一种牙周致病菌感染标记物检测卡板和试剂盒的制作方法

1.本实用新型涉及生物化学检测技术领域，具体涉及一种牙周致病菌感染标记物检测卡板和试剂盒。


背景技术：

2.阿尔茨海默症(ad)是一种中枢神经退行性疾病，占老年性痴呆中的60
‑
70％。临床主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状。特征性病理改变为β淀粉样蛋白(aβ)沉积形成的细胞外老年斑，tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结(nft)，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。
3.ad的确切病因和病机仍未完全阐明，但都认同ad的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果，感染是主要的环境因素，中枢神经系统的炎症反应在ad的发生和发展中起着关键作用。
4.已明确与ad相关的感染病原体包括病毒、细菌、螺旋体等，其中最重要且研究较透彻的是牙周致病菌，主要包括牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis，pg)、齿垢密螺旋体(treponema denticola，td)、伴放线聚集杆菌(aggregatibacter actinomycetemcomitans，aa)、中间普氏菌(prevotella intermedia，pi)、具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum，fn)等，这些菌都是革兰阴性厌氧菌，正常情况下可以菌斑生物膜的形式定植在牙菌斑处。当牙周局部免疫防御屏障破坏而感染时，牙周致病菌大量增殖，并释放牙龈蛋白酶等多种毒性产物，刺激局部中性粒细胞渗出，破坏牙龈和牙周组织，引起牙龈炎和牙周炎(合称牙周病)。病原菌及其毒性产物、中性粒细胞释放的胞外酶、炎症介质等可通过多种机制，引起中枢神经系统特征性病理改变。因此，牙周致病菌感染是ad发生的启动因子和病情恶化的促进因子。牙周致病菌感染的控制，对ad预防、ad病情发展控制措施的制订有重大指导意义。
5.通常临床通过神经精神症状特点、特征性病理标记物对ad进行诊断。例如通过对aβ、tau蛋白的检测来支持ad的诊断，通过对特定基因(如淀粉样蛋白前体蛋白基因(app)、早老素1、2基因突变(ps1、ps2))的检测来判定家族性早发型ad的风险高低，通过对载脂蛋白apoe4基因的检测来作为散发性ad的确诊依据。
6.牙周致病菌的感染标志物包括病原菌标志物、炎症标志物两类。
7.病原菌标记物包括病原菌个体、基因、毒性产物三类。病原菌个体主要包括上述pg、td、aa、pi、fn等牙周致病菌，常规通过培养法检测，但不能反映感染菌数量；致病菌特有基因可通过pcr检测，但也不能反映感染菌数量；致病菌的毒性产物包括脂多糖、蛋白酶、凝集素a等，其中的牙龈蛋白酶(gingipain)为牙周致病菌共有，可采用酶化学法、免疫学法检测，可定量，可直接反映感染菌数量。
8.炎症标记物包括中性粒细胞和炎症介质两种。中性粒细胞形态特殊，含特异酶(如弹性蛋白酶、碱性磷酸酶、髓过氧化物酶、β
‑
葡萄糖苷酶、胶原酶(基质金属蛋白酶
‑
8，mmp
‑
