喹啉类TGF-β1抑制剂的制备方法与流程

喹啉类tgf
‑
β
1抑制剂的制备方法
技术领域
1.本发明属于医药化学领域，具体涉及4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法。


背景技术：

[0002]
tgf
‑
β(转换生长因子β)是一类重要的细胞因子，迄今为止已发现6种不同的亚型(tgf
‑
β1～6)，彼此间的同源性各不相同，而在哺乳动物中只表达3种亚型，即tgf
‑
β1、tgf
‑
β2和tgf
‑
β3。它是一个多功能生长因子超家族，具有广泛的生物学活性，参与早期胚胎发育，软骨和骨的形成，包外基质的合成，炎症，间质纤维化，免疫和内分泌功能的调节，肿瘤的形成和发展。同时，这3种异构体结构相似，它们的氨基酸序列具有高度同源性，但在各自基因敲除小鼠模型中，却表现为完全不同的表型，提示每一种异构体在体内均有特异的且互不交叉的功能。tgf
‑
β家族的配体都可以与膜表面的受体结合，启动细胞内下游信号的传递。
[0003]
tgf
‑
β1是tgfβ最常见也是最重要的一种亚型，是肝脏中表达最丰富的一种亚型，也是已知最强的肝纤维化诱导因子，在慢性肝病向终末肝病发展的过程中发挥着举足轻重的作用(yamazaki,et al.digestive disease,2011,29:284
‑
288)。多项研究显示，tgf
‑
β1和tgfβ受体在肝脏病变器官、血管和细胞外间质通常高表达。在经典的tgfβ
‑
tgfβr
‑
smads通路中，tgf
‑
β1激活信号通路中的tgfβr1(转换生长因子β受体1,alk5)，进而调控整个信号通路，实现调控一系列与纤维化和肿瘤发生发展相关的靶基因的表达。目前普遍认为，tgf
‑
β具对肝癌的促进作用主要表现在促进肿瘤细胞转移、加强肿瘤细胞免疫逃逸和诱导血管生成等方面(ling,et al.current pharmaceutical biotechnology,2011,12:2190
‑
2202)。
[0004]
关于靶向tgf
‑
β通路的药物研究已进行了多年，但是tgfβr1抑制剂如galunisertib等在动物模型上表现出一定的心脏毒性(如出血、功能退化、炎性损伤等)，究其原因，是由于该类药物的靶点选择性和特异性较低，药物在抑制tgfβr1激酶活化位点的同时，对其他具有相同激酶区域的蛋白也产生较强的抑制作用(如p38α)，进而产生众多非预期的脱靶毒副作用。因此，仍然需要开发选择性更高的tgfβr1抑制剂，以便特异性地调节tgf
‑
β信号通路，从而用于tgf
‑
β相关疾病的治疗。


