一种改善畜禽水产动物肠道功能的饲料添加剂的制作方法

1.本发明属于动物营养、饲料工业领域，更具体地涉及一种改善畜禽水产动物肠道功能的饲料添加剂。


背景技术：

2.抗菌生长促进剂(agps)能够促进动物生长，保障动物健康，降低动物患肠道疾病的风险。但长期使用agps会导致动物体内抗生素残留、细菌耐药性增加、肠道菌群失调、肠道稳态破坏以及环境污染等多种不利影响，已逐步危及人类食品安全。因此，在动物饲料中禁抗已成为必然趋势。我国已明确规定，自2020年7月1日起，饲料企业要停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。所以如何解决因禁止添加抗生素带来的生产成本增加、畜禽尤其幼畜健康问题是当前面临的首要任务。
3.每年因肠道疾病对动物生产影响较大，比如仔猪痢疾、仔猪胃肠炎、细菌诱导的仔猪腹泻等肠道炎症性疾病是引发仔猪死亡的首要因素。因此，保护动物肠道健康是当前养殖业面临的第一要务。多酚类植物提取物作为一种天然物质，属于多羟基酚类物质。因其具有抗氧化、抗炎、抑菌等特性，近年来成为行业研究热点之一。如二氢槲皮素、槲皮素、圣草酚以及山奈酚均为酚类物质，主要提取自落叶松的根部，其中二氢槲皮素、槲皮素因其具有四个酚羟基而具有较强的抗氧化能力。圣草酚以及山奈酚为多酚类提取物，具有抗氧化、抗炎的作用。另外，二氢槲皮素还具有抗炎、抗病毒、保健的作用，近年来还发现二氢槲皮素对肝损伤具有缓解作用，但关于二氢槲皮素保护动物肠道健康、缓解肠道炎症的报道较少。
4.因此，研究一种能够保护动物肠道健康，提高机体抗氧化和免疫能力，进而缓解肠道炎症，且安全、天然、环保的饲料添加剂，对于动物健康养殖和畜禽可持续发展具有重要意义。


技术实现要素：

5.针对上述问题，克服上述饲料添加剂的缺陷和不足，本发明提供一种改善畜禽水产动物肠道功能的饲料添加剂。所述饲料添加剂包括植物提取物，所述植物提取物以复配的预混料为载体；所述植物提取物包含圣草酚、槲皮素、二氢槲皮素以及山奈酚中的一种或多种。
6.例如，所述的植物提取物为落叶松植物提取物，本发明公开了其在制备动物饲料添加剂中的应用及相应饲料在提高动物肠道免疫功能的应用。落叶松植物提取物作为饲料添加剂在改善畜禽水产动物肠道功能，包括缓解动物肠道炎症、促进肠道健康、提高机体抗氧化和肠道免疫能力中的应用。落叶松植物提取物作为饲料添加剂制备的饲料能缓解动物肠道炎症，提高机体抗氧化和肠道免疫能力。
7.本发明是通过下述技术方案实现的：
8.本发明提供一种改善畜禽水产动物肠道功能的饲料添加剂，所述饲料添加剂包括植物提取物，所述的植物提取物以复配的预混料为载体；所述植物提取物包含圣草酚、槲皮
素、二氢槲皮素以及山奈酚中的一种或多种。
9.优选地，所述复配的预混料包含矿物元素和微量元素。所述的矿物元素包括锰、铜、铁、锌、硒和碘中的一种或多种。所述的微量元素包括维生素a、维生素d3、维生素e、维生素k3、维生素b1、泛酸钙、烟酰胺、叶酸、生物素和维生素b
12
中的一种或多种。
10.本发明提供一种改善畜禽水产动物肠道功能的饲料添加剂，所述畜禽水产饲料包括基础饲料和如上任一项所述的饲料添加剂；以所述畜禽水产饲料总质量计，所述畜禽水产饲料由99.85wt％～99.95wt％的基础饲料和0.05wt％～0.15wt％的饲料添加剂组成。
