一种用于治疗类风湿性关节炎的纳米抗体重组蛋白的制作方法

1.本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种用于治疗类风湿性关节炎的纳米抗体重组蛋白。


背景技术：

2.类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，ra)是一种慢性炎性和破坏性关节病，在工业化世界，其影响0.5
‑
1％的人群，并且常常导致明显的残疾从而降低患者生活质量。
3.患有ra的患者滑膜中的血管形成被认为是发病机制和疾病永存中一个重要的早期步骤(taylor、2002)。如在肿瘤性疾病中，血管形成促进扩张滑膜(walsh et al.，1998)。血管生长很可能有助于炎性滑膜血管翳的增生，并有助于炎性白细胞进入滑膜组织内。患有ra的患者的滑膜包含增加量的成纤维细胞生长因子
‑
2(fgf
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2)和血管内皮细胞生长因子(vegf)(koch，2003)。血清vegf浓度与疾病活性相关，并且当滑膜炎可通过治疗而成功抑制时血清vegf浓度下降(taylor，2002)。
4.肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,tnfα)是一种多功能细胞因子，参与细胞的凋亡和存活、炎症反应、免疫反应等重要的生理过程，在类风湿性关节炎、克罗恩病(crohn’s disease)和银屑病(psoriatic)等疾病的发生发展中扮演重要角色。因此，tnfα被视为是治疗上述相关疾病的十分重要的药物研发靶点。英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、戈利木单抗(golimumab)等便是治疗性抗tnfα抗体，在治疗ra等疾病上表现出显著疗效和安全性，均已成为全球最畅销的重磅药物之一，而且其他治疗性抗tnfα抗体的研究与开发也依然炙手可热。
5.20世纪90年代早期，hamers研究小组发现驼科生物能同时加工两种不同类型的免疫球蛋白，一种是含有两个结构域的轻链和四个结构域的重链组成的经典抗体，另一种则是一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(vhh)和两个常规的ch2与ch3区，但却不像人工改造的单链抗体片段(scfv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。更重要的是，单独克隆并表达出来的vhh结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。vhh晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15kda，因此也被称作纳米抗体(nanobody，nb)。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种用于治疗类风湿性关节炎的纳米抗体重组蛋白，以解决上述现有技术存在的问题，将来源于骆驼的抗tnf
‑
α与抗人血清蛋白(hsa)的纳米抗体的序列通过柔性连接肽融合在一起，形成具有更强生物学活性的抗tnf
‑
α纳米抗体(tnf50)。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
8.本发明提供一种纳米抗体重组蛋白，将骆驼源抗tnf
‑
α与抗人血清蛋白的纳米抗体的序列通过柔性连接肽融合在一起，形成融合抗体，其氨基酸序列如seq id no.1所示或包括与seq id no.1具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的且具有相同功能
的氨基酸序列。
9.本发明还提供一种核苷酸，编码上述的纳米抗体重组蛋白。
10.进一步地，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
11.本发明还提供一种表达载体，包括上述的核苷酸或包括与seq id no.2具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的且编码同一蛋白的核苷酸序列。
12.本发明还提供一种基因工程表达菌，包括上述的载体。
13.进一步地，所述基因工程菌为大肠杆菌rosetta(de3)。
14.本发明还提供一种上述的基因工程表达菌的构建方法，将上述的核苷酸连接到pet
‑
22b或pet
‑
28a大肠杆菌表达质粒中，构建获得上述的表达载体，转化到所述大肠杆菌中，筛选得到表达纳米抗体重组蛋白的基因工程表达菌。
15.本发明还提供一种药物组合物，包括上述的纳米抗体重组蛋白、以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
16.进一步地，还包括至少一种药学上可接受的佐剂。
17.药物组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬助剂、稳定剂、着色剂、矫味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂、及其组合。
