一种可多步时序反应的微流控芯片、微流控方法及其应用与流程

1.本发明涉及微流控芯片技术领域，特别涉及一种可多步时序反应的微流控芯片、微流控方法及其应用。


背景技术：

2.微流控芯片是一种以在微米尺度空间对流体进行操控为主要特征的科学技术，具有将生物、化学等实验室基本功能微缩到一个几平方厘米芯片上的能力，因此又被称为芯片实验室，其在化学分析、生物检测等众多领域都有着广泛的应用。面对突发性传染性疾病时，往往需要区分与溯源致病病菌，这时就需要对样品进行多病原体的并行检测分析。而要实现对同一样品的多指标并行检测分析，通常会将核酸提取样品分配到用于分析不同靶标的多个反应孔中。利用微流控芯片的多个并行腔体来进行多靶标的反应和检测是一种灵活的解决思路，但其带来一个潜在的问题，即待分析样本被分配到多个反应腔体中，导致每个腔体中的样本含量就减少了，相当于降低了整个系统的检测灵敏度。因而多腔体分配与高灵敏度检测之间存在矛盾。
3.综上所述，如何提供一种芯片能够同时满足高灵敏度和多指标的检测需求，是目前本领域技术人员亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.为解决本领域存在的上述问题，本发明旨在提供一种全新结构的可多步时序反应的微流控芯片，及基于该微流控芯片的微流控方法及其应用。本发明的微流控芯片不仅可用于常规的核酸提取及扩增反应，还可用于多指标反应，同时确保反应结果的灵敏度，不因原始样品的分配而降低灵敏度。
5.本发明的技术方案如下：一种可多步时序反应的微流控芯片，其特征在于，包括：反应腔、缓冲分流单元、以及可连通反应腔和缓冲分流单元的管路；所述反应腔沿流体流动方向从上游、中游至下游依次设置若干个；上游反应腔的出口可通过管路与中游反应腔的入口相连通；中游反应腔可通过管路与下游反应腔相连通；缓冲分流单元可暂时储存或缓冲流体并分流流体；缓冲分流单元的出口可经管路与中游反应腔相连通；中游反应腔上、缓冲分流单元内均设有定量分流机构。
6.所述反应腔内设有防接触机构；所述防接触机构选自：设置在反应腔出口处的反应腔底部内壁上的凸起、或，与反应腔出口外接的凸起空间、或，设置在反应腔的腔壁上远离下游端延伸出的突出空间、或，毛细管向远离下游端方向伸出的折弯结构；所述凸起优选呈三角形的台阶，三角形的斜面朝向流体流入反应腔的方向，三角
形的台阶与反应腔出口所在的侧壁之间存在空隙，该空隙与出口相通；优选地，中游反应腔与下游反应腔之间的管路上设有界面阀，所述界面阀直径大于所述管路直径；进一步优选地，所述微流控芯片还包括流体储存单元；流体储存单元位于反应腔的上游；所述流体储存单元可通过管路与缓冲分流单元相连通；优选地，所述缓冲分流单元按流体流动方向包括至少2个缓冲腔；相邻的缓冲腔之间可通过管路相连通；优选地，按流体进入的先后顺序设置至少2个中游反应腔；相邻的中游反应腔之间可通过管路相连通；优选地，所述定量分流机构为设置在反应腔或缓冲腔的腔壁上的高度可调的开口。
7.所述的一种可多步时序反应的微流控芯片还包括：通气单元；所述通气单元包括设置在微流控芯片内部的通气管道、和/或，设置在微流控芯片上的通气孔；优选地，流体储存单元包括：至少1个流体储存腔；流体储存腔可通过管路与缓冲分流单元的位于上游的缓冲腔相连通；流体储存腔与缓冲腔之间的管路上优选设有阀；所述阀优选石蜡阀；所述石蜡阀优选为流体储存腔漏斗状出口处的覆盖的石蜡；所述漏斗状出口为流体储存腔底部内壁开设的通孔且通孔纵剖面为漏斗形；优选地，所述通气管道的一端为开放端，分别设置在上游反应腔、缓冲分流单元的缓冲腔、中游反应腔、下游反应腔、流体储存腔的腔壁上的上游端并与腔内相连通；通气管道的另一端为可封闭端；优选地，流体储存腔的腔壁上设置的通气管道的可封闭端、以及上游反应腔的腔壁上设置的通气管道的可封闭端分别与设置在微流控芯片外壁上的通气孔相连通；优选地，所述微流控芯片外壁上还设置有加样孔；加样孔可通往上游反应腔内、和/或，加样孔可通往流体储存腔内；优选地，加样孔和通气孔均可密封。
8.优选地，流体储存腔、反应腔内设有阻流机构；所述阻流机构为可在非平行于流体流动方向上将腔内空间分隔但又能保持流体流动连通的结构；所述阻流机构选自：腔体上部内壁向内的凹陷，或腔体内的阻流板；所述的一种可多步时序反应的微流控芯片还包括：芯片固定槽；优选地，所述下游反应腔包括分配管道和分别与分配管道相连通的若干终端反应孔；若干终端反应孔优选均匀分布在分配管道的下游侧，优选地，各终端反应孔与流体储存单元的距离相同；流体最后到达的终端反应孔内空间大于其它各终端反应孔的孔内空间；优选地，所述管路均为虹吸管；优选地，各反应腔内设有干燥的反应试剂；优选地，所述反应试剂包括：核酸提取试剂、核酸释放剂、引物、核酸扩增所需的酶、扩增缓冲液、dntp。
9.所述微流控芯片为圆盘型结构或扇形结构；
在一些优选的实施例中，所述微流控芯片为圆盘型结构，从圆盘中心像圆盘边缘的方向为流体流动方向；所述微流控芯片上设有至少1套微流控系统；所述微流控系统a包括：反应液存储腔、预混腔、缓冲腔、分配管、多个反应孔、虹吸管、通气管道；距离圆盘中心最近的为反应液储存腔，做为流体储存单元；样品存储腔做为上游反应腔，其位于反应液储存腔的下游；所述预混腔做为中游反应腔，其包括：第一预混腔和第二预混腔，均位于样品存储腔的下游；第一预混腔为中游反应腔中流体先进入的反应腔，而第二预混腔为中游反应腔中流体后进入的反应腔；样品存储腔的出口通过虹吸管与第一预混腔的入口相连通，第一预混腔的出口通过虹吸管与第二预混腔的入口相连通；在第一预混腔和第二预混腔的下游还设置有分配管和多个反应孔，做为下游反应腔；分配管沿圆盘周缘的部分或全部平行设置，多个反应孔设置在分配管远离圆盘中心的一侧并分别与分配管相连通；多个反应孔即为所述终端反应孔；在反应液储存腔的下游、第一预混腔、第二预混腔的上游的位置还设置有2个缓冲腔，做为分流缓冲单元；2个缓冲腔之间通过虹吸管相连通；流体先进入的缓冲腔为上游缓冲腔；流体后进入的缓冲腔为下游缓冲腔；上游缓冲腔的入口通过虹吸管与其上游的反应液储存腔的出口相连通，该虹吸管上设有石蜡阀；上游缓冲腔的出口通过虹吸管与第一预混腔的入口相连通；下游缓冲腔的出口通过虹吸管与第二预混腔的入口相连通，且该虹吸管上设有至少1个界面阀；第二预混腔的出口通过虹吸管与下游反应腔的分配管的入口相连通；优选地，样品存储腔的出口、上游缓冲腔的出口、下游缓冲腔的出口、第一预混腔的出口、第二预混腔的出口均分别设置在各自腔壁上距离圆盘中心的最远端的位置；优选地，样品存储腔的入口为开设在微流控芯片的外壁上的加样孔；优选地，微流控芯片的外壁对应反应液储存腔的位置开设的通孔为加样孔；优选地，上游缓冲腔的入口、第一预混腔的入口、第二预混腔的入口、分配管的入口均分别设置在各自腔壁上距离圆盘中心的最近端的位置；优选地，反应液储存腔的腔壁上距离圆盘中心的最近端的位置与通气管道相连通；该通管道的可封闭端与芯片外壁上的通气孔相通；上游缓冲腔、第一预混腔各自的腔壁上距离圆盘中心的近端位置分别与通气管道的开放端相连通，该通气管的可封闭端与样品存储腔对应位置所在芯片外壁上的通气孔相连通；分配管道上流体最先进入的位置为起始端，最后到达的位置为末尾端；第一预混腔的腔壁上距离圆盘中心的最近端位置与通气管道的开放端相连通，该通气管道的可封闭端与分配管道的起始端相连通；第二预混腔的腔壁上距离圆盘中心的近端位置与通气管道的开放端相连通，该通气管道的可封闭端与分配管道的末尾端相连通；优选地，各通气管道均具有向接近圆盘中心的方向伸出的折弯结构。