8))，可通过形态学观察法、酶化学法、免疫学法等定量检测，标本中的中性粒细胞数量能直
接反映局部炎症的严重程度。炎症介质包括细胞因子(如白细胞介素
‑
1β(interleukin
‑
1β，il
‑
1β)、肿瘤坏死因子
‑
α(tumor necrosis factor
‑
α，tnf
‑
α)、γ
‑
干扰素(interferon
‑
γ，ifn
‑
γ))和前列腺素e2(prostaglandine2，pge2)等，可用采用免疫学方法检测，可定量，能间接反映局部炎症程度。
9.当前ad的实验室检查仅限于特征性病理标志物检查，未对ad相关的感染标志物进行检测，检测结果仅对该病的诊断有支持作用，对该病的预防、病情发展的控制等治疗措施制订缺乏指导意义。


技术实现要素：

10.本实用新型的目的是针对上述问题，提供一种牙周致病菌感染标记物检测卡板和试剂盒。
11.本实用新型为了实现其目的，采用的技术方案是：
12.一种牙周致病菌感染标记物检测卡板，包括卡板，所述卡板上设置有至少一组检测孔，所述检测孔中均设置有包被液载体，每组检测孔由两个检测孔组成，其中一个检测孔的包被液载体上包被髓过氧化物酶显色反应底物，另一个检测孔的包被液载体上包被牙龈蛋白酶显色反应底物。
13.优选地，所述包被液载体为滤纸片。将滤纸片放入检测孔中，直接将显色反应底物溶液滴至滤纸片上后冷冻真空干燥，使用方便，容易操作。
14.优选地，所述检测孔为凹槽，检测孔的容积为100～150ul，该容积适合于临床样本检测用，检测结果准确可靠。
15.优选地，所述卡板上还设置有两个空白对照孔，其中一个空白对照孔的包被液载体上包被髓过氧化物酶显色反应底物，另一个空白对照孔的包被液载体上包被牙龈蛋白酶显色反应底物。空白对照孔的设置让检测结果更可信。
16.优选地，所述卡板上还设置有髓过氧化物酶质控孔、牙龈蛋白酶质控孔，所述髓过氧化物酶质控孔的包被液载体上也包被髓过氧化物酶显色反应底物，所述牙龈蛋白酶质控孔的包被液载体上也包被牙龈蛋白酶显色反应底物。质控孔的设置使得检测结果更加可靠，防止由于检测卡板的失效导致的结果误判。
17.优选地，还包括与所述卡板配合的盖板，隔绝其它污染源。
18.优选地，所述卡板上设置有字母和/或数字和/或文字标注以区分不同的检测孔。方便操作者区分不同检测孔的检测对象、准确记录检测结果。
19.一种牙周致病菌感染标记物检测试剂盒，包括上述任一所述的检测卡板，还包括外置的样本洗脱液瓶、牙龈蛋白酶显色液瓶和髓过氧化物酶显色液瓶，所述样本洗脱液瓶中装有样本洗脱液，所述牙龈蛋白酶显色液瓶中装有牙龈蛋白酶显色液，所述髓过氧化物酶显色液瓶中装有髓过氧化物酶显色液。
20.优选地，还包括髓过氧化物酶质控品瓶、牙龈蛋白酶质控品瓶，所述髓过氧化物酶质控品瓶中装有辣根过氧化物酶，所述牙龈蛋白酶质控品瓶中装有胰蛋白酶。
21.进一步地，所述样本洗脱液为三羟甲基氨基甲烷、3
‑
吗啉丙磺酸、4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸、哌嗪
‑
n,n'
‑
二(2
‑
乙磺酸)或2
‑
(n
‑
吗啡啉)乙磺酸的水溶液；
22.所述髓过氧化物酶显色反应底物为氧化酶和氧化偶联底物对的底物之一，所述髓
过氧化物酶显色液为氧化酶对应的底物和氧化偶联底物对的另外一个底物的水溶液；
23.所述牙龈蛋白酶显色反应底物为特异底物baee、乙醇氧化酶、过氧化物酶和氧化偶联底物对的底物之一，对应的牙龈蛋白酶显色液为氧化偶联底物对的另外一个底物的水溶液；