18.药物组合物中的主要媒介物或载体可以本质上是水性或非水性的。例如，合适的媒介物或载体可以是注射用水、生理盐水或人工脑脊液，可以补充有注射中常见的其他材料。例如，媒介物或载体可以是中性缓冲盐溶液或混有血清白蛋白的盐溶液。其他示例性的药物组合物包含tris缓冲液、或醋酸盐缓冲液，其还可以包含山梨醇或其合适的替代物。在本发明的一个实施方式中，组合物可以通过混合具有所需纯度的所选组分与任意的配制剂以冻干或水溶液形式制备而用于储存。此外，治疗组合物可以使用合适的赋形剂例如蔗糖配制为冻干剂。
19.优选地，药物组合物适用于静脉、肌内、皮下、非肠道、脊柱、或表皮给药(例如，通过注射或推注)。取决于给药途径的不同，活性分子可以包裹在材料中以保护其免受酸和可能使其失活的其他自然条件的作用。
20.本发明还提供一种上述的纳米抗体重组蛋白、上述的核苷酸、上述的表达载体、上述的基因工程表达菌或上述的药物组合物在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。
21.本发明公开了以下技术效果：
22.本发明提供一种抗tnf
‑
α纳米抗体重组蛋白，可用于类风湿性关节炎的预防或治疗，具有安全可靠、特异性强的优势。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为本发明构建的pet22
‑
tnf50和pet28
‑
tnf50两种表达质粒；
25.图2为本发明tnf50的表达验证；
26.图3为本发明tnf50蛋白序列的验证；
27.图4为本发明培养基的优化；
28.图5为本发明tnf50活性检测。
具体实施方式
29.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
30.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
31.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
32.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
33.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
34.实施例1
35.一、设计并构建抗tnf
‑
α纳米抗体及其基因工程表达菌，步骤如下：
36.1.tnf50核酸编码序列的获得
37.(1)将来源于骆驼的抗tnf
‑
α与抗人血清白蛋白(hsa)的纳米抗体的序列通过柔性连接肽融合在一起，获得具有更强生物学活性的抗tnf
‑
α纳米抗体(tnf50)序列；
38.(2)将获得的序列按照标准氨基酸密码子表翻译成核苷酸序列；
39.(3)合成tnf50的编码核苷酸序列。
40.2.引物的合成
41.共设计合成4条引物，如下：
42.ec01：atcgaaggtcgtgaagttcaacttgttgaatcagg；
43.ec02：gcgaggagctcattatgatgaaacagtaacaagag；
44.ec03：aacttcacgaccttcgatgccgctgctgtgatgatg；
45.ec04：agctacatcactcagacttcagcaaccgcacctgtg。
46.3.tnf50原核表达载体的构建
47.为了构建tnf50原核表达质粒pet22
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tnf50和pet28
‑
tnf50，我们先合成了所需的引物，分别命名为ec01、ec02、ec03和ec04，其中ec01和ec04含有同源序列xa。
48.(1)以质粒pet28a为模板，通过引物ec03和ec04扩增出片段pt7
‑
xa；
49.(2)以合成的tnf50核苷酸序列为模板，通过引物ec01和ec02扩增出片段xa
‑
tnf50；
50.(3)以片段pt7
‑
xa和xa
‑
tnf50为共同模板，通过引物ec02和ec04扩增出片段pt7
‑
tnf50；
51.(pt7
‑
tnf50包含6个重要的原件—重要启动子pt7、ncoⅰ的限制酶识别位点、6xhistag标签序列、蛋白酶xa识别位点、目的基因序列tnf50、sacⅰ限制酶识别位点)
52.(4)用限制酶ncoi和sacⅰ分别处理片段pt7
‑
tnf50、质粒pet22b和pet28a 1小时；
53.(5)通过琼脂糖凝胶纯化处理后的片段与线性质粒，并通过thermo紫外核酸蛋白定量仪进行定量；
54.(6)按照摩尔比片段：质粒＝1:1和3:1的方式配比连接反应混合液，将混合液置于16式反应，过夜；
55.(7)将连接后的连接混合物转化到大肠杆菌dh5α的感受态细胞中；
56.(8)从长有白色菌落的转化平皿中挑取数十个单克隆进行菌落pcr；
57.(9)选取步骤(8)中得到的部分阳性克隆接种到含有5ml lb培养基的试管中，并加入5μl氨苄氨苄青霉素钠盐溶液(pet22b)或硫酸卡纳霉素溶液(pet28a)，置于摇床中培养，37℃，220rpm，过夜；
58.(10)提取质粒；
59.(11)用限制酶ecorⅰ和ecor
ⅴ
