猪繁殖与呼吸综合征病毒的嵌合病毒及使用其的疫苗的制作方法

1.本发明涉及一种可用作疫苗的猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)的嵌合病毒，本发明的嵌合病毒与其亲本株相比具有低致病性和高安全性。本发明的prrsv嵌合病毒可增强与交叉免疫相关的中和抗体的分泌，并提供一种可有效保护猪繁殖与呼吸综合征的疫苗。


背景技术：

2.猪繁殖与呼吸综合征(以下简称prrs)与猪圆环病毒感染和口蹄疫是对家猪业危害最大的传染病。prrs导致怀孕母猪不能生育，流产或早产或死产等生殖障碍，并在乳猪和育肥猪中引起呼吸道症状，例如打喷嚏、发热等。一般来说，重度呼吸道症状是由病毒感染后细菌等继发感染引起的，但在慢性感染的情况下，则体重增加减少，死亡率增加，而没有特征性的临床症状。
3.这种病毒性疾病于1987年首次在美国被发现，然后在欧洲发现，并于1990年代初在亚洲被发现。迄今为止，prrs一直在养猪国流行，并在世界范围内蔓延，每年都造成巨大的经济损失。
4.引起prrs的病原体是属于网巢病毒目(nidovirales)，动脉炎病毒科(arteriviridae)，动脉炎病毒属(arteriviru)的prrs病毒。prrs病毒具有正链单链rna基因组，大小约为15.4千碱基。prrs病毒的基因组有9个orf(conzelmann等人，1993；meulenberg等人，1993)。其中，编码非结构蛋白(nsp)的orf1a和orf1b约占病毒基因组的80％(bautista等人，2002；meulenberg等人，1993；snijder和meulenberg，1998，2001)。在非结构蛋白中，nsp1
‑
α、nsp
‑
1β和nsp2至nsp8已知位于orf1a中，nsp9至nsp12已知位于orf1b中。糖基化结构蛋白gp2、gp3、gp4和gp5以及非糖基化膜(m)蛋白和核衣壳(n)蛋白由orf2
‑
7编码，占其余的20％。次要结构蛋白gp2、gp3和gp4形成异源三聚体并在病毒侵入宿主细胞时起作用，主要结构蛋白gp5和m形成异源二聚体并用于增加病毒的感染性。
5.由于rna病毒的性质，prrs病毒是高度突变的，所以病毒之间存在很多差异。prrs病毒主要分为北美型和欧洲型。存在i型(lelystad病毒，lv)代表欧洲型，ii型代表北美型病毒株(北美毒株)atcc vr2332(vr2332的基因组序列见genbank登录号ay150564)(murtaugh等人，arch virol.1995；140:1451
‑
1460)。
6.已知，北美型与欧洲型之间存在高达40％的基因差异，因此无法相互交叉保护。此外，即使在属于同一类型的突变株之间，也不经常进行交叉保护(meng,x.j.等人,2000)。为此，已经针对每种标准突变株生产了基于标准突变株的疫苗，但由于交叉保护能力差，不能有效预防prrs。为了克服这个问题，已经进行了各种尝试以生产具有有效安全性、免疫原性和保护能力的疫苗。
7.由于这种疾病的严重性，自从发现引起猪繁殖与呼吸综合征(prrs)的猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)以来，已经持续约20年投入大量努力来开发针对这种病毒的预防方法，但一直没有开发出预防和管理方法。已开发出各种疫苗如灭活疫苗和减毒活疫苗来控
制猪繁殖与呼吸综合征(prrs)，但发现仅具有易感染性的减毒疫苗才能诱导令人满意的保护作用。然而，由于存在许多种猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)，各种病毒之间不存在交叉免疫，因此难以用一种疫苗预防各种猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)。另外，目前的减毒疫苗只能通过在其他动物物种的细胞系中连续传代100代至200代以上来生产，所以存在研制周期长，难以保证有效性和安全性的问题。为此，已经针对每种标准突变株生产了基于标准突变株的疫苗，但由于交叉保护能力差，不能有效预防prrs。
8.为了克服上述问题，人们进行了各种尝试以生产具有有效安全性、免疫原性和保护性的疫苗(申请第10
‑
2011
‑
7004020号，发明名称：针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征(hp prrs)的疫苗)。


技术实现要素：

9.技术问题
10.本发明涉及一种具有低致病性和高安全性且增强中和抗体的分泌的猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)的嵌合病毒、包含其的疫苗及其制备方法。
11.在一个示例中，嵌合病毒可以包含：
12.(1)来源于保藏编号为kctc 13394bp的lmy ver2突变株的orf1a和orf1b的核酸序列，或与该核酸序列具有70％或更高的序列同源性同时保持与该核酸序列功能等效的核酸序列，和
13.(2)保藏编号为kctc 13393bp的bp2017
‑
2分离株的orf2至orf7区域的核酸序列，或与该核酸序列具有70％或更高的序列同源性同时保持与该核酸序列功能等效的核酸序列。
14.技术方案
15.本发明涉及一种可用作疫苗的猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)的嵌合病毒。本发明的prrsv嵌合病毒是减毒的，因此与其亲本株相比具有低致病性和高安全性，并增强与交叉免疫相关的中和抗体的分泌，从而显著增强了猪的免疫力。因此，它可以作为预防和治疗prrs疾病的有效疫苗。
16.在下文中，将更详细地描述本发明。
17.如本文所用，“减毒病毒”是指能够在目标哺乳动物体内诱导免疫应答而不引起prrs疾病的临床症状的无毒性病毒，也指感染减毒病毒且未接受减毒病毒的动物的临床症状减少，或与感染非减毒prrs病毒的“对照”动物相比，症状的严重程度有所降低。在该上下文中，术语“减少(reduction/reduced)”是指与如上定义的对照相比减少至少10％，优选地，减少25％，更优选地减少50％，或最优选地减少100％或更多。