10.优选地，第二预混腔距圆盘中心的距离略大于第一预混腔距圆盘中心的距离。
11.所述微流控芯片内设有2套微流控系统，包括微流控系统a和微流控系统b；微流控系统b内，缓冲腔设置1个，预混腔包括第三预混腔和第四预混腔；第四预混
腔设置在第三预混腔的下游；缓冲腔的出口通过虹吸管与第三预混腔的入口相连通，且该虹吸管上设有界面阀；第三预混腔的出口通过虹吸管与第四预混腔的入口相连通；微流控系统a内的第二预混腔的出口不与下游反应腔的分配管的入口连通，微流控系统a内的第二预混腔的出口通过虹吸管与微流控系统b的第四预混腔的入口相连通；微流控系统b的第四预混腔的出口通过虹吸管与分配管的入口相连通；优选地，圆盘中心为芯片固定槽的设置位置。
12.一种可多步时序反应的微流控方法，其特征在于，采用所述的一种可多步时序反应的微流控芯片对流体进行控制。
13.所述的一种可多步时序反应的微流控方法包括：（1）将流体样品自加样孔分别注入微流控芯片的上游反应腔的样品存储腔内，以及反应液存储腔内；（2）将微流控芯片置于流体流动驱动装置内或与流体流动驱动装置相连，启动流体流动驱动装置，使微流控芯片的反应液存储腔内的流体样品在流体流动驱动装置提供的驱动力下进入上游缓冲腔，同时使样品存储腔内的流体样品聚集至腔内底部；（3）调整驱动力大小，使样品存储腔内的流体样品经样品存储腔的出口进入虹吸管、上游缓冲腔内的部分流体样品经定量分流机构经上游缓冲腔的出口进入与下游缓冲腔连通的虹吸管内、上游缓冲腔内的另一部分经上游缓冲腔的出口进入与第一预混腔连通的虹吸管内；再次调整驱动力大小，使经样品存储腔的出口进入虹吸管的流体样品及经上游缓冲腔的出口进入与第一预混腔连通的虹吸管内的流体样品进入第一预混腔内，进行反应；（4）调整驱动力大小，使第一预混腔的流体样品经第一预混腔的出口进入虹吸管并突破界面阀充满整个虹吸管；再次调整驱动力大小，使经第一预混腔的出口进入虹吸管内的流体样品、以及下游缓冲腔内的流体样品均进入第二预混腔内，进行反应；（5）调整驱动力大小，第二预混腔内的流体样品经第二预混腔的出口进入虹吸管；再次调整驱动力大小，使经第二预混腔的出口进入虹吸管内的流体样品进入分配管道进而进入各终端反应孔，进行反应。
14.所述的一种可多步时序反应的微流控方法包括：（1）将流体样品自加样孔分别注入微流控芯片的微流控系统a和微流控系统b中的上游反应腔的样品存储腔内，以及反应液存储腔内；（2）将微流控芯片置于流体流动驱动装置内或与流体流动驱动装置相连，启动流体流动驱动装置，使微流控芯片的微流控系统a中：反应液存储腔内的流体样品在流体流动驱动装置提供的驱动力下进入上游缓冲腔，上游缓冲腔内的部分流体样品经定量分流机构经上游缓冲腔的出口的虹吸管进入下游缓冲腔内、同时使样品存储腔内的流体样品聚集至腔内底部；使微流控芯片的微流控系统b中：反应液存储腔内的流体样品在流体流动驱动装置提供的驱动力下进入上游缓冲腔；（3）调整驱动力大小，使微流控系统a中：使样品存储腔内的流体样品经样品存储腔的出口进入虹吸管、下游缓冲腔内的部分流体样品经下游缓冲腔的出口进入与第二预混腔连通的虹吸管内，上游缓冲腔内的另一部流体样品分经上游缓冲腔的出口进入与第一预
混腔连通的虹吸管内；使微流控系统b中：缓冲腔内的流体样品经缓冲腔的出口进入与第三预混腔连通的虹吸管内；再次调整驱动力大小，使微流控系统a中：使样品存储腔内的流体样品经样品存储腔的出口进入虹吸管进而进入第一预混腔内，上游缓冲腔的流体样品经上游缓冲腔的出口进入虹吸管进而进入第一预混腔内，进行反应；（4）调驱动力大小，使微流控系统a中：第一预混腔的流体样品经第一预混腔的出口进入虹吸管、经下游缓冲腔的出口进入与第二预混腔连通的虹吸管内的部分流体样品突破界面阀并充满整个虹吸管；使微流控系统b中：经缓冲腔的出口进入与第三预混腔连通的虹吸管内的流体样品突破界面阀并充满整个虹吸管；再次调整驱动力大小，使微流控系统a中：使经第一预混腔的出口进入虹吸管内的流体样品、以及下游缓冲腔内的流体样品均进入第二预混腔内，进行反应；使微流控系统b中：突破界面阀并充满整个虹吸管的流体样品进入第三预混腔中；（5）调驱动力大小，使微流控系统a中：第二预混腔内的流体样品经第二预混腔的出口进入虹吸管；使微流控系统b中：第三预混腔内的流体样品经第三预混腔的出口进入虹吸管；再次调整驱动力大小，使经第二预混腔的出口进入虹吸管的流体样品、和经第三预混腔的出口进入虹吸管的流体样品进入第四预混腔内，进行反应；（6）调整驱动力大小，第四预混腔内的流体样品经第四预混腔的出口进入虹吸管；再次调整驱动力大小，经第四预混腔的出口进入虹吸管的流体样品进入分配管道进而进入各反应孔内，进行反应；优选地，所述流体流动驱动装置选自：离心机、负压泵；优选地，所述驱动力选自：离心力、压力、重力；优选地，所述调整驱动力大小指降低或升高离心机转速、降低或升高负压泵的压力；优选地，所述反应选自：核酸提取反应、核酸释放反应、核酸扩增反应、细胞培养反应；优选地，所述流体样品选自反应液、或，待测样品；所述待测样品选自 由细胞培养液、血液、拭子涮洗液、脑脊液、肺泡灌洗液、尿液组成的组；所述反应液可以是液体形态的反应试剂。
15.所述的一种可多步时序反应的微流控芯片、和/或，所述的一种可多步时序反应的微流控方法 在核酸提取、和/或，核酸释放、和/或，核酸扩增检测、和/或，环境监测、和/或，食品检测、和/或，法医鉴定方面的应用。根据本发明提出的用于多步反应的离心式微流控芯片能够实现核酸的多步扩增反应与检测，既可以实现恒温扩增的多步反应，也能够实现巢式pcr的扩增检测，操作流程简单，可并行高通量检测，具有很高的临床应用价值，促进分子诊断的普及。
16.本发明对现有技术做出的核心贡献在于：通过芯片上各腔体的巧妙连接以及各部件机构的协同作用解决离心式芯片实现核酸多指标高灵敏度的检测。具体为，流体储存单元的石蜡阀解决了芯片上稳定存储试剂以及试剂可控释放的问题；同时，整个芯片的腔体结构布局实现多步扩增反应的可控有序进行；整个芯片的腔体结构布局包括：虹吸管道在腔体之间的位置设置及其在芯片上下游腔体以及腔体之间的连接。此外缓冲分流单元以及定量分流机构的设置解决了各步反应以及液体转移的精确定量，使整个芯片控制更稳定。