技术实现要素：

[0005]
本发明的发明人发现了一种喹啉类tgf
‑
β1抑制剂，其化合物结构如下式(i)所示，化学名称为4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉(以下简称“式(i)化合物”)：
[0006][0007]
本发明的发明人研究发现，式(i)化合物或其水合物、溶剂合物或结晶对tgf
‑
βr1激酶表现出了显著的抑制活性，非常有希望成为tgf
‑
βr1相关疾病的治疗剂。
[0008]
众所周知，对于人类用药，出于安全性因素要求，国内和国际管理机构对原料药(api)中未确证或毒性未定杂质的限度规定非常低。原料药中的杂质可能是由于自身的降解而产生的，也可能来源于制备方法，例如，包括未反应的起始原料、起始原料中包含的杂质的化学衍生物、合成副产物等。因此，需要对式(i)化合物或其衍生物的制备方法进行研究，以获得反应条件温和，工艺稳定，纯化容易，易于操作，有利于工业化大生产的制备式(i)化合物或其药学可接受的盐、异构体、溶剂合物或结晶的方法。
[0009]
本发明的发明人对式(i)所示的化合物的制备方法进行了研究探索，尝试的反应路线一包括如下反应步骤：
[0010][0011]
1)式(1)的7
‑
氯
‑4‑
羟基喹啉的羟基经保护后生成式(2)的化合物；
[0012]
2)式(2)的化合物与3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6,7,8
‑
四氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪盐酸盐经buchward偶联反应，得到式(3)的化合物；
[0013]
3)式(3)的化合物在酸性条件下脱除羟基保护基，得到式(4)的化合物；
[0014]
4)式(4)的化合物的羟基经三氯氧磷氯代得到式(5)的化合物；
[0015]
5)式(5)的化合物在缚酸剂作用下，与1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
醇反应，得到式(i)的化合物。
[0016]
路线一步骤2)在buchward偶联制备式(3)的化合物时，式(2)的化合物部分脱boc(叔丁氧羰基)，而脱除boc后的式(1)的化合物由于羟基的供电子作用，对buchward偶联反应有钝化作用，导致一旦boc脱除，所得原料无法参与反应，使得此反应步骤转化率降低。后期尝试其他羟基保护基如甲氧基甲基醚(mom)、(三甲基硅)乙氧基甲基(sem)等均存在转化
率低的问题，原料残余，若加大钯试剂的用量则会产生较多掉氯的副产物。
[0017]
本发明的一个目的是提供式(i)所示的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，包括使式(ii)的化合物和式(iii)的化合物发生反应的步骤，其中x为离去基团，
[0018][0019]
在一些实施方案中，所述离去基团x选自卤素、羟基、氨基、烷氧基、酰氧基、芳氧基、杂芳氧基、磺酰氧基、任选取代的烷基磺酰氧基、任选取代的烯基磺酰氧基、任选取代的芳基磺酰氧基、酰基、重氮部分和羟基的活性酯，如羧酸酯、磺酸酯、磷酸酯或硼酸酯。在一些具体的实施方案中，所述离去基团x为氯、碘、溴、氟、乙酰氧基、甲磺酰氧基、甲苯磺酰氧基、三氟甲磺酰氧基、硝基苯磺酰氧基或溴
‑
苯磺酰氧基。
[0020]
在一些优选的实施方案中，本发明提供的本发明的式(i)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中x选自卤素和羟基的活性酯；进一步优选地，x选自氟、氯、溴、碘、羧酸酯基、磺酸酯基、磷酸酯基和硼酸酯基；更进一步优选地，x选自氟、氯、溴、碘、甲磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基、苯磺酸酯基、对甲苯磺酸酯基、对溴苯磺酸酯基和对硝基苯磺酸酯基。在一些实施方案中，本发明的式(i)的化合物的制备方法包括在催化剂存在下，使式(ii)的化合物和式(iii)的化合物发生反应的步骤，优选地，其中所述的催化剂为过渡金属催化剂。在一些实施方案中，优选地，所述过渡金属催化剂是钯催化剂。在另一些实施方案中，所述过渡金属催化剂是铜催化剂。在另一些实施方案中，所述过渡金属催化剂是镍或铑催化剂。在另一些实施方案中，所述过渡金属催化剂是锰催化剂，如mncl2。钯催化剂包括pd(0)和p(ii)来源。在一些实施方案中，钯/碳可以用作催化剂。在一些实施方案中，可以使用钯催化剂种类，其一般包括一个或多个结合至钯金属的配体。在一些具体的实施方案中，所述钯催化剂选自(ph3p)4pd、(ph3p)2pdcl2、(ch3cn)2pdcl2、pd2(dba)3、(dppf)pdcl2和pd(oac)2。各式各样的配体是本领域已知的，包括一般优选的膦配体(参见，例如，c.amatore and a.jutand,coord.chem.rev.1998,178
‑
180和511
‑
528)。用于本发明方法的膦配体包括但不限于三苯基膦、三(邻
‑
甲苯基)膦、三(2
‑
呋喃基)膦、1,2
‑
二(二苯基膦基)乙烷(dppe)、1,4
‑
二(二苯基膦基)丁烷(dppb)，2,3
‑
二(二苯基膦基)丁烷(chiraphos)、4,5
‑
二(二苯基膦基)
‑
9,9
‑
二甲基呫吨(xantphos)、1,2
‑
二(2,5
‑
二甲基磷杂环戊烷基)苯(me
‑
duphos)、二苯基膦基)二茂铁基]乙基二环己基膦(josiphos)、二(二苯基膦基)甲烷(dppm)、1,3
‑
二(二苯基膦基)丙烷(dppp)、1,2
‑
二(二环己基膦基)乙烷(dcpe)、三环己基膦、三丁基膦、三叔丁基膦、三(五氟苯基膦)、三(2,4,6
‑
三甲基苯基)膦、2,2'
‑
二(二苯基膦基)
‑
1,1'
‑
联萘(binap)、(2
‑
联苯)二
‑
叔丁基膦、(2
‑
联苯)二环己基膦、2
‑
二
‑
叔丁基膦基
‑2’
,4’,6
’‑
三异丙基联苯("叔丁基xphos")、2
‑
二环己基膦基
‑2’
,6
’‑
二甲氧基联苯("sphos")、2
‑
二环己基膦基
‑2’‑
(n,n
‑
二甲基氨基)联苯("davephos")、2
‑
二环己基膦基
‑2’
,4’,6
’‑
三异丙基联苯("xphos")等。在一些实施方案中，根据本发明的式(i)的化合物的制
备方法，其中所述的配体选自2
‑
二环己基磷
‑
2',6'
‑
二异丙氧基
‑
1,1'
‑
联苯(ruphos)、2
‑
二环己膦基
‑
2'
‑
(n,n
‑
二甲胺)
‑
联苯(davephos)、2
‑
二环己基磷
‑
2',4',6'
‑
三异丙基联苯(x
‑
phos)、2
‑
(二叔丁基膦)联苯(johnphos)、4,5
‑
双二苯基膦
‑
9,9
‑
二甲基氧杂蒽(xantphos)、和2
‑
二环己基磷
‑
2',6'
‑
二异丙氧基
‑
1,1'
‑
联苯(ruphos)；优选地，所述的配体选自2
‑
二环己基磷
‑
2',6'
‑
二异丙氧基
‑
1,1'
‑
联苯(ruphos)、2
‑
二环己膦基
‑
2'
‑
(n,n
‑
二甲胺)
‑
联苯(davephos)和4,5
‑
双二苯基膦
‑
9,9
‑
二甲基氧杂蒽(xantphos)。
[0021]
此外，钯偶联反应可以用n
‑
杂环卡宾配体(参见例如，hillier,a.c.et al.,j.organomet.chem.2002,69
‑
82)进行，包括但不限于1,3
‑
二(2,4,6
‑
三甲基苯基)咪唑鎓氯化物、1,3
‑
二(2,6
‑
二异丙基苯基)咪唑鎓氯化物、1,3
‑
二(2,6
‑
二异丙基苯基)咪唑烷鎓四氟硼酸盐、1,3
‑
二(2,4,6
‑
三甲基苯基)咪唑烷鎓四氟硼酸盐等。催化剂可以衍生自预先形成的配合物，例如(ph3p)4pd、(ph3p)2pdcl2、(ch3cn)2pdcl2、pd2(dba)3、(dppf)pdcl2([1,1'
‑
二(二苯基膦基)二茂铁]钯(ii)二氯化物)等，或者催化剂可以从包括但不限于pdcl2、pd(oac)2、pd(dba)2等的钯来源和适宜配体的组合原位形成。在一些实施方案中，催化剂是pd2(dba)3。在另一些实施方案中，可以将胺碱例如二异丙基乙胺、三乙胺等加至反应混合物以稳定化催化剂。在另一些实施方案中，钯催化剂可以是钯/炭。各种类型的钯/炭催化剂可商购自johnson
‑
matthey和其它来源。在另一些实施方案中，催化剂是负载型钯催化剂。这些催化剂包括金属例如钯，其负载于包括金属结合部分的聚合物载体上。在一些实施方案中，负载型聚合物是聚合物基底纤维上的钯，所述聚合物基底纤维包括但不限于聚烯烃基底纤维例如来自johnson
‑
matthey的聚烯烃基底纤维。在另一些实施方案中，负载型催化剂是聚合物
‑
固定的均质催化剂，其中钯金属共价结合至聚合物链，后者可以进一步连接至在普通有机溶剂中不溶的惰性聚烯烃纤维。适宜的负载型催化剂包括johnson
‑
matthey以商品名销售的那些，特别是johnson
‑