18.如本文所用，“疫苗组合物”可以是prrs嵌合病毒或其任何免疫原性片段或部分，优选是减毒prrs嵌合病毒，例如本发明的prrs嵌合病毒。这会导致“免疫应答”，如细胞和/或抗体介导的对prrsv的免疫应答。优选地，疫苗组合物能够提供针对prrsv感染及其相关临床症状的预防性免疫。
19.如本文所用，“免疫应答”意指针对向被施用了本发明的prrsv嵌合病毒或包含其的疫苗组合物的动物所施用的嵌合病毒或疫苗的任何细胞和/或抗体所介导的免疫应答。通常，“免疫应答”包括以下作用中的一种或多种，但不限于此：相应组合物或疫苗中包含的
抗原、或针对抗原特异性诱导的抗体、b细胞、辅助性t细胞、抑制性t细胞和/或细胞毒性t细胞和/或γδt细胞的产生或活化。优选地，与未接受免疫原性组合物或疫苗的对照相比，宿主表现出治疗性或预防性免疫应答，从而改善了对新感染的抗性和/或降低了疾病的临床严重性。这种预防将至多通过没有与上述宿主感染相关的症状以及除此之外的频率或严重程度的降低来证明。
20.如本文所用，“猪(pigs/pig)”和“小猪”可以兼容使用。
[0021]“接种疫苗”是指在暴露于prrs疾病之前施用如本文所述的prrsv嵌合病毒或包含其的疫苗。
[0022]“预防(prevent/prevention)是指作为施用本发明的prrsv病毒或包含其的疫苗组合物的结果，prrs的临床发生频率或症状的严重程度或频率的降低。严重程度或频率的降低是与未施用本发明的prrsv嵌合病毒或包含其的疫苗组合物的动物或动物组比较的结果。动物可以优选地是猪。
[0023]
本文中的序列为方便起见以dna核苷酸描述，当多核苷酸类型为rna时，是指核苷酸序列中的胸腺嘧啶(t)全部或部分地被尿嘧啶(u)取代的序列。
[0024]
在此，特定核苷酸序列和/或氨基酸的“由序列组成”包括以下的全部：包含该序列、基本上包含该序列和/或由该序列组成，并且如果必要，可以被适当地替换和使用。
[0025]
本发明提供了一种针对作为感染猪的病毒性疾病的猪繁殖与呼吸综合征(prrsv)的减毒嵌合病毒。
[0026]
为实现上述目的，本发明提供了一种包含结构式1的结构的多核苷酸：
[0027]
[结构式1]
[0028]
5'
‑
[x]
‑
[y]
‑
3'
[0029]
在该式中，[x]为保藏编号为13394bp的lmy ver2突变株的orf1a和orf1b区域的基因的核酸序列或与orf1a和orf1b区域的基因的核酸序列具有70％或更高序列同源性的核酸序列，其包括保藏编号为kctc 13394bp的lmy ver2突变株的nsp1基因(nsp1
‑
α基因和nsp1
‑
β基因)的核酸序列或在保持同等功能的范围内与该核酸序列具有70％或更高序列同源性的核酸序列，例如包括lmy ver2突变株的nsp1基因的核酸序列或在保持同等功能的范围内与该核酸序列具有70％或更高序列同源性的核酸序列；[y]为保藏编号为kctc 13393bp的bp2017
‑
2突变株的orf2至orf7区域的基因核酸序列或在保持同等功能的范围内与该核酸序列具有70％或更高序列同源性的核酸序列。如本文所用，“同等功能”可以指在定性(活性)和/或定量(水平)方面与期望功能相同或相似的功能。例如，该基因编码的蛋白质的氨基酸序列可以与野生型基因编码的蛋白质的氨基酸序列相同。
[0030]
在一个示例中，[x]可以包括在由seq id no：11的核苷酸序列组成的nsp1基因的核酸序列中在保持由nsp1基因编码的nsp1蛋白的氨基酸序列的范围内发生的所有类型的点突变(沉默突变)，例如，可以在旨在降低nsp1基因的cbp值的范围内自由选择和使用。
[0031]
例如，[x]可以包括如下突变：在由seq id no:11的核苷酸序列组成的nsp1基因的核酸序列中，选自由以下位置组成的组中的一个或多个、25个或更多个、66个或更多个、80个或更多个或全部91个碱基被置换：位置222、位置225、位置237、位置240、位置252、位置306、位置309、位置312、位置315、位置324、位置327、位置330、位置333、位置336、位置339、位置342、位置345、位置357、位置363、位置366、位置378、位置379、位置381、位置393、位置
396、位置543、位置546、位置549、位置555、位置558、位置561、位置573、位置579、位置582、位置588、位置612、位置618、位置621、位置627、位置633、位置639、位置654、位置673、位置675、位置678、位置681、位置684、位置705、位置708、位置729、位置735、位置738、位置741、位置744、位置747、位置771、位置786、位置789、位置792、位置810、位置825、位置828、位置838、位置840、位置846、位置849、位置858、位置867、位置879、位置882、位置885、位置891、位置900、位置903、位置906、位置924、位置936、位置939、位置948、位置954、位置963、位置966、位置1026、位置1029、位置1038、位置1047、位置1053、位置1066、位置1068、位置1086和位置1110。
[0032]
