一种天然纳米生物复合保鲜剂及其制备方法和对娃娃鱼鲜肉的保鲜应用与流程

1.本发明属于食品保鲜与贮藏、添加剂、纳米材料等相关技术领域，具 体涉及一种天然纳米生物复合保鲜剂制备方法及其在娃娃鱼鲜肉加工食 品中的应用。


背景技术：

2.娃娃鱼肉在低温冷藏过程中，常容易被食品致病菌和腐败菌浸染， 进而给人们带来巨大的经济与健康损害。由此，市场对娃娃鱼肉生鲜制 品的低温保存技术与保鲜剂有很大的需求。
3.植物精油，如肉桂精油、丁香精油、牛至精油等，对多种细菌(大肠 杆菌和金黄色葡萄酒菌)、霉菌和酵母菌都有明显抑菌效果。植物精油达 到一定浓度后，因其有效成分浓缩，有效作用位点多，可使微生物的细 胞内容物，或细胞内离子渗漏流出，影响微生物的正常生长活动，当浓 度超过其耐受范围，极可能使微生物死亡。植物精油中含有的多种成分 具有协同作用，其效果优于各有效成分单独使用的效果，协同作用是有 利于食品保藏的。本课题组的进一步研究结果表明，一些种类的精油经 环糊精特殊处理后，会形成精油/环糊精超分子包合物，而包合物的抑菌 效果远超过未经处理的精油。
4.由于金属纳米颗粒的抗菌潜力，以及银纳米颗粒的潜在毒性劣势， 我们将重点放在我们对广泛研究的硒纳米颗粒的研究。硒纳米材料，包 括纳米颗粒，纳米棒，纳米线，碳纳米管和纳米管已被广泛探索并用于 拥有出色的抗癌活性和低毒。目前，有一些研究涉及硒纳米材料的抗菌 性能。例如，在一项体外研究中，硒纳米粒子能有效抑制金黄色葡萄球 菌的生长。在另一项研究中，发现用高稳定硒纳米颗粒填充的织物 (psp
‑
senps)具有显著的抗真菌和抗菌活性。而且，硒元素具有抗癌、 抗氧化、增强人体免疫力的作用。主要能够防止肿瘤以及肝病的发生， 提高身体免疫力，和各种重要器官的正常功能，而且还有一定的预防老 年性心脑血管疾病的发生，调节各种维生素的吸收与利用。
5.本课题组长期从事新型功能食品添加剂的制备与应用研究工作，我 们研发了一种天然纳米生物复合保鲜剂。为保持食品品质，我们研发了 一种天然纳米生物复合保鲜剂，可有效提高其抗氧与抑菌效果，且避免 了化学防腐剂的使用，符合当代人类大健康理念。


技术实现要素：

6.根据现有技术不足之处，本发明的目的是提供一种天然纳米生物复合 保鲜剂，此保鲜剂使用健康、安全，且防腐保鲜与抗氧效果优良，并且抑 菌应用广泛。
7.为实现上述目的，本发明的技术方案在于：
8.一种天然纳米生物复合保鲜剂，包括以下重量份的组分：
9.植物精油/内生no型环糊精超分子包合物
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1～2份
10.天然硒纳米脂质体(se
‑
nps
‑
lps)
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1～2份
11.本发明中，所述的生物复合保鲜剂以固体粉末的形式存在。
12.所述的天然纳米生物复合保鲜剂的制备方法，包括以下步骤：
13.先制备含内生no型环糊精，再制备植物精油/内生no型环糊精超分 子包合物，然后制备天然硒纳米脂质体，最后将植物精油/内生no型环 糊精超分子包合物和天然硒纳米脂质体混合，得到天然纳米生物复合保 鲜剂。其中，本发明还提供了一种内生no型环糊精的制备方法，步骤如 下：
14.将β
‑
环糊精和氯化锂溶解在dma中搅拌过夜，冰水浴中向体系中加 入三乙胺和对甲苯磺酰氯，搅拌反应。丙酮沉淀，过滤，用适量甲醇、 去离子水和丙酮清洗，真空除残留溶剂。将上述产物与氯化锂加入dma 中，加入三乙胺和乙二硫醇(即1,2
‑
乙二硫醇)，氮气保护下，55～65(优 选60)℃搅拌过夜，反应结束后，丙酮沉淀，过滤并用甲醇和丙酮清 洗。然后将其重悬在含有二硫苏糖醇和三乙胺的dma中，室温下搅拌合 适时间；过滤后，用甲醇和丙酮清洗，真空除溶剂。继续重悬在dma/甲 醇中，加入亚硝酸叔丁酯，室温下搅拌10～20(优选15)小时；反应结束 后，使用甲醇沉淀，过滤后，用丙酮和二乙醚洗涤，真空除溶剂，制得 内生no型环糊精(no