11.优选地，以基础饲料总质量计，所述的基础饲料包含常规饲料和预混料，其中常规饲料包括膨化玉米45wt％～50wt％、膨化大豆8wt％～12wt％、去皮豆粕10wt％～15wt％、鱼粉3wt％～5.5wt％、乳清粉8wt％～12wt％、大豆油1wt％～3wt％、碳酸氢钙0.5wt％～0.8wt％、食盐0.2wt％～0.4wt％、石粉0.5wt％～1wt％、氯化胆碱0.05wt％～0.1wt％、蛋氨酸0.1wt％～0.2wt％、赖氨酸0.8wt％～1wt％、苏氨酸0.1wt％～0.4wt％、色氨酸0.05wt％～0.1wt％、蔗糖2.5wt％～3wt％、葡萄糖2.5wt％～3wt％和微晶纤维素4wt％～6wt％。
12.优选地，所述基础饲料中的预混料包含矿物元素和微量元素；所述的矿物元素包括锰、铜、铁、锌、硒和碘中的一种或多种。所述的微量元素包括维生素a、维生素d3、维生素e、维生素k3、维生素b1、泛酸钙、烟酰胺、叶酸、生物素和维生素b
12
中的一种或多种。
13.本发明还提供一种如上任一项所述的饲料添加剂在饲料中的应用，所述饲料添加剂在所述饲料中的浓度为0.05wt％～0.15wt％。
14.优选地，所述植物提取物为圣草酚、槲皮素、二氢槲皮素以及山奈酚中的一种或多种，从落叶松根部提取。
15.优选地，所述饲料应用于畜禽水产动物饲料。
16.优选地，按照基础饲料质量计，所述的基础饲料包含膨化玉米45wt％～50wt％、膨化大豆8wt％～12wt％、去皮豆粕10wt％～15wt％、鱼粉3wt％～5.5wt％、乳清粉8wt％～12wt％、大豆油1wt％～3wt％、碳酸氢钙0.5wt％～0.8wt％、食盐0.2wt％～0.4wt％、石粉0.5wt％～1wt％、氯化胆碱0.05wt％～0.1wt％、蛋氨酸0.1wt％～0.2wt％、赖氨酸0.8wt％～1wt％、苏氨酸0.1wt％～0.4wt％、色氨酸0.05wt％～0.1wt％、蔗糖2.5wt％～3wt％、葡萄糖2.5wt％～3wt％和微晶纤维素4wt％～6wt％。将植物提取物添加到所述基础饲料中，所述的饲料添加剂在所述饲料中的浓度为0.05wt％～0.15wt％。
17.进一步地，所述饲料作为养殖动物饲料。所述植物提取物包含圣草酚、槲皮素、二氢槲皮素以及山奈酚中的一种或多种；所述饲料具有缓解动物结肠炎、提高机体抗氧化和肠道免疫能力，所述饲料中含有上述植物提取物。上述植物提取物以饲料添加剂的方式添加于饲料中。
18.本发明还提供了上述饲料添加剂及制备的饲料在动物中的应用。所述应用在动物任何阶段中均可使用，具体表现为可在如下1、2中的任意一种：
19.1)在提高动物肠道健康、调节肠道生理功能、维持肠道稳态，提高动物机体抗氧化能力的应用；
20.2)在降低动物肠道疾病如肠道炎症和肠道损伤，改善肠道屏障功能的应用。
21.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
22.本发明证明上述植物提取物在饲料中应用效果突出，且安全无毒副作用。
23.本发明提供的饲料添加剂在改善畜禽水产动物肠道功能中的应用，在缓解动物肠道炎症，提高动物机体抗氧化水平(如提高抗氧化酶sod、gsh
‑
px、cat的活性)，维持动物肠道健康，增加肠道有益菌(如乳酸杆菌)丰度，抑制有害菌丰度等方面效果良好。
24.作为饲料添加剂在动物上使用具有促生长、抗腹泻的效果。
25.本发明提供添加剂为植物提取物，具有来源天然、价格便宜、不易产生抗药性、无污染等优点。
附图说明
26.图1显示了植物提取物可以缓解动物肠道炎症，将植物提取物添加到饲料中饲喂动物，采用elisa法检测血清相关抗氧化指标。不同字母表示差异显著。
27.图2显示了植物提取物缓解动物肠道炎症，将植物提取物添加到饲料中饲喂动物，采用elisa法检测血清相关炎症细胞因子指标。不同字母表示差异显著。
28.图3显示了植物提取物缓解动物肠道炎症，将动物结肠组织切片进行h&e染色，通过显微镜观察植物提取物对动物结肠组织病理变化的影响。