在一个示例中，[x]可以包括在由seq id no:11的核苷酸序列组成的nsp1基因的核酸序列中，选自由以下组成的组中的一种或多种、25种或更多种、66种或更多种、80种或更多种或全部91种突变：位置222处的g被置换为c的突变、位置225处的c被置换为a的突变、位置327处的t被置换为c的突变、位置240处的a被置换为t的突变、位置252处的t被置换为c的突变、位置306处的a被置换为c的突变、位置309处的t被置换为c的突变、位置312处的g被置换为a的突变、位置315处的c被置换为a的突变、位置324处的t被置换为c的突变、位置327处的c被置换为g的突变、位置330处的g被置换为a的突变、位置333处的c被置换为t的突变、位置336处的c被置换为g的突变、位置339处的t被置换为c的突变、位置342处的a被置换为t的突变、位置345处的t被置换为a的突变、位置357处的a被置换为g的突变、位置363处的t被置换为a的突变、位置366处的t被置换为c的突变、位置378处的c被置换为t的突变、位置379处的c被置换为a的突变、位置381处的c被置换为g的突变、位置393处的t被置换为c的突变、位置396处的t被置换为a的突变、位置543处的t被置换为c的突变、位置546处的t被置换为c的突变、位置549处的c被置换为a的突变、位置555处的t被置换为c的突变、位置558处的t被置换为c的突变、位置561处的t被置换为a的突变、位置573处的c被置换为t的突变、位置579处的t被置换为c的突变、位置582处的g被置换为t的突变、位置588处的t被置换为c的突变、位置612处的t被置换为c的突变、位置618处的g被置换为c的突变、位置621处的t被置换为c的突变、位置627处的a被置换为t的突变、位置633处的t被置换为c的突变、位置639处的t被置换为g的突变、位置654处的c被置换为t的突变、位置673处的c被置换为t的突变、位置675处的c被置换为a的突变、位置678处的c被置换为t的突变、位置681处的c被置换为g的突变、位置684处的c被置换为g的突变、位置705处的g被置换为c的突变、位置708处的c被置换为t的突变、位置729处的a被置换为c的突变、位置735处的t被置换为c的突变、位置738处的g被置换为t的突变、位置741处的t被置换为c的突变、位置744处的t被置换为c的突变、位置747处的t被置换为a的突变、位置771处的t被置换为c的突变、位置786处的t被置换为c的突变、位置789处的c被置换为t的突变、位置792处的t被置换为g的突变、位置810处的c被置换为t的突变、位置825处的t被置换为c的突变、位置828处的c被置换为t的突变、位置838处的t被置换为c的突变、位置840处的g被置换为c的突变、位置846处的c被置换为g的突变、位置849处的g被置换为a的突变、位置858处的a被置换为g的突变、位置867处的t被置换为c的突变、位置879处的t被置换为c的突变、位置882处的c被置换为g的突变、位置885处的c被置换为t的突变、位置891处的c被置换为t的突变、位置900处的t被置换为c的突变、位置903处的c被置换为a的突变、位置906处的t被置换为c的突变、位置924处的g被置换为t的突变、位置936处的t被置换为c的突变、位置939处的t被置换为c的突变、位置948处的a被置换为c的突变、
位置954处的a被置换为c的突变、位置963处的a被置换为t的突变、位置966处的t被置换为c的突变、位置1026处的a被置换为g的突变、位置1029处的g被置换为c的突变、位置1038处的c被置换为t的突变、位置1047处的t被置换为c的突变、位置1053处的t被置换为c的突变、位置1066处的a被置换为c的突变、位置1068处的a被置换为c的突变、位置1086处的c被置换为t的突变和位置1110处t的被置换为c的突变。
[0033]
例如，[x]可以是保藏编号为13394bp的lmy ver2突变株的nsp1基因(seq id no:12)和/或nsp1
‑
β(seq id no:1；seq id no:12的5'端609碱基位点)的核酸序列或在保持同等功能的范围内与该核酸序列具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、或99.5％或更高的序列同源性的核酸序列。
[0034]
例如，[y]可以是保藏编号为kctc 13393bp的bp2017
‑
2突变株的orf2至orf7区域的基因核酸序列或在保持同等功能的范围内与该核酸序列具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、或99.5％或更高的序列同源性的核酸序列。
[0035]
根据本发明的一个示例，在结构式1的[y]的3’端还可以包含[a]n。n是包含碱基a的核苷酸的数目，可以是10至100的整数。优选地，n可以是10至80、10至70、10至60、10至50、10至40、10至30、15至80、15至70、15至60、15至50、15至40、15至30、20至30、20至26的整数。
[0036]
多核苷酸可以是rna、rna的逆转录组(dna)或其组合。多核苷酸可具有作为prrsv嵌合病毒的基因组的功能。
[0037]
相应地，本发明的另一个示例提供了一种包含具有结构式1的结构的多核苷酸的猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)的嵌合病毒。prrsv嵌合病毒的基因组可以是dna或rna，优选为rna。
[0038]
[x]对应于包含保藏编号为13394bp的lmy ver2突变株的nsp1
‑
β的nsp1基因区域，可以是通过用限制酶asci和paci处理lmy ver2突变株的基因组而获得的基因片段，例如，[x]可以包含seq id no:1和/或seq id no:12的核酸序列或在保持同等功能的范围内与该核酸序列具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、或99.5％或更高的序列同源性的核酸序列。
[0039]
[y]对应于保藏编号为kctc 13393bp的bp2017
‑
2突变株的orf2至orf7区域，可以是通过用限制酶asci和paci处理bp2017
‑
2突变株的基因组而获得的基因片段，例如，[y]可以包含seq id no:2的核酸序列或在保持同等功能的范围内与该核酸序列具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、或99.5％或更高的序列同源性的核酸序列。
[0040]
在一个示例中，结构式1可包含seq id no:4的核酸序列或在保持同等功能的范围内与该核酸序列具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、或99.5％或更高的序列同源性的核酸序列。例如，结构式1可以是seq id no：4的核酸序列。
[0041]