17.本发明对微流控芯片中各环节所涉及的腔体、管路等部件均做出了巧妙且简单的结构设计，例如，上游反应腔内的台阶、中游反应腔与下游反应腔之间的管路上的界面阀、以及缓冲分流单元内的定量分流机构，同时本发明对腔体、管路等各部件之间的位置、连接关系也做了创新性调整，这使得本发明无需通过任何额外的智能控制，仅需简单调整离心力大小，即离心机转速就可实现稳定的按预设顺序及反应程度，逐步时序地进行分步反应。基于上述各部件结构的创新以及各部件之间结构位置连接关系形成的整体，本发明集成出两套具有代表性的微流控系统，为本领域提供了一套可行且有效的实现多步时序反应的单元化、集成化、系统化的微流控系统及基于该系统的微流控芯片和方法，可根据具体的实践需要将本发明的微流控系统、芯片、方法进行灵活组合、定制使用，既适用于常规简单操作，也可集成大规模的微流控系统群、芯片群进行多指标、多重复、高通量检测。不仅如此，采用本发明的芯片、方法进行反应检测，能保持很高的检测灵敏度，完全能满足各类生物实验，尤其适用于大规模临床诊断，高效灵敏、操作便捷、应用范围极为广泛。
附图说明
18.本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1a为根据本发明的一个实施例的微流控芯片的正面结构示意图；图1b为根据本发明的另一个实施例的微流控芯片的背面结构示意图；图2为根据本发明的一个实施例的微流控芯片石蜡阀局部结构示意图；图3a为根据本发明的一个实施例的微流控芯片工作时步骤（1）中液体流向示意图；图3b为根据本发明的另一个实施例的微流控芯片工作时步骤（2）中液体流向示意图；图3c为根据本发明的另一个实施例的微流控芯片工作时步骤（3）中液体流向示意图；图3d为根据本发明的一个实施例的微流控芯片工作时步骤（4）中液体流向示意图；图3e为根据本发明的一个实施例的微流控芯片工作时步骤（5）中液体流向示意图；图4a为根据本发明的一个实施例的微流控芯片的正面结构示意图；图4b为根据本发明的另一个实施例的微流控芯片的背面结构示意图；图5a为根据本发明的另一个实施例的微流控芯片工作时步骤（1）中液体流向示意图；图5b为根据本发明的一个实施例的微流控芯片工作时步骤（2）中液体流向示意图；图5c为根据本发明的另一个实施例的微流控芯片工作时步骤（3）中液体流向示意图；图5d为根据本发明的一个实施例的微流控芯片工作时步骤（4）中液体流向示意图；
图5e为根据本发明的一个实施例的微流控芯片工作时步骤（5）中液体流向示意图；图5f为根据本发明的另一个实施例的微流控芯片工作时步骤（6）中液体流向示意图；图6为根据本发明的一个实施例的微流控芯片的流体储存单元的流体储存腔的石蜡阀的纵切面结构示意图。
19.图7为根据本发明的另一个实施例的微流控芯片的上游反应腔（样品存储腔）内防接触机构的结构示意图。
20.图中标记列示如下：100
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微流控芯片；101
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芯片固定槽；102
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反应液存储腔；103
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样品存储腔；104
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第一预混腔；104b
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第三预混腔；105
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虹吸管；106
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通气管道；107
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石蜡阀；108a
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上游缓冲腔；108b
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下游缓冲腔；108c
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第二下游缓冲腔；109
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第二预混腔；110
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分配管道；111
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终端反应孔；112
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界面阀；113
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上游缓冲腔与下游缓冲腔之间的管道；114
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反应液储存腔与缓冲腔之间的直通管道；115
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通气孔；116
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加样孔；117
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第四预混腔。
具体实施方式
21.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细的说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的发明构思和创新原理之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
22.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
23.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
