一种插入miRNA互补序列的多组织限制型柯萨奇B组III型病毒及其应用的制作方法

一种插入mirna互补序列的多组织限制型柯萨奇b组iii型病毒及其应用
技术领域
1.本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种插入mirna互补序列的多组织限制型柯萨奇b组iii型病毒及其应用。


背景技术：

2.柯萨奇b组病毒(cvb)一直被确定为是造成严重急、慢性心肌炎、胰腺炎、脑炎等相关疾病的主要致病原，其中柯萨奇b组iii型病毒(cvb3)是常见的致病病原微生物。病毒在靶器官处的大量复制会直接裂解细胞，同时还会造成受损部位严重的免疫炎性损伤，比如活化的t细胞通过细胞介导的细胞毒作用会摧毁病毒感染的细胞，细胞因子在病变部位的产生、趋化和浸润会加重对靶器官的损伤。因此，有效抑制病毒在靶器官的复制是降低cvb3对机体损害的重要途径。
3.针对病毒感染性疾病，疫苗被认为是抵御病毒性疾病最成功的方法之一，尤其是减毒活疫苗有着较好的诱发机体产生抗病毒免疫反应的效果。然而还有许多针对病毒感染的疫苗在研制过程中未能在临床使用，包括预防病毒性心肌炎的柯萨奇b3病毒疫苗，由于基因组在传代过程中的不稳定性以及cvb有持续性感染的特性，导致了存在病毒对心肌损伤的长期风险，因此阻碍了该疫苗的使用，目前最大的问题是缺乏稳定有效降低致病性的减毒方法或途径。疫苗毒力回复问题在已应用的疫苗中也存在，已有报道有些减毒活疫苗在接种人体后可能会发生回变，恢复病毒在感染受累器官组织中的致病表型，由此产生疫苗相关病。因此合理调控病毒疫苗进入体内组织分布和降低对重要器官致病性是亟待解决的关键问题。
4.近几年，有多项研究利用mirna具有组织特异性分布、在转录后水平调控基因表达的特点对病毒基因组进行改造，以实现限制病毒在特定组织中复制的目的。将特异性mirna互补序列导入病毒基因组，可以限制病毒在重要靶器官复制，同时不改变病毒在其他器官中的复制能力。通过这种方法改造病毒亲嗜性的研究可行性已在神经毒性黄病毒，脊髓灰质炎病毒、水泡性口炎病毒、cva21等病毒上得到证实。
5.在前期的研究中我们以cvb3感染性克隆为载体，在cvb3全长基因组的5’utr插入心肌特异性mirna133和mirna206的互补序列，获得心肌限制型cvb3。当以相同滴度的病毒(0.01ld50)感染小鼠后，心肌限制型cvb3组小鼠心肌部位的病毒滴度较野生cvb3病毒组明显降低，降低100倍，心肌部位的病理损伤程度和小鼠的病死率也明显降低，实现了对心肌组织的定向减毒。但病毒性心肌炎患者除心肌组织受损外，cvb3感染还可造成病毒在胰腺，脑组织等部位的大量复制，导致胰腺炎，脑膜炎，严重损害机体。我们前期也发现心肌限制型cvb3感染小鼠后，心脏部位的病毒滴度较对照组明显降低，但胰腺处仍有病毒大量复制，这表明我们构建的心肌限制型cvb3仍存在局限性。


技术实现要素：

6.本发明首先涉及一种插入mirna互补序列的多组织限制型柯萨奇b组iii型病毒(cvb
‑
mirt*3)，所述的mirna包括：mir
‑
206，mirna
‑
29a
‑
3p，mirna
‑
124
‑
3p。
7.所述的互补序列分别为：
8.mir
‑
206：5’ccacacacttccttacattcca3’；
9.mir
‑
29a
‑
3p：5’taaccgatttcagatggtgcta3’；
10.mir
‑
124
‑
3p：5’ggcattcaccgcgtgcctta 3’。
11.优选的，所述的cvb
‑
mirt*3中的插入序列如seq id no.1所示：
[0012]5’‑
ccacacacttccttacattccacgattaaccgatttcagatggtgctaaccggtggcattcaccgcgtgccttaatacagcaaa
