外泌体环状RNA0109315作为靶点在防治良性前列腺增生中的应用的制作方法

外泌体环状rna 0109315作为靶点在防治良性前列腺增生中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术与良性前列腺增生领域，具体涉及外泌体环状rna hsa_circ_0109315作为靶点在防治良性前列腺增生中的应用。


背景技术：

2.良性前列腺增生(benign prostate hyperplasia，bph)是中老年男性的常见疾病，发病率呈上升趋势，且随年龄递增。据报道，bph在50、60和80岁以上男性中的发病率分别约在25％、50％和83％(wuf,ding s,li x,et al.elevated expression of hif
‑
1αin actively growing prostate tissuesis associated with clinical features of benign prostatic hyperplasia.oncotarget,2016,7(11):12053
‑
62.)。此外，bph也是男性出现排尿困难和储尿障碍等下尿路症状的最常见原因(gratzke c,bachmann a,descazeaud a,et al.eau guidelines on the assessment of non
‑
neurogenic male lower urinary tract symptoms including benign prostatic obstruction.eur urol,2015,67(6):1099
‑
109.)。bph虽然不是短期内可威胁生命的疾病，但给患者的日常生活造成极度的尴尬和烦恼，而且带来巨大的经济压力。随着我国人均寿命的延长和逐步进入老龄化社会，bph对患者生存质量的严重制约已引起越来越多的关注。然而，bph的病因学复杂，虽然既往研究揭示了年龄、激素水平改变、代谢综合征和炎症等因素参与bph的诱发，但确切的发病分子机制至今仍未阐明，使得现阶段的临床干预手段并不能真正阻断或逆转bph。bph的首选治疗药物包括α受体阻滞剂和5α
‑
还原酶抑制剂。其中α受体阻滞剂并不能减少前列腺体积。另外，大约有25
‑
30％的患者在使用5α
‑
还原酶抑制剂后下尿路症状没有改善，甚至有5
‑
7％的患者出现进一步恶化(bechis sk,otsetov ag,ge r,et al.personalized medicine for the management of benign prostatic hyperplasia.j urol,2014,192(1):16
‑
23.)。因此迫切需要寻找新的分子靶点，以期为针对性的治疗提供指导。
3.环状rna(circular rnas，circrnas)是由前体mrna通过反剪接或共价结合形成的单链闭环rna，主要存在于胞质。大多数的circrnas在病理条件下以细胞或组织特异性的方式异常表达，并通过海绵抑制微小rna(micrornas，mirnas)等多种方式发挥生理效应(kristensen ls,andersen ms,stagsted lvw,et al.the biogenesis,biology and characterization of circular rnas.nat rev genet,2019,20(11):675
‑
91.)。外泌体是一类直径约在30
‑
150nm的内源性囊泡，广泛分布于各种细胞和体液(包括前列腺液)中(kalluri r,lebleu vs.the biology,function,and biomedical applications of exosomes.science,2020,367(6478):eaau6977.)。circrnas比对应的线性rna更稳定，经外泌体富集后易于通过外周血收集检测。由此可见，外泌体circrnas不仅是潜在的治疗靶点，而且是有诊断和预后指示价值的生物标志物。
4.然而，有关外泌体circrnas在bph病理发展中的作用鲜有报道。申请人前期研究发
现，相对于空白组，丙酸睾酮刺激后的细胞模型上存在大量显著性差异表达的外泌体circrnas。令人遗憾的是，对共表达分析选取的9个circrnas(circ_0006869,circ_0000722,circ_0084765,circ_0002965,circ_0005311,circ_0001410,circ_0000043,circ_0001573,circ_0075796)进行低通量验证发现部分circrnas未能差异表达，甚至无法检出(chen jl,rong n,liu m,et al.,the exosome
‑
like vesicles derived from androgen exposed
‑
prostate stromal cells promote epithelial cells proliferation and epithelial
‑