24.第1组实施例、本发明的可多步时序反应的微流控芯片本组实施例提供一种可多步时序反应的微流控芯片。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述可多步时序反应的微流控芯片包括：反应腔、缓冲分流单元、以及可连通反应腔和缓冲分流单元的管路；所述反应腔沿流体流动方向从上游、中游至下游依次设置若干个；上游反应腔的出口可通过管路与中游反应腔的入口相连通；中游反应腔可通过管路与下游反应腔相连通；缓冲分流单元可暂时储存或缓冲流体并分流流体；缓冲分流单元的出口可经管路与中游反应腔相连通；中游反应腔上、缓冲分流单元内均设有定量分流机构。
25.在一些实施例中，所述反应腔内设有防接触机构；所述防接触机构选自：设置在反应腔出口处的反应腔底部内壁上的凸起、或，与反应腔出口外接的突出空间、或，设置在反应腔的腔壁上远离下游端延伸出的突出空间、或，毛细管向远离下游端方向伸出的折弯结构；凸起或突出空间可有效防止进入反应腔内的流体在反应完成前接触反应腔出口进而进入与出口连接的管路，也可防止液体进入与反应腔内连通的通气管；例如，图1a中，做为中游反应腔的第一预混腔104右侧的突出空间就是为了调整进入第二预混腔109的液体的体积，此情形下虹吸管105的入口直接与突出空间的距圆盘中心的最远端相连通；第二预混腔109右侧的突出空间也是为了保证液体在第二预混腔109内震荡混合时不会进入虹吸管105内，虹吸管105的入口直接与突出空间的距圆盘中心的最远端相连通；第一预混腔104上部延伸出的突出空间直接与通气管道106相接，可有效避免液体在第一预混腔104内震荡混合
时，液体回流到通气管道106；另外，虹吸管105向远离下游端方向伸出的折弯结构，且该折弯结构的最高点高于上游缓冲腔与下游缓冲腔之间的管道113，该折弯结构的设置可使高速离心下的芯片的上游缓冲腔108a中的液体不与虹吸管105接触而只向上游缓冲腔与下游缓冲腔之间的管道113流出并进入下游缓冲腔108b。
26.本文中，第一预混腔104、第二预混腔109、第三预混腔104b、第四预混腔117均属于中游反应腔；上游缓冲腔108a、下游缓冲腔108b、第二下游缓冲腔108c均属于分流缓冲单元；样品存储腔103属于上游反应腔；反应液存储腔102即流体储存腔；分配管道110、终端反应孔111均属于下游反应腔；终端反应孔111在本文中的其它一些地方也表述为“多个反应孔”或“反应孔”。
27.所述凸起优选正面投影呈三角形的台阶，如图7所示；三角形的台阶的斜面朝向流体流入反应腔的方向，三角形的台阶与反应腔出口所在的侧壁之间存在空隙，该空隙与出口相通；优选地，中游反应腔与下游反应腔之间的管路上设有界面阀，所述界面阀直径大于所述管路直径，能够起到液体界面隔离的作用；进一步优选地，所述微流控芯片还包括流体储存单元；流体储存单元位于反应腔的上游；所述流体储存单元可通过管路与缓冲分流单元相连通；优选地，所述缓冲分流单元按流体流动方向包括至少2个缓冲腔；相邻的缓冲腔之间可通过管路相连通；优选地，按流体进入的先后顺序设置至少2个中游反应腔；相邻的中游反应腔之间可通过管路相连通；优选地，所述定量分流机构为设置在反应腔或缓冲腔的腔壁上的高度可调的开口：在一些实施例中，所述高度可调的开口可以设置成：开口底沿所在腔壁的内部设有可上下滑动的、形状大小与开口周缘对应的腔壁相适配且密封接触的开合门，开合门的上下移动位置即可决定开口的高度；可通过调整在反应腔或缓冲腔的腔壁上开口的高度，来实现进入下游缓冲腔液体量的调整。可被分流的流体量q满足下述关系式：q=q
‑
sh，其中：进入芯片内部的流体总量q，开口高度h，中游反应腔底面积s；优选地，所述高度可调的开口与管路相连通。
28.在进一步的实施例中，所述的一种可多步时序反应的微流控芯片还包括：通气单元；所述通气单元包括设置在微流控芯片内部的通气管道、和/或，设置在微流控芯片上的通气孔；优选地，流体储存单元包括：至少1个流体储存腔；流体储存腔可通过管路与缓冲分流单元的位于上游的缓冲腔相连通；流体储存腔与缓冲腔之间的管路上优选设有阀；所述阀优选石蜡阀；所述石蜡阀优选为流体储存腔漏斗状出口处的覆盖的石蜡；所述漏斗状出口为流体储存腔底部内壁开设的通孔且通孔纵剖面为漏斗形，石蜡覆盖封堵于漏斗嘴较小一端的出口所在的较细管状部位的顶端；通孔的纵切面呈漏斗形，这样设计容易保证熔化的石蜡能够顺着漏斗壁完全密封通孔，漏斗形状是最优的；芯片在工作状态下处于高温环境，石蜡受热熔化即可打开石蜡阀使通孔保持畅通，如图6所示，流体进入通孔流向缓冲腔。
29.优选地，所述通气管道的一端为开放端，分别设置在上游反应腔、缓冲分流单元的缓冲腔、中游反应腔、下游反应腔、流体储存腔的腔壁上的上游端并与腔内相连通；通气管道的另一端为可封闭端；优选地，流体储存腔的腔壁上设置的通气管道的可封闭端、以及上游反应腔的腔壁上设置的通气管道的可封闭端分别与设置在微流控芯片外壁上的通气孔相连通；优选地，所述微流控芯片外壁上还设置有加样孔；加样孔可通往上游反应腔内、和/或，加样孔可通往流体储存腔内；优选地，加样孔和通气孔均可密封，在本发明的微流控芯片工作时，整个芯片相对于外界而言是一个整体密封状态，可采用本领域常见的密封手段或密封部件对加样孔或通气孔进行密封操作；例如，密封部件可选用形状大小与加样孔/通气孔相适配的密封盖，或者通过紫外固化胶进行密封。
30.优选地，流体储存腔、反应腔内设有阻流机构，可使流体自加样孔进入腔体后，能够顺利地进入并填充腔体内部而不会从通气孔溢出；所述阻流机构为可在非平行于流体流动方向上将腔内空间分隔但又能保持流体流动连通的结构；所述阻流机构选自：腔体上部内壁向内的凹陷，或腔体内的阻流板。
31.在更进一步的实施例中，所述的一种可多步时序反应的微流控芯片还包括：芯片固定槽，可通过该芯片固定槽将整个微流控芯片固定于流体流动驱动装置上；流体流动驱动装置为流体在芯片内部流动提供驱动力，该驱动力可以是离心力、重力、压力；流体流动驱动装置可以选自离心机、负压泵等；优选地，所述下游反应腔包括分配管道和分别与分配管道相连通的若干终端反应孔；若干终端反应孔优选均匀分布在分配管道的下游侧，优选地，各终端反应孔与流体储存单元的距离相同；流体最后到达的终端反应孔内空间大于其它各终端反应孔的孔内空间，为了收集多余的流体，做废液池使用；优选地，所述管路均为虹吸管，本发明中使用的虹吸管具有亲水特性，液体接触虹吸管可产生虹吸效应并顺利进入虹吸管内。虹吸管做为流体通道，其容积相对于反应腔体的体积可以忽略不计。
32.优选地，各反应腔内设有干燥的反应试剂；可通过本领域常见的干燥手段，例如，冻干技术，将反应试剂以干燥形态固定附着于反应腔内壁上，待流体进入反应腔内即可将附着于内壁上的反应试剂溶解并发挥其正常用途；优选地，所述反应试剂包括：核酸提取试剂、核酸释放剂、引物、核酸扩增所需的酶、扩增缓冲液、dntp；所述核酸提取试剂可商购获得，例如：天根生物核酸提取试剂、圣湘生物核酸提取试剂、达安基因核酸提取试剂；优选地，所述核酸释放剂选自：异硫氰酸胍、十二烷基硫酸锂、tritonx
‑
100、tris、nacl；所述核酸扩增所需的酶选自：taq酶、bst dna聚合酶、耐高温逆转录酶；所述扩增缓冲液选自：tris
