降血糖乳杆菌ZJUIDS09及其应用的制作方法

降血糖乳杆菌zjuids09及其应用
技术领域
1.本发明涉及食品微生物技术领域，具体涉及到具有血糖功能的约氏乳杆菌zjuids09及应用。


背景技术：

2.目前，糖尿病已经成为中国及世界人口的数量最多的代谢性疾病。血清中高血糖含量被认为是糖尿病等代谢性疾病的主要因素。因此，降低血清血糖水平直接关系到人体的健康。迄今为止，已有大量实验证实了服用部分乳酸菌及其相关制品具有减少人体血清血糖含量，降低糖尿病发病率或缓解症状的功效。乳酸菌是人体肠道中重要的益生菌，其数量和组成对维持宿主的微生态平衡和提高免疫系统功能起着至关重要的作用。
3.乳杆菌与人类生活密切相关，是广泛应用于食品发酵、工业乳酸发酵及医疗保健领域的有益微生物之一。约氏乳杆菌作为乳杆菌的一种，将其添加到食品中，可以改善食品的口感、质地和风味。约氏乳杆菌也能够定植于人体内发挥益生作用，如调节肠道菌群、抑制肠道病原菌生长、降低血清血糖、增强机体免疫力、提高乳糖消化和抗肿瘤、抗氧化等方面。
4.cn102026554b的《副干酪乳杆菌与体重控制》告知了副干酪乳杆菌st11在制备治疗或预防超重、肥胖和/或相关代谢疾病的组合物中的应用，其中所述相关的代谢疾病选自糖尿病、肝硬化、代谢综合症、心血管疾病及其组合。
5.cn1380902b的《治疗或预防肥胖症和糖尿病的微生物及含有所述微生物的药物组合物》告知了一种用于治疗和预防肥胖症或糖尿病的药物组合物，所述微生物选自醋杆菌(acetobacter)kctc 0773bp和乳杆菌(lactobacillus)kctc 0774bp。
6.cn112075638a的《包含降低血糖的乳酸菌菌株的食品组合物以及医药组合物》包含降低血糖的乳酸菌菌株的食品组合物以及医药组合物，所述组合物包含经分离的乳酸菌菌株，其选自罗伊氏乳酸杆菌(lactobacillus reuteri)gl
‑
104菌株cctcc no：m209138、唾液乳酸杆菌(lactobacillus salivarius subsp.salicinius)ap
‑
32菌株cctcc no：m2011127、嗜酸乳酸杆菌(lactobacillus acidophilus)tyca06菌株cgmcc no.15210、及约氏乳酸杆菌(lactobacillus johnsonii)mh
‑
68菌株cctcc no：m2011128之一或组合。


技术实现要素：

7.本发明要解决的技术问题是提供一种人源性降血糖约氏乳杆菌zjuids09及其应用。
8.为了解决上述技术问题，本发明提供一种约氏乳杆菌(lactobacillus johnsonii)zjuids09，其保藏编号为cgmcc no.22608。
9.作为本发明的约氏乳杆菌zjuids09的改进：约氏乳杆菌zjuids09的16s rdna全序列为seq id no：1所示。
10.本发明还同时提供了上述约氏乳杆菌zjuids09在制备具有降血糖功能的产品(例
如药物)中的应用。
11.作为本发明应用的改进：具有降低血糖功能的产品包含约氏乳杆菌(lactobacillus johnsonii)zjuids09的菌粉制剂(活菌制剂)。
12.约氏乳杆菌(lactobacillus johnsonii)zjuids09的菌粉制剂(活菌制剂)中，约氏乳杆菌zjuids09的活菌数为1.0
×
10
11
～5
×
10
11
cfu/g。
13.本发明的菌株zjuids09，保藏名称：约氏乳杆菌lactobacillus johnsonii；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmcc no.22608，保藏时间2021年05月26日。