‑
cd)，储存在
‑
20℃备用。
15.作为优选，β
‑
cd或羟丙基
‑
β
‑
cd，作为最容易获得和最便宜的cds， 由于其合适的腔径和体积
16.所述的环糊精为α
‑
环糊精(α
‑
cd)、β
‑
环糊精(β
‑
cd)、γ
‑
环糊精(γ
‑
cd)、 羟丙基β
‑
环糊精(hp
‑
β
‑
cd)中的至少一种；
17.所述的环糊精与氯化锂的质量比在0.25～1：1；
18.所述的对甲苯磺酰氯与环糊精的质量比在1～10：1；
19.所述的1,2
‑
乙二硫醇与环糊精的用量之比0.5～3ml:1g；
20.所述的亚硝酸叔丁酯与环糊精的用量之比为0.5～6：1g。
21.环糊精与对甲苯磺酰氯在0～5℃搅拌反应20～24h
22.所述的植物精油/内生no型环糊精包合物超分子包合物的制备步骤 如下：
23.将内生no型环糊精溶解于去离子水中，磁力搅拌至完全溶解，得到 内生no型环糊精水溶液；再将植物精油的无水乙醇溶液缓慢滴加至上述 内生no型环糊精水溶液中，滴加结束后，55～65℃持续搅拌36～60h；
ꢀ‑
2至
‑
8℃冰箱放置36～60h，至白色固形物析出，过滤，收集滤液，
‑
15 至
‑
20℃冰箱冷藏过夜后，冷冻干燥后得所述的超分子包合物；
24.所述的冷冻干燥的条件为：温度为
‑
40至
‑
50℃，时间为18～30h，进一步 优选，冷冻干燥的温度为
‑
45℃，时间为24h。即得所述的含植物精油
‑
环 糊精超分子包合物粉末。
25.其中，所述的天然硒纳米脂质体保鲜剂制备方法，包括以下步骤：
26.作为优选，所述的天然硒纳米脂质体(se
‑
nps
‑
lps)的制备步骤如下：
27.(1)将新鲜细菌培养物(500μl)和0.1mm的无菌na2seo3添加 到50ml无菌lb培养基中。在发酵反应初期，使培养基的ph维持在7 附近。反应结束时，由于产生的元素硒(se0)。以7500～12500(优选10000) rpm离心5～15(优选10)分钟从反应混合物中分离出纳米se，并用蒸馏 水洗涤数次，所有收获的样品都存储在
‑
4℃下备用。
28.(2)将上述天然硒纳米微颗粒分散于乙醇中，再将其与卵磷脂混合， 磁力搅拌，至二者充分混溶；置于2～8℃条件下，贮存12～24h，再将上 述体系减压加热除溶剂，此时容器底部形成一薄层均匀干膜；将膜分散于 去离子水中，均质，以获得脂质体，冷冻干燥，收
集产品，制得天然硒纳 米脂质体。
29.具体地，将上述36mg天然硒纳米颗粒(se
‑
nps)分散在12ml的乙 醇(96％)中，并与60mg卵磷脂充分混合，室温，磁力搅拌，至二者充 分混溶，4℃冰箱，贮存过夜。再将上述体系60℃，减压旋蒸除溶剂， 直至圆底烧瓶底部形成一薄层均匀干膜；将膜分散于10ml去离子水中， 均质过程伴随搅拌20000rpm，15min，辅助超声波以减小颗粒直径，以获 得满足颗粒尺寸要求的单层稳定的脂质体(liposomes)，
‑
65℃冷冻干燥， 收集产品(se
‑
nps
‑
lps)，4℃，贮藏备用。
30.步骤(1)中，所述的细菌为嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆 菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、格氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、保加利亚 乳酸杆菌、约氏乳杆菌、凝结芽孢杆菌、费氏丙酸杆菌、粪肠球菌、乳酸 乳球菌、嗜热链球菌中的至少一种。
31.步骤(2)中，所述的乙醇与天然精油微颗粒溶液及卵磷脂的质量比 率为14：20～40：60～80；
32.所述的均质条件为：20000
‑
25000rpm转速，均质时间为15～30min， 超声波发生器的振幅为60
‑
80％，周期为0.5个循环/min，功率为200～250 w，频率为24khz。
33.作为优选，辅助超声条件为振幅70％，0.5循环/秒，220w，24khz， 每分钟10次，间隔1min。
