红掌AaMYB6转录因子及其编码蛋白与应用的制作方法

红掌aamyb6转录因子及其编码蛋白与应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术技术领域，尤其涉及红掌aamyb6转录因子及其编码蛋白与应用。


背景技术：

2.红掌anthurium andraeanum(hort.)是国际流行的热带花卉，在我国是年宵花和日常切花的主打产品。佛焰苞和肉穗花序是红掌的主要观赏部位，花青素苷使二者呈现红色、粉红、紫红、橙红等颜色。培育具有新异佛焰苞和肉穗花序的颜色，以及二者颜色的搭配设计将成为红掌花色育种的亮点，具有重要的学术价值和市场前景。解析红掌花青素苷合成和调控的机理是花色改良的前提。人工杂交试验发现红掌佛焰苞和肉穗花序的颜色独立遗传。国内外前期研究重点关注了佛焰苞颜色遗传规律和花青素苷合成途径上酶基因的表达特征，推测出红掌佛焰苞中至少有3种花青素苷生物合成的调控方式，而对肉穗花序的呈色机理了解甚少。
3.r2r3
‑
myb转录因子是决定植物花器官中花青素苷合成时空模式的关键因素。如金鱼草的rosea1、rosea2和venosa；矮牵牛的an2、dpl、phz等。在兰科植物中，蝴蝶兰的3个myb转录因子基因pemyb2、pemyb11和pemyb12分别控制花瓣整体的红色、红色斑点和纹理的式样，在唇瓣中，pemyb11决定唇瓣胼胝体红色斑点的形成，而pemyb12控制唇瓣中裂片的整体着色。
4.已从红掌中鉴定了5个r2r3
‑
myb转录因子基因和1个bhlh转录因子基因，其中aamyb1、aamyb2、aamyb4和aamyb5具有调控花青素苷合成的功能，aamyb3促进原花青素合成。aamyb2被认为是调控佛焰苞花青素苷合成的转录因子，而调控肉穗花序中花青素苷合成的转录因子基因仍待挖掘。