24.或者，所述牙龈蛋白酶显色反应底物为特异底物bana，对应的牙龈蛋白酶显色液为重氮盐显色剂的水溶液。
25.检测对象牙龈蛋白酶和髓过氧化物酶的显色反应底物和显色液均能直接商购获得。
26.本实用新型的有益效果是：该检测卡板和试剂盒可以同时检测病原菌标志物、炎症标志物两类牙周致病菌的感染标志物，可以同时检测出是否感染病菌并且是否发生炎症，判断是否有牙周病，并且可以判断病原菌标志物、炎症标志物的相对含量，从而判断牙周病严重程度，非常适合于临床牙周病快速诊断。通过对病原菌标志物的检测，可以进行ad罹患风险评估，以便提前干预，预防ad发生；还可以进行ad病情进展关联指标评估，制订相应措施，防止病情恶化。本实用新型的检测卡板和试剂盒使用方便，结果判断容易，结果准确可靠，非常适合临床快速检测。
附图说明
27.图1是本实用新型的结构示意图；
28.其中，图上标记：卡板1、检测孔2、包被液载体3、空白对照孔4、髓过氧化物酶质控孔5、牙龈蛋白酶质控孔6。
具体实施方式
29.下面结合实施例对本实用新型作进一步说明，但并不因此而限制本实用新型。
30.下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
31.实施例1牙周致病菌感染标记物检测卡板
32.如图1所示的一种牙周致病菌感染标记物检测卡板，主体为卡板1，所述卡板1上设置有至少一组检测孔2，所述检测孔2中均设置有包被液载体3，每组检测孔2由两个检测孔2组成，其中一个检测孔2的包被液载体3上包被髓过氧化物酶显色反应底物，另一个检测孔2的包被液载体3上包被牙龈蛋白酶显色反应底物。
33.在一些实施方案中，所述包被液载体3为滤纸片。
34.在一些实施方案中，所述检测孔2为凹槽，检测孔2的容积为100～150ul。
35.在一些实施方案中，所述卡板1上还设置有两个空白对照孔4，其中一个空白对照孔4的包被液载体3上包被髓过氧化物酶显色反应底物，另一个空白对照孔4的包被液载体3上包被牙龈蛋白酶显色反应底物。
36.在一些实施方案中，所述卡板1上还设置有髓过氧化物酶质控孔5、牙龈蛋白酶质控孔6，所述髓过氧化物酶质控孔5的包被液载体3上也包被髓过氧化物酶显色反应底物，所述牙龈蛋白酶质控孔6的包被液载体3上也包被牙龈蛋白酶显色反应底物。
37.在一些实施方案中，本实用新型的检测卡板还包括与所述卡板1配合的盖板。
38.在一些实施方案中，所述卡板1上设置有字母和/或数字和/或文字标注以区分不
同的检测孔2。
39.实施例2牙周致病菌感染标记物检测试剂盒
40.一种牙周致病菌感染标记物检测试剂盒，包括实施例1的检测卡板，还包括外置的样本洗脱液瓶、牙龈蛋白酶显色液瓶和髓过氧化物酶显色液瓶，所述样本洗脱液瓶中装有样本洗脱液，所述牙龈蛋白酶显色液瓶中装有牙龈蛋白酶显色液，所述髓过氧化物酶显色液瓶中装有髓过氧化物酶显色液。
41.在一些实施方案中，本实用新型的牙周致病菌感染标记物检测试剂盒还包括髓过氧化物酶质控品瓶、牙龈蛋白酶质控品瓶，所述髓过氧化物酶质控品瓶中装有辣根过氧化物酶，所述牙龈蛋白酶质控品瓶中装有胰蛋白酶。
42.在一些实施方案中，所述样本洗脱液为三羟甲基氨基甲烷、3
‑
吗啉丙磺酸、4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸、哌嗪
‑
n,n'
‑
二(2