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hcl、kcl、peg35000。
33.在具体的实施例中，所述微流控芯片为圆盘型结构或扇形结构；
在一些优选的实施例中，所述微流控芯片为圆盘型结构，从圆盘中心像圆盘边缘的方向为流体流动方向；所述微流控芯片上设有至少1套微流控系统；所述微流控系统a包括：反应液存储腔、预混腔、缓冲腔、分配管、多个反应孔、虹吸管、通气管道；距离圆盘中心最近的为反应液储存腔，做为流体储存单元；样品存储腔做为上游反应腔，其位于反应液储存腔的下游；所述预混腔做为中游反应腔，其包括：第一预混腔和第二预混腔，均位于样品存储腔的下游；第一预混腔为中游反应腔中流体先进入的反应腔，而第二预混腔为中游反应腔中流体后进入的反应腔；样品存储腔的出口通过虹吸管与第一预混腔的入口相连通，第一预混腔的出口通过虹吸管与第二预混腔的入口相连通；在第一预混腔和第二预混腔的下游还设置有分配管和多个反应孔，做为下游反应腔；分配管沿圆盘周缘的部分或全部平行设置，多个反应孔设置在分配管远离圆盘中心的一侧并分别与分配管相连通；多个反应孔即为所述终端反应孔；在反应液储存腔的下游、第一预混腔、第二预混腔的上游的位置还设置有2个缓冲腔，做为分流缓冲单元；2个缓冲腔之间通过虹吸管相连通；流体先进入的缓冲腔为上游缓冲腔；流体后进入的缓冲腔为下游缓冲腔；上游缓冲腔的入口通过虹吸管与其上游的反应液储存腔的出口相连通，该虹吸管上设有石蜡阀；上游缓冲腔的出口通过虹吸管与第一预混腔的入口相连通；下游缓冲腔的出口通过虹吸管与第二预混腔的入口相连通，且该虹吸管上设有至少1个界面阀；第二预混腔的出口通过虹吸管与下游反应腔的分配管的入口相连通；优选地，样品存储腔的出口、上游缓冲腔的出口、下游缓冲腔的出口、第一预混腔的出口、第二预混腔的出口均分别设置在各自腔壁上距离圆盘中心的最远端的位置；优选地，样品存储腔的入口为开设在微流控芯片的外壁上的加样孔；优选地，微流控芯片的外壁对应反应液储存腔的位置开设的通孔为加样孔；优选地，上游缓冲腔的入口、第一预混腔的入口、第二预混腔的入口、分配管的入口均分别设置在各自腔壁上距离圆盘中心的最近端的位置；优选地，反应液储存腔的腔壁上距离圆盘中心的最近端的位置与通气管道相连通；该通管道的可封闭端与芯片外壁上的通气孔相通；上游缓冲腔、第一预混腔各自的腔壁上距离圆盘中心的近端位置分别与通气管道的开放端相连通，该通气管的可封闭端与样品存储腔对应位置所在芯片外壁上的通气孔相连通；分配管道上流体最先进入的位置为起始端，最后到达的位置为末尾端；第一预混腔的腔壁上距离圆盘中心的最近端位置与通气管道的开放端相连通，该通气管道的可封闭端与分配管道的起始端相连通；第二预混腔的腔壁上距离圆盘中心的近端位置与通气管道的开放端相连通，该通气管道的可封闭端与分配管道的末尾端相连通；优选地，各通气管道均具有向接近圆盘中心的方向伸出的折弯结构，可增加气体通路的实际空间，有效提供空气流通路径，提升通气效果，使芯片内部的流体流动更畅通无阻。
34.优选地，第二预混腔距圆盘中心的距离略大于第一预混腔距圆盘中心的距离。
35.在另一些实施例中，所述微流控芯片内设有2套微流控系统，包括微流控系统a和微流控系统b；微流控系统b内，缓冲腔设置1个，预混腔包括第三预混腔和第四预混腔；第四预混腔设置在第三预混腔的下游；缓冲腔的出口通过虹吸管与第三预混腔的入口相连通，且该虹吸管上设有界面阀；第三预混腔的出口通过虹吸管与第四预混腔的入口相连通；微流控系统a内的第二预混腔的出口不与下游反应腔的分配管的入口连通，微流控系统a内的第二预混腔的出口通过虹吸管与微流控系统b的第四预混腔的入口相连通；微流控系统b的第四预混腔的出口通过虹吸管与分配管的入口相连通；优选地，圆盘中心为芯片固定槽的设置位置。
36.第2组实施例、本发明的可多步时序反应的微流控方法本组实施例提供一种可多步时序反应的微流控方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：采用第1组实施例任一项所提供的一种可多步时序反应的微流控芯片对流体进行控制。
37.在一些具体的实施例中，所述的一种可多步时序反应的微流控方法，包括：（1）将流体样品自加样孔分别注入微流控芯片的上游反应腔的样品存储腔内，以及反应液存储腔内；（2）将微流控芯片置于流体流动驱动装置内或与流体流动驱动装置相连，启动流体流动驱动装置，使微流控芯片的反应液存储腔内的流体样品在流体流动驱动装置提供的驱动力下进入上游缓冲腔，同时使样品存储腔内的流体样品聚集至腔内底部；（3）调整驱动力大小，使样品存储腔内的流体样品经样品存储腔的出口进入虹吸管、上游缓冲腔内的部分流体样品经定量分流机构经上游缓冲腔的出口进入与下游缓冲腔连通的虹吸管内、上游缓冲腔内的另一部分经上游缓冲腔的出口进入与第一预混腔连通的虹吸管内；再次调整驱动力大小，使经样品存储腔的出口进入虹吸管的流体样品及经上游缓冲腔的出口进入与第一预混腔连通的虹吸管内的流体样品进入第一预混腔内，进行反应；（4）调整驱动力大小，使第一预混腔的流体样品经第一预混腔的出口进入虹吸管并突破界面阀充满整个虹吸管；再次调整驱动力大小，使经第一预混腔的出口进入虹吸管内的流体样品、以及下游缓冲腔内的流体样品均进入第二预混腔内，进行反应；（5）调整驱动力大小，第二预混腔内的流体样品经第二预混腔的出口进入虹吸管；再次调整驱动力大小，使经第二预混腔的出口进入虹吸管内的流体样品进入分配管道进而进入各终端反应孔，进行反应。
38.在另一些实施例中，所述的一种可多步时序反应的微流控方法包括：（1）将流体样品自加样孔分别注入微流控芯片的微流控系统a和微流控系统b中的上游反应腔的样品存储腔内，以及反应液存储腔内；（2）将微流控芯片置于流体流动驱动装置内或与流体流动驱动装置相连，启动流体流动驱动装置，使微流控芯片的微流控系统a中：反应液存储腔内的流体样品在流体流动驱动装置提供的驱动力下进入上游缓冲腔，上游缓冲腔内的部分流体样品经定量分流机构经上游缓冲腔的出口的虹吸管进入下游缓冲腔内、同时使样品存储腔内的流体样品聚集至
