1.本发明属于医药化学领域,具体涉及喹啉类化合物、其制备方法及其作为参比对照品用于4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉原料药质量研究中相关杂质定性和/或定量分析的用途。
背景技术:
[0002]
tgf
‑
β(转换生长因子β)是一类重要的细胞因子,迄今为止已发现6种不同的亚型(tgf
‑
β1~6),彼此间的同源性各不相同,而在哺乳动物中只表达3种亚型,即tgf
‑
β1、tgf
‑
β2和tgf
‑
β3。它是一个多功能生长因子超家族,具有广泛的生物学活性,参与早期胚胎发育,软骨和骨的形成,包外基质的合成,炎症,间质纤维化,免疫和内分泌功能的调节,肿瘤的形成和发展。同时,这3种异构体结构相似,它们的氨基酸序列具有高度同源性,但在各自基因敲除小鼠模型中,却表现为完全不同的表型,提示每一种异构体在体内均有特异的且互不交叉的功能。tgf
‑
β家族的配体都可以与膜表面的受体结合,启动细胞内下游信号的传递。
[0003]
tgf
‑
β1是tgfβ最常见也是最重要的一种亚型,是肝脏中表达最丰富的一种亚型,也是已知最强的肝纤维化诱导因子,在慢性肝病向终末肝病发展的过程中发挥着举足轻重的作用(yamazaki,et al.digestive disease,2011,29:284
‑
288)。多项研究显示,tgf
‑
β1和tgfβ受体在肝脏病变器官、血管和细胞外间质通常高表达。在经典的tgfβ
‑
tgfβr
‑
smads通路中,tgf
‑
β1激活信号通路中的tgfβr1(转换生长因子β受体1,alk5),进而调控整个信号通路,实现调控一系列与纤维化和肿瘤发生发展相关的靶基因的表达。目前普遍认为,tgf
‑
β具对肝癌的促进作用主要表现在促进肿瘤细胞转移、加强肿瘤细胞免疫逃逸和诱导血管生成等方面(ling,et al.current pharmaceutical biotechnology,2011,12:2190
‑
2202)。
[0004]
关于靶向tgf
‑
β通路的药物研究已进行了多年,但是tgfβr1抑制剂如galunisertib等在动物模型上表现出一定的心脏毒性(如出血、功能退化、炎性损伤等),究其原因,是由于该类药物的靶点选择性和特异性较低,药物在抑制tgfβr1激酶活化位点的同时,对其他具有相同激酶区域的蛋白也产生较强的抑制作用(如p38α),进而产生众多非预期的脱靶毒副作用。因此,仍然需要开发选择性更高的tgfβr1抑制剂,以便特异性地调节tgf
‑
β信号通路,从而用于tgf
‑
β相关疾病的治疗。
技术实现要素:
[0005]
本发明的发明人发现了一种喹啉类tgf
‑
β1抑制剂,其化合物结构如下式(i)所示,化学名称为4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉(以下简称“式(i)化合物”):
[0006][0007]
本发明的发明人研究发现,式(i)化合物或其水合物、溶剂合物或结晶对tgf
‑
βr1激酶表现出了显著的抑制活性,非常有希望成为tgf
‑
βr1相关疾病的治疗剂。
[0008]
众所周知,对于人类用药,出于安全性因素要求,国内和国际管理机构对原料药(api)中未确证或毒性未定杂质的限度规定非常低,通常低于0.1%(重量)。需要对这些重要杂质进行深入研究,以确保制备得到符合药用标准、能够用于制备安全有效的药物制剂的原料药。原料药中的杂质可能是由于自身的降解而产生的,也可能来源于制备方法,例如,包括未反应的起始原料、起始原料中包含的杂质的化学衍生物、合成杂质、以及降解产物等。通过了解杂质的化学结构和合成途径,以及通过鉴别影响终产物中杂质含量的参数,能够大大增强对相关杂质的控制。
[0009]
式(i)化合物及其衍生物例如式(i)化合物的药学可接受的盐、异构体、晶型或溶剂合物作为原料药可能包含多种来源的杂质,对其成药性、安全性和有效性带来隐患。因此,研究式(i)化合物及其衍生物的杂质或杂质的性质,对这些杂质或杂质进行检测控制具有重大的意义。
[0010]
本发明的第一个目的是提供式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)或式(g)所示的化合物:
[0011][0012][0013]
优选地,分离制备的式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)或式(g)化合物的纯度至少为90%(根据hplc判断,面积归一化法)。在一些实施方案中,分离制备的式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)或式(g)化合物的纯度至少为95%。在一些实施方案中,分离制备的式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)或式(g)化合物的纯度至少为97%。在另
一些实施方案中,分离制备的式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)或式(g)化合物的纯度至少为98%。在另一些实施方案中,分离制备的式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)或式(g)化合物的纯度至少为99%。在另一些实施方案中,分离制备的式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)或式(g)化合物的纯度至少为99.5%。
[0014]
本发明的第二个目的是提供式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)或式(g)化合物的制备方法:
[0015]
所述的式(a)化合物的制备方法包括使7
‑
溴
‑4‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)喹啉在在钯碳作用下脱除溴的步骤。在一些具体的实施方案中,其中所述的式(a)的制备方法,其中反应溶剂选自四氢呋喃、水、甲苯、二甲基亚砜、n
‑
甲基吡咯烷酮、n,n
‑
二甲基甲酰胺、乙醇和甲醇中的一种或几种。
[0016]
所述的式(b)化合物的制备方法包括使1
‑
环丙基
‑5‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
醇与7
‑
溴
‑4‑
氯喹啉在碱性试剂的作用下发生反应的步骤。在一些具体的实施方案中,其中所述的碱性试剂包括但不限于氢氧化锂、四丁基氟化铵、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸铯、碳酸钾或氯化铵。
[0017]
所述的式(c)化合物的制备方法包括使7
‑
溴
‑4‑
((1
‑
环丙基
‑5‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)喹啉与3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6,7,8
‑
四氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪在碱性试剂的作用下发生反应的步骤。在一些具体的实施方案中,其中所述的碱性试剂包括但不限于磷酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸铯或碳酸氢铯。