29.图4显示了植物提取物对动物结肠组织相关基因表达量的影响，不同字母表示差异显著。
30.图5显示了植物提取物对动物粪便微生物组成的影响，*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001。
具体实施方式
31.下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
32.实施例1动物饲料的制备
33.(1)制备饲料添加剂和复配的预混料
34.称取1kg植物提取物(二氢槲皮素900g、圣草酚20g、槲皮素50g以及山奈酚30g)，添加到9kg预混料中形成复配的预混料，搅拌混合5分钟。其中所述的预混料由矿物元素(锰：40g、铜：20g、铁：140g、锌：140g、硒：0.3g、碘：0.5g)和微量元素(维生素a：18000
×
103iu、维生素d3：4500
×
103iu、维生素e：22.5g、维生素k3：4.5g、维生素b1：4.32g、泛酸钙：33.12g、烟酰胺：41.58g、叶酸：1.764g、生物素：480mg、维生素b
12
：12g)、玉米粉8.54kg组成。
35.(2)制备基础饲料中的常规饲料：
36.分别称取膨化玉米467.3kg和膨化大豆100kg置于粉碎机中粉碎混合，而后将粉碎混合均匀的混合物通过螺旋上料机传送至混合机，然后在混合机中添加预先称取好的去皮豆粕130kg、鱼粉45kg、乳清粉100kg、大豆油20kg、碳酸氢钙5kg、食盐3kg、石粉5.1kg、氯化胆碱0.9kg、赖氨酸8kg、蛋氨酸1.7kg、色氨酸0.8kg、苏氨酸3.2kg、蔗糖25kg、葡萄糖25kg以及微晶纤维素(50kg)原料，混合10分钟，制得常规饲料。
37.(3)制备添加饲料添加剂的饲料：
38.将步骤(2)制得的基础饲料置于混合机中，然后在混合机中添加步骤(1)所得的含
有植物提取物的复配预混料，再混合10分钟；最后用螺旋上料机传至制粒机进行制粒，制粒温度为60℃，制得颗粒的粒径为2mm，制得含有上述植物提取物的饲料，营养水平见表1。
39.以下实施例中仔猪所用饲料为本实施例1制备得到的含有上述植物提取物的饲料。
40.表1基础饲料的营养水平
41.指标含量总能，mcal/kg3.94粗蛋白，％18.01钙，％0.67总磷，％0.54有效磷，kcal/0.39
42.实施例2饲料中添加上述植物提取物对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响
43.1、实验方法
44.试验选用健康、生长发育正常、体重相近约7.5kg左右的三元杂交断奶仔猪100头，随机分成2个组：对照组和试验组。对照组饲喂不含植物提取物的饲料，其他组成比例均一致，每头猪每天饲喂400g。试验组饲喂由实施例1制得的含有上述饲料添加剂的饲料，每头猪每天饲喂400g。本试验于2020年10月5日至2020年11月16日在黑龙江某猪场进行，试验期42天，其中预饲期5天。
45.饲养管理：实验期内按照猪场常规饲养管理程序操作，自由采食和饮水，并按照猪场的免疫程序进行免疫。
46.指标测定：试验开始和结束时，分别于当日饲喂前空腹称重作为试验初始重和末重，以重复组为单位详细记录耗料量，记录各组腹泻发生情况，计算平均日增重、料重比和腹泻率(表2)。日增重＝(末重
‑
初始重)/试验天数；料重比＝平均日采食量/平均日增重；腹泻率＝总腹泻率次数/(总头数
×
试验天数)
×
100％)。
47.表2试验结果
[0048] 对照组试验组平均初始重，kg7.537.47平均末重，kg25.6327.23平均日增重，g430.95470.48平均日采食量，g659.35682.20料肉比1.531.45腹泻率，％11.345.95