处理提取到的各管质粒并进行核酸电泳；
60.(12)选取步骤(11)所得到的部分阳性克隆，送至北京金唯智生物科技有限公司进行测序；将测序正确的质粒转入到大肠杆菌rosetta(de3)中；
61.(测序反应所使用的引物为通用引物
‑
t7promoter和t7terminator)
62.(13)两种表达质粒各选取一株阳性克隆按照步骤(9)接菌，待od600为0.6时，加入诱导剂(iptg)至终浓度为1mm，然后置于摇床继续培养7小时，30℃，220rpm；
63.(14)收集两种含表达质粒的菌体各1ml到1.5ml ep管中，12000rpm，常温离心2min；
64.(15)弃去上清，加入1ml pbs，轻轻吹悬，重复步骤(14)的离心操作；
65.(16)重复步骤(15)的漂洗操作；
66.(17)小心吸尽上清，加入45μl pbs和5μl 5x蛋白上样缓冲液，并于沸水中煮沸10min；
67.(18)将步骤(17)中的样品取20μl加载到事先配制好的15％聚丙烯酰胺凝胶中，开始电泳；电泳条件：70v跑浓缩胶，140跑分离胶；
68.(19)停止电泳，切取分离胶，一块胶做考马斯亮蓝显色；另一块按下述步骤进行western
‑
blot检测分析；
69.4、tnf50的纯化与定量。
70.5、tnf50与人tnf
‑
α的相互作用。通过免疫印迹法可以检测tnf50与其靶点—人tnf
‑
α的相互作用。
71.6、tnf50 250ml摇瓶培养优化
72.7、tnf50的生物活性检测。
73.卡拉胶是红藻细胞壁中的一种黏多糖，是由1,3α
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1,4β半乳糖组成的阴离子线性
多聚体分子，按照每个单体中所含硫的不同分为κ(1)、ι(2)和λ(3)三种构型，其中前两种会聚集成螺旋结构从而分别形成硬或软的胶状物，而λ构型的卡拉胶不会聚集成螺旋结构，在溶液中是非凝结的状态。向动物皮下注射卡拉胶之后会立即出现水肿、疼痛和红斑这样的炎症症状。其分子机理为卡拉胶诱导细胞产生组胺、缓激肽、速激肽、活性氧和一氧化氮等应激分子，这分子能够招募嗜中性粒细胞到被注射部位，然后该细胞能分泌包括tnf
‑
α在内的促炎因子，从而诱导炎症的发生。本发明通过λ卡拉胶致小鼠足踝肿胀，并通过测量足踝肿胀程度来评价所制备tnf50的生物学活性。其具体方法为：
74.(1)40只spf级km小鼠，每只大约30克，每组雌雄各半，分开饲养；
75.(2)适应环境一周后，将这些小鼠按重量均匀分成5组，每组雌雄各半；
76.(3)给第1、2小鼠腹腔注射200μl的pbs，第3小组注射50μl的120mg/ml的阿司匹林溶液，第4小鼠注射200μl的含5mg/ml的tnf50 pbs溶液，第5小鼠注射200μl的含10mg/ml的tnf50 pbs溶液；
77.(3)半小时后，给第一组小鼠右后腿足踝注射25μl的pbs溶液，给其余每只小鼠的右后腿足踝注射25μl的含1％λ卡拉胶的pbs溶液；
78.(4)注射后每隔1小时用游标卡尺测量小鼠后腿足踝的直径，每次测量重复两次；
79.(5)计算每次测量的小鼠足趾肿胀程度，并将每组的变化情况统一绘制到同一“肿胀度—时间”表中。实验结束后取实验部位进行切片分析。
80.结果：
81.图1为本发明构建的pet22
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tnf50和pet28
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tnf50两种表达质粒。分别随机挑取了pet22
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tnf50转化平皿中的10个转化子和pet28
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tnf50转化平皿中的30个转化子进行pcr验证，并以转化子附近空白琼脂做阴性对照的模板，结果30个转化子均扩增出了同目的条带大小一致的片段，而阴性没有改片段(图1a)。进一步，选取pcr验证的5个pet22
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tnf50的转化子和5个pet28
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tnf50的转化子进行培养和质粒提取，然后用ecori和ecorv两种限制酶做限制性图谱分析，结果显示来自10转化子的质粒均切出了属于阳性克隆的目标条带。最后，每类转化子中选取三个进行dna测序，结果显示序列与目标序列一致(图1b)。
82.图2为本发明tnf50的表达验证。由于序列没有按照大肠杆菌密码子的偏好进行优化，所以用大肠杆菌rosetta(de3)作为tnf50的表达宿主。把构建好的质粒pet22
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tnf50和pet28
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tnf50转化到rosetta(de3)后，对其分别进行了诱导培养，并通过sds