腔内底部；使微流控芯片的微流控系统b中：反应液存储腔内的流体样品在流体流动驱动装置提供的驱动力下进入上游缓冲腔；（3）调整驱动力大小，使微流控系统a中：使样品存储腔内的流体样品经样品存储腔的出口进入虹吸管、下游缓冲腔内的部分流体样品经下游缓冲腔的出口进入与第二预混腔连通的虹吸管内，上游缓冲腔内的另一部流体样品分经上游缓冲腔的出口进入与第一预混腔连通的虹吸管内；使微流控系统b中：缓冲腔内的流体样品经缓冲腔的出口进入与第三预混腔连通的虹吸管内；再次调整驱动力大小，使微流控系统a中：使样品存储腔内的流体样品经样品存储腔的出口进入虹吸管进而进入第一预混腔内，上游缓冲腔的流体样品经上游缓冲腔的出口进入虹吸管进而进入第一预混腔内，进行反应；（4）调驱动力大小，使微流控系统a中：第一预混腔的流体样品经第一预混腔的出口进入虹吸管、经下游缓冲腔的出口进入与第二预混腔连通的虹吸管内的部分流体样品突破界面阀并充满整个虹吸管；使微流控系统b中：经缓冲腔的出口进入与第三预混腔连通的虹吸管内的流体样品突破界面阀并充满整个虹吸管；再次调整驱动力大小，使微流控系统a中：使经第一预混腔的出口进入虹吸管内的流体样品、以及下游缓冲腔内的流体样品均进入第二预混腔内，进行反应；使微流控系统b中：突破界面阀并充满整个虹吸管的流体样品进入第三预混腔中；（5）调驱动力大小，使微流控系统a中：第二预混腔内的流体样品经第二预混腔的出口进入虹吸管；使微流控系统b中：第三预混腔内的流体样品经第三预混腔的出口进入虹吸管；再次调整驱动力大小，使经第二预混腔的出口进入虹吸管的流体样品、和经第三预混腔的出口进入虹吸管的流体样品进入第四预混腔内，进行反应；（6）调整驱动力大小，第四预混腔内的流体样品经第四预混腔的出口进入虹吸管；再次调整驱动力大小，经第四预混腔的出口进入虹吸管的流体样品进入分配管道进而进入各反应孔内，进行反应；优选地，所述流体流动驱动装置选自：离心机、负压泵；优选地，所述驱动力选自：离心力、压力、重力；优选地，所述调整驱动力大小指降低或升高离心机转速、降低或升高负压泵的压力；优选地，所述反应选自：核酸提取反应、核酸释放反应、核酸扩增反应、细胞培养反应；优选地，所述流体样品选自反应液、或，待测样品；所述待测样品选自 由细胞培养液、血液、拭子涮洗液、脑脊液、肺泡灌洗液、尿液组成的组；所述反应液可以是液体形态的反应试剂。
39.第3组实施例、本发明的微流控芯片及方法的应用本组实施例提供本发明的微流控芯片或微流控方法的具体应用。
40.本组实施例的特征是：第1组实施例任一项所提供的一种可多步时序反应的微流控芯片、和/或，第2组实施例任一项所提供的一种可多步时序反应的微流控方法 在核酸提取、和/或，核酸释放、和/或，核酸扩增检测、和/或环境监测、食品检测、法医鉴定方面的应用。
41.下面结合附图并通过2个最具体的实验例对本发明的微流控芯片和微流控方法做
进一步详细描述：实验例1如图1a和图1b所示，本实验例所提供的微流控芯片100主体为碟式芯片，可以辐射状排布多个单元。图中所示单个单元，包括芯片固定槽101，两个加样孔116和至少两个通气孔115，所述两个加样孔116分别与反应液存储腔102和样品存储腔103底部相通；所述反应液存储腔102通过芯片背面的反应液储存腔与缓冲腔之间的直通管道114与分流缓冲单元的上游缓冲腔108a相通，所述反应液储存腔与缓冲腔之间的直通管道114的一端被石蜡阀107密封（如图2）；所述上游缓冲腔108a与下游缓冲腔108b通过靠近离心中心侧的上游缓冲腔与下游缓冲腔之间的管道113相通；所述样品存储腔103通过虹吸管105与其下游的第一预混腔104相连，进一步所述样品存储腔103和上游缓冲腔108a位于其下游的第一预混腔104靠近离心中心的内侧；所述上游缓冲腔108a通过虹吸管105与第一预混腔104相连；所述第一预混腔104通过虹吸管105与第二预混腔109相连；所述下游缓冲腔108b通过设有界面阀112的虹吸管105与所述第二预混腔109相连；所述第二预混腔109位于所述下游反应腔的分配管道110的内侧，通过虹吸管105连通分配管道110，所述下游反应腔的分配管道110与终端反应孔111连通，所述终端反应孔111位于远离离心中心的最外侧，以离心中心为圆心沿周向等间隔分布。通气管115与样品存储腔103相通。
42.图1a中，虹吸管105、通气管道106这几条管路上方对应的分别连接样品存储腔103右上角和上游缓冲腔108a左上角的横向通道也为通气管道；通气管道106的下端与终端反应孔111相通；最右侧的两个虹吸管105中间的斜向管道也是通气管道，分流缓冲单元的下游缓冲腔108b和中游反应腔的第二预混腔109以及下游反应腔的分配管道110通过该管道自通气；反应液存储腔102和上游缓冲腔108a通过图1b的芯片背面的反应液储存腔与缓冲腔之间的直通管道114连接；芯片的腔体之间的连接管道多数是虹吸管，如虹吸管105，虹吸管在离心式微流控芯片中应用较多，在高速离心时，因离心力远大于毛细作用力，这些虹吸管道不充满液体，从而不能让液体转移，停止离心或低速离心时，因为这些管道都是亲水的，从而因为毛细作用而填充这些管道，再次离心时，这些管道就能虹吸液体，从而让液体从上游腔体转移到下游腔体中，此为离心式微流控技术中很基础和常见的工作原理，并且在下面的芯片使用方法中有进一步介绍。
43.进一步，所述上游反应腔的样品存储腔103与虹吸管105相连处设有凸出于所述上游反应腔底部呈三角状的台阶，保证加样时样本不直接接触虹吸管105被填充，只有离心时才可接触虹吸管105；进一步，所述虹吸管105具有亲水特性，与芯片静止或低速离心时与水相液体接触会因毛细作用而填充满液体。
44.进一步，如图2所示，所述石蜡阀107呈漏斗形结构，加入熔化的石蜡，熔化的石蜡因为重力作用而进入通孔，石蜡冷却凝固后能堵住通孔，即实现阀的关闭。使用时，芯片整体被加热导致石蜡熔化，这时在通孔中的石蜡会因为受到垂直于通孔的离心力作用而从通孔中被离出，从而实现阀在离心时的打开。熔化的石蜡会被离入其下游的分流缓冲单元的上游缓冲腔108a，因为石蜡不溶于反应体系，且量少，所以不会对反应液或样品造成污染。
现有技术公开的常规石蜡阀的结构通常是在管道上设置小坑加入石蜡。而本发明的石蜡阀是通过通孔的漏斗形结构设置的，经反复试验验证，漏斗形设计更有利于可控地释放上游试剂到下游腔体中，同时利于芯片的加工、装配。
45.进一步，所述样品存储腔103、所述上游缓冲腔108a和所述第一预混腔104之间，所述第一预混腔104和所述分配管道110之间，所述通气孔115和所述反应液存储腔102之间，所述下游缓冲腔108b、所述第二预混腔109和所述分配管道110之间，分别设有相连的通气管道106；以上通气管能保证芯片在整体密封的情况下，芯片离心时各部分的液体顺畅流动。通气管道是靠近离心中心的，在离心控制过程中与离心力方向相反，因此液体不会进入通气管道。也可以通过疏水试剂修饰各个通气管道来进一步保证液体不会进入通气管道。
46.进一步，所述虹吸管105设置有界面阀112，用于实现流体程序性控制填充虹吸管道。界面阀设置于虹吸管道上，直径略大于虹吸管道，呈圆形浅坑。程序性控制流程：当液体进入下游缓冲腔108b中后，先低速离心或停止离心，此时液体会填充虹吸管105，当液体流到界面阀112时，高速离心此时液体不会突破界面阀；随后快速高低速切换，液体会突破界面阀112，随后低速离心或停止离心，液体会继续填充虹吸管105，依次类推。