matthey销售的负载型聚合物1000系列。当然，可以使用其它类型的负载于聚合物载体上的钯催化剂，包括但不限于基于聚苯乙烯的负载型催化剂等。在某些实施方案中，希望从溶剂和/或含催化剂的溶液中除去氧以避免配体氧化和催化剂的去稳定化。这可以以本领域已知的任何方式完成，例如通过交替地向混合物应用真空、随后引入氮或另一些适宜惰性气体使得混合物脱气。另选地，氮或另一些惰性气体可以鼓泡通过溶剂或含催化剂的溶液。在一些具体的实施方案中，本发明的式(i)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法包括在钯催化剂、膦配体存在下，使式(ii)的化合物和式(iii)的化合物发生反应的步骤。在一些具体的实施方案中，钯偶联反应一般在不干扰反应的溶剂中进行。有用溶剂包括但不限于烃溶剂、芳族溶剂、醚、卤化的溶剂、酯溶剂、酮溶剂、酰胺溶剂、腈溶剂等。烃溶剂包括1,4
‑
二氧六环、庚烷、环己烷、甲基环己烷、异辛烷等；芳族溶剂包括但不限于甲苯、二甲苯、乙基苯、茴香醚等。醚包括但不限于四氢呋喃、2
‑
甲基四氢呋喃、乙基醚、甲基叔丁基醚、丁基醚、二噁烷等。酯溶剂包括烷基酯例如乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯、乙酸异丁酯等。腈溶剂包括乙腈等。酮溶剂包括丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、甲基异丙基酮等。酰胺溶剂包括二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、n
‑
甲基吡咯烷酮等。在一些实施方案中，根据本发明的式(i)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，除了催化剂之外，还可以向反应混合物中添加适宜的碱。适宜的碱包括但不限于碱金属氢氧化物或醇盐例如naoh、lioh和koh；碱土金属氢氧化物或醇盐，碱金属碳酸盐包括碳酸钠、碳酸钾和碳酸铯，碱土金属碳酸盐，碱
金属和碱土金属磷酸盐如k3po4，碱金属乙酸盐，碱土金属乙酸盐，和胺碱例如三烷基胺，包括但不限于三乙胺，二异丙基乙胺，1,8
‑
二氮杂二环[5.4.0]十一烷
‑7‑
烯(dbu)；1,5
‑
二氮杂二环[4.3.0]非3
‑
烯(dbn)；1,4
‑
二氮杂二环[2.2.2]辛烷(dabco)等。在一些具体的实施方案中，本发明的发明人考察了其它条件相同时，三(二亚苄基丙酮)二钯pd2(dba)3作为金属催化剂，仅配体不同时化合物(i)的剩余量及化合物(i)生成量，具体数据见表1，实验数据显示，当选用三(二亚苄基丙酮)二钯作为金属催化剂选用不同的配体发现，使用x
‑
phos与johnphos两种配体无法反应完全。因此，本发明提供本发明的式(i)的化合物的制备方法，其中所述的制备方法包括配体，优选地，其中所述的配体选自2
‑
二环己基磷
‑
2',6'
‑
二异丙氧基
‑
1,1'
‑
联苯(ruphos)、2
‑
二环己膦基
‑
2'
‑
(n,n
‑
二甲胺)
‑
联苯(davephos)、2
‑
二环己基磷
‑
2',4',6'
‑
三异丙基联苯(x
‑
phos)、2
‑
(二叔丁基膦)联苯(johnphos)、4,5
‑
双二苯基膦
‑
9,9
‑
二甲基氧杂蒽(xantphos)、和2
‑
二环己基磷
‑
2',6'
‑
二异丙氧基
‑
1,1'
‑
联苯(ruphos)；优选地，所述的配体选自2
‑
二环己基磷
‑
2',6'
‑
二异丙氧基
‑
1,1'
‑
联苯(ruphos)、2
‑
二环己膦基
‑
2'
‑
(n,n
‑
二甲胺)
‑
联苯(davephos)和4,5
‑
双二苯基膦
‑
9,9
‑
二甲基氧杂蒽(xantphos)。
[0022]
表1
[0023]
配体式(ii)的化合物(％)式(i)的化合物(％)ruphos0.1587.98davephos0.2480.80x
‑
phos17.0868.27johnphos66.2424.55xantphos2.1880.86
[0024]
在另一些具体的实施方案中，本发明的发明人对金属催化剂的用量进行了考察，实验数据显示，随着三(二亚苄基丙酮)二钯的使用量增加，反应越来越彻底，当三(二亚苄基丙酮)二钯使用量过大，则导致式(ii)的化合物脱溴生成杂质式(ii)的化合物
‑
1；若三(二亚苄基丙酮)二钯使用量过小，则导致反应不完全，反应时间过长等问题，部分实验数据见表2。因此，本发明提供本发明的式(i)的化合物的制备方法，其中式(ii)的化合物和三(二亚苄基丙酮)二钯的摩尔比为约1:0.005至1:0.04，优选为约1:0.009至1:0.02，进一步优选为约1:0.01。
[0025]
表2
[0026][0027]
在另一些具体的实施方案中，本发明的发明人考察了在使用三(二亚苄基丙酮)二钯催化剂的情况下，反应温度、时间的影响。分别在60℃、80℃、100℃反应，于2小时、3小时、4小时、8小时、20小时取反应液hplc检测，考察不同温度下，式(i)的化合物与式(ii)的化合
物随时间的变化关系，同时也对式(i)的化合物在反应液中的耐受度进行考察，具体数据见表3。实验数据显示，在相同时间内，反应速率随着温度升高而加快，式(ii)的化合物的剩余量与反应温度之间的关系呈现明显相关性。当温度为60℃、80℃时在相同反应时间内式(ii)的化合物无法完全反应，即使延长反应时间，反应速率无明显加快。在100℃下，经hplc检测，在3小时后式(ii)的化合物完全反应，随着反应时间延长，反应液中杂质及纯度无明显变化。在同等条件下降低温度则反应结束时间延长，而降低温度提高催化剂三(二亚苄基丙酮)二钯用量反而会使杂质式(ii)的化合物
‑
1增加。所以三(二亚苄基丙酮)二钯用量与温度均对产品关键质量属性产生影响，因此，本发明提供本发明的式(i)的化合物的制备方法，其中反应温度为约60
‑
120℃，优选为约80
‑
110℃，进一步优选为约90
‑
100℃。
[0028]
表3
[0029][0030][0031]
在一个具体的实施方案中，本发明的式(i)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法包括在钯催化剂三(二亚苄基丙酮)二钯、膦配体存在下，使式(ii)的化合物和式(iii)的化合物发生反应的步骤。
[0032]
在一些具体的实施方案中，本发明的式(i)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其进一步包括使式(iv)的化合物与式(v)的化合物反应生成式(ii)的化合物的步骤，其中，x为离去基团(同以上所定义)，
[0033][0034]
在一些具体的实施方案中，以上式(ii)的化合物的制备方法包括在合适的溶剂如水溶性溶剂，例如乙腈、乙醇、丙酮、烷醇、醇、醚、丙二醇、丙三醇、三醋精、聚(丙二醇)、pvp(聚(乙烯基吡咯烷酮))、二甲亚砜、n,n
‑
二甲基甲酰胺、甲酰胺、n,n
‑
二甲基乙酰胺、吡啶、丙醇、n
‑
甲基乙酰胺、丁醇、soluphor(2
‑
吡咯烷酮)或pharmasolve(n
‑
甲基
‑2‑
吡咯烷酮)等，优选乙腈、甲醇或乙醇中，使式(iv)的化合物与式(v)的化合物反应生成式(ii)的化合物的步骤。
[0035]
在一些具体的实施方案中，根据本发明的式(ii)的化合物的制备方法，其中反应溶剂为乙腈。本发明的发明人使用乙腈作为溶剂进行示例性实验，发现此步骤为非均相反应，若溶剂量过大则反应接触面减小导致反应速率减慢；若溶剂量过少，则会导致在后处理过程中爆析。实验显示，当乙腈用量约为10v
‑
20v(溶剂体积(ml)与式(iv)的化合物质量(g)之间的比值)时，不会对式(ii)的化合物的冷却析出造成损失，同时也避免了在热过滤过程中式(ii)的化合物爆析以及过多的反应溶剂对反应速率降低产生的风险等。因此，在一些优选的实施方案中，本发明提供本发明的式(ii)的化合物的制备方法，使用乙腈作为反应溶剂，其中乙腈与式(iv)的化合物的用量比为约10
‑
20:1(乙腈体积(ml)与式(iv)的化合物质量(g)之间的比值)，优选为约10
‑
17:1(乙腈体积(ml)与式(iv)的化合物质量(g)之间的比值)。在一个具体的实施方案中，本发明提供本发明的式(ii)的化合物的制备方法，使用乙腈作为反应溶剂，其中乙腈与式(iv)的化合物的用量比为约14:1(乙腈体积(ml)与式(iv)的化合物质量(g)之间的比值)。
[0036]
在一些具体的实施方案中，本发明的式(i)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其进一步包括使式(vi)的化合物发生反应生成式(v)的化合物的步骤，其中，x为离去基团(同以上所定义)，
[0037][0038]
在一些具体的实施方案中，本发明提供本发明的式(v)的化合物的制备方法，其中反应溶剂选自水溶性溶剂，例如乙腈、乙醇、丙酮、烷醇、醇、醚、丙二醇、丙三醇、三醋精、聚(丙二醇)、pvp(聚(乙烯基吡咯烷酮))、二甲亚砜、n,n
‑
二甲基甲酰胺、甲酰胺、n,n
‑
二甲基乙酰胺、吡啶、丙醇、n
‑
甲基乙酰胺、丁醇、soluphor(2
‑
吡咯烷酮)、pharmasolve(n
‑
甲基
‑2‑
吡咯烷酮)等，优选选自乙腈、甲醇和乙醇。
[0039]
在一些具体的实施方案中，本发明的式(i)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其进一步包括使式(vii)的化合物在碱性试剂的作用下游离为式(iii)的化合物的步骤，
[0040][0041]
在一些实施方案中，本发明提供本发明的式(iii)的化合物的制备方法，其中碱性试剂包括但不限于碱金属氢氧化物或醇盐例如naoh、lioh和koh；碱土金属氢氧化物或醇盐，碱金属碳酸盐包括碳酸钠、碳酸钾和碳酸铯，碱土金属碳酸盐，碱金属和碱土金属磷酸盐，碱金属乙酸盐，碱土金属乙酸盐，和胺碱例如三烷基胺，包括但不限于三乙胺，二异丙基乙胺，1,8