14.本发明从健康母乳喂养婴儿的粪便中筛选出一株约氏乳杆菌zjuids09(lactobacillus johnsonii zjuids09)，通过细菌形态学、生理学和培养特征，结合api 50ch鉴定试剂条(法国梅里埃)和16s rdna测序等对该菌进行了鉴定。
15.本发明所提供的约氏乳杆菌zjuids09(lactobacillus johnsonii zjuids09)的菌落形态学特征为：在mrs琼脂培养基上形成明显的菌落，菌落大小0.3～1.5mm。菌落圆形，边缘整齐，白色，表面湿润光滑。其菌体形态特性为：革兰氏染色呈阳性，不产芽孢，圆端直杆菌，单个、成对或短链状。
16.本发明所提供的约氏乳杆菌zjuids09(lactobacillus johnsonii zjuids09)的降血糖能力中dpp
‑
iv抑制率达到30.6～38.9％，α
‑
葡萄糖苷酶抑制率在23.6～40.1％。其还具有以下能力：
17.1、具有较强的胆盐水解酶活力；
18.2、能耐受酸和胆盐，并且具有一定的增殖能力；对常见的抗生素敏感；具有抗菌活性；即，能耐受胃肠道环境、无抗生素耐性、能抑制肠内有害的病原菌。
19.综上所述，本发明从健康母乳喂养婴儿的粪便中分离获得的益生菌中筛选出来具有强降血糖功能的约氏乳杆菌zjuids09。该菌株具有较强的胆盐水解酶活力，该菌株在耐酸耐胆盐方面比其他乳酸菌有明显的优势，适合肠胃环境并具有增殖能力。无抗生素耐性，具有抗菌活性。本发明的约氏乳杆菌zjuids09可广泛用于开发降血糖相关益生功能产品，例如具有降低血糖功能的发酵果蔬、具有低血糖功能性发酵酸肉；具有低血糖功能性酸奶、具有降低血糖功能的青贮饲料和宠物奶粉等。
附图说明
20.图1为约氏乳杆菌zjuids09的菌落形态图。
21.图2为约氏乳杆菌zjuids09革兰氏染色的菌体形态图。
22.图3为约氏乳杆菌zjuids09的16s rdna的电泳鉴定图；
23.注:m从上到下依次为5000、3000、2000、1000、750、500、250、100bp。
24.图4为约氏乳杆菌zjuids09抗菌活性的平板示例；
25.从左到右分别是对肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单增李斯特氏菌的抑制圈。
具体实施方式
26.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于
此：
27.实施例1、约氏乳杆菌zjuids09的筛选及鉴定：
28.1.乳酸菌的筛选
29.1.1 样品来源
30.本发明所使用的菌株均从母乳喂养健康婴儿(3～6月)粪便样品中分离获得。粪便样品共采集30份，其中所有采样对象在被采样前的至少一个月时间内未服用任何含有活菌的发酵食品和益生菌制剂、未出现腹泻等胃肠道疾病、未服用任何种类的抗生素类药物。
31.1.2 菌株的分离纯化
32.取大约5g新鲜粪便样品用无菌管收集，立即送至实验室进行菌株分离。取1g样品放入9ml的mrs液体培养基中，涡旋混匀后于37℃下富集培养48h；然后在超净台中吸取富集液1ml，用无菌生理盐水进行十倍梯度稀释，选取10
‑6、10
‑7、10
‑8三个稀释梯度，每个梯度取菌液100μl涂于mrs琼脂培养基上，于37℃培养48h。培养结束后，从琼脂培养基中选择生长有50～150个单菌落的平板，挑取典型菌落，在mrs琼脂平板上多次划线纯化，直至整个平板上的菌落形态一致，挑取单菌落到mrs液体培养基增菌培养。得到的菌株均在含40％甘油的mrs液体培养基中于
‑
80℃冷冻保存。得到菌株zjuids09。
33.2.约氏乳杆菌zjuids09的鉴定
34.2.1 菌落特征
35.约氏乳杆菌zjuids09在mrs琼脂培养基培养48h后，直径在0.3～1.5mm之间，菌落圆形，边缘整齐，白色，表面湿润光滑，见图1。
36.2.2 显微镜下形态：