[0049]
效果评价：
[0050]
试验过程中观察发现，与对照组相比，试验组显示上述植物提取物具有降低仔猪腹泻率，改善仔猪肠道健康的作用。
[0051]
上述结果显示，与对照组相比，试验组猪的平均日增重提高了约39.53g，料重比降低约0.08；腹泻率降低了47.53％。说明本发明所得饲料在改善仔猪肠道健康，预防肠道疾病方面都有较好的效果。
[0052]
实施例3添加上述植物提取物的饲料对dss诱导的结肠炎动物血清生化指标的影
响
[0053]
以下实施例中所用的动物(小鼠)饲料为定制饲料(由北京科奥协力饲料有限公司加工生产的大小鼠维持饲料)，以此定制饲料作为基础饲料。具体为：在其生产维持期小鼠饲料时，每公斤基础饲料额外添加1500mg的上述植物提取物(二氢槲皮素1350mg、圣草酚30mg、槲皮素75mg以及山奈酚45mg)，提取自落叶松的根部。具体营养成分见表3。
[0054]
表3基础饲料的营养水平
[0055]
指标含量水分，％10粗蛋白，％23.07粗脂肪，％11.85碳水化合物，％65.08总能，kcal/g3.40
[0056]
选取3周龄icr小鼠经过一周的适应期后，随机分为三组。con组为空白对照，全程正常饮水(水为蒸馏水)，饮水量为4ml/d/只，给予基础饲料。dss组给予基础饲料，试验第15天开始饮用添加3wt％dss的饮水。具体配比方式为：1000ml的蒸馏水中溶解30g的dss(葡聚糖硫酸钠盐，dextran sulfate sodium salt)。给予动物连续饮用7天，目的在于建立动物溃疡性结肠炎模型，而后换成蒸馏水连续使用2天。tax组全期饲喂由基础饲料中添加1500mg/kg植物提取物(二氢槲皮素、圣草酚、槲皮素以及山奈酚)的混合物，配好后的饲料，tax占总质量的比例为0.15％的饲料，其他处理同dss组。待试验结束后，屠宰所有动物并取样。具体实验方法和实验结果如下述实施例3
‑
6所述。
[0057]
1、实验方法
[0058]
于试验结束后，眼窝采血离心获得血清，采用酶联免疫吸附试验(elisa)方法检测血清中抗氧化指标。所用试剂盒选购自南京建成生物工程研究所。实验步骤包括：1)血清样本用生理盐水按体积比1:1、1:4、1:7、1:9、1:14、1:19稀释，分别取不同浓度的血清100ul按照操作表进行实验；2)检测血清od值；3)测定后计算抑制率(抑制率结果在45％
‑
55％之间是最佳取样量)，抑制率计算公式＝(非酶管od值
‑
酶管od值)/非酶管od值*100％；4)通过酶标仪检测相应抗氧化酶的活力。本实验在常规实验室即可完成全部过程。
[0059]
2、实验结果
[0060]
添加植物提取物的饲料对动物血清抗氧化指标的测定结果，如图1所示。图1显示了植物提取物可以缓解动物肠道炎症，将植物提取物添加到饲料中饲喂动物，采用elisa法检测血清相关抗氧化指标，不同字母表示差异显著。可以看出，基础饲料中添加植物提取物能显著提高血清中超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)以及谷胱甘肽过氧化物酶(gsh
‑
px)的水平，显著降低丙二醛(mda)的水平。
[0061]
实施例4添加植物提取物的饲料对dss诱导的结肠炎动物血清炎症细胞因子水平的影响
[0062]
1、实验方法
[0063]
实验所用动物(实施例3屠宰的小鼠)。于试验结束后，眼窝采血，离心后取血清，采用酶联免疫吸附试验(elisa)方法检测动物血清中炎症细胞因子的水平。实验步骤包括：1)在预先包被动物相应抗体的包被微孔中，依次加入标品、标准品、hrp标记的检测抗体，经过