在下表1中，在lmy ver2的nsp1基因的核苷酸序列中以粗体标记的部分表示nsp1
‑
β区域。
[0042]
[表1]
[0043]
[0044]
[0045]
[0046][0047]
[表2]
[0048]
[0049]
[0050]
[0051]
[0052]
[0053]
[0054]
[0055]
[0056]
[0057][0058]
(在表中，本文提供的多核苷酸(rna)可以包含在seq id no:1至4所示的序列中t被u置换的核酸序列。)
[0059]
本发明提供包含结构式1的多核苷酸作为基因组的prrsv嵌合病毒。prrsv嵌合病毒可包括培养1至80代、1至70代、1至60代、1至50代、1至40代、1至30代、1至20代或1至10代的后代病毒。
[0060]
[结构式1]
[0061]
5'
‑
[x]
‑
[y]
‑
3'
[0062]
在该式中，[x]为保藏编号为13394bp的lmy ver2突变株的nsp1基因和/或nsp1
‑
β的核酸序列或与该核酸序列具有70％或更高的序列同源性的核酸序列，[y]为保藏编号为kctc 13393bp的bp2017
‑
2突变株的orf2至orf7区域的基因核酸序列或与该核酸序列具有70％或更高序列同源性的核酸序列。
[0063]
例如，[x]可以是保藏编号为13394bp的lmy ver2突变株的nsp1基因和/或nsp1
‑
β的核酸序列或与该核酸序列具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、或99.5％或更高的序列同源性的核酸序列。
[0064]
此外，[y]可以是保藏编号为kctc 13393bp的bp2017
‑
2突变株的orf2至orf7区域
的基因核酸序列或与该核酸序列具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、或99.5％或更高的序列同源性的核酸序列。
[0065]
根据本发明的一个示例，在结构式1的[y]的3’端还可以包含[a]n。n是包含碱基a的核苷酸的数目，可以是10至100的整数，例如可以是10至80、10至70、10至60、10至50、10至40、10至30、15至80、15至70、15至60、15至50、15至40、15至30、20至30、20至26的整数。
[0066]
多核苷酸可以是rna、rna的逆转录组(dna)或其组合。多核苷酸可具有作为prrsv嵌合病毒的基因组的功能。相应地，本发明的另一个示例提供了一种包含具有结构式1的结构的多核苷酸的猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)的嵌合病毒。prrsv嵌合病毒的基因组可以是dna或rna，优选为rna。
[0067]
[x]对应于包含保藏编号为13394bp的lmy ver2突变株的nsp1
‑
β的nsp1基因区域，可以是通过用限制酶asci和paci处理lmy ver2突变株的基因组而获得的基因片段，例如，[x]可以包含seq id no:1的核酸序列或在保持同等功能的范围内与该核酸序列具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、或99.5％或更高的序列同源性的核酸序列。
[0068]
[y]对应于保藏编号为kctc 13393bp的bp2017
‑
2突变株的orf2至orf7区域，可以是通过用限制酶asci和paci处理bp2017
‑
2突变株的基因组而获得的基因片段，例如，[y]可包含seq id no:2的核酸序列或在保持同等功能的范围内与该核酸序列具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、或99.5％或更高的序列同源性的核酸序列。
[0069]
在一个示例中，结构式1可包含seq id no:4的核酸序列或在保持同等功能的范围内与该核酸序列具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、或99.5％或更高的序列同源性的核酸序列。例如，结构式1可以是seq id no：4的核酸序列。
[0070]
一个具体实例提供了prrsv嵌合病毒，其包含含有seq id no:4的多核苷酸作为基因组的核酸序列，并将该prrsv嵌合病毒命名为lmy bp2017。lmy bp2017病毒可以是保藏编号为kctc 13394bp的病毒。
[0071]
作为lmy bp2017嵌合病毒框架的lmy ver2突变株可以是包含突变nsp1
‑
β的prrsv突变株，在该突变nsp1
‑
β中，包含在lmy亲本株(genbank登录号dq473474.1.)的seq id no:5的非结构蛋白1(nsp1)中的至少一个碱基被置换。
[0072]
编码mly株的nsp1和/或nsp1
‑
β的基因的核苷酸序列中要被置换的核苷酸序列可以使用已知的合成减毒病毒工程(synthetic attenuated virus engineering，save)程序进行选择，优选地，可以使用本发明人开发的save程序进行选择。特别地，要被置换的核苷酸序列可以是通过用本发明人开发的save程序分析亲本株lmy基因组中遗传高度安全的nsp1区域，并选择和替换部分或全部显示较高密码子对偏好(codon pair bias，cpb)的核苷酸序列而去优化的核苷酸序列。去优化的核苷酸序列可以包括在由seq id no:11的核苷酸序列组成的编码lmy株的nsp1蛋白的基因中选自由以下组成的组中的一种或多种、25种或更多种、66种或更多种、80种或更多种或全部91种突变：位置222处的g被置换为c的突变、位置225处的c被置换为a的突变、位置327处的t被置换为c的突变、位置240处的a被置换为t
ver2突变株可以包含由seq id no:6的核苷酸序列组成的编码nsp1
‑
β蛋白的基因或由seq id no:12的核苷酸序列组成的编码nsp1蛋白的基因。
[0074]
此外，本发明可提供包含本发明的prrsv嵌合病毒的基因组的细胞。细胞是指将嵌合病毒的基因组(dna、rna或含有它们的载体)或含有该基因组的嵌合病毒转染到细胞中以大量产生嵌合病毒的细胞，该细胞的类型只要在目的范围内则不受特别限制。