‑
乙磺酸)或2
‑
(n
‑
吗啡啉)乙磺酸的水溶液；
43.所述髓过氧化物酶显色反应底物为氧化酶和氧化偶联底物对的底物之一，所述髓过氧化物酶显色液为氧化酶对应的底物和氧化偶联底物对的另外一个底物的水溶液；
44.所述牙龈蛋白酶显色反应底物为特异底物baee、乙醇氧化酶、过氧化物酶和氧化偶联底物对的底物之一，对应的牙龈蛋白酶显色液为氧化偶联底物对的另外一个底物的水溶液；
45.或者，所述牙龈蛋白酶显色反应底物为特异底物bana，对应的牙龈蛋白酶显色液为重氮盐显色剂的水溶液。
46.实施例3
47.配制下面的试剂供各实施例中的检测实验使用。
48.一、样本洗脱液的制备
49.按以下组方配制样本洗脱液
[0050]2‑
(n
‑
吗啡啉)乙磺酸(mes)
ꢀꢀ
4.26g
[0051]
去离子水
ꢀꢀ
100ml
[0052]
调节ph至6.5放置2
‑
8℃冷藏备用。
[0053]
二、微孔板微孔包被和对应显色液配制
[0054]
牙龈蛋白酶显色反应底物可以使用牙龈蛋白酶显色反应底物i或牙龈蛋白酶显色反应底物ii，髓过氧化物酶显色反应底物可以使用髓过氧化物酶显色反应底物i或者髓过氧化物酶显色反应底物ii。
[0055]
按照表1所示配制显色反应底物和对应的显色液：
[0056]
表1
[0057][0058][0059]
本实用新型的牙周致病菌感染标记物检测卡板采用空白微孔板制作，空白微孔板也称反应卡，可以从市面上直接购买得到，反应卡上设置有多个放置滤纸片的凹槽(即微孔，用作检测孔)，使用前先在凹槽中装入滤纸片，滤纸片用于附着包被液。
[0060]
用包被液对微孔板的微孔进行包被：包被液包被微孔时，10ul包被液/孔，加入包被液后冷冻真空干燥，铝箔袋密封包装，放置2
‑
8℃冷藏备用。不同的微孔可以包被不同的包被液，以检测牙龈蛋白酶或者髓过氧化物酶。
[0061]
实施例4对质控菌株
‑
牙龈卟啉单胞菌菌株牙龈蛋白酶的检测
[0062]
1.菌种扩增：
[0063]
a)阳性菌株：牙龈卟啉单胞菌菌株复苏后，转种于哥伦比亚血琼脂平板，置厌氧袋，37℃恒温培养5
‑
7天，直至培养基表面出现黑色菌落；
[0064]
b)阴性菌株：甲型链球菌菌株复苏后，转种于哥伦比亚血琼脂平板，置37℃恒温培养24
‑
48小时，直至培养基出现草绿色溶血菌落；
[0065]
2.制备0.5个麦氏浊度单位菌液：分别刮取阳性菌株、阴性菌株放入无菌生理盐水中，调整浓度至0.5个麦氏浊度单位；
[0066]
3.制备不同浓度菌液：按0.5麦氏浊度单位相当于1.5*108cfu/ml计算，用样本洗脱液分别稀释制备1*107、1*106、1*105、1*104、1*103、1*102、1*101、0cfu/ml菌液；
[0067]
4.检测：用包被有牙龈蛋白酶显色反应底物i的微孔板进行试验，第1
‑
9孔分别加1.5*108、1*107、1*106、1*105、1*104、1*103、1*102、1*101、0cfu/ml菌液30ul，然后加入牙龈蛋白酶显色反应底物i对应的显色液30ul；
[0068]
4. 37℃恒温培养箱放置20min，观察微孔颜色变化。
[0069]
结果显示，除0cfu/ml无颜色变化外，其余微孔由无色变紫红色，颜色深浅与菌液浓度成正比，菌液浓度为1*103cfu/ml时肉眼即可见明显的颜色变化。
[0070]
实施例5对牙龈蛋白酶质控酶
‑
胰蛋白酶的检测
[0071]