[0018]
在一些实施方案中,根据本发明的式(c)的化合物的制备方法,其中所述的制备方法包括催化剂,优选地,其中所述的催化剂选自四(三苯基膦)钯(pd(pph3)4)和三(二亚苄基丙酮)二钯(pd2(dba)3)。在一些实施方案中,根据本发明的式(c)的化合物的制备方法,其中所述的制备方法包括配体,优选地,其中所述的配体选自2
‑
二环己基磷
‑
2',6'
‑
二异丙氧基
‑
1,1'
‑
联苯(ruphos)、2
‑
二环己膦基
‑
2'
‑
(n,n
‑
二甲胺)
‑
联苯(davephos)、2
‑
二环己基磷
‑
2',4',6'
‑
三异丙基联苯(x
‑
phos)、2
‑
(二叔丁基膦)联苯(johnphos)、4,5
‑
双二苯基膦
‑
9,9
‑
二甲基氧杂蒽(xantphos)、和2
‑
二环己基磷
‑
2',6'
‑
二异丙氧基
‑
1,1'
‑
联苯(ruphos);优选地,所述的配体选自2
‑
二环己基磷
‑
2',6'
‑
二异丙氧基
‑
1,1'
‑
联苯(ruphos)、2
‑
二环己膦基
‑
2'
‑
(n,n
‑
二甲胺)
‑
联苯(davephos)和4,5
‑
双二苯基膦
‑
9,9
‑
二甲基氧杂蒽(xantphos)。
[0019]
所述的式(d)化合物的制备方法,包括如下反应步骤:
[0020][0021]
1)式(d
‑
1)的化合物和3,4
‑
二氢
‑
2h
‑
吡喃(dhp)在三氟乙酸作用下反应生成式(d
‑
2)的化合物;
[0022]
2)式(d
‑
2)的化合物在碱性试剂作用下发生反应生成式(d
‑
3)的化合物;
[0023]
3)式(d
‑
3)的化合物与7
‑
溴
‑4‑
氯喹啉在碱性试剂的作用下发生反应生成式(d
‑
4)的化合物;
[0024]
4)式(d
‑
4)的化合物和3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6,7,8
‑
四氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪在碱性试剂作用下发生反应生成式(d
‑
5)的化合物;
[0025]
5)式(d
‑
5)的化合物在酸性试剂的作用下发生反应生成式(d)的化合物;
[0026]
其中,步骤2)
‑
步骤4)所述的碱性试剂包括但不限于碱金属氢氧化物或醇盐例如naoh、lioh和koh;碱土金属氢氧化物或醇盐,碱金属碳酸盐或碳酸氢盐包括碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸氢钾或碳酸氢铯,碱土金属碳酸盐,碱金属和碱土金属磷酸盐,碱金属乙酸盐,碱土金属乙酸盐,和胺碱例如三烷基胺,包括但不限于三乙胺,二异丙基乙胺,1,8
‑
二氮杂二环[5.4.0]十一烷
‑7‑
烯(dbu);1,5
‑
二氮杂二环[4.3.0]非3
‑
烯(dbn);1,4
‑
二氮杂二环[2.2.2]辛烷(dabco)等;步骤5)所述的酸性试剂包括但不限于浓盐酸或三氟乙酸。在一些具体的实施方案中,步骤2)
‑
步骤4)所述的碱性试剂为磷酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸铯或碳酸氢铯。
[0027]
在一些实施方案中,根据本发明的式(d)的化合物的制备方法,其中步骤4)所述的制备方法包括催化剂,优选地,其中所述的催化剂为钯催化剂。在一些实施方案中,所述钯催化剂选自选自pd(pph3)4(四(三苯基膦)钯)、(ph3p)2pdcl2、(ch3cn)2pdcl2、pd2(dba)3(三(二亚苄基丙酮)二钯)、
[0028]
(dppf)pdcl2和pd(oac)2。在一些实施方案中,根据本发明的式(d)的化合物的制备方法,其中步骤4)所述的制备方法包括配体,优选地,其中所述的配体为膦配体。在一些具体的实施方案中,所述的配体选自三苯基膦、三(邻
‑
甲苯基)膦、三(2
‑
呋喃基)膦、1,2
‑
二(二苯基膦基)乙烷(dppe)、1,4
‑
二(二苯基膦基)丁烷(dppb),2,3
‑
二(二苯基膦基)丁烷(chiraphos)、4,5
‑
二(二苯基膦基)
‑
9,9
‑
二甲基呫吨(xantphos)、1,2
‑
二(2,5
‑
二甲基磷杂环戊烷基)苯(me
‑
duphos)、二苯基膦基)二茂铁基]乙基二环己基膦(josiphos)、二(二苯基膦基)甲烷(dppm)、1,3
‑
二(二苯基膦基)丙烷(dppp)、1,2
‑
二(二环己基膦基)乙烷(dcpe)、
三环己基膦、三丁基膦、三叔丁基膦、三(五氟苯基膦)、三(2,4,6
‑
三甲基苯基)
[0029]
膦、2,2'
‑
二(二苯基膦基)
‑
1,1'
‑
联萘(binap)、(2
‑
联苯)二
‑
叔丁基膦、(2
‑
联苯)二环己基膦、2
‑
二
‑
叔丁基膦基
‑2’
,4’,6
’‑
三异丙基联苯("叔丁基xphos")、2
‑
二环己基膦基
‑2’
,6
’‑
二甲氧基联苯("sphos")、2
‑
二环己基膦基
‑2’‑
(n,n
‑
二甲基氨基)联苯("davephos")、2
‑
二环己基膦基
‑2’
,4’,6
’‑
三异丙基联苯("xphos"),优选地,所述的配体选自2
‑
二环己基磷
‑
2',6'
‑
二异丙氧基
‑
1,1'
‑
联苯(ruphos)、2
‑
二环己膦基
‑
2'
‑
(n,n
‑
二甲胺)
‑
联苯(davephos)、2
‑
二环己基磷
‑
2',4',6'
‑
三异丙基联苯(x
‑
phos)、2
‑
(二叔丁基膦)联苯(johnphos)、4,5
‑
双二苯基膦
‑
9,9
‑
二甲基氧杂蒽(xantphos)、和2
‑
二环己基磷
‑
2',6'
‑
二异丙氧基
‑
1,1'
‑
联苯(ruphos);优选地,所述的配体选自2
‑
二环己基磷
‑
2',6'
‑
二异丙氧基
‑
1,1'
‑
联苯(ruphos)、2
‑
二环己膦基
‑
2'
‑
(n,n
‑
二甲胺)
‑
联苯(davephos)和4,5
‑
双二苯基膦
‑
9,9
‑
二甲基氧杂蒽(xantphos)。
[0030]
所述的式(e)化合物的制备方法包括使4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉发生氧化反应的步骤。
[0031]
所述的式(f)化合物的制备方法包括使4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉发生氧化反应的步骤。
[0032]
所述的式(g)化合物的制备方法包括使4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉发生氧化反应的步骤。
[0033]