[0075]
根据本发明的一个示例，可以提供一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗组合物，该疫苗组合物包含prrsv嵌合病毒或其传代培养的后代。
[0076]
传代培养的后代可包括传代1至80代、1至70代、1至60代、1至50代、1至40代、1至30代、1至20代或1至10代的后代病毒。
[0077]
根据本发明的一个示例，疫苗可以是活疫苗或死疫苗，但优选为活疫苗。具体地，本文所述的减毒prrs嵌合病毒可以是经修饰的活疫苗，其含有在药学上可接受的载体中的一种或多种处于存活状态的上述病毒株。此外，或可供选择地，灭活病毒可用于制备死疫苗。
[0078]
疫苗还可包含选自由载体、稀释剂、赋形剂和佐剂组成的组中的一种或多种。药学上可接受的载体的种类没有特别限制，但可以包括任何溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、防腐剂、抗生素剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。
[0079]
另一方面，疫苗组合物中包含的本发明的减毒嵌合病毒的有效剂量可以是在施用有效剂量的病毒的动物中引起或能够引起免疫应答的病毒量。有效量可能取决于疫苗组分和施用时间表。疫苗组合物的剂量可以在tcid
50
为2至6的范围内，优选地tcid
50
为3至4的范围内，并且可以根据受试者的类型而变化，但不限于此。
[0080]
本发明的lmy
‑
bp2017嵌合病毒的基因组和包含该基因组的疫苗组合物可用于使猪免受prrs疾病的影响。此外，包括prrs嵌合病毒的免疫原性片段或部分的亚单位可用于使猪免受prrs疾病的影响。本发明的减毒嵌合病毒或包含该减毒嵌合病毒的疫苗组合物可以在猪暴露于引起prrs的prrs病毒株之前进行预防性施用，可以在猪暴露于prrs病毒株的同时向猪施用，并且可以在目标猪暴露于病毒株后进行治疗性施用。
[0081]
本发明提供的疫苗组合物可用于预防猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrs)，例如预防由北美型prrsv引起的prrs。在一个示例中，北美型prrsv可以是ii型vr2332病毒株。
[0082]
可以通过口服、肠胃外、皮下、肌内、皮内、舌下、经皮、直肠、经粘膜、通过吸入经表面或颊施用或其组合施用本发明的减毒prrsv嵌合病毒或包含该减毒prrsv嵌合病毒的疫苗组合物。此外，可以以能够允许减毒病毒持续释放的植入物的形式施用减毒prrs嵌合病毒。
[0083]
本发明的减毒prrsv嵌合病毒或包含该减毒prrsv嵌合病毒的疫苗组合物可以通过注射、吸入或移植的方式给药，注射是特别优选的。取决于所需的疫苗接种或治疗的时间和有效性，减毒prrsv嵌合病毒或包含该减毒prrsv嵌合病毒的疫苗组合物可以以不同剂量每天一次或多次间歇给药，例如持续数天、数周或数个月。注射可以通过注射所需量或通过皮下注射或通过喷雾到鼻腔，或者连续输注来进行。
[0084]
根据本发明的一个示例，本发明的prrsv嵌合病毒可以是tcid
50
值为亲本株(genbank登录号dq473474.1.)的tcid
50
值的0.01倍至0.1倍的病毒，tcid
50
值为通过将嵌合病毒及其亲本株接种到猪肺巨噬细胞中而测得的病毒的tcid
50
值。优选地，测量时间为2天
后，tcid
50
值可以为0.05倍至0.1倍。本发明的prrsv嵌合病毒的tcid
50
值低于亲本株，并具有降低的增殖特性并且被减毒。
[0085]
此外，本发明提供了一种病毒，该病毒的突变体的中和抗体含量通过用本发明的prrsv嵌合病毒及其亲本株接种至猪来测量，为亲本株的2至8倍，优选为2至4倍。测量时间优选在28天后。中和抗体是指对vr2332具有中和能力的抗体，vr2332是代表性的北美型prrsv株。因此，当将本发明的减毒嵌合病毒或包含该减毒嵌合病毒的疫苗组合物接种于猪时，猪的中和抗体的滴度增加，猪的免疫因子的表达增加，因此针对prrs的免疫作用可以显著增加。
[0086]
根据一个具体实例，上述本发明的prrsv嵌合病毒lmy bp2017的cpb值显示出低于lmy亲本株(genbank登录号dq473474.1.)的值，优选为
‑
0.39至0，更优选为
‑
0.35至
‑
0.20，适当地为
‑
0.35至
‑
0.26，例如为
‑
0.2393184052058128。当cpb值小于
‑
0.39时，难以制造病毒，而当cpb值超过0时，存在可以制造病毒但增殖特性不降低，因此不减毒的问题。因此，本发明的减毒lmy bp2017嵌合病毒优选具有上述cpb值。
[0087]
此外，本发明还提供了cpg、upa值为亲本株(genbank登录号dq473474.1.)的1.0倍至3.0倍的lmy bp2017嵌合病毒。cpg、upa比值的变化是去优化过程中必然发生的结果，当真核基因的cpg、upa值升高时，会引起细胞应激，因此降低病毒的增殖特性，从而可以使病毒减毒。本发明的lmy bp2017嵌合病毒具有比亲本株更高的cpg、upa值，优选是亲本株的cpg、upa值的1.0倍至3.0倍，例如本发明的减毒嵌合病毒的cpg可以为1.1753，upa可以为1.03。
[0088]
根据本发明的一个示例，一种生产猪繁殖与呼吸综合征病毒的嵌合病毒的方法，包括用限制酶asci和paci处理保藏编号为13394bp的lmy ver2突变株的基因组以制备多核苷酸片段，用限制酶asci和paci处理保藏编号为kctc13393bp的bp2017
‑
2突变株的基因组以制备多核苷酸片段，以及将lmy ver2的多核苷酸片段和bp2017
‑
2的多核苷酸片段重组以制备感染性克隆。
[0089]
通过用限制酶asci和paci处理lmy ver2突变株的基因组制备的多核苷酸片段可以包含编码nsp1
‑
β的区域。
[0090]
通过用限制酶asci和paci处理bp2017
‑
