选择这些片段到bac中的成功整合。
[0749]
通过跨越插入的dna和内源的dna的连接的pcr验证抗性克隆的成功修饰。在对bac的两个末端进行修饰后，将bac dna纯化并且电穿孔到electromax
tm dh10b细胞(life technologies)中。选择已经损失潮霉素抗性并且因此是psim18阴性的克隆用于进一步分析。对来自这些克隆的dna进行pcr反应，以确保任一末端的正确修饰，以及待使用相关的bac插入的外显子的存在。通过该质量控制检查的克隆被用于胚胎干细胞(esc)工程。
[0750]
esc工程
[0751]
esc培养、电穿孔和药物选择的过程如由lee等人2014描述的。使用在每个免疫球蛋白基因座处已经包含srmce的着落垫的雄性小鼠ab2.1细胞，并且培养在m15培养基(敲除dmem
‑
补充有15％fbs、2mm谷氨酰胺和100μmβ
‑
巯基乙醇)中，并且维持在受辐照的snl76/7供给装置上。测试使用的所有细胞以确保它们不含污染物诸如支原体。
[0752]
每次转染使用1
×
107个细胞，并且使用bio
‑
rad电穿孔仪(genepulser xcell)以500μf和230v实施所有转染。对于bac的引入，每次转染使用10μg的bac dna和25μg的pcaggs
‑
icre。在24h后以3μg/ml嘌呤霉素选择细胞持续一周，并且挑选集落用于扩增和测试。使用跨越小鼠dna和bac dna的连接的引物用pcr验证bac成功掺入到着落垫中。
[0753]
然后使用pb酶对阳性克隆进行3’着落垫的切除。扩增克隆，并且每次电穿孔使用1
×
105个细胞与10μg piggybac转座酶质粒。在m15中恢复三天后，将细胞分开并且以低密度接种，然后第二天用fiau选择并且维持十天。通过连接pcr确认着落垫的3’末端的成功切除。然后，对阳性克隆进行与原始bac相同的外显子测试，以确保尚未发生损失。
[0754]
小鼠产生和分析
[0755]
将阳性es细胞克隆通过标准程序注射到来自c57bl/6tyrc
‑
brd小鼠系的胚泡中。将注射的胚泡转移到假妊娠雌性b6/cba f1受体的子宫。对于每个克隆注射大约40个胚泡。高百分比嵌合雄性与白化c57bl/6 tyrc
‑
brd雌性交配，以便可以基于皮毛色素(coat pigment)鉴定出来源于注射的esc的幼仔。用跨越小鼠dna和插入的dna的连接的引物对来源于esc克隆的小鼠进行pcr测试。
[0756]
为了验证插入的基因的表达，实施了基于逆转录的方法。收获来自确认具有bac存在的小鼠以及相关野生型对照的血液、脾脏和股骨。用pbs抽吸股骨以产生骨髓样品。这三
种组织类型使用nucleospin rna
‑
试剂盒(macherey
‑
nagel)转换成rna。使用针对与插入的bac相关的鼠恒定区的5’末端(例如针对包含igl bac的小鼠的iglc)、或针对mrna的polya尾的引物，使用superscript ii(thermo fisher)实施逆转录。然后使用嵌套(nested)在鼠c区的加条形码的引物(barcoded primer)、以及从来自犬科动物v基因的插入的前导区引发(priming)的那些引物扩增这些转录物。这确保了仅嵌合转录物将被扩增，而不是所有鼠免疫球蛋白转录物。这些pcr产物在凝胶上可视化，确认了嵌合转录物在具有bac的小鼠而非野生型小鼠中的存在。参见图15
‑
igh嵌合转录物的确认。前8条泳道对应于来自血液样品的rna，第二个8条对应于骨髓样品，并且最后8条对应于脾脏样品。给定的8条的前4条是c区引发的，第二个4条是从polya尾引发的。在4条内，前两条是对照，并且后两条是预期产生嵌合转录物的小鼠。
[0757]
所有动物实验和饲养在wellcome trust sanger研究所awerb(动物福利与伦理审查机构(animal welfare and ethics review body))的批准下进行。英国内政部(united kingdom home office)的批准根据项目许可证80/2432提供。
[0758]
实施例3
[0759]
图4、图5和图6显示了猫ig基因座的注释。注释的方法与实施例1中的2.1.1中概述的方法相同，不同的是猫基因组代替犬科动物基因组被询问，并且不使用rna
‑
seq数据。
[0760]
注释提供了允许使用如上文描述的方法在啮齿动物基因组中使用猫dna的工具和信息。
[0761]
实施例4
‑5’
快速扩增cdna末端(5’race)
[0762]
材料与方法
[0763]
血液样品
[0764]
基线样品：在明尼苏达大学兽医学院从十三只犬抽取外周血。在现场提取rna并且在干冰上运输。本研究得到了明尼苏达大学兽医学院伦理委员会(the ethics committee of the veterinary school of the university of minnesota)的事先批准。
[0765]
文库制备
[0766]
用c特异性引物混合池和模板转换型寡聚物(tso)合成第一链cdna。反应物包含：30μl体积中的666.7μm dntp(sigma aldrich)、666.7nm tso、333.3nm的每一种重链和轻链rt引物混合物、1
‑
5μg rna、2mm dtt(invitrogen)、3mm mgcl2、40单位的rnaseout(invitrogen)和100单位的superscript ii逆转录酶(invitrogen)。在42℃延伸60分钟，其后添加1μl的rna酶a/t1混合物(thermo scientific)，并且将反应物在37℃孵育15分钟。然后根据制造商的建议(使用初始反应物：ampure xp溶液比率为5:4)使用ampure xp系统(agencourt)纯化(cleaned up)反应物。将cdna重悬浮于21μl的pcr级水中，并且均匀地分到一个重链反应物和一个轻链反应物中。在25μl的体积中使用q5高保真聚合酶(new england biolabs)、10.5μl重悬浮的cdna以及各自为400nm的5’rfwa和重链或轻链pcr1混合物实施pcr。循环条件是：98℃30秒，然后20个循环的(98℃10秒、63℃30秒、72℃20秒)，随后是在72℃最后延伸2分钟。对pcr反应物进行与之前相同的ampure xp纯化，并且重悬浮于10.5μl的pcr级水中。这被补足到25μl pcr反应物，该25μl pcr反应物具有q5聚合酶，和各自为400nm的5’rrva和包含样品特异性索引六聚体的正向引物。pcr条件与之前相同，并且使用相同的ampure xp系统纯化产物并且将其重悬浮于20μl pcr级水中。然后将这些文库
定量并且汇集(pooled)在等摩尔混合物中，并且稀释到最终浓度为10nm，用于测序。
[0767]
测序和数据分析
[0768]
由wellcome trust sanger研究所的核心测序团队使用300bp成对末端读段(包括10％phix掺入(spike
‑
in))在miseq仪器(illumina)上对文库测序。然后对去多重化(de
‑
multiplexed)的数据进行质量过滤，然后提交到imgt v
‑
quest软件(使用“highv
‑
quest”软件并且选择“物种”＝“canis lupus家族(犬)”和“受体类型或基因座”＝“ig”)
14
。