1.制备浓缩质控液：用样本洗脱液配制256u/ml的胰蛋白酶酶液；
[0072]
2.制备不同浓度的质控品：用样本洗脱液对浓缩质控液进行稀释，制备胰蛋白酶酶浓度分别为浓度为256u/ml、128u/ml、64u/ml、32u/ml、16u/ml、8u/ml、4u/ml、2u/ml、1u/ml、0.5u/ml的质控品；
[0073]
3.用包被有牙龈蛋白酶显色反应底物ii的微孔板进行试验，第1
‑
9孔分别加浓度为64u/ml、32u/ml、16u/ml、8u/ml、4u/ml、2u/ml、1u/ml、0.5u/ml、0u/ml的质控品30ul，牙龈蛋白酶显色反应底物ii对应的显色液30ul；
[0074]
4. 37℃恒温培养箱放置20min，观察微孔颜色变化。
[0075]
结果显示，除0u/ml孔无颜色变化外，其余微孔由橙红色变为蓝黑色，颜色深浅与胰蛋白酶浓度成正比，酶浓度2u/ml时肉眼即可见明显的颜色变化。由于胰蛋白酶和牙龈蛋白酶采用本实用新型的检测试剂盒能引起一样的显色反应，因此在生产中，可以用市售商品胰蛋白酶作为本实用新型的牙龈蛋白酶检测试剂的质控酶，用于检测本实用新型的牙龈蛋白酶检测试剂是否有效。
[0076]
实施例6对中性粒细胞髓过氧化物酶质控酶
‑
辣根过氧化物酶的检测
[0077]
1.制备浓缩质控液：用样本洗脱液配制256u/ml的辣根过氧化物酶酶液；
[0078]
2.制备不同浓度的质控品：用样本洗脱液对浓缩质控液进行稀释，制备辣根过氧化物酶浓度分别为256u/ml、128u/ml、64u/ml、32u/ml、16u/ml、8u/ml、4u/ml、2u/ml、1u/ml、0.5u/ml、0u/ml的质控品；
[0079]
3.用包被髓过氧化物酶显色反应底物i的微孔板进行试验，第1
‑
9微孔分别加64u/ml、32u/ml、16u/ml、8u/ml、4u/ml、2u/ml、1u/ml、0.5u/ml、0u/ml的质控品30ul，髓过氧化物酶显色反应底物i对应的显色液30ul；
[0080]
4. 37℃恒温培养箱放置20min，观察微孔颜色变化。
[0081]
结果显示，除0u/ml孔无颜色变化外，其它微孔均由无色变蓝紫色，颜色深浅与辣根过氧化物酶浓度成正比，1u/ml时肉眼可见明显的颜色变化。由于辣根过氧化物酶和髓过氧化物酶采用本实用新型的检测试剂盒能引起一样的显色反应，因此在生产中，可以用市售商品辣根过氧化物酶作为本实用新型的髓过氧化物酶检测试剂的质控酶用于检测本实用新型的髓过氧化物酶检测试剂是否有效。
[0082]
实施例7对牙周病患者牙菌斑样本的检测
[0083]
1.专科医师用无菌牙签采集已确诊牙周病患者龈下牙菌斑样本，放入样本管内；
[0084]
2.加入样本洗脱液200ul，将带样牙签在样本洗脱液内反复碾压振洗等方式使牙菌斑脱落，再用洗液枪吸嘴将牙菌斑吹打分散得到待测样本液；
[0085]
3.检测：用第1、3孔包被有牙龈蛋白酶显色反应底物i，第2、4孔包被有髓过氧化物酶显色反应底物ii的微孔板进行试验，使用未加采集样本的样本洗脱液作为对照，每个微孔加入30ul待测样本液或者对照，然后加入30ul对应的显色液。37℃恒温培养箱放置20min，观察微孔颜色变化。
[0086]
结果显示，牙周病患者样本液在牙龈蛋白酶检测孔(第1、3孔)呈紫红色，髓过氧化
物酶检测微孔(第2、4孔)呈蓝色，非牙周病患者样本液及对照孔无颜色变化。