2突变株的基因组制备的多核苷酸片段可以包含orf2至orf7区域。
[0091]
在重组片段时，可以使用连接酶，可以通过将制备的感染性克隆接种到细胞来制备嵌合病毒。
[0092]
细胞是指转染了嵌合病毒dna或rna或包含该嵌合病毒dna或rna的载体、感染性克隆或嵌合病毒以产生大量嵌合病毒的细胞，该细胞的类型没有特别限制。
[0093]
此外，本发明的一个示例可提供一种用于预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒的组合物，其包含所述疫苗组合物。
[0094]
作为优选的形式，本发明的用于预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征病毒的组合物可包含本领域技术人员已知的额外组分，还可包含通常用于制备药物组合物的合适的载体、赋形剂和稀释剂。
[0095]
此外，还可以配制成诸如粉末剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂等的口服制剂、外用剂、栓剂合无菌注射液等形式使用。优选使用如文件(雷明顿药物
科学(remington's pharmaceutical science),最近的,mack publishing company,easton pa)中公开的本领域已知的合适制剂。
[0096]
可包含在本发明的药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。当配制组合物时，使用诸如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或赋形剂来制备。口服施用的固体制剂包括片剂、丸剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂等，这些固体制剂通过将至少一种赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等混合到组合物中来制备。此外，除了简单的赋形剂外，还有诸如硬脂酸镁和滑石粉的润滑剂。口服施用的液体制剂包括混悬剂、口服液、乳剂、糖浆剂等，并且除了常用的简单稀释剂、水和液体石蜡外，还可以包含各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、空气清新剂、防腐剂等。肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。作为非水溶剂和悬浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油的植物油、诸如油酸乙酯的注射用酯等。作为栓剂的基质化合物，可以使用witepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可脂、月桂酸、甘油明胶等。
[0097]
本发明的组合物的优选剂量根据受试者的病症和体重、疾病的严重程度、药物形式和施用途径和时间而变化，也可以由本领域技术人员适当地选择。例如，为了获得优选的效果，本发明的组合物可以以每天0.0001至1,000mg/kg(体重)的量施用。组合物的施用可以一天一次或分数次施用。
[0098]
本发明的组合物可以通过多种途径施用于受试者。可以预期所有施用途径。
[0099]
本发明的其他示例可提供一种预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的方法，包括将本发明的疫苗组合物施用于猪。
[0100]
通过将包含本发明的嵌合病毒基因组的疫苗组合物施用于猪，可以诱导增强猪对prrsv抗原的免疫应答，通过诱导增强猪对prrsv抗原的免疫应答，可以提供一种预防或治疗猪繁殖与呼吸综合征的方法。优选地，可以进行预防。
[0101]
具体地，该方法可以通过皮下注射、静脉内注射、皮内注射、肠胃外注射、肌内注射、无针注射、电穿孔、口服递送、鼻内递送、口鼻递送或其任何组合来施用组合物。
[0102]
本发明可以提供用于执行任何上述方法的试剂盒。该试剂盒可包含容器、优选含有本发明的减毒prrs嵌合病毒的疫苗组合物、药学上可接受的载体、佐剂和用于向有需要的动物施用免疫原性组合物以减少prrs感染的临床症状或影响，优选减少prrs的频率或严重程度的说明书。试剂盒还可包含注射装置和/或其他类型的施用装置。此外，试剂盒可包含溶剂。减毒疫苗可以冻干并用溶剂重构以成为注射用溶液和/或吸入用溶液。溶剂可以是水、生理盐水、缓冲溶液或增强溶剂。该试剂盒可以包括单独容器，该单独容器含有减毒病毒、溶剂和/或药学上可接受的载体。使用说明书可以是贴在一个或多个容器上的标签和/或印刷品。
[0103]
有益效果
[0104]
根据本发明的prrsv病毒的嵌合病毒在接种到猪时，可通过显著增加中和抗体的分泌而用于有效预防prrs，并且可有效地用作治疗prrs的疫苗。
附图说明
[0105]
图1显示了prrs病毒的一般基因组排列。
[0106]
图2为通过分别切割lmy ver2病毒和bp2017
‑
2病毒的克隆的一部分并连接而合成的lmy bp2017嵌合病毒的基因组排列的示意图。
[0107]
图3显示了prrsv lmy ver2病毒和lmy bp2017嵌合病毒的系统发生树。
[0108]
图4显示了prrsv lmy ver2病毒和lmy bp2017嵌合病毒在猪肺泡巨噬细胞(pam细胞)中的增殖特性的差异。
[0109]
图5比较了向猪接种prrsv lmy、lmy bp2017嵌合病毒和pbs后中和抗体的分泌的差异。
具体实施方式
[0110]
下文中，将通过实施例对本发明进行详细说明。然而，以下实施例仅用于说明本发明，本发明不受以下实施例的限制。
[0111]
由于rna很容易被破坏，因此在将rna转化为dna以完成所有工作后，通过由其合成rna来转染细胞。
[0112]
实施例1：嵌合病毒的制备
[0113]1‑
1.嵌合病毒的设计
[0114]
prrs嵌合病毒被设计为包含lmy毒株的突变株的非结构蛋白(non structure protein 1，nsp1；seq id no：11)区域和2017年分离的bp2017
