一种籽粒发育相关蛋白TaGSR1及其在小麦株型育种中的应用的制作方法

一种籽粒发育相关蛋白tagsr1及其在小麦株型育种中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种籽粒发育相关蛋白及其应用，尤其涉及一种籽粒发育相关蛋白tagsr1或其编码基因在小麦株型育种中的应用；属于植物基因工程及分子育种技术领域。


背景技术：

2.小麦是世界第二大粮食作物，为人类提供20％的碳水化合物和23％的蛋白质。人类的食品安全问题面临着耕地面积的减少、全球气候变暖、人口持续增长以及环境污染加剧等问题，如何在有限的资源条件下提高小麦产量对粮食安全具有重要意义。小麦的“绿色革命”降低了小麦的株高，增加了小麦的抗倒伏能力，极大的增加了小麦的产量，也证明了作物的理想株型对产量的重要性。
3.油菜素内酯(br)作为植物第六大植物激素，在细胞伸长与分裂、叶片衰老、植物形态建成、植物抗逆等过程中起着非常重要的作用。由于br在植物生长和发育的过程中的广泛作用，其在农业生产上的应用也越来越受到重视。bri1(brassinosteroid
‑
insensitive 1)作为定位于细胞膜的br受体，结合br后，与共受体bak1(bri1
‑
associated receptor)相互磷酸化，起始下游信号转导，进而磷酸化bsk/cdg1激酶，磷酸化的bsk/cdg1进一步通过磷酸化而激活下游的bsu1(bri1
‑
suppressor 1)，bsu1作为一个磷酸酶，通过去磷酸化bin2(brassinosteroid
‑
insensitive 2)而使bin2这个br信号通路中的负调控因子失活，进而调控下游基因的表达。
4.申请人研究发现tagsr1(grain size regulator 1of triticum aestivum l.)是br信号下游的转录因子，具有调控小麦籽粒大小的功能，同时对小麦叶片夹角、株高等株型具有重要的调控作用。该调控功能为研究br在小麦中生长发育及产量育种提供了非常重要的信息。经检索，有关小麦tagsr1基因的编码序列及其编码的籽粒发育相关蛋白tagsr1，以及蛋白tagsr1在调控小麦株型育种中的应用未见报道。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种籽粒发育相关蛋白tagsr1或其编码基因在小麦株型育种中的应用。
6.本发明所述的籽粒发育相关蛋白，其特征在于：所述蛋白命名为蛋白tagsr1，来源于普通小麦，该蛋白为如下1)或2)所描述的蛋白：
7.1)由序列表中seq id no.1所示的氨基酸序列组成的蛋白；
8.2)将序列表中seq id no.1所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替代和/或缺失和/或增加且与籽粒发育相关的由seq id no.1衍生的蛋白。
9.进一步优选的实施方式是：所述蛋白tagsr1的氨基酸序列由203个氨基酸组成，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
10.本发明公开了一种上述籽粒发育相关蛋白tagsr1的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核酸序列为如下a)或b)或c)的核苷酸序列：
11.a)在序列表中seq id no.2所示的脱氧核糖核苷酸序列；
12.b)与seq id no.2所示的脱氧核糖核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述蛋白质的脱氧核糖核苷酸序列；
13.c)在严格条件下，与a)或b)限定的脱氧核糖核苷酸序列互补且编码所述蛋白质的核糖核苷酸序列。
14.进一步优选的实施方式是：所述编码基因由612个脱氧核糖核苷酸组成，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
15.本发明还公开了一种具有在小麦中异位高表达tagsr1基因作用的双元载体，其特征在于：所述双元载体命名为plgy02
‑
tagsr1，其核苷酸序列如seq id no.4所示；该双元载体含有tagsr1基因在小麦遗传转化过程中起主要作用的表达盒e1，其中所述表达盒e1的核苷酸序列如seq id no.3所示，其从上游至下游依次是：来自玉米的泛素启动子ubi，所述tagsr1基因的编码序列，来自多管水母属的荧光加强型绿色荧光蛋白编码基因gfp，终止子t1。
16.其中：所述玉米泛素启动子ubi的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述tagsr1基因的编码序列如seq id no.2所示，来自多管水母属的荧光加强型绿色荧光蛋白编码基因gfp的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述终止子t1的核苷酸序列如seq id no.7所示。
