抗人NKX3.1单克隆抗体及其制备方法和应用与流程

抗人nkx3.1单克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于免疫学技术领域，具体涉及抗人nkx3.1单克隆抗体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.人类nkx3.1cdna全长为3263bp，有2个外显子。外显子i有96个氨基酸，尚未发现有明显功能区；外显子ii包括其同源结构域，其n
‑
端含28个氨基酸残基，c
‑
端含53个氨基酸残基。人类与鼠nkx3.1蛋白在同源结构域处完全相同，其表达受雄激素调控。人类nkx3.1的基因编码区位于8p21，其编码产物是1种由234个氨基酸组成的蛋白。nkx3.1与巨噬细胞吞噬体ⅱmsr2、脂蛋白酶lpl及神经丝轻链的基因编码区相连。研究结果表明，nkx3.1基因在人类各种前列腺组织及睾丸中均有表达，在其他组织中如胃、肺、肾等组织中无表达，且睾丸中表达强度明显低于前列腺组织，表明nkx3.1具有高度前列腺组织特异性。
3.nkx3.1高度局限地表达于前列腺癌与正常前列腺组织，正常睾丸低水平表达，部分乳腺癌组织有表达，其组织分布较psa更为局限，有高度前列腺上皮组织特异性。在确定转移性肿瘤的原发部位时，nkx3.1是比psa、psap更敏感的前列腺癌标志物；nkx3.1的低表达是人类前列腺癌和前列腺上皮内瘤变的典型特征，而抗nkx3.1阴性染色在尿路上皮癌中很常见。nkx3.1可用作区分高级别前列腺癌和高级别浸润性尿路上皮癌的辅助手段。
4.目前制备的nkx3.1单克隆抗体多采用原核表达nkx3.1全长重组蛋白进行免疫，种类较少、价格昂贵且特异性和稳定性有待提高。并且，传统单克隆抗体的制备方法不利于标准化生产，抗体批次间差异较大、稳定性差。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供抗人nkx3.1单克隆抗体。
6.本发明的第二个目的在于提供上述抗人nkx3.1单克隆抗体的应用。
7.本发明的第三个目的在于提供nkx3.1免疫组化检测试剂。
8.本发明的第四个目的在于提供包含上述单克隆抗体编码基因的核酸分子，以及包含该核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。
9.本发明的第五个目的在于提供上述核酸分子、表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌的应用。
10.本发明的第六个目的在于提供抗人nkx3.1单克隆抗体的制备方法。
11.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
12.抗人nkx3.1单克隆抗体，其包含氨基酸序列如seq id no：1
‑
3所示的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3，和氨基酸序列如所示seq id no:4
‑
6所示的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。
13.本领域技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列基础上，可通过常规蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守型变异体或其片段，而仍能保持与nkx3.1蛋白特异性结合。
14.优选的，所述单克隆抗体包含氨基酸序列如seq id no：7所示的重链可变区，和氨基酸序列如seq id no.8所示的轻链可变区。
15.优选的，所述单克隆抗体包含核苷酸序列如seq id no：9所示的重链可变区，和核苷酸序列如seq id no.10所示的轻链可变区。
16.上述抗人nkx3.1单克隆抗体在制备nkx3.1体外免疫检测试剂或试剂盒中的应用。
17.一种nkx3.1免疫组化检测试剂，所述试剂包括上述抗人nkx3.1单克隆抗体。该试剂或包含该试剂的试剂盒可用于体外免疫检测组织细胞中nkx3.1的表达情况。
18.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码上述抗人nkx3.1单克隆抗体的基因序列。优选的，抗人nkx3.1单克隆抗体重链可变区的基因序列如seq id no：9所示；抗人nkx3.1单克隆抗体轻链可变区的基因序列如seq id no：10所示。