技术实现要素：

5.本发明所提供的红掌转录因子aamyb6，来源于红掌品种
‘
粉冠军
’‘
pink champion’。
6.本发明所提供的红掌转录因子aamyb6，是如下a)或b)的蛋白质∶
7.a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
8.b)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与花青素苷合成相关的由a)衍生的蛋白质。
9.序列1由284个氨基酸序列组成，此氨基酸序列具有保守的r2r3重复序列。
10.所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
11.所述编码基因为如下1)或2)或3)或4)所示∶
12.1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示dna分子；
13.2)其核苷酸序列是序列表中序列3所示dna分子；
14.3)在严格条件下与1)或2)限定的dna分子杂交的dna分子；
15.4)与1)或2)或3)限定的dna分子具有90％以上的同源性的dna分子。
16.全长的cdna为941bp，如序列表中序列2所示；其中序列2自5’末端第56位到第907位为开放阅读框，开放阅读框部分为852bp，如序列表中序列3所示；其编码序列表中序列1所示的蛋白。
17.含有所述编码基因的表达盒、重组表达载体或重组菌也属于本发明的保护范围。
18.本发明还提供了一种制备花丝中花青素苷含量提高的转基因植物的方法。
19.本发明所提供的制备花丝中花青素苷含量提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：将所述编码基因导入出发植物中，得到转基因植物；与出发植物相比，转基因植物花丝中花青素苷含量明显提高。
20.所述编码基因是通过重组表达载体导入的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体part
‑
cam的多克隆位点得到的；
21.所述植物为烟草。
22.扩增所述编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围，所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列4所示，另一条引物序列如序列表中序列5所示。
23.所述a)或b)的蛋白在作为转录因子中的应用也属于本发明的保护范围。
24.所述转录因子为调控花丝中花青素苷生物合成的转录因子。
25.所述蛋白、所述编码基因在调控花丝中花青素苷合成中的应用也属于本发明的保护范围。
26.本发明所提供的转录因子aamyb6是从红掌中获得的，属于调控花青素苷合成的r2r3
‑
myb转录因子家族。通过反转录rt
‑
pcr，获得了该基因的完整编码框，随后构建超量表达载体并异源转化烟草进行稳定表达，发现该转录因子具有促进花青素苷积累的能力。
附图说明
27.为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：
28.图1为aamyb6与已报道的植物调控花青素苷合成的r2r3
‑
myb氨基酸序列比对结果；其中，zmc1，玉米zea mays，ncbi genbank序列号：1613412；pemyb2，蝴蝶兰phalaenopsis equestris，ais35919.1；aamyb5，红掌anthurium andraeanum，mh720335；aamyb1，红掌anthurium andraeanum，aao92352.1。
29.图2为aamyb6在红掌中的表达情况和花青素苷含量；其中，图2中a为品种
‘
紫公主’不同组织；图2中b为不同品种的肉穗花序；数据表示为平均值
±
标准差(n＝3)；不同小写字母表示在p＝0.05水平下，duncan's多重比较的显著性差异。
30.图3为aamyb6在拟南芥原生质体中的亚细胞定位；其中：gfp，绿色荧光蛋白信号场；rfp，红色荧光蛋白场，表示融合了核定位信号序列的mkate信号；chl，叶绿体自发荧光；merged，绿色荧光、红色荧光、叶绿体自发荧光以及明场的叠加；标尺，10μm。
31.图4为转基因烟草的表型、目标基因检测及花青素苷含量；图4中a为转基因烟草表型及花丝中提取的花青素苷；图4中b为花瓣和花丝中aamyb6基因相对表达量；图4中c为花瓣和花丝中花青素苷含量；图4中d为花丝中与花青素苷生物合成相关的内源转录因子基因的相对表达量；数据表示为平均值
±
标准差(n＝3)；在p＝0.01的显著性水平上转基因株系
与对照(wt)的差异显著；wt：野生型植株；l1、l2、l3：过表达aamyb6的3个t1代烟草株系，每个株系两株。
32.图5为转基因烟草花瓣和花丝中酶基因的相对表达量；log2(相对于野生型的变化倍数)；l1、l2、l3：过表达aamyb6的3个t1代烟草株系，每个株系两株。
具体实施方式
33.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
34.实施例1、红掌aamyb6基因的克隆
35.以红掌品种anthurium
‘
粉冠军
’‘
pink champion’(购自广州花卉研究中心)佛焰苞为材料，利用天根多糖多酚植物总rna提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号dp441)法提取总rna，使用thermo scientific反转录试剂盒(购自赛默飞世尔科技，产品目录号k1622)合成cdna，以此为模板。设计全长cdna扩增引物：f1:5'
‑
tccagctatgccatgtgtactt
‑
3'(序列表中序列4)；r1:5'
‑
gggatatgatatcggagtggtca
‑
3'(序列表中序列5)。用上述模板进行扩增，该反应程序为95℃3min,95℃30s,60℃30s,72℃1min30s,30个循环，72℃10min。所用dna聚合酶为vazyme 2
×
phanta max master mix(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)。扩增体系：mix 10μl，正向引物和反向引物各0.5μl，模板cdna 0.5μl，用无菌水补足总体系20μl。扩增产物进行1％琼脂糖电泳，回收目的条带并克隆到pmd 18
‑
t载体(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为6011)上测序。
36.结果见图1。获得的基因全长的cdna为941bp，如序列表中序列2所示；其中序列2自5’末端第56位到第907位为开放阅读框，开放阅读框部分为852bp，如序列表中序列3所示；其编码序列表中序列1所示的蛋白，序列1由284个氨基酸序列组成，此氨基酸序列具有保守的r2r3重复序列，与玉米和蝴蝶兰等参与花青素苷合成的r2r3
‑
myb具有较高的保守性，c
‑
端拥有保守的调控单子叶植物花青素苷合成r2r3