17.本发明进一步公开了籽粒发育相关蛋白tagsr1或其编码基因在小麦株型育种中的应用；其中所述籽粒发育相关蛋白tagsr1的氨基酸序列如seq id no.1所示，其编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述小麦株型育种中的应用指调控小麦株高的应用或是调控小麦叶片夹角的应用。
18.其中，所述应用方法是：通过构建异位表达tagsr1基因的双元表达载体plgy02
‑
tagsr1，将该双元表达载体转化到小麦中，实现tagsr1基因的异位高表达；或将该双元表达载体通过农杆菌转化到普通小麦中，获得tagsr1基因过表达的转基因小麦，实现小麦株高的降低和叶片夹角的减小；其中所述tagsr1基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
19.本发明提供了一种籽粒发育相关蛋白tagsr1或其编码基因及其在优化小麦理想株型育种中的应用；其中，所述籽粒发育相关蛋白tagsr1或其编码基因为首次公开。本发明进一步确定了tagsr1是br信号下游的转录因子，具有调控小麦籽粒大小的功能，同时对小麦叶片夹角、株高等株型具有重要的调控作用。同时利用实验明确了小麦tagsr1基因与小麦株高和叶夹角的关系，验证了tagsr1的高表达可以降低小麦的株高降低和减小叶片的夹角。发明的突出效果是：通过构建了可以异位表达tagsr1基因的双元表达载体plgy02
‑
tagsr1，并遗传转化到普通小麦中得到了tagsr1基因高表达的后代，实现了tagsr1基因的过表达。实验证实，获得的tagsr1基因过表达转基因小麦实现了小麦株高的降低和叶片直立，此株型更适合密植。本发明利用基因工程技术实现了小麦理想株型的快速育种，为提高小麦抗倒伏能力和合理密植，提供了一种切实可行的方法，具有重要的育种应用价值和广阔的市场应用前景。
附图说明
20.图1为石新828的tagsr1基因扩增电泳图。
21.其中：泳道1为transgen 2k plus marker，泳道2为tagsr1目的条带。
22.图2tagsr1基因连入入门克隆载体pdonor221的测序结果。
23.图3tagsr1基因通过lr反应连入双元表达载体plgy02载体中。
24.其中：1为transgen 2k plus marker，2
‑
6为tagsr1成功连入plgy02载体的阳性克隆。
25.图4过表达tagsr1转基因后代的pcr鉴定。
26.其中：1为transgen 2k plus marker，2～9为转基因株系1
#
～8
#
的目的条带检测结果。
27.图5过表达tagsr1的转基因后代的蛋白表达量鉴定。
28.图6oe
‑
tagsr1过表达转基因株系与其基因编辑敲除株系tagsr1
‑
ko籽粒大小比较。
29.其中：a&b，与野生型jw1小麦相比，oe
‑
tagsr1过表达株系籽粒长度与宽度显著减小；c&d，与野生型jw1小麦相比，纯合基因敲除株系tagsr1
‑
ko籽粒长度显著增加，籽粒宽度无明显变化。bar＝1cm。
30.图7oe
‑
tagsr1过表达转基因株系与其基因编辑敲除株系tagsr1
‑
ko株高性状比较。
31.其中：tagsr1过表达转基因株系株高显著降低，tagsr1
‑
ko敲除株系株高无显著变化。bar＝5cm。
32.图8oe
‑
tagsr1过表达转基因株系与其基因编辑敲除株系tagsr1
‑
ko叶片夹角性状比较。
33.其中：tagsr1过表达转基因株系叶片夹角显著减小，tagsr1
‑
ko敲除株系叶片夹角显著增加。bar＝1cm。
具体实施方式
34.下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
35.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
36.下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均从常规生化试剂公司购买得到。
37.pcr扩增所需的高保真酶为kod
‑
fx neo(东洋纺)；bp反应所用的载体为pdonor221(invitrogen)；2
×
pcr master mix购自北京聚合美生物科技有限公司；t4连接酶购自neb公司；用于同源重组的bpclonase与lr clonase、酶切片段回收所需的凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒以及western blotting的抗体均购自赛默飞世尔科技公司。培养基配制所需的无机盐购自国药集团，维生素和抗生素以及购自sigma公司。所述质粒plgy02从山东省农业科学院作物研究所获得。本发明所用的大肠杆菌菌株是e.coli transgen5α，购自北京全式金公司；所使用的引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，相关引物序列如表1所示：