‑
二氮杂二环[5.4.0]十一烷
‑7‑
烯(dbu)；1,5
‑
二氮杂二环[4.3.0]非3
‑
烯(dbn)；1,4
‑
二氮杂二环[2.2.2]辛烷(dabco)等。在一些具体的实施方案中，所述碱性试剂选自碳酸钠、碳酸钾和氢氧化钠。
[0042]
在一些具体的实施方案中，根据本发明的式(iii)的化合物的制备方法，其中使用乙腈作为反应溶剂。在一些优选的实施方案中，根据本发明的式(iii)的化合物的制备方法，其中使用乙腈和水的混合物作为反应溶剂。优选地，使用催化量的水。在一些具体的实施方案中，根据本发明的式(iii)的化合物的制备方法，其中反应溶剂为含有约0.1
‑
1.0％水的乙腈。在一些具体的实施方案中，根据本发明的式(iii)的化合物的制备方法，其中反应溶剂为含有约0.2
‑
0.6％水的乙腈。在一些具体的实施方案中，根据本发明的式(iii)的化合物的制备方法，其中反应溶剂为含有约0.2
‑
0.4％水的乙腈。在一些具体的实施方案中，根据本发明的式(iii)的化合物的制备方法，其中反应溶剂为含有约0.3％水的乙腈。
[0043]
在一些具体的实施方案中，本发明提供本发明的式(iv)的化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0044][0045]
1)式(iv
‑
1)的化合物与溴素在酸性条件下发生反应制得式(iv
‑
2)的化合物；
[0046]
2)式(iv
‑
2)的化合物在碱性条件下和苯甲酸发生反应制得式(iv
‑
3)的化合物；
[0047]
3)式(iv
‑
3)的化合物与n,n
‑
二甲基甲酰胺二甲缩醛(dmf
‑
dma)发生反应制得式(iv
‑
4)的化合物；
[0048]
4)式(iv
‑
4)的化合物和水合肼在冰醋酸的作用下制得式(iv
‑
5)的化合物；
[0049]
5)式(iv
‑
5)的化合物和环丙基硼酸在1,2
‑
二氯甲烷中发生反应制得式(iv
‑
6)的化合物；
[0050]
6)式(iv
‑
6)的化合物在碱性条件下发生反应制得式(iv)的化合物。
[0051]
在一些具体的实施方案中，本发明提供式(i)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法，其中所述方法包括如下步骤：
[0052][0053]
1)式(vi
‑
1)的化合物经反应制得式(v
‑
1)的化合物；
[0054]
2)式(v
‑
1)的化合物和式(iv)的1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
醇发生反应制得式(ii
‑
1)的化合物；
[0055]
3)式(vii)的3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6,7,8
‑
四氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪盐酸盐在碱性试剂的作用下游离为式(iii)的化合物；
[0056]
4)式(ii
‑
1)的化合物和式(iii)的化合物发生反应制得式(i)的化合物。
[0057]
相较于路线一，该条路线大大简化实验步骤。其中将氯代喹啉换成溴代喹啉，使buchward偶联制备式(i)的化合物可以得到较高的收率。将反应顺序改为先亲核取代再偶联可以解决羟基钝化作用以及筛选羟基保护基和脱除保护基等众多问题。该路线步骤少、操作简便、适合工业化生产、更加环境友好且收率更高。
[0058]
在一些优选的实施方案中，本发明提供式(i)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的一种精制方法，其中所述方法包括将式(i)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶溶解在溶剂中，降温析晶；优选地，本发明提供式(i)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的一种精制方法，其中所述方法包括将式(i)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶溶解在溶剂中，加入金属清除剂、活性炭，过滤，降温析晶；进一步优选地，本发明提供式(i)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的一种精制方法，其中所述方法包括将式(i)的化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶溶解在溶剂中，加入金属清除剂，过滤，加入反溶剂析晶；其中所述溶剂优选选自二氯甲烷、乙腈、水、碳原子数小于6的酯类、碳原子数小于6的醇类和碳原子数小于6的酮类中的一种或几种，更优选选自乙酸乙酯、乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、仲丁醇、异丙醇、二氯甲烷、丙酮和水中的一种或几种；其中所述反溶剂选自甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷和庚烷。
[0059]
本发明的发明人发现，本发明提供的式(i)化合物或其盐、水合物、溶剂合物或结晶的制备方法反应路线步骤少、操作简便、更加环境友好、有较高的收率及纯度，反应条件温和，纯化容易，工艺稳定，易于操作，能够满足工业规模的生产和应用。
[0060]
术语说明
[0061]
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本发明的“离去基团”，具有本领域的通常含义，是指可以容
易地置换的基团，当形成新键时，由分子发生置换反应的分子上的活性官能团。具有此功能的基团是本领域技术人员众所周知的，其具体实例可进一步参考本领域常见的有机合成手册，例如
″
advancedorganic chemistry，
″
杰瑞马奇(jerrymarch)，第5版，第351
‑
第357页，johnwileyandsons，n.y。例如，所述离去基团可以是卤素原子、氨基、烷氧基、酰氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷基磺酰氧基、芳基磺酰氧基、羟基、羟基的活性酯，例如羧酸酯、磺酸酯、磷酸酯或硼酸酯。
[0062]
本发明的“缚酸剂”，具有本领域的通常含义，优选地，其中所述的缚酸剂选自醇盐碱、碱金属醇盐和碳酸盐碱；进一步优选地，所述缚酸剂选自叔丁醇钾、叔丁醇钠、叔戊醇钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸铯、碳酸氢铯、磷酸钾和磷酸氢二钾。
[0063]
本发明的“羟基保护基”是本领域已知的适当的用于羟基保护的基团，参见文献(“protective groups in organic synthesis”，5
th ed.t.w.greene&p.g.m.wuts)中的羟基保护基团。作为示例，优选地，所述的羟基保护基可以是(c1‑
10
烷基或芳基)3硅烷基，例如：三乙基硅基，三异丙基硅基，叔丁基二甲基硅基，叔丁基二苯基硅基等；可以是c1‑
10
烷基或取代烷基，例如：甲基，叔丁基，烯丙基，苄基，甲氧基甲基，乙氧基乙基，2
‑
四氢吡喃基(thp)等；可以是(c1‑
10
烷基或芳香基)酰基，例如：甲酰基，乙酰基，苯甲酰基等；可以是(c1‑6烷基或c6‑
10
芳基)磺酰基；也可以是(c1‑6烷氧基或c6‑
10
芳基氧基)羰基。
[0064]
本发明的“盐”可以是任何盐，尤其是指药学上可接受的盐。在本文中，“药学上可接受的盐”是指本发明所述的化合物与本发明的“酸”或“酸性试剂”形成的药学上可接受的盐，本发明的“酸”或“酸性试剂”可选自盐酸、氢溴酸、磷酸、氨基磺酸、硝酸、对甲基苯磺酸、苯磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、乙酸、乙二酸、苯乙酸、丙酸、丙二酸、三氟乙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、抗坏血酸、双羟萘酸、羟基马来酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、2
‑
乙酰氧基苯甲酸、反丁烯二酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸、柠檬酸、d
‑
葡萄糖酸、乳酸、l
‑
苹果酸、琥珀酸、l
‑
酒石酸、富马酸、α
‑
酮戊二酸、马尿酸、马来酸、d
‑
酒石酸、甲烷磺酸或其类似物。本发明化合物的“药学上可接受的盐”能由包含酸性或碱性部分的本发明化合物经常规的化学方法合成，通常，碱性化合物的盐类能通过例子交换色谱法制备，或将游离碱与化学计量或过量的所期望的成盐无机或有机酸在适宜的溶剂或溶剂的各种组合中进行反应来制备。类似的，酸性化合物的盐类可通过与适宜的无机或有机碱进行反应来形成。
[0065]
本发明“碱性试剂”是指能够使羟基或氨基去质子化的化合物。碱的实例包括但不限于，与醇溶剂组合的(c1‑6烷基)氧化物((c1‑6烷基)om)，其中(c1‑6烷基)氧化物包括但不限于meo
‑
、eto
‑
、n
‑
pro
‑
、i
‑
pro
‑
、t
‑
buo
‑
、i
‑
amo
‑
(异戊氧基)等，且其中m是碱金属阳离子，例如li

