一种结直肠靶向载药外泌体及应用和治疗结直肠疾病药物的制作方法

一种结直肠靶向载药外泌体及应用和治疗结直肠疾病药物
1.技术领域
2.本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种结直肠靶向载药外泌体及应用和治疗结直肠疾病药物。
[0003]

背景技术：

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结肠和直肠是消化系统的一部分，二者组成一个肌肉长管，称为大肠。起源于结肠的癌症称为结肠癌，而起源于直肠的癌症称为直肠癌。二者也可以称之为结直肠癌。结肠直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，是世界的第四大肿瘤类型，每年导致50万的患者死亡。我国结直肠癌发病率和死亡率分别为27.3/10万和13.9/10万，分别位居肿瘤发病率和死亡率的第5位，其中45岁以上患者占到了总患病人群的93.5%。早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。
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近50年来，尽管外科技术有迅猛发展，但大肠癌的手术治愈率、5年生存率始终徘徊在50%左右，治疗失败原因主要为局部复发率较高，故提高大肠癌的治疗效果必须考虑综合治疗。除了手术治疗的方法外，近年来也上市了一些针对于结直肠癌症治疗的药物。结直肠肿瘤的靶向药物治疗，按照作用机制分为三大类：第一种作用于肿瘤细胞生长信号通路，通过阻断肿瘤细胞生长信号，抑制肿瘤细胞的增殖。代表药物：西妥昔单抗、帕尼单抗。第二种作用于肿瘤生长的微环境（肿瘤血管生成），通过阻断肿瘤细胞的血液供应，阻断其营养供应，达到“饿死肿瘤”目标。代表药物：贝伐珠单抗、瑞戈非尼。第三种作用于患者免疫细胞（t细胞），通过使免疫细胞持续活化，增强免疫细胞对肿瘤的识别和杀伤作用。代表药物：抗pd
‑
1单抗（pembrolizumab）。这些药物虽然在一定层度上延长了患者的寿命，但因为其靶向能力较弱都具有明显的毒副作用。
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良好的靶向药物，可以携带药物进入病兆部位，而正常组织和器官不富集药物。这样可以提高药物在病灶部位的有效浓度，进而提高疗效，同时也可以降低药物在正常组织和器官的浓度进而降低药物的副作用。虽然近年来靶向治疗得到医学药学领域的大力关注，有文献指出采用靶向基团（例如癌细胞表面特异性的受体结合的配体）与载药体系结合，可以增加药物的靶向作用，但是临床应用显示这样的靶向作用效果甚微。目前一直没有理想的药物靶向给药体系，这是癌症治疗方面亟待解决的重大科学难题。
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近年来，外泌体的出现有望解决这一问题。研究发现外泌体是身体各个组织和细胞间信息传递的载体。它可以在身体进行远距离的信息传递。且外泌体可以自由跨越细胞膜是一个理想的载药体系。
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化疗药物具有良好的抗肿瘤活性，但由于其较差的靶向性导致化疗药物具有极大
的毒副作用。例如：奥沙利铂和五氟尿嘧等。奥沙利铂（oxaliplatin）为第3代铂类抗癌药，为二氨环己烷的铂类化合物，即以1，2
‑
二氨环己烷基团代替顺铂的氨基。与其他铂类药作用相同，即均以dna为靶作用部位，铂原子与dna形成交叉联结，拮抗其复制和转录。
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因此，制备一种高效的结直肠靶向外泌体载药体系对结直肠部相关疾病进行治疗是亟需的。
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技术实现要素：

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本发明实施例的目的在于提供一种结直肠靶向载药外泌体及应用和治疗结直肠疾病药物，以解决上述背景技术中提出的问题。
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为实现上述目的，本发明实施例提供一种结直肠靶向载药外泌体，所述结直肠靶向载药外泌体由用于治疗结直肠疾病的药物导入到具有结直肠组织靶向性的外泌体中获得，所述具有结直肠组织靶向性的外泌体来源于肺细胞。
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当然，肺细胞也可以进行基因修饰或改造以使其对结直肠组织具有靶向性，包括但不限于基因改造，基因修饰、基因过表达或删除、分子修饰等；肺细胞的外泌体也可以进行表面修饰或改造以使其对结直肠组织具有靶向性，包括但不限于表面蛋白修饰、表面蛋白改造、表面小分子修饰等。
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优选地，所述肺细胞包括但不限于人胚肺成纤维细胞；人胚肺细胞；人肺成纤维细胞；人胚肺二倍体细胞；人肺癌细胞；动物胚肺细胞；动物胚肺成纤维细胞；动物肺细胞；动物肺癌细胞；诱导多能干细胞诱导的肺细胞。