37.约氏乳杆菌zjuids09菌落涂片：革兰氏染色呈阳性，不产芽孢，圆端直杆菌，单个、成对或短链状，见图2。
38.2.3 益生菌api鉴定结果
39.采用api 50ch(法国梅里埃公司)生理生化试纸鉴定，结果表明该菌株为约氏乳杆菌。
40.表1、约氏乳杆菌zjuids09生理生化特性
[0041][0042][0043]
注： 表示反应为阳性，
‑
表示反应为阴性。
[0044]
2.4 16s rdna鉴定
[0045]
用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒提取目标菌株基因组dna，将提取的乳酸菌基因组dna作为pcr扩增的模板，采用细菌通用引物27f和1492r进行16s rdna的pcr实验，
pcr反应扩增结束后，取pcr产物进行琼脂糖凝胶检测拍照，扩增片段长度为1.5kb左右，见图3。将pcr产物送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序，结果如seq id no：1所示，在ncbi网站上进行blast序列比对，结果显示该序列与约氏乳杆菌的16s rdna序列同源性超过99％。
[0046]
将菌株zjuids09的序列比对结果和生理生化结果相结合，确定筛选的乳酸菌zjuids09为约氏乳杆菌(lactobacillus johnsonii)。
[0047]
本发明的菌株zjuids09，保藏信息为：保藏名称：约氏乳杆菌lactobacillus johnsonii；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmcc no.22608，保藏时间2021年05月26日。
[0048]
实施例2、约氏乳杆菌zjuids09体外降血糖能力的确认
[0049]
1、dpp
‑
iv抑制率
[0050]
菌株发酵液的制备
[0051]
将于甘油管中保存的菌株zjuids09先在mrs琼脂平板上划线活化2～3次，然后挑取单菌落在mrs液体培养基中扩大培养18h，菌液的浓度达到107cfu/ml左右，作为菌悬液。将菌悬液以2％(体积％)的接种量接种于血糖(水溶性)浓度为100μg/ml的mrs液体培养基中，于37℃培养48h后得到菌株发酵液。发酵液通过离心(12000的转速下离心20分钟)得到上清液和菌体，菌体通过细胞破碎仪破碎后制备成内容物。
[0052]
测定方法如下：
[0053]
在96孔微孔板中，加入25μl甘氨酸
‑
对硝基苯胺(0.2mm)和25μl菌样品(分别为上清、菌悬液、内容物)，37℃下预孵育10分钟。之后，加入50μl dpp
‑
iv(0.01u/ml)并在37℃下孵育60分钟。加入100μl乙酸钠缓冲液(1m，ph 4.0)终止反应，在405nm测定样品的吸光度。所得结果为“dpp
‑
iv抑制率”公式中的a。
[0054]
将“50μl dpp
‑
iv(0.01u/ml)”改成“50μl无菌水”，其余方法同上，所得结果为“dpp
‑
iv抑制率”公式中的b。
[0055]
将“25μl菌样品”改成“25μl pbs溶液(浓度0.1mol/l，ph＝6.8)”，其余方法同上，所得结果为“dpp
‑
iv抑制率”公式中的c。
[0056]
将“25μl菌样品”改成“25μl pbs”、且将“50μl dpp
‑
iv(0.01u/ml)”改成“50μl无菌水”，其余方法同上，所得结果为“dpp
‑
iv抑制率”公式中的d。
[0057]
dpp
‑
iv抑制率＝[1
‑
(a
‑
b)/(c
‑
d)]*100％。
[0058]
每个菌种做3个平行，每组实验重复3次，同时以pbs溶液对照，以鼠李糖乳杆菌atcc53103作阳性对照菌株。
[0059]
表2、菌株的dpp
‑
iv抑制率(％)
[0060][0061]
*代表差异显著，p<0.05