本发明的第三个目的是提供一种定位、定量式(i)化合物中作为杂质的式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)或式(g)化合物的hplc方法。当式(i)化合物作为原料药生产时,产品中可能会存在一定量的作为杂质的式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)或式(g)化合物。为满足药品的要求,需要检测和控制作为杂质的式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)或式(g)化合物的含量。因此,式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)或式(g)化合物可以作为参比对照品,应用于hplc法分析式(i)化合物中相关杂质的归属和定位,可以用于式(i)化合物中作为杂质的式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)或式(g)化合物的定量分析以及用于式(i)化合物的质量分析。在一些实施方案中,本发明提供了式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)或式(g)化合物在式(i)化合物的杂质检查时作为参比对照品的用途。本发明的所述利用式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)或式(g)化合物分析式(i)化合物的hplc方法包括以下步骤:
[0034]
1)制备各含有式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)、式(g)、式(i)化合物的定位溶液;
[0035]
2)制备含有式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)、式(g)和式(i)化合物的混合溶液;和
[0036]
3)使用步骤1)制得的定位溶液和步骤2)制得的混合溶液通过高效液相色谱法(hplc)分离式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)、式(g)和式(i)化合物,并确定式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)、式(g)和式(i)化合物的位置和含量。
[0037]
在一些具体的实施方案中,根据本发明的利用式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、
式(f)、式(g)和式(i)化合物的hplc方法,其中步骤2)的所述的混合溶液的制备方法包括:
[0038]
i)精密称定式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)或式(g)化合物,分别用溶剂溶解,各获得相应溶液;和
[0039]
ii)精密称定式(i)化合物,用溶剂溶解,再加入步骤i)制得的各溶液,之后再用溶剂稀释,得到混合溶液;
[0040]
其中所述溶剂为有机溶剂或有机溶剂和水的混合溶剂,优选为极性有机溶剂或有机溶剂和水的混合溶剂,更优选为n,n
‑
二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃、乙腈、乙腈和水的混合溶剂、四氢呋喃和水的混合溶剂、甲醇、甲醇和水的混合溶剂、乙醇、乙和水的混合溶剂、或丙醇。
[0041]
在本文中,式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)、式(g)和式(i)化合物还包括所述化合物的水合物、溶剂合物、结晶或药学上可接受的盐。
[0042]
术语说明
[0043]
除非另外定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
[0044]
在本发明中,“纯度”可以使用传统的分析方法来确认,如可容易地通过本领域所建立的和公知的适当方法(例如高压液相色谱法(hplc)、气相色谱法(gc))等)将化合物与其它化合物完全分离,通过面积归一化法计算得到。
[0045]
本发明化合物中的“氢”、“碳”、“氧”包括其所有同位素。同位素应理解为包括具有相同原子数但具有不同质量数的那些原子。举例来说,氢的同位素包括氕、氚和氘,碳的同位素包括
13
c和
14
c,氧的同位素包括
16
o和
18
o等。
具体实施方式
[0046]
下面结合实施例对本发明作进一步详细阐述,但本发明不限于这些实施例。以下实施例中使用的材料如无特殊说明均为商购获得。
[0047]
实施例1 4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉的制备
[0048][0049]
步骤1:2
‑
溴
‑1‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)乙烷
‑1‑
酮的制备
[0050]
[0051]
氮气保护下,在1000ml三口瓶中,依次加入甲醇(100ml)、1
‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)乙酮(20.0g,156mmol),降温到
‑
15℃以下,缓慢滴入液溴,保持温度
‑
15℃以下。滴完升温到0℃,反应45min,然后升温到10℃,反应45min,维持内温在室温以下缓慢滴入11mol/l硫酸(55ml),滴完室温反应过夜。监控反应结束,加入乙酸乙酯和氯化钠水溶液萃取,合并有机层,有机层用饱和碳酸氢钠调ph值7
‑
8,合并有机层,减压浓缩,得到淡黄色固体标题化合物,共计28.5g,收率:87.5%;ms(esi)m/z 207.0[m h]
。
[0052]
步骤2:2
‑
氧代
‑2‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)乙基苯甲酸酯的制备
[0053][0054]
将苯甲酸(18.5g,151.4mmol)溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺(dmf,495ml)中,加入碳酸钾(38g,275.2mmol),再向体系中加入2
‑
溴
‑1‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)乙烷
‑1‑
酮(28.5g,137.6mmol),室温反应过夜。加入乙酸乙酯稀释,氯化钠水溶液洗涤。合并有机相。减压浓缩,得到淡黄色固体标题化合物,共计30.0g,收率:88.2%;lc
‑
ms m/z[m h]
=249。
[0055]
步骤3:(z)
‑1‑
(二甲基氨基)
‑3‑
氧代
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)丙
‑1‑
烯
‑2‑
基苯甲酸酯的制备
[0056][0057]
向1,1
‑
二甲氧基
‑
n,n
‑
二甲基甲胺(795.15ml,5975.8mmol)中加入2
‑
氧代
‑2‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)乙基苯甲酸酯(95.0g,383mmol),加热至100℃,反应2h,再升温到106℃,反应2h,监控反应结束后恢复至室温,减压浓缩至干,向体系中加入乙酸乙酯,和食盐水洗涤,有机相用无水硫酸钠干燥。过滤得有机相,减压浓缩,得红色固体标题化合物,共计107.9g,收率:93.1%,直接用于下一步。lc
‑
ms m/z[m h]
=304。
[0058]
步骤4:3
‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基苯甲酸酯的制备
[0059][0060]
向1000ml反应瓶中依次加入乙酸(376.1ml)、(z)
‑1‑
(二甲基氨基)
‑3‑
氧代
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)丙
‑1‑
烯
‑2‑
基苯甲酸酯(32.56g,107.46mmol),冰浴下缓慢滴加80%水合肼(37.6ml),滴完室温搅拌过夜。监控至反应终点,向反应液中加入乙酸乙酯,水洗,合并有机相,饱和碳酸氢钠溶液洗涤至ph为7
‑
8,有机相无水硫酸钠干燥,过滤得有机相经减压浓缩得黄色油状物,室温放置过夜得黄色固体标题化合物,共计28.0g,收率:95.8%;lc
‑
ms m/z[m h]
=273。
[0061]
步骤5:1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基苯甲酸酯的制备
[0062][0063]
向1,2
‑
二氯乙烷(250ml)中依次加入2,2'
‑
联吡啶(17.7g,113.2mmol),乙酸铜(20.6g,113.2mmol),于75℃下反应30min,冷却至室温后,依次加入环丙基硼酸(17.5g,205.9mmol)、碳酸钠(21.8g,205.9mmol)以及3
‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基苯甲酸酯(28.0g,102.9mmol)的1,2
‑
二氯乙烷(250ml)溶液,在氧气氛围下,于75℃下反应4h。监控至反应终点,冷却至室温,硅藻土助虑,乙酸乙酯洗涤滤饼,滤液经减压浓缩得到红褐色油状标题化合物,共计32.0g,收率:98.5%,直接用于下一步;lc
‑
ms m/z[m h]
=313。
[0064]
步骤6:1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
醇的制备
[0065][0066]
向甲醇(308ml)中加入1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基苯甲酸酯(32.0g,102.6mmol),室温反应2h。监控至反应终点,减压浓缩除去部分甲醇,1mol/l稀盐酸调ph至6~7,二氯甲烷萃取,合并有机层。减压浓缩至干,经柱层析色谱纯化得黄色固体标题化合物,共计9.0g,收率:45%;lc
‑
ms m/z[m h]
=209。
[0067]
步骤7:7
‑
溴
‑4‑
氯喹啉的制备
[0068][0069]
向50l立式夹套反应釜中加入4.50kg乙腈,开启搅拌,依次加入7
‑
溴
‑4‑
羟基喹啉(1.80kg,8.03mol)、4.00kg乙腈,内温降至低于10℃时滴加三氯氧磷(1.85kg,12.05mol),滴加完毕后升温回流搅拌1~3小时,监控至反应终点,将体系降温至5℃以下,滴加4mol/l naoh溶液调节ph至7~8,加入42.00kg水,室温搅拌1~2小时,将料液离心,滤饼5.00kg水洗涤,真空干燥,将固体收集称重,得棕色固体的标题化合物粗品,共计1.73kg,收率:88.8%。
[0070]
向50l立式夹套反应釜中依次加入14.4kg甲基叔丁基醚、1.73kg 7
‑
溴
‑4‑
氯喹啉粗品,于50
±
5℃范围内搅拌1~3小时,趁热过滤,用甲基叔丁基醚洗涤滤饼,滤液减压浓缩至干,所得固体真空干燥,干燥完毕将固体收集称重,得黄色固体的标题化合物精制品,共计1.54kg,收率89.0%。
[0071]
步骤8:7
‑
溴
‑4‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)喹啉的制备
[0072][0073]
向30l玻璃反应釜中加入8.40kg乙腈,开启搅拌,依次加入7
‑
溴
‑4‑
氯喹啉(1.26kg,5.18mol)、碳酸铯(1.69kg,5.18mol)、1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
醇(0.90kg,4.32mol,,4.00kg乙腈洗涤。氮气保护,升温至70
±
5℃搅拌2~3小时,升高温度至回流2~3小时。降温至70
±
5℃时趁热过滤,滤渣用二氯甲烷洗涤,滤液减压浓缩至粘稠状,加入14.00kg水,搅拌,离心,滤饼3.00kg水洗,50
±
5℃真空干燥10~20小时,干燥完毕将固体收集称重,得棕色固体的标题化合物粗品1,共计1.88kg,粗品收率100.0%。
[0074]
向10l四口烧瓶中加6.40kg入庚烷、1.88kg 7
‑
溴
‑4‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)喹啉粗品1,25
±
5℃搅拌3~5小时。过滤,1.40kg庚烷洗涤滤饼,50
±
5℃真空干燥3~20小时。干燥完毕将固体收集称重,得深黄色固体的标题化合物粗品2,共计1.68kg,收率89.4%。
[0075]
向10l四口烧瓶中加入4.70kg无水乙醇、1.68kg 7
‑
溴
‑4‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)喹啉粗品2,升温至回流,溶清后搅拌0.5~1小时,关闭加热,自然冷却析晶,待内温低于30℃,开启外循环于
‑
10~
‑
5℃下搅拌1~3小时。将料液离心,0.4kg冷乙醇(
‑
10~
‑
5℃)洗涤滤饼,50
±
5℃真空干燥10~20小时。干燥完毕将固体收集称重,得淡黄色固体的标题化合物精制品,共计1.35kg,收率80.4%。
[0076]
步骤9:3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6,7,8
‑
四氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪的制备
[0077][0078]
在20l四口烧瓶中加入3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6,7,8
‑
四氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪盐酸盐(1.20kg,5.25mol)、11.8kg乙腈,开启搅拌,加入氢氧化钠(0.42kg,10.50mol)、36.00g水,25
±
5℃剧烈搅拌3~15小时;过滤,乙腈洗涤,滤液减压浓缩至干,加入0.5g晶种,待固化后真空干燥。干燥完毕将固体收集称重,得白色固体的标题化合物,共计0.92kg,收率91.2%。
[0079]
步骤10:4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉的制备
[0080]
[0081]
向20l四口烧瓶中加入7.10kg 1,4
‑
二氧六环,开启搅拌,依次加入7
‑
溴
‑4‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)喹啉(1.34kg,3.23mol)、3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6,7,8
‑
四氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪(0.75kg,3.88mol)、磷酸钾(k3po4,1.37kg,6.47mol)、4,5
‑
双二苯基膦
‑
9,9
‑
二甲基氧杂蒽(xantphos,37.40g,65.00mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(pd2(dba)3,29.6g,32.00mmol)。氮气保护,维持氮气氛围。升温至95
±
5℃搅拌3~15小时,关闭加热,待内温降至70~80℃时趁热过滤,1.6kg热1,4
‑
二氧六环(70~80℃)洗涤,母液缓慢倒入冰水中,加入n
‑
乙酰
‑
l
‑
半胱氨酸,搅拌1~1.5小时,离心,5.00kg水洗,真空干燥。干燥完毕将固体收集称重,得黄色固体的标题化合物粗品1,共计1.41kg,收率83.1%。
[0082]
步骤11:4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉的精制
[0083]
向10l四口烧瓶中加入3.8kg乙酸乙酯、1.40kg 4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉粗品1,氮气保护下升温至55
±
5℃搅拌2~4小时,自然冷却至内温30℃以下,于
‑
5~
‑
10℃搅拌析晶1~3小时,离心,0.5kg冷乙酸乙酯(
‑
10~
‑
5℃)洗涤,真空干燥,得淡黄色固体的标题化合物粗品2。共计1.21kg,收率85.8%。
[0084]
向30l玻璃反应釜中加入14.30kg无水甲醇、1.20kg 4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉粗品2,氮气保护下升温回流溶清,加入0.12kg活性炭、0.12kg回流1~1.5小时,趁热过滤,热甲醇(50~60℃)洗涤,滤液减压浓缩,于
‑
10~
‑
5℃下冷却析晶1~3小时,离心,冷甲醇(
‑
10~
‑
5℃)洗涤。真空干燥,得类白色固体的标题化合物粗品3共计1.03kg。收率85.1%。
[0085]
向10l四口烧瓶中加入9.50kg二氯甲烷、1.02kg 4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉粗品3,开启搅拌。溶清后加入0.20kg搅拌,过滤,二氯甲烷洗涤,滤液中缓慢滴加26.20kg庚烷,搅拌10~15小时,过滤,1.60kg庚烷洗涤滤饼,真空干燥,得白色固体的标题化合物精制品,共计0.99kg。收率97.1%。esi
‑
ms[m h]
m/z:526.3,1h nmr(400mhz,dmso)δ8.59(d,j=5.2hz,1h),8.17(d,j=11.2hz,1h),7.94(s,1h),7.64(dd,j=11.2,2.4hz,1h),7.45(d,j=2.4hz,1h),6.56(d,j=5.2hz,1h),4.91(s,2h),4.34(t,j=5.1hz,2h),4.02(t,j=5.2hz,2h),3.88
–
3.71(m,2h),3.73
–
3.63(m,1h),3.30
–
3.19(m,2h),2.82
–
2.65(m,1h),1.78
–
1.59(m,4h),1.12
–
1.01(m,2h),1.01
–
0.88(m,2h).
[0086]
实施例2:4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)喹啉
[0087]
[0088]
将7
‑
溴
‑4‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)喹啉(1.00g,2.41mmol)、pd/c(0.20g)溶于甲醇(20ml)中,氢气置换,维持氢气氛围室温搅拌4~5hr,lc
‑
ms监控反应完全,过滤,母液浓缩至干得标题化合物,共计0.92g。esi
‑
ms[m h]
m/z:336.2,1h nmr(500mhz,dmso
‑
d6)δ9.14
‑
9.15(1h,j=6.5hz,d),8.55
‑
8.57(1h,j=6.5hz,dd),8.30
‑
8.32(1h,j=8.5hz,d),8.20
‑
8.23(1h,j=8hz,t),8.10(1h,s),7.98
‑
8.02(1h,j1=8hz,t),7.29
‑
7.30(1h,j=6.5hz,d),3.74
‑
3.75(1h,m),3.25
‑
3.30;3.76
‑
3.80(4h,m),2.78
‑
2.84(1h,m),1.62
‑
1.71(4h,m),0.97
‑
1.11(4h,m).
[0089]
实施例3:4
‑
((1
‑
环丙基
‑5‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉
[0090][0091]
步骤1:1
‑
环丙基
‑5‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
醇的制备
[0092][0093]
将实施例1步骤6的1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
醇反应母液经柱层析得粗品15g。取粗品10g加入乙酸乙酯(50ml),升温回流溶清,缓慢滴加石油醚(50ml),关闭加热冷却析晶至40℃,热过滤,滤饼经真空干燥3h得标题化合物,收率35.0%。esi
‑
ms[m h]
m/z:209.1,1h nmr(500mhz,dmso
‑
d6)δ7.97(1h,s),6.85(1h,s),3.43
‑
3.46;3.92
‑
3.95(4h,m),3.36
‑
3.41(1h,m),3.11
‑
3.18(1h,m),1.56
‑
1.59;2.02
‑
2.10(4h,m),0.92
‑
0.97(4h,m).
[0094]
步骤2:7
‑
溴
‑4‑
((1
‑
环丙基
‑5‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)喹啉的制备
[0095][0096]
将1
‑
环丙基
‑5‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
醇(2.10g,10.00mmol)、7
‑
溴
‑4‑
氯喹啉(2.69g,11.00mmol)溶于乙腈(100ml)中,加入碳酸铯(9.95g,30.00mmol),升温回流5~6hr,过滤,母液浓缩至干,经柱层析分离得浅黄色固体,共计2.50g,收率60.3%。esi
‑
ms[m h]
m/z:414.1,1h nmr(500mhz,dmso
‑
d6)δ8.743
‑
8.754(1h,j=5.5hz,d),8.258
‑
8.276(2h,m),7.815
‑
7.837(1h,j1=2.0hz,j2=9.0hz,dd),7.463(1h,s),6.797
‑
6.808(1h,
j=5.5hz,d),3.677
‑
3.720(1h,m),3.314
‑
3.388;3.790
‑
3.817(5h,m),1.671
‑
1.741(4h,m),1.044
‑
1.072;1.139
‑
1.170(4h,m).
