一种能够抑制SOCS3下调的微小RNA抑制剂及其制备方法与流程

一种能够抑制socs3下调的微小rna抑制剂及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及基因调控技术领域，特别涉及一种能够抑制socs3下调的微小rna抑制剂及其制备方法。


背景技术：

2.吗啡作为阿片类的代表药物，是治疗各种原因引起的剧烈疼痛的金标准，但是长期暴露于吗啡会带来严重的副作用，例如耐受性，即随着药物的重复使用，药效降低，需要加大用药剂量或者缩短给药间隔，才能维持原有药效。吗啡耐受是极具挑战的临床问题，限制了其在疼痛治疗中的临床应用。目前有大量关于吗啡耐受机制的报道，主要包括阿片受体数量下调[1]、抑制性神经元的变化[2]以及神经炎症[3]等。越来越多的研究表明，吗啡耐受是一种包含多重行为和细胞适应性的现象，其中包括中枢神经系统中的细胞、突触和网络水平的神经元可塑性的改变。炎症因子(如il
‑
1β、il
‑
6、tnf
‑
α等)在吗啡耐受中的作用被广泛研究。
[0003]
在基础研究中，有文献报道通过抑制神经炎症缓解吗啡耐受的药物主要有ampk激动剂(二甲双胍)[4]、全麻药(氯胺酮)[5]、局麻药(利多卡因)[6]、抗抑郁药物(文拉法辛)[7]和自噬激动剂(雷帕霉素)[8]等，但是在临床上，目前并没有公认的治疗吗啡耐受的特效药。
[0004]
socs3(suppressor of cytokine signaling 3，抑制细胞信号因子3)是一个重要内源性抑炎蛋白，socs3被鉴定为许多细胞内和病理事件交叉路口的关键蛋白[9]。众多研究表明，socs3基于对肿瘤还死因子(tnf)受体相关因子6(traf6)和转化生长因子(tgf)
‑
β激活激酶(tak1)的抑制作用[10]，阻断tlr4信号通路，从而抑制炎症因子白介素6(il
‑
6)、肿瘤坏死因子
‑
α(tnf
‑
α)以及白介素1β(il
‑
1β)的释放，发挥抑制炎症作用。目前已有关于socs3在多种疾病模型中发挥抗炎作用的报道，我们前期数据已证明，芍药苷通过上调socs3抑制热休克蛋白70(hsp70)/toll样受体4(tlr4)信号通路抑制神经炎症缓解术后痛。此外，利多卡因作为一种局麻药和抗心律失常药能够通过激活磷酸腺苷激活蛋白激酶(adenosine monophosphate
‑
activated protein kinase，ampk)上调socs3蛋白水平抑制炎症因子的释放，改善神经炎症，缓解吗啡耐受[6]，但是ampk如何上调socs3的具体机制尚不清楚，目前也并无报道。在此项工作中，吸引我们的数据是，利多卡因激活ampk对socs3的调控仅仅发生在蛋白水平，而对mrna水平并没有影响。我们猜测ampk激活后上调socs3可能是一种转录后调控。ampk是一种丝氨酸/苏氨酸代谢敏感性蛋白激酶，哺乳动物的ampk能被细胞能量状态的下降所激活，提示amp/atp和adp/atp比率的上升。越来越多研究表明激活ampk是治疗多种代谢性疾病的有效途径，例如糖尿病[11]、肥胖[12]以及炎症[13]等，并且通过激活ampk可以有效启动自噬[14]，维持细胞的分解代谢和合成代谢所需要的能量。但是广泛激活ampk亦会带来众多负面影响，例如激活ampk后启动自噬，通过为肿瘤细胞提供必要的营养成份，维持肿瘤细胞的生存，促进肿瘤细胞的生长[15]。众所周知，在临床上，吗啡多用于治疗癌痛，因此广泛激活ampk并不是治疗吗啡耐受的最佳选择。基于以上事实，寻
pathway."experimental neurology 303(2018):134
‑
141.
[0015]
[8]xu,j.t.,et al."opioid receptor
–
triggered spinal mtorc1 activation contributes to morphine tolerance and hyperalgesia."journal of clinical investigation 124.2(2014):592
‑
603.
[0016]
[9]yoshimura,a.,t.naka,and m.kubo."socs proteins,cytokine signalling and immune regulation."nature reviews immunology 7.6(2007):454
‑
65.
[0017]
[10]frob？se,h.,et al."suppressor of cytokine signaling
‑
3inhibits interleukin
‑
1signaling by targeting the traf
‑
6/tak1 complex."molecular endocrinology 7(2006):1587
‑
1596.
[0018]
[11]madhavi,y.v.,et al."targeting ampk in diabetes and diabetic complications:energy homeostasis,autophagy and mitochondrial health."current medicinal chemistry 26.27(2018):5207
‑
5229.
[0019]
[12]garcia,d.,et al."genetic liver
‑
specific ampk activation protects against diet
‑
induced obesity and nafld."cell reports 26.1(2019):192
‑
208.
[0020]
[13]velagapudi,r.,et al."ampk and sirt1 activation contribute to inhibition of neuroinflammation by thymoquinone in bv2 microglia."molecular and cellular biochemistry 435.1
‑
2.
[0021]
[14]kim,j.,et al."ampk and mtor regulate autophagy through direct phosphorylation of ulk1."nature cell biology.
[0022]
[15]laura,et al."role of tumor and host autophagy in cancer metabolism."genes&development 33.11
‑
12(2019):610
‑
619.