19.本发明涉及的抗体核酸分子可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。本领域技术人员显然知晓，在本发明提供的上述核酸分子经一个或多个核苷酸添加、删除、替换、修饰等突变后得到的重链可变区核苷酸序列和/或轻链可变区核苷酸序列的变异序列，其所编码的氨基酸序列组成的单链抗体或嵌合单克隆抗体或改型单克隆抗体或其他形式的单克隆抗体或抗体片段，仍保留与nkx3.1蛋白特异性结合的能力。
20.含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。
21.优选的，所述重组表达载体选自原核或真核表达载体；更进一步的，所述重组表达载体选自细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。
22.优选的，所述表达系统为细菌、酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或无细胞表达系统。
23.上述核酸分子或上述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌在制备抗人nkx3.1抗体中的应用。
24.本发明提供了抗人nkx3.1单克隆抗体的重链和轻链的可变区氨基酸序列，在此基础上，可以采用常规基因工程的方法获得本发明的单克隆抗体。
25.一种抗人nkx3.1单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：将上述核酸分子导入宿主细胞。
26.本发明取得的有益效果：
27.本发明抗人nkx3.1单克隆抗体的制备所采用的免疫原，是在结合同源框蛋白序列特点的基础上，选择nkx3.1分头部尾部两部分截短序列，经原核表达纯化获得的重组蛋白nkx3.1
‑
a和nkx3.1
‑
b，试验证明，截短后的抗原可以实现预期免疫效果。本发明采用混合免疫的免疫方式，提高对nkx3.1的免疫命中率。
28.本发明还提供了抗人nkx3.1单克隆抗体的重链和轻链的可变区氨基酸序列，在此基础上，可以采用常规抗体工程的方法获得本发明的单克隆抗体(参见实施例6)。试验证明，获得的抗人nkx3.1重组抗体能够特异性的识别人nkx3.1蛋白，能够用于ihc免疫组化检测。与传统单克隆抗体制备方法相比，本发明采用基因工程方法制备的抗人nkx3.1重组抗体具有序列已知、抗体性质稳定、重复性好等优点，标准化的抗体生产流程避免了传统单克隆抗体生产保存过程中出现的风险因素。进一步的，在发明提供的抗体氨基酸序列的基础上，还可采用一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得其活性片段或保守性变异
体，为进一步提升抗体的特异性和亲和力奠定了基础。
附图说明
29.图1为本发明实施例2获得的抗人nkx3.1单克隆抗体的westernblot验证结果；
30.图中，m：marker；1：sp2/0细胞裂解液；2：lncap细胞裂解液。
31.图2为本发明实施例2获得的nkx3.1单克隆抗体的免疫组化结果，检测组织为前列腺(200
×
)；
32.图3为本发明实施例2获得的nkx3.1单克隆抗体的免疫组化结果，检测组织为乳腺(200
×
)；
33.图4为本发明实施例2获得的nkx3.1单克隆抗体的免疫组化结果，检测组织为睾丸(200
×
)；
34.图5为本发明实施例6获得的抗人nkx3.1重组抗体的westernblot结果，样品为人前列腺组织裂解液、lncap细胞裂解液；
35.图中，左侧泳道：marker；中间泳道：人前列腺组织裂解液；右侧泳道：lncap细胞裂解液。
36.图6为抗人nkx3.1重组抗体的免疫组化结果。
具体实施方式
37.下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
38.实施例1免疫原的制备
39.1、nkx3.1头部和尾部的选取
40.根据uniprot公布的nkx3.1序列和结构选择头部和尾部序列，用于nkx3.1的融合表达。人nkx3.1的uniprot的登录号是q99801，含有234个氨基酸，其中1
‑
123为其头部，124
‑