[0062]
如表2所示，本发明筛得约氏乳杆菌zjuids09在菌体抑制率、上清抑制率及内容物
抑制率等方面均显著优于标准菌株鼠李糖乳杆菌atcc53103。表明约氏乳杆菌zjuids09具有优异的dpp
‑
iv抑制效果，可用于降血糖功能菌株的筛选。
[0063]
2、α
‑
葡萄糖苷酶抑制率
[0064]
发酵上清液、菌体及菌体内容物的制备同上。
[0065]
在总体积205μl的体系中，其中添加50μl的pbs溶液(浓度0.1mol/l，ph＝6.8)，再加入50μl浓度为20mmol/l的对硝基苯酚
‑
α
‑
d
‑
吡喃葡葡糖苷(pnpg)溶液及25μ待测样(分别为上清、菌液、内容物)，将混合物于37℃孵化10min，加入30μlα
‑
葡萄糖苷酶溶液20u/ml继续反应20min，加入50μl浓度为1mol/l na2co3作为反应终止液，将反应液于405nm处测其吸光值，吸光值与对硝基苯酚pnp的游离量成正比。所得结果为“α
‑
葡萄糖苷酶抑制率”公式中的a。
[0066]
将“50μl浓度为20mmol/l的对硝基苯酚
‑
α
‑
d
‑
吡喃葡葡糖苷(pnpg)溶液”改成“50μl无菌水”，其余方法同上，所得结果为“α
‑
葡萄糖苷酶抑制率”公式中的b。
[0067]
将“25μl待测样”改成“25μl pbs溶液”，其余方法同上，所得结果为“α
‑
葡萄糖苷酶抑制率”公式中的c。
[0068]
将“25μl待测样”改成“25μl pbs溶液”、且将“50μl浓度为20mmol/l的对硝基苯酚
‑
α
‑
d
‑
吡喃葡葡糖苷(pnpg)溶液”改成“50μl无菌水”，其余方法同上，所得结果为“α
‑
葡萄糖苷酶抑制率”公式中的d。
[0069]
α
‑
葡萄糖苷酶抑制率＝[1
‑
(a
‑
b)/(c
‑
d)]*100％
[0070]
每个菌种做3个平行，每组实验重复3次，同时以pbs为对照，以鼠李糖乳杆菌atcc53103作阳性对照菌株。
[0071]
表3、菌株的α
‑
葡萄糖苷酶抑制率(％)
[0072][0073]
*代表差异显著，p<0.05
[0074]
如表3所示，本发明筛得约氏乳杆菌zjuids09在菌体和破碎内容物的α
‑
葡萄糖苷酶抑制率上显著高于标准菌株鼠李糖乳杆菌atcc53103，而在上清液的抑制率上和标准菌株无显著差异。这表明约氏乳杆菌zjuids09菌体具有优良的α
‑
葡萄糖苷酶抑制能力。
[0075]
上述两个试验表明约氏乳杆菌zjuids09在dpp
‑
iv和α
‑
葡萄糖苷酶抑制方面均有良好的效果，对比标准菌株鼠李糖乳杆菌atcc53103有明显的优势，可用于后期的降血糖功效研究及产品开发。
[0076]
实施例3、约氏乳杆菌zjuids09的胆盐水解酶活力的确认
[0077]
1.约氏乳杆菌zjuids09胆盐水解酶定性测定
[0078]
在新鲜配制的mrs琼脂培养基中添加0.3％(m/v，即3g/1000ml)脱氧牛磺胆酸钠、0.2％(m/v)巯基乙酸钠、0.37g/l cacl2，将其完全溶解。于121℃灭菌15min，倾倒入无菌平板中，待凝固后把无菌滤纸片均匀放入平板中，在滤纸片上滴加10μl约氏乳杆菌zjuids09菌悬液(约107cfu/ml)，以滴加10μl的无菌磷酸盐缓冲液为空白对照。将平板于厌氧罐
(oxoid)中37℃厌氧培养72h。若滤纸片周围有白色沉淀物则认为有胆盐水解酶活性。
[0079]
2.约氏乳杆菌zjuids09胆盐水解酶活力的定量测定
[0080]
取约氏乳杆菌zjuids09发酵液(约107cfu/ml)10ml于离心管中。在4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，收集菌体沉淀。用无菌生理盐水漂洗菌体2次，再用30ml 0.1mol/l的磷酸盐缓冲溶液(ph 7.0)将其悬浮。细菌悬浮液于冰浴中进行超声波破碎20min(100w，工作时间/间隙时间＝3：5，保护温度为37℃)。之后，10000r/min、4℃离心10min，其上清液即为约氏乳杆菌zjuids09的胆盐水解酶溶液。