技术实现要素：

[0023]
本发明所要解决的技术问题：本发明提供能够抑制靶向socs3的microrna
‑
30a
‑
5p的微小rna抑制剂序列，旨在通过抑制microrna
‑
30a
‑
5p对socs3的转录后调控，上调socs3，抑制神经炎症缓解吗啡耐受。
[0024]
为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：
[0025]
一种能够抑制socs3下调的微小rna抑制剂，所述微小rna抑制剂精确靶向socs3蛋白转录后调节的微小rna，解除微小rna对socs3蛋白的基因沉默作用。
[0026]
优选地，所述微小rna抑制剂包含如下rna序列：5
’‑
cuuccagucgaggauguuua ca
‑3’
。
[0027]
优选地，所述微小rna抑制剂序列中含有2
’‑
ome化学修饰，以增强微小rna抑制剂在体内的稳定性。
[0028]
优选地，所述微小rna抑制剂序列为microrna
‑
30a
‑
5p天然序列的互补链。
[0029]
优选地，所述microrna
‑
30a
‑
5p天然序列为人源或鼠源，且人源和鼠源的microrna
‑
30a
‑
5p天然序列保持高度一致。
[0030]
一种上述能够抑制socs3下调的微小rna抑制剂的制备方法，步骤如下：
[0031]
(a)筛选出能够显著抑制socs3蛋白表达的microrna天然序列；
[0032]
(b)将microrna天然序列的互补链进行人工合成获得微小rna序列抑制剂；
[0033]
(c)将微小rna抑制剂序列的2
’‑
o进行甲基化修饰，提高体内稳定性即得能够抑制socs3下调的rna抑制剂。
[0034]
一种上述能够抑制socs3下调的微小rna抑制剂的应用，通过竞争性地互补结合体内的microrna
‑
30a
‑
5p解除人或小鼠的socs3表达抑制，提高体内socs3的表达量继而缓解吗啡耐受。
[0035]
本发明获得的有益效果：
[0036]
本发明中的microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor是进行了2
’‑
ome化学修饰的microrna
‑
30a
‑
5p的抑制剂，通过特异的靶向抑制microrna
‑
30a
‑
5p，抑制内源性microrna
‑
30a
‑
5p的基因沉默效应，提高socs3的蛋白表达量，改善神经炎症缓解吗啡耐受，具有靶向性强、安全性高、有效性强以及稳定性高的优点。
附图说明
[0037]
图1为可能对socs3产生调控的五种microrna序列及其与mrna的结合位点。
[0038]
图2为筛选出microrna
‑
30a
‑
5p对socs3产生抑制作用。
[0039]
图3为所有可能对socs3产生靶向调控作用的micrornas。
[0040]
图4为三种ampk激动剂(二甲双胍、白藜芦醇和aicar)显著抑制microrna
‑
30a
‑
5p的表达。resveratrol为终浓度50μm的白藜芦醇在bv
‑
2细胞上单给药处理；aicar为终浓度300μm的阿卡地新在bv
‑
2细胞上单给药处理，metformin为终浓度2.5mm的二甲双胍在bv
‑
2细胞上单给药处理。
[0041]
图5为小鼠吗啡耐受甩尾行为学实验的统计曲线图。
[0042]
图6为实施例3中造模和给药组核转录因子p65(nf
‑
κb
‑
p65)的磷酸化水平。
[0043]
图7为实施例4中造模和给药组socs3蛋白表达量。
[0044]
图8为实施例5中造模和给药组的脊髓背角小胶质细胞的活化情况。
[0045]
图9为实施例6中造模和给药组的小胶质细胞核转录因子p65(nf
‑
κb
‑
p65)的磷酸化水平。
[0046]
图10为实施例6中造模和给药组的小胶质细胞socs3表达量变化对比。
[0047]
图11为实施例7中造模和给药组的小胶质细胞il
‑
1βmrna转录变化情况。
[0048]
图12为实施例7中造模和给药组的小胶质细胞tnf
‑
αmrna转录变化情况。
[0049]
其中，morphine为吗啡造模处理；negative control或nc为阴性对照处理，其中，mirna
‑
30a
‑
5p inhibitor的阴性对照序列为5
’‑
caguacuuuuguguaguacaa
‑3’
,图2中，mirna
‑
nc序列为：正义链：5
’‑
uucuccgaacgugucacgutt
‑3’
,反义链：
[0050]5’‑
acgugacacguucggagaatt
‑3’
。
具体实施方式
[0051]
下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
[0052]
实施例1：基于生物学信息学理论和实验验证，筛选出五种可能对socs3产生调控的microrna，如图1所示，包括microrna
‑
30a
‑
5p、microrna
‑
203
‑
3p、microrna
‑
19a
‑
3p、microrna
‑
455
‑
5p以及microrna
‑
218
‑
5p，通过将这些micrornas mimics转染进入小胶质细
胞(bv
‑
2)，micrornas mimics采用双链rna作为阴性对照即mirna
‑
nc，我们发现microrna
‑
30a
‑
5p显著抑制socs3的表达，筛选结果如图2、图3所示。此外，图4实验数据亦表明，ampk激动剂(二甲双胍、白藜芦醇和aicar)能够显著抑制microrna
‑
30a
‑
5p的表达，如图4所示，从而上调socs3蛋白水平而非socs3 mrna。
[0053]
根据mmu
‑
microrna
‑
30a
‑
5p的天然序列5
’‑
uguaaacauccucgacuggaag
‑3’
，得到其互补链，即mmu
‑
microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor，其序列为5
’‑
cuuccagucgaggauguuuaca
‑3’
,根据理论设计所得到的microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor序列，进行生物合成获得microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor，并对microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor进行2