‑
2的orf2、orf3、orf4、orf5、orf6和orf7区域。
[0115]1‑
2.减毒lmy突变株的制备
[0116]
lmy ver2突变株是通过用lmy株(genbank登录号dq473474.1.)置换nsp1区域基因的核苷酸序列的91个碱基来制备的，lmy株是常规检疫机构(quarantine agency)分离的prrs株。在nsp1区域的基因中，nsp1
‑
α区域的25个碱基和nsp1
‑
β区域的66个碱基被置换。
[0117]
具体地，重组株lmy ver2是使用众所周知的save(合成减毒病毒工程)程序或由本发明人开发的save(合成减毒病毒工程)程序，根据密码子对去优化原理(表3)，通过对一部分核苷酸序列进行沉默突变来制备的。首先，使用save程序用计算机算法量化cpb(密码子对碱基)评分，cpb评分是由lmy病毒的基因密码子成对排列时相互作用引起的偏差。cpb评分在lmy病毒基因的某些核苷酸序列被置换为其他核苷酸序列时出现波动，并且与病毒的增殖特性密切相关。当cpb评分通过核苷酸序列置换去优化时，病毒增殖特性会降低和减弱(密码子对偏好的基因组尺度变化导致的病毒减毒(virus attenuation by genome
‑
scale changes in codon pair bias,science),science,2008,j.robert coleman等人)。本发明人在lmy亲本株的基因组中选择了遗传稳定性高的nsp1区域(nsp1
‑
α和nsp1
‑
β，seq id no：11)并用save程序对其进行了分析，并在cpb评分相对较高的碱基区域中选择了nsp1
‑
α区域中的25个碱基以及nsp1
‑
β区域中的66个碱基(总共91个碱基)与其他碱基置换，从而制备了lmy病毒变异株。通过该方法制备的nsp1的91个核苷酸的序列发生突变(seq id no：12)的lmy病毒突变株被命名为lmy ver2，其核苷酸序列示于下表3中。lmy ver2的保藏编号为13394bp。
[0118]
[表3]
[0119]
[0120]
[0121][0122]
(表3中，lmy ver2 nsp1基因序列中的粗体和下划线指示的部分是lmy nsp1基因或lmy nsp1
‑
β基因中发生突变的碱基部分。)
[0123]
然后，为了确认lmy ver2突变株的减毒程度，测量了cpb评分。lmy亲本株的nsp1 cpb评分测量为约0.0139，nsp1
‑
βcpb评分测量为约0.016，但本发明的lmy ver2突变株的cpb评分在nsp1中测量为约
‑
0.2393，在nsp1
‑
β中测量为约
‑
0.33。由此可知，本发明的lmy ver2突变株与常规亲本株相比的增殖特性降低，是减毒株。
[0124]
[表4]
[0125]
病毒株nsp1区域密码子去优化(cbp)lmynsp10.01392516640897059lmy ver2nsp1
‑
0.2393184052058128lmynsp1
‑
β0.016079236408108866lmy ver2nsp1
‑
β
‑
0.3377269630038442
[0126]
然后，制备lmy ver2的感染性克隆。
[0127]
首先，将lmy株(genbank登录号dq473474.1.)的全基因序列分成7个片段并分别合成。7个片段中，片段1为nps
‑
1区域，将该区域合成为lmy菌株的nsp1区域的基因核苷酸序列中91个碱基被置换的dna片段(seq id no：12)。将合成的片段基因依次用下表5中所示的限制酶切割并用连接酶连接以制备一个感染性克隆。
[0128]
[表5]
[0129][0130]1‑
3.嵌合病毒克隆的构建
[0131]
如图1的示意图所示，prrs病毒共含有8个orfs，即orf1a、orf1b、orf2至7。
[0132]
在包含实施例1
‑
1中扩增的lmy ver2突变株的完整结构基因的基因组区域中，使用限制酶asci和paci切割orf2至orf7区域。随后，用相同的限制酶asci和paci切割bp2017株的基因组区域中的与lmy ver2突变株的orf2至orf7区域对应的部分，然后将lmy ver2突变株的orf1a和orf1b部分和与bp2017株的orf2至orf7区域对应的部分用连接酶连接，制备一个重组感染性克隆，命名为lmy bp2017。使用的限制酶示于下表6中。
[0133]
[表6]
[0134][0135]
将完成的感染性克隆插入到负载有cmv启动子和氨苄青霉素抗性基因的高拷贝载体中，然后使用脂质体转染到bhk细胞(韩国细胞系库)中，最终构建了本发明的lmy bp2017嵌合病毒。
[0136]
lmy bp2017嵌合病毒于2018年10月24日保藏在韩国生命工学研究院微生物资源中心，给予的保藏编号为kctc 13675bp。
[0137]
实施例2.lmy bp2017嵌合病毒的cpg和upa值的测量
[0138]
为了评价实施例1中制备的lmy bp2017嵌合病毒的增殖特性，测量了lmy bp2017嵌合病毒的nsp1基因中cpg和upa的比值以及亲本株lmy的nsp1β基因中的cpg和upa值。
[0139]
病毒基因的cpg和upa的比值的变化是去优化过程中不可避免的结果，当基因的cpg和upa值升高时，诱导细胞应激，降低病毒增殖特性。使用sse程序(1.2版)测量lmy bp2017嵌合病毒和lmy病毒的nsp1β基因中的cpg和upa比值，结果见下表7。
1000次。在此基础上，编写了lmy bp2017嵌合病毒和lmy的粗略系统发育树，如图3所示。从图3的系统发育树可以了解本病毒的系统。
[0155]3‑
3.细胞传代研究
[0156]
确认了实施例1中产生的lmy bp2017嵌合病毒传代时修饰区域能保持多久。本发明的lmy bp2017嵌合病毒在称为prrs病毒可溶性细胞系的marc
‑
145细胞中经过30次传代过程稳定，为了证实每10次传代的基因突变，使用与实施例3
‑
1相同的方法进行测序。
[0157]