温育并彻底洗涤。2)用底物tmb显色，tmb在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的动物相应炎症细胞因子呈正相关。3)用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(od值)，计算样品的浓度。本实验同样在常规实验室即可完成全部过程。
[0064]
2、实验结果
[0065]
添加植物提取物的饲料对动物血清炎症细胞因子相关指标的测定结果，如图2所示。图2显示了植物提取物缓解动物肠道炎症，将植物提取物添加到饲料中饲喂动物，采用elisa法检测血清相关炎症细胞因子指标。不同字母表示差异显著。可以看出，基础饲料中添加1500mg/kg的植物提取物，血清中促炎细胞因子白介素
‑
6(il
‑
6)、白介素
‑
1β(il
‑
1β)、白介素
‑
12(il
‑
12)、肿瘤坏死因子
‑
α(tnf
‑
α)以及转化生长因子
‑
α(tgf
‑
α)显著低于dss组，而抗炎细胞因子il
‑
10显著高于dss组。
[0066]
实施例5添加植物提取物的饲料对dss诱导的结肠炎动物结肠组织损伤的影响
[0067]
1、实验方法
[0068]
实验所用动物(实施例3屠宰的小鼠)。取动物的结肠组织置于4％的多聚甲醛(以质量百分比计，将40g多聚甲醛粉末加入60～70℃450ml去离子水中，再加入1mmol/l naoh溶液并不断搅拌(滴加)，调ph至7.0使其呈清亮状，再加入500ml2
×
pbs(磷酸缓冲盐溶液)，充分混匀，最后检测ph值，过滤后定容至1000ml即为4％多聚甲醛溶液)，在配好的4％多聚甲醛中固定过夜，采用石蜡包埋后切片并进行h&e染色，采用显微镜观察结肠组织病理结构并拍照。
[0069]
2、实验结果
[0070]
添加植物提取物的饲料对动物结肠组织形态的测定结果，如图3所示。图3显示了植物提取物缓解动物肠道炎症，将动物结肠组织切片进行h&e染色，通过显微镜观察植物提取物对动物结肠组织病理变化的影响。可以看出，植物提取物可显著改善结肠病理损伤，减少炎症浸润，维持肠道上皮结构完整。
[0071]
实施例6添加植物提取物的饲料对dss诱导的结肠炎动物结肠组织炎症细胞因子、肠道屏障以及nf
‑
κb信号通路相关基因表达量的影响
[0072]
1、实验方法
[0073]
实验所用动物(实施例3屠宰的小鼠)。屠宰全部动物，取动物结肠组织
‑
80℃保存。取
‑
80℃冰箱冻存的结肠组织，实验步骤如下：1)每个离心管添加组织样、钢珠以及1ml的trizol混合，置于匀浆机中匀浆；2)匀浆后，加入200μl氯仿，摇晃后静止10min离心(12000rpm，4℃，10min)；3)取上层无色液体(组织提取出的rna)200μl移入新的1.5ml ep管中；3)在ep管中再加入等体积的异丙醇，震荡摇匀静置15min后离心(12000g，4℃，15min)；4)去除异丙醇，加入75％depc乙醇1ml，震荡30s后离心(8000g，4℃，10min)，重复2次；5)干燥，加0.1％depc水，震荡，利用nanodrop超微量分光光度计测定rna浓度，而后配平，保证浓度一致；6)利用pcr仪去除dna，加入gdna eraser 1μl，5
×
gdna eraser 2μl，dnase free h2o eraser 3μl，样品4μl。实验条件为：42℃，2min，降到4℃，进行若干个循环；7)利用pcr仪反转至cdna模板，加入primer script rt enzyme mix 1μl，5