’‑
ome化学修饰以确保其注射到小鼠体内后的稳定性。人源和鼠源的microrna
‑
30a
‑
5p的天然序列高度一致，因此我们合成的microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor对人亦具有保护作用。
[0054]
实施例2：将实施例1中制备的microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor的冻干粉末用depc水配置成溶液，应用in转染试剂作为microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor的传递介质，通过鞘内注射含5微升10％葡萄糖溶液、3微升in2微升microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor的10微升体系，确保给予每只小鼠125pmol microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor，microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor的negative control为单链rna杂乱序列，给药剂量和体系同microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor。连续七天给予吗啡(10微克/10微升)以制备吗啡耐受模型，在造模的第0天、第3天(吗啡给药之后)以及第6天(吗啡给药之后)给予含microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor的上述体系。每天在吗啡给药30min后，通过甩尾试验检测microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor对吗啡耐受的作用，结果如图5所示。图5中的行为学数据表明，在给予microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor之后能够显著缓解吗啡耐受。###p<0.001versus morphine
‑
treated group。
[0055]
实施例3：按照实施例2的方法分别在第0、3、6天给予125pmol microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor,每天给予吗啡10微克/10微升，连续给药7天后，取材脊髓，通过蛋白质免疫印迹(western blot)检测核转录因子p65(nf
‑
κb
‑
p65)的磷酸化水平，如图6所示。
[0056]
实验结果表明，microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor能够显著抑制吗啡引起的核转录因子p65(nf
‑
κb
‑
p65)的磷酸化水平。*p<0.05versus the control group；##p<0.01versus morphine
‑
treated group。
[0057]
实施例4：将实施例3中取材的脊髓，通过蛋白质免疫印迹(western blot)检测socs3，实验结果表明，microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor能够显著上调socs3的含量。如图7所示，**p<0.01versus control group。
[0058]
实施例5：按照实施例2的方法分别在第0、3、6天给予小鼠125pmol microrna
‑
30a
‑
5pinhibitor,每天给予吗啡10微克/10微升，连续给药7天后，取脊髓l4
‑
l6节段，通过免疫荧光实验检测小胶质细胞活化情况(小胶质细胞标志物，iba1)。结果如图8所示，实验结果表明，microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor能够显著抑制吗啡引起的脊髓背角小胶质细胞的活化。scale bar 100μm.
[0059]
实施例6：将100pmol microrna
‑
30a
‑
5pinhibitor转染进入小胶质细胞(bv
‑
2cells),36h后用200um吗啡刺激12h，收集样本。蛋白质免疫印迹检测核转录因子p65(nf
‑
κb
‑
p65)的磷酸化水平以及socs3的变化。实验结果表明，microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor能够显著抑制吗啡引起的核转录因子p65(nf
‑
κb
‑
p65)的磷酸化并上调socs3的蛋白水平，如图9
和图10所示，**p<0.01versus control group；###p<0.001versus morphine
‑
treated group.
[0060]
实施例7：将100pmol microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor转染进入小胶质细胞(bv
‑
2cells),36h后用200um吗啡刺激12h，收集样本。通过实时定量聚合酶链反应(quantitative real
‑
time pcr)实验检测验证指标tnf
‑
α、il
‑
1βmrna变化情况。实验结果表明，microrna
‑
30a
‑
5p inhibitor能够显著抑制吗啡引起的tnf
‑
α、il
‑
1βmrna的上调，如图11和图12所示，*p<0.05，**p<0.01versus control group；##p<0.01,###p<0.001versus morphine
‑
treated group。
[0061]
综上所述，进行了2
’‑
ome化学修饰的microrna
‑
30a
‑
5p的抑制剂，通过特异的靶向抑制microrna
‑
30a
‑
5p，抑制内源性microrna
‑
30a
‑
5p的基因沉默效应，提高socs3的蛋白表达量，改善神经炎症缓解吗啡耐受。
[0062]
本技术中的蛋白质免疫印迹(western blot)、免疫荧光实验的实验方法参照《精编分子生物学实验指南》进行。
[0063]
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。