测序确认的结果证实了，本病毒的基因置换区域即使在稳定30次传代后也能保持。在下表10中，显示了根据每个传代次数的碱基突变数(nt变化)、突变位点和氨基酸突变(a.a变化)。
[0158]
[表10]
[0159][0160]
如表10可以确认，即使进行传代超过30次，orf1a的nsp1a或nsp1b基因中的突变仍保持原状，仅鉴定出nsp2蛋白或orf2a的突变。因此，证实了即使在传代40次后，编码实施例1中产生的病毒的nsp1蛋白的基因的突变仍然保持。
[0161]
实施例4：lmy和lmy bp嵌合体的增殖特性的比较
[0162]
为了证实实施例1中制备的lmy bp2017嵌合病毒的增殖特性，将lmy bp2017嵌合病毒及其亲本株接种到巨噬细胞(pam，猪肺泡巨噬细胞)后，通过测量tcid
50
确定产生的病毒量。
[0163]
具体而言，将pam细胞以每孔2
×
106个细胞/孔的比例等分到含有2ml rpmi培养基(包含10％fbs、1％青霉素和链霉素)的6孔板中。然后将lmy和lmy bp2017嵌合病毒分别以moi为0.01的比例接种到不同的孔中，接种后1小时去除所有上清液，并等分2ml维持液rpmi培养基(含10％fbs，1％青霉素和链霉素)。等分后2天，收集每孔的上清液并测量tcid
50
(组织培养感染剂量
50
)。对于后续实验中使用的细胞，在测量tcid
50
前一天提前通过将100ul dmem培养基(10％(v/v)fbs、1％(w/v)青霉素、链霉素)与2x105个细胞/孔的marc
‑
145细胞一起等分到96孔板中，使所述细胞贴附。
[0164]
如下制备待接种的病毒。将之前收集的上清液200μl等分到96孔板最左边的一列孔中，其余各孔中等分180μl的dmem培养基(fbs，不加抗生素)。接着，从左侧依次使用多道
移液器各取20μl，在等分到右侧的孔中时进行10倍稀释。一边更换枪头一边依次稀释，最后12个孔留作阴性对照。将制备的病毒稀释液接种到贴附有marc
‑
145细胞的板中。然后，将marc
‑
145细胞的培养液全部除去，200μl的pbs等分到每孔中，反复弃去3次以进行洗涤过程。之后，将制备的病毒稀释液100ul等分到每孔中进行接种，接种后2小时内将接种液全部去除，等分100μl新的维持液(dmem培养基、10％fbs、1％青霉素、链霉素)。
[0165]
等分后约7天，确认细胞内出现作为cpe(致细胞病变效应(cytopathogenic effect))的一类的聚集和细胞凋亡，最后基于先前没有显示cpe的孔的稀释度，计算可显示cpe的4个孔(8个病毒接种液的一半)的稀释度。通过以1ml为基础乘以10计算最终值。
[0166]
将lmy bp2017嵌合株和亲本株lmy株接种于猪肺泡巨噬细胞(pam细胞)，1天至2天测得的tcid
50
值示于下表11和图4。
[0167]
[表11]
[0168][0169]
如表11和图4所示，在接种毒株和开始正式产生病毒后第2天测量的tcid
50
值显示，lmy bp2017嵌合体的tcid
50
值是lmy的tcid
50
值的1/100。由此可以看出，本发明的lmy bp2017嵌合病毒在作为prrs的主要感染细胞的pam(猪肺泡巨噬细胞)细胞中的增殖特性与lmy相比至少降低至1/10以上，而且可以证实，本发明的lmy bp2017嵌合病毒由于增殖特性比亲本株lmy降低而减毒。
[0170]
实施例4：中和抗体分泌模式的确认
[0171]
接种本发明的嵌合病毒后，为了确认中和抗体的分泌模式，将12头3周龄的猪分成3组，每组4只，分别接种各2ml的lmy(105tcid
50
)、lmy bp2017嵌合病毒(105tcid
50
)和pbs。4周后，从每组猪的静脉采血，分离2ml血清，测定血清中中和抗体的量。
[0172]
具体而言，试验方法按照常规熟知的方法进行。所有血清样品在开始测试前在56℃下热灭活45分钟。将灭活的血清添加到rpmi 1640培养基(10％fcs、20mm l
‑
谷氨酰胺、抗生素
‑
抗真菌混合物
‑
100iu/ml青霉素、100μg/ml链霉素、50μg/ml庆大霉素、0.25mg/ml两性霉素b)，连续稀释两倍。随后，各收集100μl稀释的血清，与100μl预先制备的200tcid
50
/ml的vr2332株混合，37℃温育1小时，然后接种在前一天预先培养的单层状态的marc
‑
145细胞。随后，依次去除37℃培养1小时后的所有接种液，更换为200μl的rpmi培养液。此后，每天在37℃下培养的同时检查致细胞病变效应(cpe)，培养5天后确认每孔的cpe。在没有cpe的孔中，通过用sdow 17抗体染色来确认病毒的生长。通过计算没有病毒生长迹象的最高稀释倍数的倒数来测量中和抗体的效价，并且测量结果显示在下表11和图5中。
[0173]
[表12]
[0174]
接种毒株lmylmy bp2017嵌合体pbs(对照)中和抗体(log2)2.754.750
[0175]
如表11和图5所示，可以证实lmy bp2017嵌合病毒与lmy亲本株相比，在细胞中分泌了显著高的中和抗体。
[0176]
(中文译文)
[0177]
国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
[0178]
收件人：biopoa株式会社
[0179]
京畿道龙仁市器兴区新正路105
‑
11(邮编)17093
[0180][0181]
上述翻译与原文没有相违之处
[0182]
(中文译文)
[0183]
国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
[0184]
收件人：biopoa株式会社
[0185]
京畿道龙仁市器兴区新正路105
‑
11(邮编)17093
[0186][0187]
上述翻译与原文没有相违之处
[0188]
(中文译文)
[0189]
国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约
[0190]
收件人：biopoa株式会社
[0191]
京畿道龙仁市器兴区新正路105
‑
11(邮编)17093
[0192][0193]
上述翻译与原文没有相违之处