mesenchymal transition.toxicol appl pharmacol,2021,411:115384.)。进一步的临床验证也未能得出理想的结果。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术的不足，提供了外泌体环状rna hsa_circ_0109315作为靶点在防治良性前列腺增生中的应用，所述的外泌体环状rna hsa_circ_0109315其对应的亲本基因位于chr19:23541232
‑
23545527。
6.为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
7.外泌体环状rna hsa_circ_0109315作为靶点在防治良性前列腺增生中的应用，所述的外泌体环状rna hsa_circ_0109315其对应的亲本基因位于chr19:23541232
‑
23545527，序列为seq id no：1所示；
8.所述的应用包括：检测外泌体环状rna hsa_circ_0109315的试剂在作为良性前列腺增生的诊断试剂中的应用；利用本领域的常规方案或技术手段，seq id no：1所示序列制备的检测试剂都可以达到上述目的；在本发明中是利用引物：5
’‑
tacctgctcacatcgtactcaaa
‑3’
和5
’‑
aagaatcttccatgctctgctct
‑3’
进行检测的。
9.抑制外泌体环状rna hsa_circ_0109315表达的试剂在治疗良性前列腺增生的药物中的应用；利用本领域的常规方案或技术手段，可沉默，突变或是减弱rna hsa_circ_0109315表达的试剂，都可完成上述应用目的；在本发明实施例中，具体的是利用干扰rna(sirna：5
’‑
gaaaggtatatgtcctcat
‑3’
)对该基因进行沉默后，来抑制wpmy
‑
1增殖。
10.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
11.(1)首次发现hsa_circ_0109315可作为良性前列腺增生的药物防治靶点。临床验证证实相对于健康自愿者，bph患者外周血外泌体hsa_circ_0109315的水平升高。且抑制该外泌体环状rna能够抑制不同危险因素导致的人前列腺肌成纤维基质细胞wpmy
‑
1增生。
12.(2)与对照组相比，外泌体hsa_circ_0109315在良性前列腺增生中高表达，hsa_circ_0109315可作为良性前列腺增生的标志物。
附图说明
13.图1是人正常前列腺基质永生化细胞外泌体的鉴定图；
14.(a)：western blot检测外泌体膜特征蛋白cd63和内质特征蛋白tsg101的表达；
15.(b)：透射电子显微镜(tem)观察外泌体圆形结构，标尺为200μm；
16.图2是相对于对照组，香烟提取物刺激的wpmy
‑
1细胞增生组差异表达的外泌体环状rna层次聚类图。
17.图3是健康自愿者和良性前列腺增生患者外周血外泌体hsa_circ_0109315检测的
qpcr图；
18.*代表p值<0.05，差异非常显著。
19.图4是抑制hsa_circ_0109315表达对丙酸睾酮诱导wpmy
‑
1细胞增殖的影响力图；
20.a：空白对照组；b：丙酸睾酮组；c：丙酸睾酮 转染合成的sirna组；d：阴性对照组；*代表p值<0.05，差异非常显著。
21.图5是抑制hsa_circ_0109315表达对香烟提取物诱导wpmy
‑
1细胞增殖的影响力图；
22.a：空白对照组；b：香烟提取物组；c：香烟提取物 转染合成的sirna组；d：阴性对照组；*代表p值<0.05，差异非常显著。
具体实施方式
23.下面结合附图，对本发明作详细的说明。为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
24.实施例1：
25.香烟提取物刺激wpmy
‑
1细胞增生。
26.(1)人正常前列腺基质永生化细胞wpmy
‑
1细胞由中国科学院干细胞库提供。
27.(2)wpmy
‑
1细胞用dmem培养基(含10胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)培养。
28.(3)红金龙牌香烟(烟碱、焦油、一氧化碳含量分别为0.6、8和11mg/支)购于武汉烟草(集团)有限公司。
29.(4)新鲜的10％香烟烟雾提取物(cigarette smoke，cs)是通过将一支香烟燃烧的烟雾注入到10毫升的培养基中，并经0.22μm滤膜过滤制得。5％的cs是由培养基稀释获得的。
30.(5)wpmy
‑
1细胞用5％cs孵育48小时。
31.(6)收集50ml细胞上清液，用外泌体提取试剂盒(广州吉赛生物科技有限公司)提取外泌体。
32.实施例2：
33.wpmy
‑
1细胞上清液外泌体全转录组测序。
34.收集wpmy
‑
1细胞(对照组)、实施例1中的5％cs孵育48小时后的细胞上清液外泌体，各组生物重复均为3。
35.人正常前列腺基质永生化细胞wpmy
‑
1外泌体的生理情况如图1所示。