‑3’
[0013]
seq id no.1所示序列中包含mir
‑
206，mirna
‑
29a
‑
3p，mirna
‑
124
‑
3p的互补序列，间隔序列cgat和accggt，以及重复的kozark序列atacagcaaa。
[0014]
本发明还涉及所述的cvb
‑
mirt*3在制备疫苗中的应用。
[0015]
优选的，所述的疫苗为针对柯萨奇b组iii型病毒的疫苗；
[0016]
更优选的，所述的疫苗为针对柯萨奇b组iii型病毒的多组织限制型疫苗；所述的多组织限制指所述的疫苗为心脏，胰腺和脑组织限制。
[0017]
本发明涉及的工作中，
[0018]
我们在cvb3病毒基因组相应位置同时插入肌肉、胰腺、脑组织等特异性的mirna
‑
206，mirna
‑
29a
‑
3p，mirna
‑
124
‑
3p的串联互补序列，构建多组织限制型cvb3，命名为cvb
‑
mirt*3。该病毒感染机体，可以实现在多器官中同时抑制cvb3复制的目的。cvb
‑
mirt*3发挥作用需要基因组中所引入的三条mirna互补序列均可结合相应的mirna，而这在理论上具有可行性。有文献报道，cvb3基因序列本身具有不同的mirna结合位点，而机体中不同的mirna均可以结合这些位点，以发挥调控cvb3复制的作用：mirna
‑
10*可以结合cvb3基因组3d编码区位置，而mirna
‑
342
‑
5p可以特异性结合2c编码序列，两者与cvb3基因序列的结合均可直接调控cvb3的复制。而我们在前期研究中，我们将肌肉特异性的mirna
‑
133
‑
206
‑
133的三串联互补序列插入cvb3病毒基因组中，在hela细胞中分别单独转入外源的mirna133和mirna
‑
206，均能实现抑制该病毒复制的目的。
[0019]
根据上述研究基础，在本发明中，我们进一步验证，在表达mirna
‑
206，mirna
‑
29a
‑
3p，mirna
‑
124
‑
3p任何一种或多种mirna的细胞中，mirna均能结合多组织限制型cvb3中相应的mirna互补序列并抑制病毒复制。
[0020]
我们在人胰岛β细胞系cm，大鼠成肌细胞系l6，原代小鼠胶质细胞中验证cvb
‑
mirt*3的复制情况，还将在小鼠模型上检测多组织限制型cvb3感染机体后，小鼠心脏、胰腺和脑组织中病毒复制受限及病理受损减轻的状况。进一步我们检测到多组织限制型cvb3基因组在细胞和小鼠成体中均保留较好的稳定性，经过多次传代和感染小鼠后长时间观察，插入的外源序列没有丢失，改造过的病毒序列没有发生改变，这进一步证明了改造后病毒的序列稳定性。
[0021]
在动物试验中，多组织限制性cvb3具有极低的毒性，并且在免疫动物后，可以诱导机体产生高低度的中和抗体，并且可以诱导机体的免疫保护作用抵抗高滴度cvb3病毒的再次感染。在相同的病毒再次感染时，机体内高滴度的中和抗体有利于保护机体。我们使用多
组织限制型cvb3免疫小鼠后一个月，发现在小鼠体内内被诱导出高滴度的中和抗体；当以致死剂量的cvb3病毒再次感染小鼠时，发现多与对照组相比，受免组小鼠均存活，而对照组均有不同程度的死亡率，表明该限制型cvb3可以提供有效的保护作用。
[0022]
本发明的有益效果在于：
[0023]
1、改造后的多组织限制型cvb3具有如下的特点：在造成严重损害的心肌，胰腺和脑组织呈不复制或低复制状态，而在其他的非致病性组织比如肠道中可以复制，这样的特点与减毒型疫苗相符：它能够在一些组织中保持复制能力，降低病毒的回复压力，并诱导出持续时间较长的免疫反应，同时不在造成损伤性疾病或危及生命的靶器官或组织中复制。
[0024]
2、这一新的设计思路和技术也能够适用于其它病毒疫苗减毒的研制上，包括dna病毒和单链负链rna病毒，特别是对那些较难于制备疫苗的病毒。