47.进一步，所述虹吸管105入口位于样品存储腔103远离离心中心的外侧，所述虹吸管105入口位于所述缓冲腔108a远离离心中心的外侧，所述虹吸管105入口位于所述下游缓冲腔108b远离离心中心的外侧，所述虹吸管105入口位于所述第二预混腔109远离离心中心的外侧，这样的设计可以保证各个对应腔室中的液体完全转移到下游腔室管道中；所述虹吸管105入口位于所述第一预混腔104侧壁中间位置，为了实现只转移一定体积的预扩增液，进而控制第一预混腔104中的液体与预扩增液按一定比例混合。高于虹吸管道入口处的液体都会流入下游腔室，低于虹吸管道入口处的液体会留在原腔体，由于上游腔体的出口与虹吸管道入口相连，所以可通过上游腔体出口的腔壁上的高度可调的开口来控制进入下游腔体的液体量。由于第一预混腔104反应腔右侧设置的突出空间一方面起防接触机构的作用，另一方面突出空间的壁与第一预混腔104腔壁上设置的高度可调的开口衔接，通过调整该开口的高度来够调整其进入第二预混腔109内液体的量，该突出空间定量分流的作用原理与上游缓冲腔108a的高度可调的开口相似，本质都是通过调整设置在上下游两个腔连接管道的高度，来实现进入下一个腔的液体量。由于开口有高度设定，因此图3e中各终端反应孔111填满后，第一预混腔104中还剩余部分液体。进一步，所述虹吸管105具有亲反应液的特性，若反应液为水相，则具有亲水特性。
48.另一方面，本实验例还提供了上述芯片的使用方法，如图3a至图3e所描述，包括下述步骤：（1）如图3a所示，将样品溶液由加样孔116注入芯片的样品存储腔103，样品存储腔103中预先放置了裂解试剂
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冻干的核酸释放剂，用于释放核酸样本，反应液由加样孔116注入芯片反应液存储腔102，密封芯片加样孔116和通气孔115，随后控制具有离心和温控功能的设备操纵芯片；（2）将芯片置于控制设备中进行离心操作，同时加热芯片融化石蜡，使得石蜡阀107打开，在离心力的作用下，如图3b所示，分别把反应液从反应液存储腔102中直接离心进入上游缓冲腔108a中，多余的反应液通过上游缓冲腔与下游缓冲腔之间的管道113进入下游缓冲腔108b中（由于这一步中，芯片处于高速离心状态，而上游缓冲腔108a右侧底部连接
的虹吸管105虽然位置相比上游缓冲腔与下游缓冲腔之间的管道113更低，但虹吸管105具有向远离下游端方向伸出的折弯结构，该折弯结构的最高点高于上游缓冲腔与下游缓冲腔之间的管道113，所以液体在较大的离心力下只会进入下游缓冲腔108b，而不会进入虹吸管105管道），与此同时样品存储腔103中的样品被离心到腔体底部，进行样品裂解核酸释放；本领域公知，当芯片在高速离心的时候，不会进入毛细管道的，通过控制高速离心的时间来保证反应时长的。
49.（3）随后，如图3c所示，停止离心或将芯片转速降低到一定程度，样品存储腔103中的液体通过毛细作用进入虹吸管105，上游缓冲腔108a中的液体通过毛细作用进入虹吸管105，下游缓冲腔108b中的液体通过毛细作用进入虹吸管105中，但由于界面阀112的作用无法完全填充满管道，之后再次高速离心，使样品存储腔103中裂解后的样本和上游缓冲腔108a中的反应液离心到位于其下游的第一预混腔104中，通过加减速或正反旋转混匀，此时样品复溶预先冻干在第一预混腔104中的扩增体系和引物，之后加热温控，使得第一预混腔104中的第一步多重核酸扩增进行，即第一步扩增（也称预反应）；只要保证高速离心，就可确保第一预混腔104中的液体不与虹吸管105相接触而进入下一个腔体：第二预混腔109；（4）预反应后，如图3d所示，停止离心或将芯片转速降低到一定程度，第一预混腔104中的液体通过毛细作用进入虹吸管105，下游缓冲腔108b中的液体通过毛细作用突破界面阀112，具体为，可以通过高低切换离心机转速，来实现界面阀的突破，该界面阀突破的操作为本领域常规操作，具体可参考中国专利201610843719.0一文的记载；突破界面阀112的液体完全填充满虹吸管105，之后再次高速离心，使第一预混腔104中定量的部分预反应后的样本和下游缓冲腔108b中的反应液离心到第二预混腔109中，其中第二预混腔109中有第二步扩增所需的冻干试剂，通过加减速或正反旋转混匀，进行第二步扩增；步骤（3）的第一步扩增可以设置37度加热第一预混腔104进行重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, rpa)反应的预扩增，随后通过中游反应腔的第二预混腔109分配进入各个腔室：终端反应孔111进行rpa反应的第二步扩增，即步骤（4）的第二步扩增。也可以步骤（3）的第一步扩增先设置37度第一预混腔104进行rpa第一步预扩增，之后步骤（4）的第二步扩增设置65度在终端反应孔111内进行第二步环介导等温扩增法反应（loop
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mediated isothermal amplification, lamp）扩增进行扩增反应过程中，芯片不需要一直保持着正反旋运动，可以静止也可以保持一个方向旋转；这种运动状态下的扩增反应不仅不会影响扩增效果，而且还可保证腔体之间的无交叉污染。
50.（5）停止离心或将芯片转速降低到一定程度，如图3e所示，第二预混腔109中的液体会通过毛细作用进入虹吸管道105，随后高速离心芯片，第二预混腔109中的液体会全部进入分配管道110，进而分配进各终端反应孔111，其中终端反应孔111中固定有引物，完成分配后最后一个终端反应孔111充当废液池不完全填充满，其他终端反应孔111均填满，且分配管道110中没有液体残留；位于最下游端（末端）的最后1个反应孔的容积q`大于前面的各非末端反应孔的容积q，各非末端反应孔的容积q相同；全部反应孔的数量为n；进入芯片内部的液体总量q满足下述条件：nq＜q＜（n
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1）q q`，根据上述关系式确定液体总量并注入芯片内，这样就能够保证液体的量是恰好能够填充满前面n
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1个非末端的扩增反应腔，而
又不会过量。分配管道可以不采用亲水性的虹吸管，用常规管道即可。
51.（6）其后各终端反应孔111中独立进行各指标的反应。
52.实验例2下述为本发明实验例2的详细阐述，在本发明第二个实验例中，如图4a和图4b所示，本实验例与实验例1的区别在于：本实验例微流控芯片包括2个微流控系统a和b，微流控系统a与实验例1基本一致，但不设置石蜡阀；增加的微流控系统b中包含两个反应液存储腔102，2个反应液存储腔102中都设有阻流机构；增加了一个第二下游缓冲腔108c，增加了一个第三预混腔104b，增加了一个第四预混腔117，以及增加了对应的虹吸管105和通气管道106，去除了石蜡阀结构，变为两个反应液储存腔与缓冲腔之间的直通管道114，无石蜡阀的情况下，反应液储存腔与缓冲腔之间的直通管道114通常采用不具有亲水特性的常规管道或者疏水管道，反应液加入反应液存储腔102中并不会因接触反应液储存腔与缓冲腔之间的直通管道114而直接进入上游缓冲腔108a、第二下游缓冲腔108c，只有通过高速离心才会进入下游腔体。这样设计带来的好处在于可以由两步扩增检测反应变为三步扩增检测反应，进一步提高检测灵敏度和特异性。由于本发明的芯片上实现多步核酸扩增检测反应，相比传统的一步法扩增检测，可以在保证检测指标数的基础上，极大提升检测灵敏度。只要是有预扩增的核酸扩增反应，它的检测灵敏度肯定比传统的只有一步扩增反应灵敏度高，这是本领域技术人员所公知的。