38.表1：本发明使用的引物
[0039][0040]
本发明中使用的小麦品种jw1是山东省农科院作物所自行选育的具有良好组织培养能力的新种质，公众可从山东省农业科学院作物研究所获得；石新828是石家庄市小麦新品种新技术研究所经8代系谱选育法于2001年选育而成，并于2005年通过河北省品种审定委员会审定的具有耐寒抗旱、抗倒伏等优良性状的小麦品种，公众可从河北嘉丰种业有限公司获得。
[0041]
实施例1表达载体的构建
[0042]
1.tagsr1编码序列的克隆
[0043]
为得到tagsr1蛋白的编码序列，本实验在小麦品种石新828里扩增tagsr1基因的序列，所用引物为tagsr1
‑
f与tagsr1
‑
r，pcr反应体系为：kod
‑
fx neo buffer：25μl，dntp(2mm)：10μl，tagsr1
‑
f(10μm)：1.5μl，tagsr1
‑
f(10μm)：1.5μl，石新828gdna(50ng/μl)：1μl，kod
‑
fx neo：1μl，ddh2o补齐50μl。pcr反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性12sec；58℃退火20sec，68℃延伸25sec，反应35个循环；68℃复性5min。
[0044]
pcr结果如图1所示，泳道1为transgen 2k plus marker，泳道2为tagsr1目的条带。
[0045]
pcr产物送至青岛擎科梓熙生物技术有限公司测序，石新828小麦中的tagsr1基因与ensembl plants数据库(http://plants.ensembl.org/index.html)中小麦的公知序列相似度为93.33％。该基因编码序列全长612个碱基，不含有内含子。其核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0046]
2.tagsr1与pdonor221的bp反应
[0047]
为tagsr1基因加同源接头attb1和attb2。
[0048]
以在小麦品种石新828里扩增的tagsr1为模板，所用引物为tagsr1
‑
p1与tagsr1
‑
p2，pcr反应体系为：kod
‑
fx neo buffer：25μl，dntp(2mm)：10μl，tagsr1
‑
p1(10μm)：1.5μl，tagsr1
‑
p2(10μm)：1.5μl，tagsr1 pcr胶回收产物dna(10ng/μl)：1μl，kod
‑
fx neo：1μl，ddh2o补齐50μl。pcr反应程序为：98℃预变性2min，98℃变性12sec；58℃退火20sec，68℃延伸25sec，反应35个循环；68℃复性5min。
[0049]
pcr产物经跑胶回收，与pdonor221质粒进行bp反应，反应体系为：胶回收产物(约50ng/μl)：1μl，pdonor221(50ng/μl)：1μl，bp clonase：0.5μl，ddh2o补足至10μl。反应体系
于25℃反应1h，反应产物转化大肠杆菌transgen 5α，于lb(含由卡那霉素)平板上培养至克隆长出，挑单克隆进行菌液pcr鉴定及测序，引物用的是m13f和m13r。
[0050]
阳性重组菌株送至青岛擎科梓熙生物技术有限公司测序，测序结果如图2所示，表明tagsr1基因连入入门载体pdonor221中，重组载体命名为pdonor221
‑
tagsr1。
[0051]
3.转化
[0052]
pcr产物经跑胶回收，与plgy02质粒进行lr反应，反应体系为：pdonor221
‑
tagsr1质粒(10ng/μl)：1μl，plgy02(50ng/μl)：1μl，lr clonase：0.5μl，ddh2o补足至10μl。反应体系于25℃反应1h，反应产物转化大肠杆菌transgen 5α，于lb(含由卡那霉素)平板上培养至克隆长出，挑单克隆进行菌液pcr鉴定及测序，引物用的是tagsr1
‑
f和ccfp
‑
r。
[0053]
电泳结果如图3所示，具有目的条带的克隆为携带双元载体plgy02
‑
tagsr1的阳性克隆。其中双元表达载体plgy02
‑
tagsr1的核苷酸序列如seq id no.4所示。
[0054]
实施例2转基因后代获得与鉴定
[0055]
1.tagsr1转基因后代获得
[0056]
将实验例1构建好的双元表达载体plgy02
‑
tagsr1转化至农杆菌eha105感受态细胞，具体的：将重组双元表达载体plgy02
‑
tagsr1加入农杆菌eha105感受态中冰浴5min，液氮速冻5min，37℃热激反应5min，之后冰浴5min，加入无抗lb，放入28℃摇床复苏2h，之后用涂布器涂于lb(含有利福平、链霉素和卡那霉素)平板上，28℃倒置培养培养至克隆长出。挑取单克隆接种于含有相应抗性的lb培养液中，28℃摇菌，160rpm，培养24小时。