[0097]
步骤3:4
‑
((1
‑
环丙基
‑5‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉的制备
[0098][0099]
将7
‑
溴
‑4‑
((1
‑
环丙基
‑5‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)喹啉(1.50g,3.62mmol)、3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6,7,8
‑
四氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪(0.83g,4.34mmol)、磷酸钾(1.54g,7.24mmol)加入1,4
‑
二氧六环(50ml)中,加入2
‑
二环己膦基
‑
2'
‑
(n,n
‑
二甲胺)
‑
联苯(davephos,0.29g,0.72mmol)、pd2(dba)3(0.33g,0.36mmol),氮气保护下升温至100℃搅拌3~4hr,过滤,母液倒入水(250ml)中,搅拌20min,过滤,得黄色固体,于50℃下真空干燥12h以上得标题化合物粗品,共计2.20g。
[0100]
将标题化合物粗品(2.20g)加入乙酸乙酯(12ml),室温搅拌5~6hr,过滤,滤饼于50℃真空干燥得浅黄色固体标题化合物,共计1.20g,收率63.1%。esi
‑
ms[m h]
m/z:526.2,1h nmr(500mhz,dmso
‑
d6)δ8.58
‑
8.59(1h,j=5hz,d),8.18
‑
8.20(1h,j=9hz,d),7.64
‑
7.66(1h,j1=2hz,j2=9.5hz,dd),7.46
‑
7.47(1h,j=2hz,d),7.42(1h,s),6.52
‑
6.53(1h,j=5hz,d),4.91(2h,s),4.34
‑
4.36(2h,j1=5.5hz,t),4.02
‑
4.05(2h,j=6.5h
z,
t),3.66
‑
3.69(1h,m),3.35
‑
3.38;3.78
‑
3.80(4h,m),3.30
‑
3.35(1h,m),1.68
‑
1.73(4h,m),1.02
‑
1.19(4h,m).
[0101]
实施例4:4
‑
((3
‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉
[0102][0103]
步骤1:1
‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑2‑
基)
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基苯甲酸酯的制备
[0104]
[0105]
将3
‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基苯甲酸酯(2.30g,8.46mmol)、3,4
‑
二氢
‑
2h
‑
吡喃(dhp13.80g,164.4mmol)溶于三氟乙酸(9ml)中,升温至60℃搅拌4~5hr,tlc监控反应完全,减压浓缩至干,淡黄色油状标题化合物,共计4.00g。收率100%。
[0106]
步骤2:1
‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑2‑
基)
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
醇
[0107][0108]
将1
‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑2‑
基)
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基苯甲酸酯(3.00g,8.46mmol)溶于甲醇(30ml)中,加入碳酸钾(2.34g,16.92mmol),室温搅拌0.5~1hr,tlc监控反应完全,过滤,滤液减压浓缩至干得黄色固体标题化合物,共计6.70g。收率100%。
[0109]
步骤3:7
‑
溴
‑4‑
((1
‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑2‑
基)
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)喹啉
[0110][0111]
将1
‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑2‑
基)
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
醇(2.13g,8.46mmol)、7
‑
溴
‑4‑
氯喹啉(2.04g,8.46mmol)、碳酸铯(5.51g,16.92mmol)加入乙腈(30ml)中,升温至80℃搅拌过夜,过滤,滤液减压浓缩至干。柱层析分离得黄色油状标题化合物,共计2.4g。收率62.2%。
[0112]
步骤4:4
‑
((1
‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉的制备
[0113][0114]
将7
‑
溴
‑4‑
((1
‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑2‑
基)
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)喹啉(2.40g,5.25mmol)、3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6,7,8
‑
四氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪(1.20g,6.30mmol)、磷酸钾(2.23g,10.50mmol)加入1,4
‑
二氧六环(30ml)中,加入pd2(dba)3(0.10g,0.11mmol)、davephos(0.08g,0.21mmol),氮气保护下升温至回流过夜,lc
‑
ms监控反应完全,趁热过滤,滤液减压浓缩至干,经柱层析分离得黄色固体标题化合物,共计2.50g,收率83.3%。
[0115]
步骤5:4
‑
((3
‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉的制备
[0116][0117]
将4
‑
((1
‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉(2.50g,4.40mmol)溶于1,4
‑
二氧六环(25ml)中,加入浓盐酸(4ml),室温搅拌1hr,lc
‑
ms监控反应完全,缓慢加入饱和碳酸氢钠调节ph至7~8。二氯甲烷萃取水相,有机相合并减压浓缩至干得黄色固体标题化合物粗品,共计1.10g,收率51.6%。取标题化合物粗品(1.10g,2.27mmol)加入乙酸乙酯(10ml),氮气保护下升温至70℃打浆30min,关闭加热,自然降温析晶过夜。过滤,滤饼干燥得标题化合物,共计880mg,收率80.0%。esi
‑
ms[m h]
m/z:486.2,1h nmr(500mhz,dmso
‑
d6)δ12.806(1h,s),8.578
‑
8.588(1h,d),8.203
‑
8.221(1h,d),7.699(1h,s),7.634
‑
7.652(1h,d),7.460(1h,s),6.511
‑
6.520(1h,s),4.914(2h,s),4.353(2h,s),4.034(2h,s),3.258
‑
3.276;3.788
‑
3.809(4h,m),2.509(1h,s),1.702(4h,s).
[0118]
实施例5:7
‑
(4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)喹啉
‑7‑
基)
‑3‑
(三氟甲基)
‑
6,7
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
8(5h)
‑
酮
[0119][0120]
将4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉(14.80g,28.19mmol)溶于甲醇(300ml)中,通入氧气,开启紫外照射9天,减压浓缩,柱层析分离得6.2g。将上述粗品溶于甲醇(250ml)中,通入氧气,开启紫外照射24hr,减压浓缩,柱层析纯化,得标题化合物粗品,共计4.02g。将标题化合物粗品(4.02g)溶于乙酸乙酯(20ml)中,滴加甲磺酸的乙酸乙酯溶液至无絮状物析出,加入水(30ml)搅拌10min后分液,水相中加入二氯甲烷(30ml)搅拌,用碳酸钾饱和溶液调节ph至8~9。分液,收集有机相,减压浓缩至干得2.5g油状物。将油状物溶解于乙酸乙酯(5ml)中,加入甲基叔丁基醚(10ml),室温搅拌3hr,得到浑浊悬浊液,过滤,滤饼真空干燥过夜得灰白色固体标题化合物,共计356mg。收率2.4%。esi
‑
ms[m h]
m/z:540.2,1h nmr(500mhz,dmso
‑
d6)δ8.750
‑
8.760(1h,j=5hz,d),8.366
‑
8.384(1h,j=9hz,d),8.070
‑
8.074(1h,j=2hz,d),7.986(1h,s),7.772
‑
7.776(1h,j=2hz,d),6.814
‑
6.825
(1h,j=5.5hz,d),4.685
‑
4.708(2h,j1=5.5hz,t),4.458
‑
4.482(2h,j=5.5hz,t),3.692
‑
3.728(1h,m),3.247
‑
3.299;3.770
‑
3.798(4h,m),2.744
‑
2.805(1h,m),1.660
‑
1.702(4h,m),0.947
‑
1.105(4h,m).