[0025]
3、比较其他的技术手段该研究方法将会更经济。
[0026]
4、在过去一直认为rna病毒很难作为攻击靶标，然而在这一方法中经mirna
‑
t修饰的rna病毒基因组对mirna介导的降解是非常敏感的，当修饰型病毒一旦进入到靶细胞浆中立即发生降解作用，而不影响宿主细胞的正常功能状态。
[0027]
5、更重要的是，病毒被合理控制在组织或细胞范围并且被改造的病毒能够在其他某些组织中复制，这样将诱导出保护性免疫以抵抗cvb致病病毒株的感染，避免由于某些病毒基因变异引起毒力回复造成重要器官的致命性损伤。该研究将提供在特异性组织中控制病毒复制的常规通用机制资料，为今后发展稳定的、安全长久免疫的减毒疫苗提供可行的研究基础。
[0028]
综上，本发明在前期构建成功的心肌限制型cvb3的基础上，进一步构建多组织限制型cvb3(cvb
‑
mirt*3)，评估其在各组织中复制受限和组织病理受损减轻的状况，同时分析该型病毒免疫机体后细胞免疫和体液免疫状况及再次应对野生型cvb3病毒感染的免疫状况，为今后减毒型cvb3疫苗研制提供了参考性的基础资料。同时，我们的研究允许插入外源序列，并在仅改变插入序列的手段下扩大病毒复制受抑制的范围，该研究的成功，可为实现其他类型的多组织侵染病毒，如ev71病毒等多器官同时抑制复制，并诱导机体特异性免疫能力提供借鉴性资料。
附图说明
[0029]
图1、cvb
‑
mirt*3病毒修饰示意图。
[0030]
图2、cvb
‑
mirt*3病毒修饰后通过电泳和测序，证明外源序列插入成功。
[0031]
图3、各组cvb3感染不同细胞的毒性和病毒滴度，cvb3
‑
mirt*3在含有相应mirna的细胞中的复制效率降低，而细胞增殖率增高。
[0032]
3a、在hela细胞中评估外源mirna
‑
206，mirna
‑
29a
‑
3p，mirna
‑
124
‑
3p的表达对cvb
‑
mirt*3复制的影响。
[0033]
3b、评估cvb
‑
mirt*3对te671细胞增殖率的影响。
[0034]
3c、评估cvb
‑
mirt*3对min
‑
6细胞增殖率的影响。
[0035]
3d、评估cvb
‑
mirt*3对小鼠星形胶质细胞增殖率的影响。
[0036]
3e、评估cvb
‑
mirt*3在te671细胞中的病毒滴度。
[0037]
3f、评估cvb
‑
mirt*3在min
‑
6细胞中的病毒滴度。
[0038]
3g、评估cvb
‑
mirt*3在小鼠星形胶质细胞中的病毒滴度。
[0039]
图4、以1
×
105滴度的cvb
‑
mirt*3感染小鼠后第5天，与对照组相比，cvb
‑
mirt*3的心脏，胰腺和脑组织的病理损伤明显降低。
[0040]
图5、以1
×
105滴度的cvb
‑
mirt*3感染小鼠后第5天，与对照组相比，cvb
‑
mirt*3的心脏，胰腺和脑组织的病毒滴度明显降低。
[0041]
图6、以1
×
104滴度的cvb
‑
mirt*3免疫小鼠cvb
‑
mirt*3，一个月后，可以发现小鼠体内有高浓度的抵抗cvb3的中和抗体。
具体实施方式
[0042]
实施例1、cvb
‑
mirt*3的构建。
[0043]
1、cvb3
‑
wt毒株的来源，序列结构
[0044]
本发明所采用的病毒为cvb3m株(genbank:m33854.1)。
[0045]
2、cvb
‑
mirt*3插入序列(3个mirna的互补序列结构)、插入位置，构建方法
[0046]
通过反向遗传学方法构建携带有cvb3m株序列的质粒，根据microrna存在的组织特异性，我们选择具有肌肉、胰腺、脑组织特异性的mir
‑
206，mirna
‑
29a
‑
3p，mirna
‑
124
‑