34.本发明还提供了一种所述的保鲜剂的应用，所述的天然纳米生物复合 保鲜剂的制备方法在娃娃鱼鲜肉的贮藏保鲜中的应用，所述的生物复合保 鲜剂用于娃娃鱼鲜肉的保鲜。
35.作为优选，具体步骤如下，娃娃鱼加工过程结束后，将上述复合保鲜 剂粉末均匀分散于娃娃鱼鲜肉中后，迅速热封包装。
36.同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
37.(1)本发明采用植物精油/内生no型环糊精超分子包合物为持久高 效的保鲜剂，兼具优良的抑菌与抗氧化双重效果。
38.(2)脂质体中包埋的硒纳米颗粒成份，既有抑菌与抗氧效果，还具 备增强人体免疫功能、抗炎、延缓衰老，并能有效抑制肿瘤生长等保健功 效，对人体健康也有一定的促进作用。
39.(3)改善了娃娃鱼鲜肉的贮藏工艺，配方由生物抑菌剂组成，更有 利人体健康，符合当代人类社会的大健康理念。
附图说明
40.图1为本发明实施例3～5和对照组得到的太湖娃娃鱼中的菌落数变化 曲线。
41.图2为本发明实施例5和对照例得到的太湖娃娃鱼存储15天后各指 标电子鼻品评结果。
42.图3为本发明实施例5和对照例得到的太湖娃娃鱼存储15天的外观 照片。
43.图4为娃娃鱼的品质变化照片，其中，(a)代表新鲜的娃娃鱼样本(4 ℃，0d)；(b)代表未经任何处理的娃娃鱼样本(4℃，15d)；(c)代 表经对照例处理过的娃娃鱼样本(4℃，15d)；(d)经实施例3处理过 的娃娃鱼样本(4℃，15d)；(e)经实施例5处理过的娃娃鱼样本(4℃， 15d)。
具体实施方式
44.以下结合具体实施例对本发明做进一步的描述。
45.实施例1
46.内生no型环糊精(no
‑
cd)的制备如下：将1g羟丙基
‑
β
‑
环糊精和 2g氯化锂溶解在30ml dma中搅拌过夜。冰水浴中向体系中加入7ml 三乙胺和9.4g对甲苯磺酰氯，继续搅拌反应22h。200ml丙酮沉淀产物， 过滤，用200ml甲醇和丙酮清洗，真空除残留溶剂。取0.4g上述反应中 间体与0.8g氯化锂加入20ml的dma中，继续加入0.8ml三乙胺和0.5 ml乙二硫醇，氮气保护下，60℃搅拌过夜；反应结束后，利用200ml 丙酮沉淀，过滤后，用200ml甲醇与丙酮清洗；然后将其重悬在含有10 ml二硫苏糖醇和10mm三乙胺的dma中，室温25℃下搅拌1小时；过 滤后，用200ml甲醇和200ml丙酮清洗，真空除溶剂。重悬在dma/ 甲醇中，加入0.5ml亚硝酸叔丁酯，室温下搅拌15小时；反应结束后， 使用100ml甲醇沉淀，过滤后，用100ml丙酮和乙醚洗涤，真空除溶剂， 制得内生no型环糊精(no
‑
cd)，储存在
‑
20℃备用。
47.天然精油
‑
内生no型环糊精(no
‑
cd)包合物的制备方法如下：
48.室温25℃下，将内生no型环糊精溶解于去离子水中，磁力搅拌至完 全溶解；再将植物精油的无水乙醇溶液缓慢滴加至上述内生no型环糊精 水溶液中，滴加结束后，60℃，持续搅拌48h；
‑
4℃冰箱放置48h，至 白色固形物析出，过滤，收集滤液，
‑
20℃冰箱冷藏过夜后，冷冻干燥后 得所述的超分子包合物；冷冻干燥的温度为
‑
45℃，时间为24h。
49.实施例2
50.天然硒纳米脂质体(se
‑
nps
‑
lps)的制备过程：
51.将新鲜细菌培养物(500μl，lactobacillus plantarum bmz123306)和 0.1mm的无菌na2seo3添加到50ml无菌lb培养基中。在发酵反应初期， 使培养基的ph维持在7附近。反应结束时，由于产生的元素硒(se0)。 以10000rpm离心10分钟从反应混合物中分离出纳米se，并用蒸馏水洗 涤数次，所有收获的样品都存储在
‑
4℃下备用。将上述36mg天然硒纳米 颗粒(se
‑