[0121]
实施例6:7
‑
(4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)喹啉
‑7‑
基)
‑3‑
(三氟甲基)
‑
5,6,7,8
‑
四氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑8‑
醇
[0122][0123]
将4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉(14.80g,28.19mmol)溶于甲醇(300ml)中,通入氧气,开启紫外照射9天,减压浓缩,柱层析分离得4.0g。将上述粗品溶于甲酸乙酯(20ml)中,滴加甲磺酸的甲酸乙酯溶液至无絮状物析出,加入水(30ml)搅拌5min后分液,水相中加入二氯甲烷(30ml)搅拌,用碳酸钾饱和溶液调节ph至8~9。分液,收集有机相,减压浓缩至干得黄褐色固体。将上述黄褐色固体加入乙酸乙酯(30ml)中,升温至70℃搅拌1hr,关闭加热自然冷却析晶,过滤,滤饼真空干燥过夜得标题化合物,共计962mg。收率6.5%。esi
‑
ms[m h]
m/z:542.2,1h nmr(500mhz,dmso
‑
d6)δ8.602
‑
8.612(1h,j=5hz,d),8.186
‑
8.204(1h,j=9hz,d),7.943(1h,s),7.666
‑
7.689(1h,j=2hz,d),7.610
‑
7.614(1h,j=2hz,d),7.210
‑
7.223(2h,s),6.588
‑
6.558(2h,t),4.186
‑
4.440(2h,t),3.678
‑
3.722(1h,m),3.233
‑
3.284,3.768
‑
3.791(4h,m),2.721
‑
2.767(1h,m),1.646
‑
1.677(4h,m),0.939
‑
1.093(4h,m).
[0124]
实施例7:4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基l)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉氧化物
[0125][0126]
将4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉(5.0g,9.52mmol)溶于二氯甲烷(100ml)中,加入间氯过氧苯甲酸(1.8g,10.47mmol),室温下搅拌24小时。经柱层析分离得到标题化合物,共计480mg,收率:9.3%。esi
‑
ms[m h]
m/z:542.2,1h nmr(500mhz,dmso
‑
d6)δ8.34
–
8.36(1h,d),8.19
–
8.21(1h,d),7.95(1h,s),7.92
–
7.93(1h,d),7.76
–
7.79(1h,dd),6.50
–
6.52(1h,d),4.97(2h,s),4.35
–
4.37(2h,t),4.07
–
4.10(2h,t),3.67
–
3.70(1h,
m),3.24
–
3.31,3.77
–
3.80(4h,m),2.73
–
2.79(1h,m),1.64
–
1.68(4h,m),0.93
–
1.07(4h,m).
[0127]
实验例1化合物体外alk5激酶活性评价
[0128]
1.实验材料
[0129]
1.1化合物
[0130]
以上实施例1的本发明式(i)的化合物,用dmso配制成10mm后,依次稀释至3.333μm、1.111
[0131]
μm、370nm、123nm、41nm、14nm、4.6nm、1.5nm、0.5nm。
[0132]
1.2试剂和仪器
[0133]
试剂:alk5,购自于carna公司,cat.no.09
‑
141;p38α购自于carna公司,cat.no.04
‑
152;
[0134]
tgfβr1 peptide购自于signalchem公司,cat.no.t36
‑
58;二甲基亚砜(dmso),购自于美国sigma公司;edta,购自于美国sigma公司;adp
‑
glo kinase assay,购自于promega公司,cat.no.v9102/3,1
×
激酶缓冲液(40mm tris,ph 7.5,0.10%bsa,20mm mgcl2,1mm dtt),临用前配制。
[0135]
仪器:2104multilabel reader,购自于美国perkin elmer公司。
[0136]
2.实验方法
[0137]
2.1配制1x的激酶缓冲液
[0138]
1x assay buffer
[0139]
40mm tris,ph 7.5
[0140]
20mm mgcl2[0141]
0.10%bsa
[0142]
1mm dtt
[0143]
2.2化合物配制
[0144]
2.2.1化合物稀释
[0145]
2.2.1.1配制50倍的化合物:化合物的检测终浓度为10μm,配置成50倍浓度,即500μm:在96孔板上第二个孔中加入95μl的100%dmso,再加入5μl 10mm化合物溶液,配制成1000μm化合物溶液。其他孔加入60μl的100%dmso。从第二孔中取30μl化合物加入第三孔中,依次往下做3倍稀释,共稀释10个浓度。
[0146]
稀释仪器:自动微孔移液器(precision prc384u)。
[0147]
2.2.1.2用echo转移100nl化合物到反应板中。
[0148]
2.3激酶反应
[0149]
2.3.1配制2倍激酶溶液
[0150]
将激酶加入1倍激酶缓冲液,形成2倍酶溶液。384孔反应板中已有100nl的100%dmso溶解的化合物。向384孔反应板中加入2.5μl的2倍酶溶液。室温下孵育10分钟。
[0151]
2.3.2配制2倍底物溶液
[0152]
将fam标记的多肽和atp加入1倍激酶缓冲液,形成2倍底物溶液。向384孔反应板中加入2.5μl的2倍底物溶液。
[0153]
2.4激酶反应
[0154]
将384孔板于28度孵育120分钟,
[0155]
2.5反应结果的检测
[0156]
2.5.1将adp
‑
glo试剂平衡到室温。
[0157]
2.5.2转移5μl反应液到一块新的384孔板反应孔中。
[0158]
2.5.3转移5μl adp
‑
glo试剂到384孔板反应孔中终止反应。
[0159]
2.5.4在28度孵育120分钟。
[0160]
2.5.5转移10μl激酶检测试剂到每个反应孔中,振荡1分钟,室温静置30分钟。
[0161]
2.6数据读取
[0162]
在envision上读取样品发光数值。
[0163]
2.7曲线拟合
[0164]
2.7.1从envision程序上复制发光读数的数据
[0165]
2.7.2将发光读数的值通过公式转换为抑制百分率。
[0166]
percent inhibition=(max