‑
myb转录因子所共有的“kax[k/r]c[s/t]”的基序。经序列比对，aamyb6与红掌aamyb1、aamyb4、aamyb5和玉米zmc1的氨基酸同源性分别为41.8％、46.0％、40.8％、46.0％(图1)。将该基因命名为aamyb6，将其编码的蛋白命名为aamyb6。
[0037]
实施例2、aamyb6基因在红掌不同组织中以及不同品种肉穗花序中的表达水平和花青素苷含量的比较
[0038]
将红掌花(包括佛焰苞和肉穗花序)发育分为5个阶段，阶段s1，花(包括佛焰苞和肉穗)全部从保护鞘中抽出；阶段s2，花梗伸长但是佛焰苞紧包在花序外；阶段s3，佛焰苞半卷曲状态；阶段s4，佛焰苞刚全部展开；阶段s5，肉穗花序中下部2/3处颜色变白。将叶片分为嫩叶期(深红色叶片松弛卷曲)、成熟期(绿色的成熟叶)。采集品种
‘
紫公主’(
‘
rapido’)(购自广州花卉研究中心)花序发育s2阶段的佛焰苞、肉穗花序和花梗；嫩叶、成熟叶和叶柄；幼嫩的红色根和成熟的绿色根。采集品种
‘
紫公主’(肉穗花序紫色)、
‘
维他’(购自广州花卉研究中心)(
‘
vitara’，肉穗花序红色)、
‘
粉冠军’(
‘
pink champion’，肉穗花序粉色)、
‘
卫城’(购自广州花卉研究中心)(
‘
acropolis’，肉穗花序黄色)和
‘
热情’(购自广州花卉研
cell system for transient gene expression analysis.nature protocol，2(7)：1565
–
1572.)，以pbwa(v)hs
‑
glosgfp空载体为对照。利用nikon c2
‑
er激光共聚焦显微镜观察荧光信号(参考文献：li c h，qiu j，huang s r，yang g s，yin j m.2019.ectopic expression of the anthurium andraeanum(hort.)r2r3
‑
myb genes aamyb4 and aamyb5 enhance the flower color in transgenic tobacco.plant cell tissue organ culture，139：105
‑
117.)。
[0048]
结果见图3。绿色荧光蛋白(gfp)在未融合其它蛋白的情况下，普遍分散在细胞中。n末端融合了aamyb6蛋白的gfp荧光信号与核定位marker的rfp信号重合。表明aamyb6具有核定位功能。
[0049]
实施例4、红掌aamyb6基因表达载体的构建和功能分析
[0050]
以已测序的pmd18
‑
t
‑
aamyb6质粒为模板，用引物对：f3:5
′‑
ggagaggacacgctcgagatgccatgtgtacttgaggtgac
‑3′
、r3：5
′‑
ttaaagcaggactctagaaaaccattggagatcttgattgacag
‑3′
，利用vazyme 2
×
phanta max master mix酶扩增出包含完整orf和终止密码子的aamyb6 dna片段，经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。过表达载体part
‑
cam质粒(来源于陕西博瑞德生物科技有限公司)用xhoi和xbai双酶切，反应体系：10
×
buffer 4.0μl,xhoi 1μl,xbai 1μl,part
‑
cam质粒1μg，37℃2.5h，用pcr产物回收试剂盒回收载体片段。使用pcr一步定向克隆试剂盒(购于近岸蛋白质科技有限公司，上海)将aamyb6 dna与载体重组。将10μl连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞在加有壮观霉素(sm 50μg/ml)的lb平板上涂板，37℃培养过夜后进行菌斑pcr鉴定。经测序鉴定确认连接无误后，提取构建好的获得part
‑
cam
‑
aamyb6重组过表达载体。采用液氮冻融法将质粒转入农杆菌gv3101菌株(购自上海唯地生物技术有限公司，产品号ac1001)，检测目的基因获得阳性菌株。采用叶盘法转化烟草(nicotiana tabacum cv.sr1)(烟草种子购自陕西博瑞德生物科技有限公司)，烟草转基因方法参见文献：：horsch r b，fry j，hoffmann n，neidermeyer j，rogers s g，fraley r t.1988.leaf disc transformation.in:gelvin sb,schilperoort ra(eds)plant molecular biology manual.dordrecht：kluwer academic publishers：1
–
9.)，经过诱导愈伤组织、分化再生、生根壮苗、移栽和阳性植株鉴定，获得含有aamyb6编码基因的烟草植株。将烟草移入温室，经过自花授粉、结实、播种、目标基因pcr筛选获得含有aamyb6编码基因的烟草t1代植株。在温室中养护至开花后，测定花瓣中的相关基因表达量以及花青素苷(参考文献li c,qiu j,yang g,et al.isolation and characterization of a r2r3
‑
myb transcription factor gene related to anthocyanin biosynthesis in the spathes of anthurium andraeanum(hort.).plant cell reports,2016,35(10):2151
‑
2165.和bariola p a，green m i j.1999.regulation of s
‑
like ribonuclease levels in arabidopsis.antisense inhibition of rns1 or rns2 elevates anthocyanin accumulation.plant physiology,119(1)：331.)以野生型烟草sr1品种植株为对照。
[0051]
结果见图4
‑
图5。t1代转基因烟草花器官中花丝靠近花药一端因积累了花青素苷而变红，野生型烟草花丝通体为白色。转基因烟草花瓣颜色与野生型相比无明显变化(图4中a)。qrt
‑
pcr结果显示，转基因株系烟草花瓣和花丝中均检测到了aamyb6的表达，且3个株系花丝中该外源基因的表达量显著高于花瓣(t检验，p＝0.007<0.01)(图4中b)。转基因烟
草花丝中的花青素苷含量显著高于野生型烟草，但花瓣的花青素含量与野生型相比差异不显著(图4中c)。
[0052]
与野生型烟草相比，在3个株系的烟草花丝中，花青素苷合成途径的后期基因ntf3
′
h、ntdfr、ntans、ntufgt表达量大幅上调，这些基因在野生型烟草花丝中几乎检测不到表达(图5)。此外，与野生型相比，转基因烟草花丝中调控花青素苷合成的转录因子基因ntan2和ntan1b均得到了大幅上调(图4中d)。
[0053]
上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。