3p，根据数据库和文献报道这三个mirna的序列人和小鼠是完全一致的。在mirbase数据库选定带有核心序列的成熟mirna。
[0047][0048][0049]
构建合成插入子序列，如下seq id no.1所示：
[0050]5’
ccacacacttccttacattccacgattaaccgatttcagatggtgctaaccggtggcattcaccgcgtgccttaatacagcaaa 3’[0051]
序列中黑体部分为mirna互补序列，斜体部位为mirna互补序列间的间隔序列，末尾下划线部分为重复的kozark序列，该重复序列可以保证插入序列后不影响病毒序里的转录和病毒毒力。
[0052]
合成互补序列，与上述序列退火后将其插入cvb3感染性克隆起始密码子atg序列之前，完成感染性克隆的改造。将其命名为cvb
‑
mirt*3。具体的插入位点信息见图1所示(病毒序列第741位为atg起始翻译序列，第731
‑
740位atacagcaaa为kozark序列，本发明在病毒第740和741位之间插入外源序列，外源序列包含mirna互补序列和kozark序列)。
[0053]
与上述序列同时在同样位置完成了加入线虫mir
‑
39*3的互补序列作为对照组(线虫mir
‑
39在真核生物中没有任何的同源序列)，分别命名为cvb
‑
mir
‑
con。
[0054]
cvb3
‑
mirt*3和cvb
‑
mir
‑
con病毒修饰后通过电泳和测序(结果见图2)，证明外源序列插入成功。
[0055]
实施例2、体外实验对cvb
‑
mirt*3进行功能验证
[0056]
首先进行改造质粒的转染以及病毒产生的量化实验，利用空斑形成实验测定不同浓度质粒转染后不同时间点所产生的病毒量，按pfu/ml计算，做成量化曲线，成为本实验的阳性质控。
[0057]
体外合成mirna
‑
206，mirna
‑
29a
‑
3p，mirna
‑
124
‑
3p，在hela细胞中观察外源mirna对cvb
‑
mirt*3特异性作用的效果和量效关系：设定100nm的浓度合成的上述mirna及相应对照mirnacon，分别转染或混合转染至hela细胞，同时设置mirna
‑
con对照转染组，4小时后应用cvb
‑
mirt*3，moi＝1.0，24小时后观察细胞的保护作用，收集细胞作mtt增殖率实验，收集上清作病毒滴度实验。
[0058]
肌肉源细胞te671(高表达mirna206)，胰腺源细胞min
‑
6细胞(高表达mirna
‑
29a
‑
3p)和原代星型胶质细胞(新生小鼠星型胶质细胞，高表达mirna
‑
124
‑
3p)中检测cvb
‑
mirt*3病毒复制受限情况。
[0059]
常规方法培养细胞培养te671和min
‑
6细胞，按照1:3的方式胰酶消化后传代。取3d内新生balb/c小鼠，颈总动脉放血，无菌条件下快速取脑，除去嗅球和小脑，仔细剔除软脑膜和血管。将剩余脑组织置于d
‑
hanks液中，机械吹打并不断收集含单细胞的上清液，1500rpm，5min离心，弃上清液取沉淀物，用含10％胎牛血清的高糖dmem制成细胞悬液，调细胞密度为1
×
10
6/
ml。随后将细胞接种于已包被0.1mg/ml多聚赖氨酸的培养瓶中。于37℃，5％co2的培养箱中培养，每3天换液一次。
[0060]
在细胞成片后(60
‑
70％)感染修饰型病毒，感染量为moi＝10，感染时间为2小时，然后用pbs洗去未感染的病毒。在预定时间点(2，4，6，8，12和24小时)收集细胞上清，
‑
80℃冻存。收齐所有时间点的细胞后融化所有样品，离心清除沉淀碎片，应用空斑形成实验测定比较上述病毒在的不同时间增长状况。同时，mtt法检测细胞的增殖率，综合评估多组织限制型cvb3在不同细胞中的复制状况及对细胞保护状况。两组间病毒滴度的比较采用配对t检验，p<0.05认为差异有统计学意义。