53.本实验例中的芯片的材料、加工方法与实验例1中的内容一致，这里不再赘述。
54.另一方面，本发明还提供了上述芯片的使用方法，如图5a到5f所示，包括下述步骤：（1）如图5a所示，将样品溶液由加样孔116注入芯片样品存储腔103，上游反应腔的样品存储腔103中预先放置了裂解试剂
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冻干的核酸释放剂，用于释放核酸样本，反应液分别由加样孔116注入芯片反应液存储腔102中，密封芯片加样孔116和通气孔115，分别与样品存储腔103，反应液存储腔102腔相连通，随后控制具有离心和温控功能的设备操纵芯片；（2）将芯片置于控制设备中进行离心操作，在离心力的作用下，如图5b所示，分别把反应液从反应液存储腔102中直接离心进入分流缓冲单元的上游缓冲腔108a和分流缓冲单元的第二下游缓冲腔108c中，分流缓冲单元的上游缓冲腔108a中多余的反应液通过分流缓冲单元的上游缓冲腔与下游缓冲腔之间的管道113进入分流缓冲单元的下游缓冲腔108b中，与此同时上游反应腔的样品存储腔103中的样品被离心到腔体底部，进行样品裂解核酸释放；非离心状态下的反应液存储腔102中的液体不会通过管道进入上游缓冲腔108a和第二下游缓冲腔108c中。
55.（3）随后，停止离心或将芯片转速降低到一定程度（可参考中国专利201610843719.0），如图5c所示，样品存储腔103中的液体通过毛细作用进入虹吸管105，虹吸管105与第一预混腔104的接口处相当于一个界面阀，需要高速离心才能突破，否则液体不会流入第一预混腔104；上游缓冲腔108a中的液体通过毛细作用进入虹吸管105，下游缓冲腔108b和第二下游缓冲腔108c中的液体通过毛细作用分别进入虹吸管105中，但由于界面阀112的作用无法完全填充满管道，之后再次高速离心，使上游反应腔的样品存储腔103中裂解后的样本和上游缓冲腔108a中的反应液离心到第一预混腔104中，通过加减速或正反旋转混匀，此时样品复溶预先冻干在下游第一预混腔104中的扩增体系和引物，之后加热
温控，使得第一预混腔104中的第一步多重核酸扩增进行；（4）第一步预扩增后，停止离心或将芯片转速降低到一定程度，如图5d所示，第一预混腔104中的液体通过毛细作用进入虹吸管105，下游缓冲腔108b和第二下游缓冲腔108c中的液体通过毛细作用突破界面阀112，完全填充满虹吸管105，之后再次高速离心，使第二下游缓冲腔108c中的反应液离心到第三预混腔104b中，使第一预混腔104中定量的部分预反应后的样本和下游缓冲腔108b中的反应液离心到第二预混腔109中，其中第二预混腔109中有第二步扩增所需的冻干试剂，通过加减速或正反旋转混匀，并进行第二步多重核酸扩增进行；（5）停止离心或将芯片转速降低到一定程度，如图5e所示，第二预混腔109中的液体会通过毛细作用进入虹吸管105，第三预混腔104b中的液体会通过毛细作用进入虹吸管105，随后高速离心芯片，第二预混腔109中的液体和第三预混腔104b中的液体会全部进入第四预混腔117，其中第四预混腔117中有第三步扩增所需的冻干试剂，通过加减速或正反旋转混匀，进行第三步扩增反应；（6）停止离心或将芯片转速降低到一定程度，如图5f所示，第四预混腔117中的液体会通过毛细作用进入虹吸管105，随后高速离心芯片，第四预混腔117中的液体会全部进入分配管道110，进而分配进各终端反应孔111，其中终端反应孔111中固定有引物，完成分配后位于最下游的最后一个终端反应孔111充当废液池不完全填充满，其他终端反应孔111均填满，且分配管道110中没有液体残留；（7）其后各终端反应孔111中独立进行各指标的反应。
56.上述（1）
‑
（7）步中，步骤（3）的第一步扩增和步骤（4）的第二步扩增的两步恒温扩增均为37度的rpa，步骤（5）的第三步扩增为37度在各个终端反应孔111的进行crispr
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cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，规律间隔性成簇短回文重复序列）检测；第三步扩增也可以是65度lamp最后crispr
ꢀ‑
cas检测。
57.使用本发明的芯片，可定制专门配套的离心设备，该离心设备除了常规离心机的常规部件结构外，还内置有加热器、控制器；控制器可通过线路分别与加热器和离心机相连，控制器内设有通过时长触发的控制程序，例如，预设：高速离心步骤、低速或停止离心步骤、低速正反向旋转步骤 等上述各步骤的时长和加热温度，高速离心步骤、低速离心步骤还需分别预设离心机转速；启动离心设备后控制器开始工作，控制加热器加热至预设温度，并控制离心机高速离心，高速离心步骤时间结束后触发控制器控制离心机低速或停止离心或正反向旋转，并控制加热器调整加热温度至预设的对应步骤的温度。上述程序的预设为本领域技术人员可根据实践中芯片实际进行的反应步骤和反应程序（例如，pcr反应程序、lamp反应程序、rpa反应程序、核酸提取反应、核酸释放反应）可进行的相应的常规设定或调整，而加热器和控制器均为本领域常规部件，均可商购获得。上述专门配套的离心设备可委托厂家定制生产，也可自行组装集成得到，因此，对本领域技术人员而言，本发明芯片配套的离心设备可基于本领域常规现有产品、并结合本领域技术常识完全可以实现、制备得到。
58.此外，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”、“第三”、“第四”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
59.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、
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示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
60.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。