nps)分散在12ml的乙醇(96％)中，并与60mg卵磷脂充分 混合，室温，磁力搅拌，至二者充分混溶，4℃冰箱，贮存过夜。再将上 述体系60℃，减压旋蒸除溶剂，直至圆底烧瓶底部形成一薄层均匀干膜； 将膜分散于10ml去离子水中，均质过程伴随搅拌20000rpm，15min， 辅助超声波(振幅70％，0.5循环/秒，220w，24khz，每分钟10次，间 隔1min)以减小颗粒直径，并获得满足颗粒尺寸要求的单层稳定的脂质 体(liposomes)，
‑
65℃冷冻干燥，收集产品天然硒纳米脂质体(se
‑
nps
‑
lps)，4℃，贮藏备用。脂质体的扫透射电镜(tem)图，如图 1所示。
52.实施例3
53.一种保鲜剂组合物，由以下组分组成：植物精油/内生no型环糊精超 分子包合物1份，天然硒纳米脂质体1份。
54.娃娃鱼的保鲜步骤：
55.分选取别10g娃娃鱼，随机分为2组，实验组：放入浓度为2％的壳 聚糖和上述保鲜剂混合溶液中；对照组：放入浓度为2％的壳聚糖溶液中， 浸泡5min后控干溶液，阴凉通风处晾干。鱼肉放入带孔的包装盒中，放 置于4℃冰箱中贮藏15天，于每个时间点测定其指标，每组平行三次测 定。
56.每间隔3天取出鱼肉，收集其表面的细菌，将10g的娃娃鱼浸泡在 90ml的生理盐水
中，进行摇匀拍打，最后用平板涂布法去测定鱼肉表面 的细菌总数，每次试验平行三次。
57.得到的娃娃鱼的菌落数变化曲线见图2。
58.实施例4
59.一种保鲜剂组合物，由以下组分组成：天然精油
‑
内生no型环糊精 (no
‑
cd)包合物1份，天然硒纳米脂质体2份。
60.娃娃鱼的保鲜步骤：
61.分选取别10g娃娃鱼，随机分为2组，实验组：放入浓度为2％的壳 聚糖和上述保鲜剂混合溶液中；对照组：放入浓度为2％的壳聚糖溶液中， 浸泡5min后控干溶液，阴凉通风处晾干。鱼肉放入带孔的包装盒中，放 置于4℃冰箱中贮藏15天，于每个时间点测定其指标，每组平行三次测 定。
62.得到的娃娃鱼的菌落数变化曲线见图2。
63.实施例5
64.一种保鲜剂组合物，由以下组分组成：天然精油
‑
内生no型环糊精 (no
‑
cd)包合物2份，天然硒纳米脂质体2份。
65.娃娃鱼的保鲜步骤：
66.分选取别10g娃娃鱼，随机分为2组，实验组：放入浓度为2％的壳 聚糖和上述保鲜剂混合溶液中；对照组：放入浓度为2％的壳聚糖溶液中， 浸泡5min后控干溶液，阴凉通风处晾干。鱼肉放入带孔的包装盒中，放 置于4℃冰箱中贮藏15天，于每个时间点测定其指标，每组平行三次测 定。
67.每间隔3天取出鱼肉，收集其表面的细菌，将10g的娃娃鱼浸泡在 90ml的生理盐水中，进行摇匀拍打，最后用平板涂布法去测定鱼肉表面 的细菌总数，每次试验平行三次。
68.得到的娃娃鱼的菌落数变化曲线见图2。
69.实施例6
70.对实施例3和5的样品，在贮藏第15d后，分别将样本置于密闭玻璃 容器中静置60min，使其挥发性气体充盈整个容器。随后以自制电子鼻探 测针置于密闭容器中抽取约为15ml气体进行分析检测，每个样本平行准 备5组并分别测试。结果如图3所示，其中，(a)代表新鲜的娃娃鱼样本 (4℃，0d)；(b)代表未经任何处理的娃娃鱼样本(4℃，15d)；(c)代 表经对照例处理过的娃娃鱼样本(4℃，15d)；(d)经实施例3处理过的 娃娃鱼样本(4℃，15d)；(e)经实施例5处理过的娃娃鱼样本(4℃， 15d)。
71.由于食物在储存过程中会产生大量不同的挥发性气体，因此可以使用 电子鼻识别气体，然后判断食物的新鲜度。储存15天后，用电子鼻将娃 娃鱼肉的气味与新鲜参考物区分开来。如图2所示，与其他样品相比，经 实施例5处理的娃娃鱼的pca区域(e)更接近新鲜参考(a)，表明保鲜 剂可以有效地维持娃娃鱼的原有的气味。而处理的娃娃鱼，其气味变化明 显，其原因归结于有大量的腐败气味产生。如图3所示，在贮藏15天后， 经过保鲜剂处理的娃娃鱼，仍然保持光泽的表明，肉的颜色无明显变化， 而对照组的娃娃鱼肉变得干瘪，颜色开始发黄。
72.得到的娃娃鱼的电子鼻检测结果见图3。娃娃鱼的品质变化图片见图 4。
73.对照例
74.参照实施例3～5中复合保鲜剂组合物的应用，但是不添加保鲜剂的处 理步骤，直
接进行包装和贮藏。得到的产品的菌落数变化见图2。