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优选地，所述人胚肺成纤维细胞包括但不限于hfl
‑
1、helf、imr
‑
90；所述人胚肺细胞包括但不限于mrc
‑
5、wi
‑
38、hlf；所述人肺成纤维细胞包括但不限于hel
‑
2、hel
‑
1、ccl
‑
153；所述人胚肺二倍体细胞为hlf
‑
02；所述动物胚肺细胞；动物胚肺成纤维细胞；动物肺细胞；动物肺癌细胞中的动物包括但不限于猴、小鼠、仓鼠、大鼠。
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优选地，所述用于治疗结直肠疾病的药物包括但不限于sirna、microrna、蛋白、抗体、氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康、卡培他滨。
[0017]
优选地，用于治疗结直肠疾病的药物导入到具有结直肠组织靶向性的外泌体的具体步骤为：将用于治疗结直肠疾病的药物和具有结直肠组织靶向性的外泌体放入电转杯中；采用指数波或方形波，使用50
‑
300v电压对用于治疗结直肠疾病的药物和具有结直肠组织靶向性的外泌体进行电转；将电转产物进行水浴加热后，离心去除游离的药物，得到纯化后结直肠靶向载药外泌体。
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本发明的第二个目的是要提供上述结直肠靶向载药外泌体在治疗结直肠疾病药物制备中的应用。
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本发明的第三个目的是要提供一种治疗结直肠疾病药物，包含上述结直肠靶向载药外泌体。
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综上所述，由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：本发明实施例提供了一种结直肠靶向载药外泌体及应用和治疗结直肠疾病药物，
本发明使用肺细胞分泌的外泌体不需要作任何修饰就可以在结直肠富集，用肺细胞来源的外泌体，解决了外泌体产量的问题，具有很好的应用前景；而且用肺细胞来源的外泌体可以装载不同药物或活性分子，通过靶向结直肠组织给药，提高结直肠疾病的治疗效果，降低药物毒副反应。
附图说明
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图1为人胚肺成纤维细胞hfl
‑
1分泌的外泌体标志性蛋白检测图。
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图2为人胚肺成纤维细胞hfl
‑
1分泌的外泌体粒径分布检测图。
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图3为pkh67标记hfl
‑
1分泌的外泌体在不同组织中分布图。
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图4为载有用于治疗结直肠疾病的药物奥沙利铂的结直肠靶向外泌体抗肿瘤活性体外检测图。
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图5为载有用于治疗结直肠疾病的药物奥沙利铂的结直肠靶向外泌体抗肿瘤活性体内检测图。
具体实施方式
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为了使本发明实施例的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明实施例进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明实施例，并不用于限定本发明实施例。
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实施例1本发明实施例提供一种结直肠靶向载药外泌体，所述结直肠靶向载药外泌体由用于治疗结直肠疾病的药物导入到具有结直肠组织靶向性的外泌体中获得，所述具有结直肠组织靶向性的外泌体来源于肺细胞。
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收集人胚肺成纤维细胞hfl
‑
1，（本实施例中选用人胚肺成纤维细胞hfl
‑
1为例）。
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需要说明的是hfl
‑
1细胞培养液为无外泌体血清和dmem培养基进行培养；在2000g离心力下离心10min，取上清液；再在10000g离心力下离心30min，取上清液，弃去细胞碎片及沉淀物；将离心后的细胞培养液在100000g（g为重力加速度）离心力下离心2 h，沉淀用无菌pbs重悬收集，4℃短期保存，即得结直肠靶向外泌体。提取分离所得的结直肠靶向外泌体表面标记蛋白及粒径分布如图1、图2所示。hfl
‑
1细胞及其分泌的外泌体表达量测定，bca法检测hfl
‑
1细胞分泌的外泌体蛋白浓度为（2.73μg/μl）。
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实施例2取上述实施例1
‑
2中hfl
‑