[0081]
取0.1ml约氏乳杆菌zjuids09的胆盐水解酶溶液，向其中加入1.8ml 0.1mol/l的磷酸盐缓冲溶液和0.1ml的6mmol/l牛磺胆酸钠；所得混合物在37℃培养30min，之后加入0.5ml 15％的三氯乙酸终止酶促反应。将其进行离心，取0.5ml上清液加入1ml的茚三酮显色液。将其旋涡震荡混匀，煮沸35min。冷却后测定其在570nm处的吸光度值。一个胆盐水解酶活力单位定义为每分钟从底物释放1μmol牛磺酸所需要的酶的量。
[0082]
3.以鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)atcc53103作为阳性对照，进行上述胆盐水解酶活力的测定。
[0083]
4.表4为两株菌的胆盐水解酶活性定量测定结果。从表中可以看出，这两株菌的胆盐水解酶活力均在1.0u/mg以上，约氏乳杆菌zjuids09的胆盐水解酶活力为1.25u/mg，与对照菌株无明显差异。实验结果表明，约氏乳杆菌zjuids09具有较高的胆盐水解酶活力。
[0084]
表4、菌株的胆盐水解酶测定结果
[0085][0086]
注： 表示产生沉淀圈，
‑
表示不产生沉淀圈。
[0087]
5.胆盐水解酶可将体内结合型胆盐水解为游离型胆盐，而游离型胆盐不参与肝肠循环，随粪便排出体外，因而胆盐水解酶活性是降低体内血脂的关键因素。本发明所提供的约氏乳杆菌zjuids09具有较强的胆盐水解酶活力，可降低体内血脂。
[0088]
实施例4、约氏乳杆菌zjuids09的耐酸性及耐胆盐性的确认
[0089]
1.耐酸实验
[0090]
挑取约氏乳杆菌zjuids09单菌落在mrs液体培养基中扩大培养18h，将扩大后菌悬液以1％的量接种到mrs液体培养基，37℃培养18h后。将培养液于4℃经8000r/min离心5min收集菌体，用磷酸盐缓冲液(ph 6.8)洗涤2次后。菌体悬浮于ph 3.0的mrs液体培养基中，将初始活菌数校正至大约108cfu/ml，先37℃培养3h。然后采用倾注平板法对0h和3h样品中的活菌进行计数，测定其存活率，存活率计算公式如下：
[0091][0092]
上式中，n0为测试菌株0h的活菌数(cfu/ml)；n
t
为测试菌株3h的活菌数(cfu/ml)。
[0093]
2.耐胆盐实验
[0094]
将活化扩大后的约氏乳杆菌zjuids09菌悬液以1％的量接种到mrs液体培养基中，
于37℃培养18h后，漩涡混匀，将初始活菌数校正至大约109cfu/ml。以10％的量接种到含0.3％(m/v)牛胆盐的mrs液体培养基(对照为不含牛胆盐的mrs液体培养基)，于37℃培养3h。然后采用倾注平板法对样品中的活菌数进行计数。菌株的胆盐耐受能力以3h时每毫升含胆盐培养基中活菌数与不含胆盐培养基中活菌数的差值的对数来表示(δlogcfu/ml)。
[0095]
3.以鼠李糖乳杆菌(lactobacillus acidophilus)atcc53103作为对照，进行上述耐酸、耐胆盐性能测定。
[0096]
4.如表5所示，约氏乳杆菌zjuids09的耐酸耐胆盐性能明显优于对照菌株atcc53103。其在ph为3.0的mrs培养基中的存活率高达81.74％。在含有0.3％的牛胆盐的环境中活菌数仍达到106cfu/ml以上，说明其具有较好的胆盐耐受性。实验证明，约氏乳杆菌zjuids09具备较高的胃肠道生存能力。
[0097]
表5、菌株对酸和胆盐耐受性结果
[0098]
菌株耐酸性(％)胆盐耐受能力(δlog cfu/ml)约氏乳杆菌zjuids0981.74
±
0.41*1.48