[0061]
修饰后的cvb
‑
mirt*3病毒具有极低的特异组织毒性结果如表1所示，，
[0062]
表1、修饰后的cvb
‑
mirt*3具有极低的毒性
[0063][0064]
mtt法检测细胞的增殖率的具体结果如图3所示，结果显示cvb3
‑
mirt*3在含有相应mirna的细胞中的复制效率降低，而细胞增殖率增高。
[0065]
实施例3、体内实验对cvb
‑
mirt*3进行功能验证
[0066]6‑
8周龄balb/c雄性小鼠(18
‑
22克)拟从中国医学科学院试验动物研究所购进。(动物实验方案通过首都儿科研究所动物伦理审查)。按照随机分组的方法将小鼠分为4组，每组15只。
[0067]
(1)结合接种后动物的死亡率进行病毒的毒力评估：
[0068]
按1*104，1*105，1*106，1*107，1*108，1*109pfu/只小鼠的病毒滴度对小鼠进行腹腔接种，按照reed
‑
muench的方法计算该病毒对小鼠的半数致死剂量(ld50)。
[0069]
(2)评估修饰型cvb3致病病理的状况：
[0070]
①
小鼠按上述分组和腹腔注射，接种量为原始株cvb3m半数致死量(ld50)，感染后不同时间点对心脏，胰腺和脑组织等进行病理分析，同时检测病毒在各组织复制状况包括病毒滴度的测定及病毒核酸的检测。结果显示，与对照组相比，cvb3
‑
mirt*3组小鼠心脏，胰
腺和脑组织的病理损伤明显降低(见图4)；与对照组相比，cvb3
‑
mirt*3组小鼠心脏，胰腺和脑组织的病毒滴度明显降低(见图5)。
[0071]
②
按照原始株cvb3m ld50和ld100剂量对小鼠进行腹腔注射，观察各组小鼠的死亡状况，按照感染后天数为单位绘制小鼠的生存曲线。
[0072]
③
病毒逃逸的监测：按上述方法接种病毒，收集cvb
‑
mirt*3、cvb
‑
mir
‑
con组感染后濒死小鼠的血清，分离cvb
‑
mirt*3病毒进行序列分析。由于在前期工作中观察到cvb3接种小鼠后，开始会出现一个高的病毒血症，然后会持续一段时间，这样有益于我们分析mirt插入序列的稳定性。经过检测，在感染20天内，病毒的序列没有改变。测序结果同图2b。
[0073]
实施例4、cvb
‑
mirt*3的免疫效力
[0074]
免疫小鼠：按照1
×
104的滴度免疫小鼠，同时设置紫外灭活型cvb3原始株、pbs注射组、以及cvb
‑
mirt
‑
133
‑
206
‑
133(另一株插入3个mirna的互补序列结构的cvb3)作为对照，每组30只小鼠，腹腔注射的方法免疫，每只总体积为0.2ml。
[0075]
30天后感染致死剂量的cvb3病毒，检测小鼠的死亡率，与对照组相比，cvb
‑
mirt3组有较好的保护能力(表2)。
[0076]
表2、cvb
‑
mirt3组有较好的保护能力。
[0077][0078]
中和抗体的检测：在免疫后的第30天采用戊巴比妥钠麻醉小鼠，摘除眼球法取小鼠全血，分离小鼠血清，灭活血清，将100倍于tcid50的野生型cvb3病毒与连续稀释的血清共同孵育2小时，设置8复孔，然后将中和后的病毒与hela细胞在96孔板中共同孵育一周，按照reed and muench方法，将可以中和病毒的最大稀释倍数作为中和抗体滴度。结果显示，一个月后，可以发现小鼠体内有高浓度的抵抗cvb3的中和抗体(图6)。
[0079]
统计方法：应用spss12.0软件，数据均以x
±
s表示，多组间比较采用方差分析后行q检验进行两两比较。两组间比较采用配对t检验，spearman进行相关性分析，p<0.05为差异有统计学意义。脏器大体病理变化差异采用ridit分析。
[0080]
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。