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page和western
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blot检测目标蛋白的表达。结果显示两种质粒在其表达宿主中均成功表达(图2a、图2b)。
83.图3为本发明tnf50蛋白序列的验证。为了进一步确定序列的正确性，进行了质谱鉴定。通过固相金属亲和纯化与sds
‑
page获得目标序列的单一条带。然后，将该条带切下送至国际生物医药联合研究院分析测试中心(中国.天津)进行蛋白质谱分析。结果共检测出六条与目标序列相匹配的肽段，覆盖率达64％)，基本证明所检测的蛋白即为目标蛋白。
84.通过tnf50蛋白的纯化与定量。由于tnf50的n端带有his tag，所以通过固相co
2
亲和层析纯化。通过漂洗条件优化，最终确定漂洗液中的咪唑最佳浓度为70mm，将收集到的洗脱峰用超滤管进行了缓冲液置换和浓缩，并进行sds
‑
page电泳，检测到其纯度为95％，通过bradford与bca试剂盒定量确定浓缩后的蛋白浓度为10mg/ml。
85.图4为本发明培养基的优化。选取了9种大肠杆菌培养基培养tnf50表达宿主菌，以
选取相对最适培养基。在9种培养基中接种相同的初始菌液，然后在相同条件下培养。然后，收集1ml各培养液中的菌体进行裂解和sds
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page。结果显示m9中几乎检测不到tnf50的存在(图4a)，因此后续数据处理将之舍弃。数据处理时，以最常用大肠杆菌培养基(即high
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salt lb)中所得到tnf50的绝对表达量和单位菌体的相对表达量为参考，其余培养基中所得到的两种结果将分别除以high
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salt lb中所得到的相应结果。结果显示sb培养基在两项指标比较中均是最优的(图4b、图4c)，所以在接下来培养条件的优化中使用sb培养基。
86.图5为本发明tnf50活性检测。首先，通过免疫印迹实验检测了在体外tnf50与人tnfα的结合活性；然后，通过λ卡拉胶致小鼠足踝肿胀检测在体内tnf50与小鼠tnfα的拮抗活性。
87.免疫印迹时通过sds
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page在三条泳道中展开了人tnf
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α。接下来，将这三条蛋白条带转移到nc膜上。之后将膜上的三条带裁剪开来，分别处理：条带1.封闭后与anti
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his tag一抗孵育，后与二抗孵育；条带2.封闭后与tnf50孵育，接着同anti
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his tag一抗孵育，最后与二抗孵育；条带3.用盐酸胍梯度漂洗(这样做能够使蛋白在膜上再折叠，使得肽链线性远离的氨基酸在三维空间中彼此靠近，以防止抗原表位在sds
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page电泳时遭到破坏)，盐酸胍浓度从6m降低至0m，每次降低一半的浓度，直至降低到0.5以下，改用pbs漂洗，后封闭，接着与tnf50孵育，然后同anti
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his tag一抗孵育，最后与二抗孵育。最后，将三条处理好的膜同时进行红外扫描。结果显示条带1无显色条带，条带2和3均有显色条带(图5a)，说明在体外tnf50与人tnfα能发生结合。
88.在进行动物实验时，我们选择腹腔给药与腿部给药两种方式。第1组(pbs pbs)：小鼠腹腔注射无菌pbs 200μl，半小时后后右腿注射无菌pbs 25μl；第2组(pbs pbs)：小鼠腹腔注射无菌pbs200μl，半小时后后右腿注射无菌1％卡拉胶溶液25μl；第3组(pbs pbs)：小鼠腹腔注射无菌低剂量的tnf50(5mg/ml)200μl，半小时后后右腿注射无菌1％卡拉胶溶液25μl；第4组(pbs pbs)：小鼠腹腔注射无菌高剂量的tnf50(10mg/ml)200μl，半小时后后右腿注射无菌1％卡拉胶溶液25μl；第5组(pbs pbs)：小鼠腹腔注射无菌阿司匹林溶液(asp，120mg/ml)50μl，半小时后后右腿注射无菌1％卡拉胶溶液25μl。各组给药后每隔1小时测量一次腿部肿胀部位的直径，然后处理实验结果最终得到相应的统计表与统计图(图5b、图5c)。结果表明tnf50能够在体内拮抗小鼠tnfα的活性。
89.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。