183为其杆部，184
‑
234为其尾部，头部氨基酸和核酸序列分别如seq id no：11和12所示，尾部氨基酸和核酸序列分别如seq id no：13和14所示。
41.2、融合表达与纯化
42.1)将nkx3.1的头部和尾部核酸序列进行人工合成，并在序列两端引入酶切位点ndei和xhoi，合成后克隆进入pet
‑
28a表达载体中，构建pet
‑
28a
‑
nkx3.1
‑
a、pet
‑
28a
‑
nkx3.1
‑
b表达载体。
43.2)将上述构建的重组质粒转化bl21(de3)大肠杆菌感受态中，挑取单菌落在4ml含卡那霉素(50μg/ml)的lb液体培养基中培养，加入终浓度1mm的iptg进行表达分析，保存可以表达目的蛋白的菌株。
44.3)将上述可以表达目的蛋白的菌株接种于350ml含卡那霉素(50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃培养至od
600
达到0.8，加入终浓度0.4mm的iptg，37℃诱导表达4h。
45.4)离心收集上述诱导表达的菌体，用冰浴冷的10mm pbs进行重悬，超声破碎(350w，20min，工作3s，休息3s)，12000g离心10min，收集上清溶液用于下一步纯化。
46.5)将上述上清溶液进行0.45μm滤器过滤，过滤液进行镍琼脂糖凝胶纯化。滤液上
样平衡过的凝胶中，控制流速为1ml/min。用10mm pbs进行洗涤除去未吸附的蛋白，用pbs和含0.5m咪唑的pbs进行线性洗脱，收集不同的洗脱峰进行sds
‑
page鉴定蛋白，将纯度大于90％的样品进行超滤换液到10mm pbs中。得到纯化的nkx3.1的头部重组蛋白nkx3.1
‑
a和尾部重组蛋白nkx3.1
‑
b。
47.实施例2 nkx3.1杂交瘤细胞株筛选以及单克隆抗体制备
48.1、动物免疫：
49.将上述分别纯化得到的nkx3.1
‑
a、nkx3.1
‑
b两种蛋白分别与等体积弗氏完全佐剂混合，采用皮下注射方法免疫6
‑
8周龄balb/c小鼠免疫剂量为100μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，抗原采用弗氏不完全佐剂乳化，免疫剂量同第一次，采取腹腔注射方法。第二次免疫后取尾血以间接elisa法梯度稀释测定血清效价，选取抗体效价最高的小鼠进行尾静脉冲击免疫，冲击剂量为50μg/只。
50.2、细胞融合：
51.骨髓瘤细胞采用balb/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；无菌摘取冲击免疫后的小鼠脾脏，制成脾脏细胞单细胞悬液；小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞以1:5混合，滴加37℃的50％peg(ph8.0)1ml，加入不完全培养基，离心弃上清后加入hat培养基悬浮混匀，定容到50ml，滴加到96孔细胞培养板中，置于37℃、5％co2恒温培养箱中进行培养。
52.3、筛选和克隆：
53.融合后7
‑
10天内挑选细胞克隆，进行elisa筛选检测，具体步骤如下：
54.首先以50ng/孔的包被量制备包被板，按照100μl/孔的加样量进行4℃包被过夜。第二天弃去上清，拍干。每孔加入150μl的封闭液，或者置于37℃条件下，放置2h；再弃去上清，拍干。抽取融合细胞培养上清，每孔100μl加入酶联免疫检测板中进行一抗孵育，将一抗在37℃条件下孵育30min后用elisa洗液洗涤5次；再进行二抗孵育：将检测板拍干后，每孔加入预先经过抗体稀释液按照1:5000比例稀释过的二抗试剂，100μl/孔，置于37℃条件下孵育30min；随后用elisa洗液洗涤5次；底物反应：将检测板拍干后，每孔加入显色液a、显色液b各50μl/孔。先加入显色剂a，后加入显色剂b。置于室温条件下避光孵育5min。最后终止反应：向反应完成后的底物中，加入50μl/孔终止液。放入酶标仪中震荡混匀后读数(450nm)。选择阳性孔od值大于或接近阳性孔的细胞培养上清，再进行ihc检测，ihc检测步骤如下：首先制备石蜡切片，65℃烤片2h；再对石蜡切片进行脱蜡和水化：将切片置于新鲜的二甲苯中，浸泡2次，15min/次；然后依次置于无水乙醇i、ii，95％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中，各浸泡1次，5min/次；再放入纯化水中清洗浸泡5min；再进行抗原修复：高压锅中加入足量抗原修复缓冲液，电磁炉加热至溶液沸腾后，设定蒸煮模式，300w，放入玻片架，定时20min后，压力锅离开热源，自然冷却5min后，自来水水浴15min，取出，浸泡于纯化水中，用油笔将组织圈定在其中，纯化水浸泡5min后，清洗液浸泡5min。取出染色架；再加阻断内源性过氧化物酶：切片上滴加80