、na

、k

等。醇溶剂包括(c1‑6烷基)oh，例如，诸如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、叔丁醇、异戊醇等。还可以使用非烷氧基碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠、六甲基二甲硅基胺钠、六甲基二甲硅基胺锂、二异丙基酰胺锂、氢化钙、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸铯、dbu(1,8
‑
二氮杂二环[5.4.0]十一碳
‑7‑
烯)、dbn(1,5
‑
二氮杂双环[4.3.0]壬
‑5‑
烯)、格氏试剂例如(c1‑6烷基)mg(卤素)，其包括但不限于甲基氯化镁、甲基溴化镁、叔丁基氯化镁、叔丁基溴化镁等。
[0066]
术语“溶剂合物”是指通过与溶剂分子配位形成固态或液态的配合物的本发明化合物的形式。水合物是溶剂合物的特殊形式，其中与水发生配位。在本发明范围内，溶剂合物优选是水合物。
[0067]
术语“结晶”是指本发明所述的化合物形成的各种固体形态，包括晶型、无定形。
[0068]
本发明化合物中的“氢”、“碳”、“氧”包括其所有同位素。同位素应理解为包括具有相同原子数但具有不同质量数的那些原子。举例来说，氢的同位素包括氕、氚和氘，碳的同位素包括
13
c和
14
c，氧的同位素包括
16
o和
18
o等。
具体实施方式
[0069]
下面代表性的实施例是为了更好地说明本发明，而非用于限制本发明的保护范围。以下实施例中使用的材料如无特殊说明均为商购获得。
[0070]
实施例1 4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉的制备
[0071][0072]
步骤1：2
‑
溴
‑1‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)乙烷
‑1‑
酮的制备
[0073][0074]
氮气保护下，在1000ml三口瓶中，依次加入甲醇(100ml)、1
‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)乙酮(20.0g,156mmol)，降温到
‑
15℃以下，缓慢滴入液溴，保持温度
‑
15℃以下。滴完升温到0℃，反应45min，然后升温到10℃，反应45min，维持内温在室温以下缓慢滴入11mol/l硫酸(55ml)，滴完室温反应过夜。监控反应结束，加入乙酸乙酯和氯化钠水溶液萃取，合并有机层，有机层用饱和碳酸氢钠调ph值7
‑
8，合并有机层，减压浓缩，得到淡黄色固体标题化合物，共计28.5g，收率：87.5％；ms(esi)m/z 207.0[m h]