±
0.11*鼠李糖乳杆菌atcc5310362.12
±
0.181.03
±
0.23
[0099]
*代表差异显著，p<0.05
[0100]
5.益生菌必须能够耐受胃肠道中胃酸和胆汁等一系列不良环境而活着才能发挥其益生作用。本发明提供的约氏乳杆菌zjuids09在ph 3.0的条件下能够生长增殖，其能顺利通过胃中的酸性环境到达小肠。同时，约氏乳杆菌zjuids09能耐受胆盐，其能在肠道内存活，进而能有效地发挥降血糖作用。
[0101]
实施例5、约氏乳杆菌zjuids09疏水能力的确认
[0102]
1.疏水性的测量
[0103]
用干净的pbs液体培养基洗涤约氏乳杆菌zjuids09菌体沉淀两次，重悬使od
610
的吸光度约为0.5左右，得乳酸菌悬液；培养基菌悬液制备参照上述实施例。
[0104]
取2ml乳酸菌悬液和2ml二甲苯彻底混合，37℃水浴充分震荡5min后，并于0h、2h后分别测量水相的od
610
吸光值。
[0105][0106]
a0＝0h的吸光值，a
t
＝th的吸光值。
[0107]
所得结果如下表6所示。
[0108]
表6、不同菌株的表面疏水性(％)
[0109][0110]
2.结果分析
[0111]
经测量，约氏乳杆菌zjuids09的疏水性在51.43％，显著高于对照标准菌株。该表明该菌株具有较强的粘附能力，可粘附到人的肠道，改善肠道菌群的健康。
[0112]
实施例6、约氏乳杆菌zjuids09的抗生素感受性的确认
[0113]
将培养18h的浓度约为107cfu/ml约氏乳杆菌zjuids09菌悬液按1％的量加入冷却至45℃左右的灭过菌的mrs琼脂培养基中，充分混合，定量加入15ml/皿。待凝固后，用镊子取药敏纸片放于培养基上。将培养皿正面朝上放于37℃培养箱中培养24h。以无抗生素的纸片为空白对照。测量抑菌圈直径。每个重复三次。
[0114]
约氏乳杆菌zjuids09对抗生素感受性抑菌圈直径如表7所示。参考clsi(2017)药敏试验标准可得，约氏乳杆菌zjuids09对青霉素g、氨苄青霉素、头孢唑林、丁胺卡那、庆大霉素、红霉素、复方新诺明和氯霉素呈现敏感性。对于环丙沙星、氟哌酸呈现中介。实验结果表明，约氏乳杆菌zjuids09对常见的抗生素敏感。
[0115]
表7、约氏乳杆菌zjuids09对抗生素敏感性结果
[0116][0117]
注：s，敏感；i，中介；r，耐药
[0118]
随着抗生素在临床治疗的广泛应用，乳酸菌的耐药性也越来越严重，长期摄入耐药性的乳酸菌会给临床治疗带来很大的困难。本发明所提供的约氏乳杆菌zjuids09对常见的抗生素敏感，不会对人体健康造成危害。
[0119]
实施例7、约氏乳杆菌zjuids09的病原菌抑制能力的确认
[0120]
采用国际通用琼脂扩散法测定乳酸菌抗菌活性。将10ml lb琼脂培养基倒入无菌培养皿中，冷却后做为下层培养基。将培养18h菌浓度约为107cfu/ml指示菌菌悬液按1％的量加入冷却至45℃左右的灭过菌的lb琼脂培养基中，充分混合，定量加入10ml/皿。在上面摆放灭过菌的牛津杯。待上层培养基冷凝后，轻轻拔掉牛津杯。定量以100μl/孔加入约氏乳杆菌zjuids09发酵上清液样品(即，实施例2所得的上清液)，并且以磷酸盐缓冲液(ph6.8)作为对照。挑选出小孔周围有明显抑菌圈的菌株，测量抑菌圈直径，每个重复三次。图4为约氏乳杆菌zjuids09对四种致病菌抑制作用的平板示例。
[0121]
如表8所示，约氏乳杆菌zjuids09的代谢产物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌和单增李斯特菌均有一定的抑制作用，并优于atcc53103的抑菌效果。可见这株菌的代谢产物具有抑菌特性。
[0122]
表8、菌株对病原菌抑制能力的结果
[0123][0124]