‑
100μl(前后添加量保持一致，下同)内源性过氧化物酶阻断剂，25℃孵育5min。清洗液冲洗、浸泡2次，5min/次；然后加一抗试剂：滴加80
‑
100μl一抗试剂(即样品试剂和对比试剂)，37℃孵育30min，清洗液冲洗、浸泡2次，5min/次；然后加一抗后试剂：滴加80
‑
100μl一抗后试剂，25℃孵育20min，清洗液冲洗、浸泡2次，5min/次；然后加酶标聚合物：滴加80
‑
100μl酶标聚合物，25℃孵育20min，清洗液冲洗、浸泡2次，5min/次。显色(dab稀释比1：50，现用现配)滴加80
‑
100μldab显色液，25℃孵育4min，纯化水冲洗、浸泡2
次，5min/次；然后复染：滴加80
‑
100μl苏木素染色液25℃孵育3min，自来水冲洗返蓝。最后脱水、透明、封片：切片依次使用70％、85％、95％乙醇、无水乙醇两次、二甲苯两次，分别浸泡1min，最后透明、中性树胶和盖玻片封片，读片。
55.对ihc检测定位正确的阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5
‑
6天测定elisa值，挑取od
450
阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至elisa测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆确定细胞株。
56.经过筛选，最终获得一株能够稳定分泌抗人nkx3.1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
57.4、腹水单抗的制备与纯化：
[0058]8‑
10周龄的balb/c小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡，一周后每只小鼠用1ml注射器腹腔注射经pbs洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为5
×
106/只，每株细胞株打3只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，protein a柱层析法进行腹水纯化，纯化后的单抗浓度测定、分装、冻存在
‑
20℃。
[0059]
实施例3蛋白印迹(western
‑
blot)检测nkx3.1单克隆抗体的特异性
[0060]
1、样品制备：准备sp2/0细胞裂解液、lncap细胞裂解液，用含1mm pmsf的rapi裂解后，加入5xsds
‑
page loading buffer制样。sp2/0是没有进行融合的小鼠骨髓瘤细胞作为阴性对照，lncap细胞是人前列腺癌细胞作为阳性对照，二者裂解液会释放出细胞内蛋白，小鼠骨髓瘤细胞不会表达nkx3.1，而lncap细胞是特异性表达nkx3.1的细胞，会与筛选得到的阳性单克隆抗体结合，wb会呈现阳性反应。
[0061]
2、电泳以及转膜：每个样品上样30μg，按照80v 20min，然后120v电泳至溴酚蓝至凝胶底部。然后开始转膜，提前用转移缓冲液浸泡nc膜与滤纸，三明治形式置于湿转转膜仪，顺序为：电极(
‑
)
‑
海绵
‑
滤纸
‑
凝胶
‑
nc膜
‑
滤纸
‑
海绵
‑
电极( )，恒压90v，90min。
[0062]
3、封闭：用封闭液(含5％脱脂奶的tbst)浸没nc膜并置于37℃孵育2小时。
[0063]
4、一抗孵育：将nc膜置于含实施例2获得的抗人nkx3.1单克隆抗体的一抗中(以封闭液将抗体按1:2000稀释)中，37℃温箱孵育1h后，再用tbst洗膜3次，每次5min。
[0064]
5、二抗孵育：将nc膜置于hrp标记的羊抗鼠igg二抗(以封闭液将抗体按1:5000稀释)中，37℃摇床孵育30min后，tbst洗膜3次，每次5min。
[0065]
6、显色：ecl发光液中a与b组分按1：1混匀后加在nc膜上,在曝光仪中曝光。