。
[0075]
步骤2：2
‑
氧代
‑2‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)乙基苯甲酸酯的制备
[0076][0077]
将苯甲酸(18.5g，151.4mmol)溶于n,n
‑
二甲基甲酰胺(dmf,495ml)中，加入碳酸钾(38g，275.2mmol)，再向体系中加入2
‑
溴
‑1‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)乙烷
‑1‑
酮(28.5g，137.6mmol)，室温反应过夜。加入乙酸乙酯稀释，氯化钠水溶液洗涤。合并有机相。减压浓缩，得到淡黄色固体标题化合物，共计30.0g，收率：88.2％；lc
‑
ms m/z[m h]

＝249。
[0078]
步骤3：(z)
‑1‑
(二甲基氨基)
‑3‑
氧代
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)丙
‑1‑
烯
‑2‑
基苯甲酸酯的制备
[0079][0080]
向1,1
‑
二甲氧基
‑
n,n
‑
二甲基甲胺(795.15ml,5975.8mmol)中加入2
‑
氧代
‑2‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)乙基苯甲酸酯(95.0g,383mmol)，加热至100℃，反应2h，再升温到106℃，反应2h，监控反应结束后恢复至室温，减压浓缩至干，向体系中加入乙酸乙酯，和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥。过滤得有机相，减压浓缩，得红色固体标题化合物，共计107.9g，收率：93.1％，直接用于下一步。lc
‑
ms m/z[m h]

＝304。
[0081]
步骤4：3
‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基苯甲酸酯的制备
[0082][0083]
向1000ml反应瓶中依次加入乙酸(376.1ml)、(z)
‑1‑
(二甲基氨基)
‑3‑
氧代
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)丙
‑1‑
烯
‑2‑
基苯甲酸酯(32.56g，107.46mmol)，冰浴下缓慢滴加80％水合肼(37.6ml)，滴完室温搅拌过夜。监控至反应终点，向反应液中加入乙酸乙酯，水洗，合并有机相，饱和碳酸氢钠溶液洗涤至ph为7
‑
8，有机相无水硫酸钠干燥，过滤得有机相经减压浓缩得黄色油状物，室温放置过夜得黄色固体标题化合物，共计28.0g，收率：95.8％；lc
‑
ms m/z[m h]

＝273。
[0084]
步骤5：1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基苯甲酸酯的制备
[0085][0086]
向1,2
‑
二氯乙烷(250ml)中依次加入2,2'
‑
联吡啶(17.7g,113.2mmol)，乙酸铜(20.6g,113.2mmol)，于75℃下反应30min，冷却至室温后，依次加入环丙基硼酸(17.5g,205.9mmol)、碳酸钠(21.8g,205.9mmol)以及3
‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基苯甲酸酯(28.0g,102.9mmol)的1,2
‑
二氯乙烷(250ml)溶液，在氧气氛围下，于75℃下反应4h。监控至反应终点，冷却至室温，硅藻土助虑，乙酸乙酯洗涤滤饼，滤液经减压浓缩得到红褐色油状标题化合物，共计32.0g，收率：98.5％，直接用于下一步；lc
‑
ms m/z[m h]

＝313。
[0087]
步骤6：1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
醇的制备
[0088][0089]
向甲醇(308ml)中加入1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基苯甲酸
酯(32.0g，102.6mmol)，室温反应2h。监控至反应终点，减压浓缩除去部分甲醇，1mol/l稀盐酸调ph至6～7，二氯甲烷萃取，合并有机层。减压浓缩至干，经柱层析色谱纯化得黄色固体标题化合物，共计9.0g，收率：45％；lc
‑
ms m/z[m h]