[0057]
取授粉后15天左右的jw1小麦种子，剥取幼胚。农杆菌悬浮液取1ml菌液于1.5ml离心管中，加入1.4ul乙酰丁香酮(0.1m)混匀。加入准备好的菌液侵染5分钟后放到共培培养基上，23℃暗培养3天。共培后放到休息培养基上25℃暗培养5天。将愈伤组织转移至筛选培养基1上，用封口膜封好培养皿，在25.5℃培养箱中暗培养2周。将愈伤切割后转移到筛选培养基2上，用封口膜再次封好培养皿，在25.5℃培养箱中继续暗培养2周。愈伤切割筛选2周后，表现有绿色芽点的抗性愈伤转移到再生培养基上。封好培养皿，放到25℃培养箱中光照/黑暗(16h/8h)培养2周。再生2周后，将健康成长的小苗转移到新的抗性再生小盒里。待苗长到一定大小可以取样检测。
[0058]
上述小麦遗传转化涉及的各种培养基及其配制见如下文献：
[0059]
kan wang(ed.),agrobacterium protocals:volume 1,methods in molecular biology,vol.1223doi10.007/978
‑1‑
4939
‑
1695
‑
5_15,spring science businedd media new york 2015。
[0060]
2.tagsr1转基因后代鉴定
[0061]
采用ctab法提取t0代小麦植株的幼嫩叶片dna，以gdna为模板，lgy
‑
df和lgy
‑
dr为引物对转基因小麦进行pcr鉴定。反应体系为：2
×
pcr master mix：10μl，lgy
‑
df(10μm)：0.5μl，lgy
‑
dr(10μm)：0.5μl，gdna(50ng/μl)：1μl，ddh2o补足至20μl。pcr反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；最后72℃延伸5min。电泳结果如图4所示，共6个t0代转基因阳性植株。
[0062]
挑选阳性转基因株系oe
‑
tagsr1
‑1#
、oe
‑
tagsr1
‑5#
和oe
‑
tagsr1
‑6#
进行western blotting蛋白表达量鉴定。主要实验操作为：sds法提取叶片总蛋白，利用12％的sds
‑
page胶进行电泳分离，并利用与tagsr1蛋白融合的gfp的抗体进行western blotting检测转基
因小麦的表达量，结果如图5所示，显示阳性转基因株系oe
‑
tagsr1
‑1#
与oe
‑
tagsr1
‑6#
具有较高的表达量。
[0063]
实施例3小麦过表达tagsr1基因后代表型鉴定
[0064]
将野生型受体品种jw1、过表达转基因小麦oe
‑
tagsr1和tagsr1及其同源拷贝的纯合敲除株系tagsr1
‑
ko一起种植于山东大学青岛校区人工气候室，培养条件为：光照16h，黑暗8小时；白天温度22℃，夜间温度16℃；湿度40％
‑
50％；co2浓度为500ppm
‑
700ppm。
[0065]
对jw、oe
‑
tagsr1和tagsr1
‑
ko的籽粒长度、宽度和千粒重进行分析。
[0066]
与野生型jw1相比，过表达株系oe
‑
tagsr1的籽粒长度与宽度显著降低，而突变体株系tagsr1
‑
ko籽粒长度显著增加，籽粒宽度无明显变化(如表2，图6所示)。测量籽粒千粒重显示，oe
‑
tagsr1过表达转基因株系千粒重显著降低，tagsr1
‑
ko千粒重显著增加(如表2)。结果表明，tagsr1基因对小麦籽粒发育具有负向调控作用。
[0067]
表2纯合三拷贝敲除突变体tagsr1
‑
ko产量性状统计
[0068][0069]
注：不同的小写字母上标表示在95％置信度水平有显著性差异。
[0070]
对过表达tagsr1基因的转基因株系oe
‑
tagsr1、基因敲除株系tagsr1
‑
ko的株高与叶片夹角进行分析。
[0071]
株高的分析结果如图7所示，与jw1相比，oe
‑
tagsr1的株高显著降低，而基因敲除株系tagsr1
‑
ko的株高与jw1相比无显著性差异，表明tagsr1基因对小麦株高具有显著的抑制作用。同时，与野生型植株jw1相比，oe
‑
tagsr1的叶片夹角显著减小，叶片直立，而基因敲除株系tagsr1
‑
ko的叶片夹角显著大于jw1，如图8所示。叶片夹角的减小导致叶片直立，进而使oe
‑
tagsr1转基因植株的株型更加紧凑，而基因敲除株系tagsr1
‑
ko的株型与jw1相比更为松散，如图7所示。
[0072]
本实验通过构建tagsr1过表达载体，并通过农杆菌侵染小麦幼胚愈伤组织，将ubi::tagsr1元件转入小麦中，验证了tagsr1虽在籽粒大小上存在负向效应，但其过表达显著降低小麦株高，并减小了叶片夹角，因此产生的矮杆、株型紧凑的小麦株型，其在作物生产中对于抗倒伏、高密度种植具有重要意义，为小麦的株型育种提供了一个优异候选基因位点和切实可行的方法。