36.提取外泌体总rna，使用nanodrop nd
‑
1000仪测量rna浓度，od260/od280值1.8
‑
2.1为合格。高通量测序由上海云序生物科技有限公司提供。去除样品中核糖体rna后构建测序文库。通过bioanalyzer 2100system对文库进行质控和定量，采用illumina hiseq 4000测序仪进行150bp双端测序。使用star软件(v2.5.1b)将高质量reads比对到参考基因组/转录组上，使用dcc软件(v0.4.4)进行环状rna检测和鉴定。并使用circbase数据库和circ2traits对所鉴定的环状rna进行注释。再使用edger软件(v3.16.5)进行数据标准化和
差异表达circrna筛选。
37.相对于对照组，烟提取物刺激的wpmy
‑
1细胞增生组差异表达的外泌体环状rna层次聚类图如图2所示，相对于空白对照，香烟提取物组17个circrnas差异表达，其中，外泌体circ_0109315的水平显著性上升。
38.实施例3：
39.hsa_circ_0109315作为前列腺增生的标志物中的应用：
40.健康自愿者和良性前列腺增生患者外周血的外泌体hsa_circ_0109315水平：
41.(1)临床标本收集2020年8月至2021年3月华中科技大学同济医学院附属普爱医院的bph患者以及体检健康自愿者的外周血各7份。本技术涉及的研究获得江汉大学学术伦理审查委员会以及华中科技大学同济医学院附属普爱医院伦理委员会批准。
42.(2)用外泌体提取试剂盒(广州吉赛生物科技有限公司)提取外泌体。
43.(3)hsa_circ_0109315长度为4296bp，其对应的亲本基因位于chr19:23541232
‑
23545527；
44.(4)hsa_circ_0109315的序列为seq id no：1所示。
45.(5)特异性扩增hsa_circ_0109315的引物序列为：上游引物为5
’‑
tacctgctcacatcgtactcaaa
‑3’
，下游引物为5
’‑
aagaatcttccatgctctgctct
‑3’
。
46.荧光定量pcr(内参为β
‑
actin)的结果如图4所示：通过qpcr验证(图4)，相对于健康自愿者，良性前列腺增生患者外周血外泌体hsa_circ_0109315的水平显著性上升。表明，确实可以通过检测hsa_ci rc_0109315的表达量来作为判定前列腺增生的标志物。
47.实施例4：
48.抑制hsa_circ_0109315表达的制剂在抑制丙酸睾酮诱导wpmy
‑
1细胞增殖中的应用：
49.(1)hsa_circ_0109315的sirna序列由广州锐博生物科技有限公司合成，采用广州锐博cp转染试剂，按说明书方法转染wpmy
‑
1细胞，通过实施例3的qpcr引物检测hsa_circ_0109315表达量，判断转染是否有效。
50.(2)hsa_circ_0109315sirna：5
’‑
gaaaggtatatgtcctcat
‑3’
。
51.(3)实验共分为4组：空白对照组为未进行任何干预的wpmy
‑
1细胞；模型组为8μg/ml丙酸睾酮孵育48小时的wpmy
‑
1细胞；干预组为wpmy
‑
1细胞转染hsa_circ_0109315sirna，并用8μg/ml丙酸睾酮孵育48小时；阴性对照组为wpmy
‑
1细胞转染sirna nc，并用8μg/ml丙酸睾酮孵育48小时。
52.(4)48小时后，cck8法检测各组细胞的存活率。
53.统计学分析采用spss17.0软件进行单因素方差分析，组间比较采用lsd检验，p<0.05为有显著性差异。结果采用均值
±
标准差进行描述。
54.结果如图4所示，相对于模型组，hsa_circ_0109315sirna能够显著抑制丙酸睾酮诱导的wpmy
‑
1细胞增殖。结果说明，抑制hsa_circ_0109315水平有助于改善雄激素相关良性前列腺增生的病症。
55.实施例5：
56.抑制hsa_circ_0109315表达的制剂在抑制香烟提取物刺激wpmy
‑
1细胞增殖中的应用：
57.(1)实验共分为4组：空白对照组为未进行任何干预的wpmy
‑
1细胞；模型组5％cs孵育48小时的wpmy
‑
1细胞；干预组为wpmy
‑
1细胞转染hsa_circ_0109315sirna，并用5％cs孵育48小时；阴性对照组为wpmy
‑
1细胞转染sirna nc，并用5％cs孵育48小时。采用实施例4中的sirna对孵育后的细胞进行处理。
58.(2)48小时后，cck8法检测各组细胞的存活率。
59.统计学分析采用spss17.0软件进行单因素方差分析，组间比较采用lsd检验，p<0.05为有显著性差异。结果采用均值
±
标准差进行描述。
60.结果如图5所示，相对于模型组，hsa_circ_0109315sirna能够显著抑制香烟提取物诱导的wpmy
‑
1细胞增殖。结果说明，抑制hsa_circ_0109315水平有助于改善香烟暴露相关良性前列腺增生的病症。
61.上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。