＝209。
[0090]
步骤7：7
‑
溴
‑4‑
氯喹啉的制备
[0091][0092]
向50l立式夹套反应釜中加入4.50kg乙腈，开启搅拌，依次加入7
‑
溴
‑4‑
羟基喹啉(1.80kg,8.03mol)、4.00kg乙腈，内温降至低于10℃时滴加三氯氧磷(1.85kg,12.05mol)，滴加完毕后升温回流搅拌1～3小时，监控至反应终点，将体系降温至5℃以下，滴加4mol/l naoh溶液调节ph至7～8，加入42.00kg水，室温搅拌1～2小时，将料液离心，滤饼5.00kg水洗涤，真空干燥，将固体收集称重，得棕色固体的标题化合物粗品，共计1.73kg，收率：88.8％。
[0093]
向50l立式夹套反应釜中依次加入14.4kg甲基叔丁基醚、1.73kg 7
‑
溴
‑4‑
氯喹啉粗品，于50
±
5℃范围内搅拌1～3小时，趁热过滤，用甲基叔丁基醚洗涤滤饼，滤液减压浓缩至干，所得固体真空干燥，干燥完毕将固体收集称重，得黄色固体的标题化合物精制品，共计1.54kg，收率89.0％。
[0094]
步骤8：7
‑
溴
‑4‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)喹啉的制备
[0095][0096]
向30l玻璃反应釜中加入8.40kg乙腈，开启搅拌，依次加入7
‑
溴
‑4‑
氯喹啉(1.26kg,5.18mol)、碳酸铯(1.69kg,5.18mol)、1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
醇(0.90kg,4.32mol，，4.00kg乙腈洗涤。氮气保护，升温至70
±
5℃搅拌2～3小时，升高温度至回流2～3小时。降温至70
±
5℃时趁热过滤，滤渣用二氯甲烷洗涤，滤液减压浓缩至粘稠状，加入14.00kg水，搅拌，离心，滤饼3.00kg水洗，50
±
5℃真空干燥10～20小时，干燥完毕将固体收集称重，得棕色固体的标题化合物粗品1，共计1.88kg，粗品收率100.0％。
[0097]
向10l四口烧瓶中加6.40kg入庚烷、1.88kg 7
‑
溴
‑4‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)喹啉粗品1，25
±
5℃搅拌3～5小时。过滤，1.40kg庚烷洗涤滤饼，50
±
5℃真空干燥3～20小时。干燥完毕将固体收集称重，得深黄色固体的标题化合物粗品2，共计1.68kg，收率89.4％。
[0098]
向10l四口烧瓶中加入4.70kg无水乙醇、1.68kg 7
‑
溴
‑4‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)喹啉粗品2，升温至回流，溶清后搅拌0.5～1小时，关闭加热，自然冷却析晶，待内温低于30℃，开启外循环于
‑
10～
‑
5℃下搅拌1～3小时。将料液离心，0.4kg冷乙醇(
‑
10～
‑
5℃)洗涤滤饼，50
±
5℃真空干燥10～20小时。干燥完毕将固体收集称重，得淡黄色固体的标题化合物精制品，共计1.35kg，收率80.4％。
[0099]
步骤9：3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6,7,8
‑
四氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪的制备
[0100][0101]
在20l四口烧瓶中加入3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6,7,8
‑
四氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪盐酸盐(1.20kg,5.25mol)、11.8kg乙腈，开启搅拌，加入氢氧化钠(0.42kg,10.50mol)、36.00g水，25
±
5℃剧烈搅拌3～15小时；过滤，乙腈洗涤，滤液减压浓缩至干，加入0.5g晶种，待固化后真空干燥。干燥完毕将固体收集称重，得白色固体的标题化合物，共计0.92kg，收率91.2％。
[0102]
步骤10：4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉的制备
[0103][0104]
向20l四口烧瓶中加入7.10kg 1,4
‑
二氧六环，开启搅拌，依次加入7
‑
溴
‑4‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)喹啉(1.34kg,3.23mol)、3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6,7,8
‑
四氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪(0.75kg,3.88mol)、磷酸钾(k3po4，1.37kg,6.47mol)、4,5
‑
双二苯基膦
‑
9,9
‑
二甲基氧杂蒽(xantphos,37.40g,65.00mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(pd2(dba)3,29.6g,32.00mmol)。氮气保护，维持氮气氛围。升温至95
±
5℃搅拌3～15小时，关闭加热，待内温降至70～80℃时趁热过滤，1.6kg热1,4
‑
二氧六环(70～80℃)洗涤，母液缓慢倒入冰水中，加入n
‑
乙酰
‑
l
‑
半胱氨酸，搅拌1～1.5小时，离心，5.00kg水洗，真空干燥。干燥完毕将固体收集称重，得黄色固体的标题化合物粗品1，共计1.41kg，收率83.1％。
[0105]
步骤11：4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉的精制
[0106]
向10l四口烧瓶中加入3.8kg乙酸乙酯、1.40kg 4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉粗品1，氮气保护下升温至55
±
5℃搅拌2～4小时，自然冷却至内温30℃以下，于
‑
5～
‑
10℃搅拌析晶1～3小时，离心，0.5kg冷乙酸乙酯(
‑
10～
‑
5℃)洗涤，真空干燥，得淡黄色固体的标题化合物粗品2。共计1.21kg，收率85.8％。
[0107]
向30l玻璃反应釜中加入14.30kg无水甲醇、1.20kg 4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉粗品2，氮气保护下升温回流溶清，加入0.12kg活性炭、0.12kg thiol。回流1～1.5小时，趁热过滤，热甲醇(50～60℃)洗涤，滤液减压浓缩，于
‑
10～
‑
5℃下冷却析晶1～3小时，离心，冷甲醇(
‑
10～
‑
5℃)洗涤。真空干燥，得类白色固体的
标题化合物粗品3共计1.03kg。收率85.1％。
[0108]
向10l四口烧瓶中加入9.50kg二氯甲烷、1.02kg 4
‑
((1
‑
环丙基
‑3‑
(四氢
‑
2h
‑
吡喃
‑4‑
基)
‑
1h
‑
吡唑
‑4‑
基)氧基)
‑7‑
(3
‑
(三氟甲基)
‑
5,6
‑
二氢
‑
[1,2,4]三唑并[4,3
‑
a]吡嗪
‑
7(8h)
‑
基)喹啉粗品3，开启搅拌。溶清后加入0.20kg thiol，搅拌，过滤，二氯甲烷洗涤，滤液中缓慢滴加26.20kg庚烷，搅拌10～15小时，过滤，1.60kg庚烷洗涤滤饼，真空干燥，得白色固体的标题化合物精制品，共计0.99kg。收率97.1％。esi
‑
ms[m h]