‑
sample rlu)/(max
‑
min)*100.“min”为不加酶进行反应的对照样荧光读数;“max”为加入dmso作为对照的样品荧光读数。
[0167]
2.7.3将数据导入ms excel并使用xlfit excel add
‑
in version 5.4.0.8进行曲线拟合,拟合公式:y=bottom (top
‑
bottom)/(1 (ic
50
/x)^hillslope),结果见表2。
[0168]
表2
[0169][0170]
从以上实验结果可以看出,本发明的化合物对alk5激酶具有很好的抑制活性,同时对p38α具有低的抑制作用,选择性高。表明本发明的化合物在产生更高疗效的同时,副作用更低。
[0171]
实验例2化合物体外细胞荧光素酶实验评价
[0172]
1.实验材料
[0173]
受试化合物:实施例1的本发明式(i)的化合物,用dmso配制成4mm,然后依次4倍稀释为20000.00nm、5000.00nm、1250.00nm、312.5nm、78.125nm、19.53nm、4.88nm、1.22nm。
[0174]
luc
‑
smad2/3
‑
nih3t3小鼠成纤维细胞(经工程化后过表达smad2,3
‑
响应性启动子)由中国药科大学实验室馈赠。
[0175]
试剂:dmem,购自于美国invitrogen公司;fbs,购自于美国invitrogen公司;dmso,购自于美国sigma公司;glo lysis buffer,购自于美国progema公司;bright
‑
glo luciferase assay system,购自于美国promega公司;tgfβ,购自于美国peprotech公司。
[0176]
仪器:md spectramax m3多功能酶标仪,购自于美国molecular devices公司。
[0177]
2.实验方法
[0178]
2.1细胞培养:
[0179]
细胞复苏:将细胞置于37度水浴中溶解,然后转移到15ml已预热的培养基中,1000rpm离心5分钟,弃去培养基,用15ml新鲜培养基重悬细胞,转移至10cm培养皿中,置于37℃、5%co2的培养箱中培养,24小时后细胞更换新鲜培养基。
[0180]
细胞传代:将上述复苏的细胞转移到50ml无菌离心管中,1000rpm离心5分钟,弃去培养基,取分散均匀的细胞计数,调整合适的细胞浓度到15ml新鲜培养基,加入到10cm培养皿中,置于37℃、5%co2的培养箱中培养。
[0181]
2.2实验步骤:
[0182]
day1:铺细胞(透底96孔板)
[0183]
luc
‑
smad2/3
‑
nih3t3细胞于10cm培养皿中正常培养至汇合度达80%
‑
90%,消化后收集至15ml离心管中,1000xg离心5分钟后,去除上清,用1ml培养基重悬后,稀释10倍计数,根据计数后的结果稀释细胞,将4x103/孔细胞数传入96孔板中(每孔加入100μl重悬细胞)。
[0184]
day2:细胞给药
[0185]
药物称量1
‑
2mg(提前称好),使用dmso配制成4mm母液。24小时后,移去培养基。用2%fbs培养基稀释药物,加入100μl 1x药物溶液,使药物终浓度分别为20000.00nm、5000.00nm、1250.00nm、312.5nm、78.125nm、19.53nm、4.88nm、1.22nm,每孔tgfβ1终浓度为4ng/ml,与化合物一起用2%fbs培养基进行稀释。
[0186]
day3:荧光检测实验
[0187]
将glo lysis buffer和bright
‑
glo luciferase assay system以及细胞平衡至室温,移去细胞上清,每孔加入100μlglo lysis buffer,缓慢摇晃使其均匀溶解细胞,室温裂解5mins。之后每孔加入100μlbright
‑
glo luciferase assay system,室温孵育5分钟,震荡2分钟,将180μl上清液转入白底96孔板,检测化学发光信号,检测条件为1s。
[0188]
2.3数据处理:使用graphpad prism 5软件进行非线性曲线拟合和数据分析,拟合得ic
50
,实验结果见表3。
[0189]
表3
[0190][0191]
从以上实验可以看出,本发明的化合物对nih3t3细胞中tgfβ
‑
alk5
‑
smad2/3信号通路均表现出了良好的抑制活性,非常有希望成为多种癌症相关疾病的治疗剂。
[0192]
实验例3:式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)和式(g)化合物的定位、定量分析
[0193]
杂质定位溶液的配制:精密称取杂质式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)和式(g)化合物适量,加乙腈
‑
水(1:1)溶解并各自定量稀释制成每1ml中约含2.5μg式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)和式(g)化合物的溶液,得到各杂质储备液,分别作为杂质定位溶液,备用;
[0194]
式(i)化合物对照品溶液的配制:称取式(i)化合物,精密称定,置于100ml容量瓶中,加乙腈
‑
水(1:1)适量超声溶解、恢复至室温,用稀释剂稀释至制成每1ml中约含0.5mg式(i)化合物的溶液;
[0195]
混合溶液的配制:取式(i)化合物与杂质式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)
和式(g)化合物对照品各适量,加乙腈
‑
水(1:1)溶解并稀释制成每1ml中约含式(i)化合物0.5mg,式(a)、式(b)、式(c)、式(d)、式(e)、式(f)和式(g)化合物各约1μg的混合溶液。
[0196]
分别精密量取各杂质定位溶液、式(i)化合物对照品溶液及混合溶液各10μl,注入液相色谱仪,依据表1梯度洗脱样品,记录色谱图,其中,色谱条件为:用五氟代苯基键合硅胶为填充剂(如phenomenex kinetex f5(2.6um,4.6*100mm)或效能相当的色谱柱);以0.05%三氟乙酸高氯酸钠溶液(取高氯酸钠约12.2g,加水1000ml使溶解,再加入三氟乙酸0.5ml)为流动相a,0.05%三氟乙酸乙腈溶液(量取乙腈1000ml后加入三氟乙酸0.5ml)为流动相b,柱温为30℃,流速为每分钟1ml。
[0197]
表1
[0198][0199]
在215nm波长处检测并确定位置和含量。
[0200]
尽管以上已经对本发明作了详细描述,但是本领域技术人员理解,在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述,而应归属于权利要求书。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询,结果仅供参考。