[0066]
结果如图1所示，由图1可知nkx3.1鼠单抗在lncap细胞裂解液中具有目的条带，30kd，其中nkx3.1鼠单抗稀释比例为1:800。说明nkx3.1鼠单抗与前列腺细胞发生特异反应，能特异性识别nkx3.1蛋白。
[0067]
实施例4免疫组织化学(ihc)检测nkx3.1单克隆抗体的特异性
[0068]
1、分别取人前列腺组织、乳腺、睾丸组织的蜡块，使用leica组织切片机进行切片，组织厚度为3μm，65℃干烤2h。
[0069]
2、使用手工免疫组化方法对本发明抗体进行免疫组化染色测试，具体步骤为：采用dako high ph修复液进行高温修复20min；待冷却后使用内源性过氧化物酶封闭液100μl室温孵育5min，清洗液浸泡2次，5min/次；一抗使用实施例2获得的抗人nkx3.1单克隆抗体，采用抗体稀释液按1:1000稀释，滴加稀释后的抗体100μl，37℃孵育30min，清洗液浸泡2次，5min/次；使用酶标多聚物100μl，室温孵育20min，清洗液浸泡2次，5min/次；使用dab显色液100μl，室温孵育5min，纯化水浸泡2次，5min/次；滴加100μl苏木素复染，室温孵育5min，自
的氨基酸序列分别如seq id no.1
‑
3所示；单克隆抗体的轻链可变区vlcdr1
‑
3的氨基酸序列分别如seq id no.4
‑
6所示。
[0085]
3、抗人nkx3.1重组抗体表达及纯化
[0086]
包括转染前细胞培养、转染细胞的准备、瞬时转染和产物表达与检测。
[0087]
1)转染前细胞培养的方法为：将cho细胞置于5％的co2恒温摇床中，37℃、120rpm恒温震荡培养，传代时，需先做细胞计数，确认密度后无需离心细胞，可直接将细胞悬液依照所需比例兑入培养液中，若在培养过程中出现死细胞数过多的状况，应把细胞丢弃，使用新的细胞。
[0088]
2)转染细胞的准备的方法为：在细胞瞬时转染前需确定其细胞密度及存活率；细胞无需离心，直接兑入cho培养液，将细胞密度稀释成2
×
106个/毫升；摇瓶置于5％的co2恒温摇床中，37℃、120rpm恒温震荡培养10min后开始转染。瞬时转染的方法为：准备两支15ml的无菌离心管，在其中一支中加入5ml kpm和无菌质粒dna按重链：轻链1：1比例加入，轻轻吹打混匀；取另一支离心管，加入5ml kpm和500μl ta
‑
293转染试剂，轻轻吹打混匀；将含有转染试剂的离心管中所有液体转移至含质粒的离心管中，轻轻吹打混匀；室温下静置10分钟制备出质粒
‑
载体复合物；从恒温摇床中取出细胞，边摇边加入制备好的质粒
‑
载体复合物，放回co2恒温摇床中震荡培养，3小时后可根据需要加入适量抗生素。产物表达与检测的方法为：转染24小时后可加入600μl 293细胞蛋白表达增强剂，以增加产物表达量；在转染24小时后添加瞬时转染营养添加剂。
[0089]
4、进行抗体验证
[0090]
抗体验证的方法包括：wb验证、ihc验证，wb验证方法参见实施例4，ihc验证方法参见实施例5。
[0091]
对本发明通过基因工程方法制备的抗人nkx3.1重组抗体进行wb验证，结果如图5所示，可知nkx3.1重组单抗在人前列腺组织裂解液、lncap细胞裂解液中均具有目的条带，30kd，其中nkx3.1鼠单抗稀释比例为1:800。说明nkx3.1重组抗体与人前列腺组织、人前列腺癌细胞发生特异反应，能特异性识别nkx3.1蛋白。同时，ihc验证结果如图6所示，可知nkx3.1鼠单抗在前列腺组织中定位正确，呈明显阳性，在睾丸、乳腺癌组织中低水平表达，呈弱阳性。
[0092]
本发明提供了抗人nkx3.1单克隆抗体的重链和轻链的可变区氨基酸序列，在此基础上，可以采用常规抗体工程的方法获得本发明的单克隆抗体，具体方法参见本实施例。wb和ihc特异性验证试验证明，获得的抗人nkx3.1重组抗体能够特异性的识别人nkx3.1蛋白，能够用于ihc免疫组化检测。与传统单克隆抗体制备方法相比，本发明采用基因工程方法制备的抗人nkx3.1重组抗体具有序列已知、抗体性质稳定、重复性好等优点，标准化的抗体生产流程，避免了传统单克隆抗体生产保存过程中出现的风险因素。进一步的，在发明提供的抗体氨基酸序列的基础上，还可采用一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得其活性片段或保守性变异体，为进一步提升抗体的特异性和亲和力奠定基础。