m/z:526.3,1h nmr(400mhz,dmso)δ8.59(d,j＝5.2hz,1h),8.17(d,j＝11.2hz,1h),7.94(s,1h),7.64(dd,j＝11.2,2.4hz,1h),7.45(d,j＝2.4hz,1h),6.56(d,j＝5.2hz,1h),4.91(s,2h),4.34(t,j＝5.1hz,2h),4.02(t,j＝5.2hz,2h),3.88
–
3.71(m,2h),3.73
–
3.63(m,1h),3.30
–
3.19(m,2h),2.82
–
2.65(m,1h),1.78
–
1.59(m,4h),1.12
–
1.01(m,2h),1.01
–
0.88(m,2h).
[0109]
实验例1化合物体外alk5激酶活性评价
[0110]
1.实验材料
[0111]
1.1化合物
[0112]
实施例1的本发明式(i)的化合物，用dmso配制成10mm后，依次稀释至3.333μm、1.111μm、370nm、123nm、41nm、14nm、4.6nm、1.5nm、0.5nm。
[0113]
1.2试剂和仪器
[0114]
试剂：alk5，购自于carna公司，cat.no.09
‑
141；p38α购自于carna公司，cat.no.04
‑
152；tgfβr1 peptide购自于signalchem公司，cat.no.t36
‑
58；二甲基亚砜(dmso)，购自于美国sigma公司；edta，购自于美国sigma公司；adp
‑
glo kinase assay，购自于promega公司，cat.no.v9102/3，1
×
激酶缓冲液(40mm tris，ph 7.5，0.10％bsa，20mm mgcl2，1mm dtt)，临用前配制。
[0115]
仪器：2104multilabel reader，购自于美国perkin elmer公司。
[0116]
2.实验方法
[0117]
2.1配制1x的激酶缓冲液
[0118]
1x assay buffer
[0119]
40mm tris,ph 7.5
[0120]
20mm mgcl2[0121]
0.10％bsa
[0122]
1mm dtt
[0123]
2.2化合物配制
[0124]
2.2.1化合物稀释
[0125]
2.2.1.1配制50倍的化合物：化合物的检测终浓度为10μm，配置成50倍浓度，即500μm：在96孔板上第二个孔中加入95μl的100％dmso，再加入5μl 10mm化合物溶液，配制成1000μm化合物溶液。其他孔加入60μl的100％dmso。从第二孔中取30μl化合物加入第三孔中，依次往下做3倍稀释，共稀释10个浓度。
[0126]
稀释仪器：自动微孔移液器(precision prc384u)。
[0127]
2.2.1.2用echo转移100nl化合物到反应板中。
[0128]
2.3激酶反应
[0129]
2.3.1配制2倍激酶溶液
[0130]
将激酶加入1倍激酶缓冲液，形成2倍酶溶液。384孔反应板中已有100nl的100％dmso溶解的化合物。向384孔反应板中加入2.5μl的2倍酶溶液。室温下孵育10分钟。
[0131]
2.3.2配制2倍底物溶液
[0132]
将fam标记的多肽和atp加入1倍激酶缓冲液，形成2倍底物溶液。向384孔反应板中加入2.5μl的2倍底物溶液。
[0133]
2.4激酶反应
[0134]
将384孔板于28度孵育120分钟，
[0135]
2.5反应结果的检测
[0136]
2.5.1将adp
‑
glo试剂平衡到室温。
[0137]
2.5.2转移5μl反应液到一块新的384孔板反应孔中。
[0138]
2.5.3转移5μl adp
‑
glo试剂到384孔板反应孔中终止反应。
[0139]
2.5.4在28度孵育120分钟。
[0140]
2.5.5转移10μl激酶检测试剂到每个反应孔中，振荡1分钟，室温静置30分钟。
[0141]
2.6数据读取
[0142]
在envision上读取样品发光数值。
[0143]
2.7曲线拟合
[0144]
2.7.1从envision程序上复制发光读数的数据
[0145]
2.7.2将发光读数的值通过公式转换为抑制百分率。
[0146]
percent inhibition＝(max
‑
sample rlu)/(max
‑
min)*100.“min”为不加酶进行反应的对照样荧光读数；“max”为加入dmso作为对照的样品荧光读数。
[0147]
2.7.3将数据导入ms excel并使用xlfit excel add
‑
in version 5.4.0.8进行曲线拟合，拟合公式:y＝bottom (top
‑
bottom)/(1 (ic
50
/x)^hillslope)，结果见表4。
[0148]
表4
[0149][0150]
从以上实验结果可以看出，本发明的化合物对alk5激酶具有很好的抑制活性，同时对p38α具有低的抑制作用，选择性高。表明本发明的化合物在产生更高疗效的同时，副作用更低。
[0151]
实验例2化合物体外细胞荧光素酶实验评价
[0152]
1.实验材料
[0153]
受试化合物：实施例1的本发明式(i)的化合物，用dmso配制成4mm，然后依次4倍稀释为20000.00nm、5000.00nm、1250.00nm、312.5nm、78.125nm、19.53nm、4.88nm、1.22nm。
[0154]
luc
‑
smad2/3
‑
nih3t3小鼠成纤维细胞(经工程化后过表达smad2，3
‑
响应性启动子)由中国药科大学实验室馈赠。
[0155]
试剂：dmem，购自于美国invitrogen公司；fbs，购自于美国invitrogen公司；dmso，
购自于美国sigma公司；glo lysis buffer，购自于美国progema公司；bright
‑
glo luciferase assay system，购自于美国promega公司；tgfβ，购自于美国peprotech公司。
[0156]
仪器：md spectramax m3多功能酶标仪，购自于美国molecular devices公司。
[0157]
2.实验方法
[0158]
2.1细胞培养：
[0159]
细胞复苏：将细胞置于37度水浴中溶解，然后转移到15ml已预热的培养基中，1000rpm离心5分钟，弃去培养基，用15ml新鲜培养基重悬细胞，转移至10cm培养皿中，置于37℃、5％co2的培养箱中培养，24小时后细胞更换新鲜培养基。
[0160]
细胞传代：将上述复苏的细胞转移到50ml无菌离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去培养基，取分散均匀的细胞计数，调整合适的细胞浓度到15ml新鲜培养基，加入到10cm培养皿中，置于37℃、5％co2的培养箱中培养。
[0161]
2.2实验步骤：
[0162]
day1：铺细胞(透底96孔板)
[0163]
luc
‑
smad2/3
‑
nih3t3细胞于10cm培养皿中正常培养至汇合度达80％
‑
90％，消化后收集至15ml离心管中，1000xg离心5分钟后，去除上清，用1ml培养基重悬后，稀释10倍计数，根据计数后的结果稀释细胞，将4x103/孔细胞数传入96孔板中(每孔加入100μl重悬细胞)。
[0164]
day2：细胞给药
[0165]
药物称量1
‑
2mg(提前称好)，使用dmso配制成4mm母液。24小时后，移去培养基。用2％fbs培养基稀释药物，加入100μl 1x药物溶液，使药物终浓度分别为20000.00nm、5000.00nm、1250.00nm、312.5nm、78.125nm、19.53nm、4.88nm、1.22nm，每孔tgfβ1终浓度为4ng/ml，与化合物一起用2％fbs培养基进行稀释。
[0166]
day3：荧光检测实验
[0167]
将glo lysis buffer和bright
‑
glo luciferase assay system以及细胞平衡至室温，移去细胞上清，每孔加入100μlglo lysis buffer，缓慢摇晃使其均匀溶解细胞，室温裂解5mins。之后每孔加入100μl bright
‑
glo luciferase assay system，室温孵育5分钟，震荡2分钟，将180μl上清液转入白底96孔板，检测化学发光信号，检测条件为1s。
[0168]
2.3数据处理：使用graphpad prism 5软件进行非线性曲线拟合和数据分析，拟合得ic
50
，实验结果见表5。
[0169]
表5
[0170][0171]
从以上实验可以看出，本发明的化合物对nih3t3细胞中tgfβ
‑
alk5
‑
smad2/3信号通路均表现出了良好的抑制活性，非常有希望成为多种癌症相关疾病的治疗剂。
[0172]
尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于
上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。