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，一些大肠杆菌可引起严重腹泻和败血症，沙门氏菌种也会引起人类食物中毒，单增李斯特也是重要的人类致病菌。乳酸菌代谢产生的细菌素、有机酸、过氧化氢等抑菌物质均能单独或共同地抑制这些致病菌的生长。本发明所提供的约氏乳杆菌zjuids09的代谢产物对这三种致病菌具有一定的拮抗作用，这对其维持肠道微生态平衡发挥重要作用，并起到健康促进效果。
[0125]
对比例、将下表9所述乳杆菌参照上述实施例进行检测，所得结果与本发明的对比如下表9所示：
[0126]
表9
[0127][0128]
约氏乳酸杆菌(lactobacillus johnsonii)mh
‑
68的胆盐水解酶活约为0.7u/mg，且胆盐耐受性也远不如本发明的zjuids09。
[0129]
实施例8、利用约氏乳杆菌zjuids09制备功能性发酵酸奶
[0130]
酸奶的加工工艺流程和操作要点
[0131]
(1)原料：2l全脂uht灭菌乳或鲜牛乳；
[0132]
(2)预热：放入容器中加热至63℃；
[0133]
(3)均质：倒入均质机中均质，压力为15
‑
25mpa)，混合液倒入铁罐中，同时加入100g白糖，于90℃水浴环境杀菌10min；
[0134]
(4)调配：牛乳中加入5％的白糖，100g并溶解；
[0135]
(5)杀菌：加糖牛乳在90℃水浴里杀菌10min；
[0136]
(6)冷却：杀菌后的牛乳，冷却至40
‑
50℃备用；
[0137]
(7)制备发酵剂：约氏乳杆菌zjuids09菌种在无菌环境下，接种于装有灭菌脱脂乳(12％,w/v)的试管中，于37℃条件下培养20小时；每次传代接种量为2
‑
4％(v/v)，传代2～3次以恢复活力，放置于4℃冰箱中保存；
[0138]
(8)接种、发酵：在无菌条件下，接入活化好的约氏乳杆菌zjuids09，接种量为2
‑
4％(v/v)。在42℃条件下恒温发酵6
‑
10h；
[0139]
(9)后熟：发酵结束后，放入4℃冰箱中后熟12
‑
24h；
[0140]
(10)灌装、冷藏：后熟完成后，灌装到250ml的灭菌玻璃瓶中，送至冷库冷藏。
[0141]
实施例9、利用约氏乳杆菌zjuids09制备功能性发酵果蔬汁
[0142]
1.发酵果蔬汁的加工工艺流程
[0143]
原料
→
清洗
→
闪蒸
→
打浆
→
调配
→
均质
→
灭菌
→
冷却
→
接种
→
密闭发酵
→
后熟
→
灌装
→
冷藏；
[0144]
2.操作要点
[0145]
(1)原料：选取新鲜的南瓜和火龙果。
[0146]
(2)清洗切块：清洗、去皮(南瓜去瓤)、切成小块。
[0147]
(3)闪蒸：采用闪蒸的方法灭酶，0.5～1min，121℃处理，迅速排气。
[0148]
(4)打浆：按照南瓜∶水(重量比)＝1∶1的比例，将南瓜和水适量的逐渐放入胶体磨中研磨，进行粗磨和细磨各一次。将火龙果用打浆机打浆至果肉均匀无块状。
[0149]
(5)调配、均质：按南瓜汁15％，火龙果汁30％，再用蔗糖调节可溶性固形物含量至10
°
brix，加入0.2％的稳定剂cmc混合均匀，采用两段均质法，先低压(15mpa)，后高压(25mpa)，使瓜肉颗粒直径粒径为2～3μm。
[0150]
(6)灭菌、冷却：调配好的复合果蔬汁在100℃下保温10min，冷却至40℃左右。
[0151]
(7)接种、发酵：在无菌条件下，接入活化好的约氏乳杆菌zjuids09，初始菌数控制在107cfu/ml。在37℃条件下恒温发酵24h。
[0152]
(8)后熟：发酵结束后，放入4℃冰箱中3h。
[0153]
(9)灌装、冷藏：后熟完成后，灌装到250ml的灭菌玻璃瓶中，送至冷库冷藏。
[0154]
实施例10、利用约氏乳杆菌zjuids09制备功能性发酵酸肉
[0155]
发酵酸肉的加工流程:
[0156]
(1)切片：将市售新鲜五花肉，切成3cm见方薄片。
[0157]
(2)拌糯米粉：1000g原料肉与250g糯米粉混匀，加入葡萄糖1％。
[0158]
(3)接种、发酵：在无菌条件下，接入活化好的约氏乳杆菌zjuids09，初始菌数控制在107cfu/ml。在37℃条件下恒温发酵18h。
[0159]
(4)腌制：加入2％的盐，于25℃下腌制20d。
[0160]
实施例11、利用约氏乳杆菌zjuids09制备降血糖菌粉
[0161]
1.约氏乳杆菌zjuids09菌泥的制备
[0162]
挑取约氏乳杆菌zjuids09单菌落接种于50ml mrs液体培养基中，放置37℃培养箱中培养18h。再按5％的接种量于250ml mrs液体培养基中活化，放置37℃培养箱中培养24h。最后将活化好的约氏乳杆菌zjuids09以5％接种量于10l发酵罐中进行高密度厌氧培养，于37℃、ph 6.8的条件下培养18h。之后在8000r/min、4℃条件下离心15min，弃去上清液，收集菌体沉淀，用无菌磷酸盐缓冲液(ph 7.0)漂洗菌体2次。即可得到约氏乳杆菌zjuids09菌泥。
[0163]
2.保护剂的制备
[0164]
冻干保护剂含有15％的脱脂乳粉，5％的海藻糖，3％的谷氨酸钠，1％的甘油，0.5％的半胱氨酸盐酸盐；余量为水(作为溶剂)。于110℃灭菌备用。上述％为质量％。
[0165]
3.约氏乳杆菌zjuids09菌粉的制备
[0166]
将上述制备的约氏乳杆菌zjuids09菌体沉淀按1:5的质量比例与保护剂溶液充分混匀。于
‑
40℃条件下预冻5h，使其均匀冻结在容器内壁上，然后进行真空冷冻干燥，干燥18～20h后，即可得到约氏乳杆菌zjuids09菌粉。用生理盐水复水后，洗涤两次，测得约氏乳杆菌zjuids09菌粉中活菌数为1.0
×
10
11
～5
×
10
11
cfu/g。
[0167]
实施例12、利用约氏乳杆菌zjuids09制备青贮饲料
[0168]
约氏乳杆菌zjuids09制备苜蓿青贮饲料的步骤如下：
[0169]
(1)原料准备：苜蓿草收割后，保证清洁，无腐败变质，将其切断至1～2cm。
[0170]
(2)青贮的调制：苜蓿草青贮时水分含量控制在60～65％，称取200g苜蓿草原料装入真空包装袋，将实施例9所制备的约氏乳杆菌zjuids09菌粉按0.02
‰
接种量接种到原料中，采用真空包装机真空包装后，至于储藏室进行发酵。
[0171]
(3)储藏条件：温度为15～45℃，时间为30～60d。
[0172]
实施例13、利用约氏zjuids09制备宠物益生菌奶粉
[0173]
1.约氏乳杆菌zjuids09菌粉的制备
[0174]
参照实施例11制备发酵乳杆菌zjuids09菌粉冻干菌粉，菌粉中活菌数为1.0
×
10
11
‑5×
10
11
cfu/g。
[0175]
2.宠物配方粉的制备
[0176]
原料初选：奶粉、鱼粉、骨粉、谷物、植物油，添加剂：维生素、微量元素、功能因子、其他；
[0177]
自动配料：按照配方将得到的物料原料投入物料仓；
[0178]
粉碎：将称量好的物料通过粉碎机粉碎；
[0179]
混合：粉碎的物料再添加植物油和微量元素，加入到混合机混合均匀；
[0180]
膨化：混合好的物料通过膨化机制成颗粒物料；
[0181]
烘干：混合好的物料通过烘干机烘干，温度控制在65
‑
70度；
[0182]
分级筛选：将物流通过分级筛，颗粒控制在2.5
‑
5毫米。
[0183]
3.宠物益生菌配方粉的制备
[0184]
将1制备的菌粉和2制备的宠物饲料按照1：1000的比例混合均匀，最终产品中的出厂的活菌在108cfu/g以上。产品灌装后，入库保存销售。
[0185]
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。