1细胞分泌的外泌体，用pkh67染色，对hfl
‑
1细胞分泌的外泌体在体内的分布进行示踪，雄性c57bl/6小鼠（4
‑
6周）购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，所有小鼠均培育于spf级设施。具体步骤如下：取100μg的hfl
‑
1细胞分泌的外泌体，与1μlpkh674℃避光孵育过夜，在100000g（g为重力加速度）离心力下离心2 h，弃掉上清，用pbs清洗两次后，无菌pbs重悬肺细胞分泌的外泌体，经尾静脉注射入c57bl/6小鼠体内。24h后，麻醉小鼠，取小鼠的心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏、胃和肠做冰冻切片，hoechst33342染细胞核后，观察hfl
‑
1细胞分泌的外泌体在小鼠各个器官的生物分布。结果显示：本实施例的hfl
‑
1细胞分泌的外泌体在结直肠组织中出现明显富集（图3），靶向效率可高达65%
‑
90%，说明本实施例制备的结直肠靶向外泌体具有
结直肠组织靶向性。
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实施例3所述用于治疗结直肠疾病的药物包括但不限于sirna、microrna、蛋白、抗体、氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康、卡培他滨。本实施例中选用用于治疗结直肠癌疾病的药物奥沙利铂。
[0032]
将用于治疗结直肠疾病的药物导入到结直肠靶向外泌体制备结直肠肿瘤靶向治疗药物，具体操作如下：取150μg结直肠靶向外泌体与奥沙利铂混合，电转缓冲液可以为pbs、dmem、cytomix、tris
‑
hcl，是本实施例中选用pbs将其补足至150μl，转移至不同规格（0.2cm、0.4cm）电转杯中。采用不同波形（指数波、方形波），使用不同的电压（50v，100v，200v，300v）分别对结直肠靶向外泌体及奥沙利铂进行电转；将电转产物于100000g离心力下超速离心120 min，收集上清测载药量。
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结果：对于奥沙利铂，150μg结直肠靶向外泌体与奥沙利铂在250v的电压下进行电转，效率最高，可达34.3%。结果显示：奥沙利铂成功载入了hfl
‑
1细胞分泌的外泌体中。
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实施例4验证体内外实验检测载有用于治疗结直肠疾病的药物奥沙利铂载入结直肠靶向外泌体对结直肠癌的治疗作用，本实施例中，balb/c nude小鼠（4
‑
6周）购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，所有小鼠均培育于spf级设施。具体步骤如下：体外实验：将结直肠癌细胞hct
‑
116细胞铺于96孔板中，每孔5
×
103个细胞，分别加入结直肠靶向外泌体（对照组）、载有结直肠肿瘤治疗药物奥沙利铂的结直肠靶向外泌体，mtt检测载有结直肠肿瘤治疗药物奥沙利铂的结直肠靶向外泌体对结肠癌细胞的杀伤作用。在体外实验中，载有结直肠肿瘤治疗药物的结直肠靶向外泌体相较于单纯的结直肠靶向外泌体可以有效的杀伤肿瘤细胞，其结果如图4所示。
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体内实验：在体内实验中，建立结直肠癌模型，将5
×
106个hct
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116细胞注射至balb/cnude小鼠皮下，待其生长到约100mm3时，尾静脉注射载有结直肠肿瘤治疗药物奥沙利铂的结直肠靶向外泌体，每3天注射一次，共注射4次，随后隔天测量肿瘤体积，肿瘤体积=1/2
×
a
×
b2。a代表长径，b代表短径。
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在体内实验中，如图5所示，载有结直肠肿瘤治疗药物奥沙利铂的结直肠靶向外泌体（奥沙利铂
‑
外泌体），较等剂量的游离抗肿瘤药物组（奥沙利铂）可显著降低小鼠的肿瘤大小。
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对于本领域技术人员而言，显然本发明实施例不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明实施例的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明实施例。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明实施例的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明实施例内。
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此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当
将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。