×
primer script buffer 4μl，rt primer mix 4μl，rnase free h2o 1μl。实验条件为：37℃，15min(85℃)，5s(4℃)，进行若干个循环；8)通过primer 5软件设计基因(il
‑
1β、il
‑
6、tnf
‑
α、il
‑
10、zo
‑
1以及
occludin)的引物；9)根据实验要求，将所需引物稀释成10μm的溶液(配置比例为：20μl引物 180μl depc水)，离心后备用；10)离心后的样品，通过y062荧光定量pcr检测结肠组织相关基因的相对表达量(原理为：以基因的cdna为模板进行pcr扩增，在pcr扩增过程中，通过收集荧光信号，对pcr进程进行实时检测。由于在pcr扩增的指数时期，模板的ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以得到的是基因的相对定量值)。
[0074]
2、实验结果
[0075]
添加植物提取物的饲料对动物结肠组织相关基因表达量的测定结果，如图4所示。图4显示了植物提取物对动物结肠组织相关基因表达量的影响，不同字母表示差异显著。可以看出，基础饲料中添加1500mg/kg的植物提取物显著降低了p65和nf
‑
κb基因mrna的表达量，抑制nf
‑
κb信号通路，进一步抑制促炎细胞因子il
‑
1β、il
‑
6以及tnf
‑
α基因mrna的表达量，提高抗炎细胞因子il
‑
10基因mrna的表达量。另外，植物提取物还可改善肠道屏障功能，与dss组比较，饲料中添加植物提取物增加zo
‑
1和occludin基因mrna的表达量。
[0076]
实施例7添加植物提取物的饲料对dss诱导的结肠炎动物粪便微生物组成的影响
[0077]
1、实验方法
[0078]
实验所用动物(实施例3屠宰的小鼠)。屠宰前，收集全部动物新鲜粪便，于
‑
80℃冷冻保存。取
‑
80℃冰箱冻存的动物粪便样品，采用16s rrna基因测序技术分析动物粪便微生物的多样性。实验步骤如下：1)用1wt％琼脂糖凝胶检测dna的质量，并用nanodrop 2000紫外可见分光光度计对dna进行定量。使用引物对338f(5'
‑
actcctacgggaggcagcag
‑
3')和806r(5'
‑
ggactachvgggtwtctaat
‑
3')通过pcr扩增细菌16s rrna基因的v3
‑
v4高变区。2)从2wt％的琼脂糖凝胶中提取pcr扩增产物，并根据制造商的说明使用axyprep dna凝胶提取试剂盒进行纯化。3)定量和纯化后，对扩增子进行测序。本实验通过illumina miseq平台直接测序。
[0079]
2、实验结果
[0080]
添加植物提取物的饲料对动物粪便微生物的影响，结果如图5所示。图5显示了植物提取物对动物粪便微生物组成的影响，*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001。可以看出，在属水平上，基础饲料中添加1500mg/kg的植物提取物，有益菌乳酸菌属和杜氏杆菌属的丰度增加，而拟杆菌属的丰度下降。
[0081]
需要说明的是，按照本发明上述各实施例，本领域技术人员是完全可以实现本发明独立权利要求及从属权利的全部范围的，实现过程及方法同上述各实施例；且本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。
[0082]
以上所述，仅为本发明部分具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。