一种香菇单核体培养基、其制备方法及应用与流程

1.本发明涉及培养基制备技术领域，具体而言，涉及一种香菇单核体培养基、其制备方法及应用。


背景技术：

2.香菇(lentinula edodes)是我国食用菌最重要的栽培品种之一，在食用菌中香菇的产量最高，市场需求量是很大的。随着香菇产业的快速发展，消费者对香菇的品质要求也愈来愈高，而高品质的菌株主要依赖于香菇育种工作，其中单核体菌株是重要的香菇育种材料。
3.但是，单核体菌株存在生长缓慢，菌丝易老化等问题，后续的育种以及原生质体制备等存在一定的困难。传统的pda培养基培养香菇单核体菌丝时，菌丝生长缓慢，易老化。
4.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种香菇单核体培养基及其制备方法，旨在有效减缓香菇单核体菌丝衰老，提高菌丝生长速度。
6.本发明的另一目的在于提供香菇单核体培养基在培养香菇单核体中的应用。
7.本发明是这样实现的：
8.第一方面，本发明提供一种香菇单核体培养基，通过pda培养基本体和木屑粉混合而得，pda培养基本体与木屑粉的质量比为100:1
‑
2。
9.第二方面，本发明提供前述实施方式中香菇单核体培养基的制备方法，包括：将pda培养基本体和木屑粉按比例混合。
10.第三方面，本发明提供前述实施方式中的香菇单核体培养基在培养香菇单核体中的应用。
11.本发明具有以下有益效果：发明人通过在传统pda培养基上添加特定量的木屑粉，能够有效减缓香菇单核体菌丝衰老，提高菌丝生长速度，从而有效改善后续育种速度缓慢的情况。
12.需要补充的是，发明人通过对木屑粉的加入量做进一步优化，得到的培养基相比于已报道的pda 木屑滤汁培养基日均生长速度增长18％～102％，菌丝生长浓密，可以缩短育种周期，具有非常好的市场应用价值。
附图说明
13.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
14.图1为单核体菌株y0107
‑
12
‑
2采用对比例2和对比例1中培养基的效果对比图；
15.图2为单核体菌株y0107
‑1‑
3采用对比例2和对比例1中培养基的效果对比图；
16.图3为单核体菌株y0040
‑1‑
2采用对比例2和对比例1中培养基的效果对比图；
17.图4为单核体菌株y0040
‑
3采用对比例2和对比例1中培养基的效果对比图；
18.图5为单核体菌株fjwf
‑4‑
3采用对比例2和对比例1中培养基的效果对比图；
19.图6为单核体菌株fjwf
‑4‑
4采用对比例2和对比例1中培养基的效果对比图；
20.图7为单核体菌株y0107
‑
12
‑
2采用对比例2和实施例3中培养基的效果对比图；
21.图8为单核体菌株y0107
‑1‑
3采用对比例2和实施例3中培养基的效果对比图；
22.图9为单核体菌株y0040
‑1‑
2采用对比例2和实施例3中培养基的效果对比图；
23.图10为单核体菌株y0040
‑
3采用对比例2和实施例3中培养基的效果对比图；
24.图11为单核体菌株fjwf
‑4‑
3采用对比例2和实施例3中培养基的效果对比图；
25.图12为单核体菌株fjwf
‑4‑
4采用对比例2和实施例3中培养基的效果对比图。
具体实施方式
26.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
27.本发明实施例提供一种香菇单核体培养基的制备方法，发明人通过在传统pda培养基上添加特定量的木屑粉，能够有效减缓香菇单核体菌丝衰老，提高菌丝生长速度，从而有效改善后续育种速度缓慢的情况。
28.在实际操作过程中，主要包括如下步骤：
29.s1、木屑前处理
30.前处理主要是对木屑进行烘干、粉碎、灭菌得到木屑粉，通过烘干去除水分，经粉碎后过30目筛得到粒径符合要求的木屑粉，再通过灭菌防止引入其他干扰菌。
31.具体地，本发明实施例所采用的木屑粉是栗树木屑。
32.需要补充的是，前处理步骤可以根据需要选择，若原料为粒径符合要求的木屑粉，且为无菌状态，则可以不进行前处理。
33.具体地，木屑粉进行灭菌是在115
‑
125℃的条件下灭菌2
‑
4h。灭菌温度可以为115℃、120℃、125℃等，也可以为以上相邻温度值之间的任意值；灭菌时间为2h、3h、4h等，也可以为以上相邻时间值之间的任意值。
34.s2、pda培养基本体的制备
35.pda培养基本体的制备过程包括：将马铃薯在水中煮制并过滤得到马铃薯滤液，将马铃薯滤液与葡萄糖和琼脂混合。以质量份数计，pda培养基本体的原料包括马铃薯180
‑
220份、葡萄糖15
‑
25份和琼脂15
‑
25份，马铃薯、葡萄糖和琼脂控制在上述范围内为宜。其中，马铃薯煮制步骤中，控制每升水对应马铃薯的质量为190
‑
210g，以更好地控制最终培养基中有效成分的含量。
36.为进一步促进香菇单核体生长，发明人对pda培养基本体的配料进行了进一步优化。以质量份数计，pda培养基本体的原料包括马铃薯190
‑
210份、葡萄糖18
‑
23份和琼脂18
‑
20份。
37.在可选的实施方式中，在马铃薯滤液与葡萄糖和琼脂混合之后，补充水量，以控制葡萄糖在pda培养基本体中的浓度为18
‑
22g/l。具体地，补充水量可以根据情况进行，精确控制各组分的在培养基中的含量。
38.s3、混合
39.将pda培养基本体和木屑粉按比例混合，控制pda培养基本体与木屑粉的质量比为100:1
‑
2，通过进一步控制木屑粉的用量以更适合于香菇单核体的生长，提升香菇单核体的生长速率。
40.为进一步提升香菇单核体菌丝生长速率，发明人对木屑粉的用量做了进一步优化：在优选的实施例中，pda培养基本体与木屑粉的质量比为100:1.5
‑
2；更优选为100:2。
41.s4、后处理
42.将木屑和pda培养基本体混合之后的混合培养基进行再次灭菌，以防止培养基中存在其他菌种，影响香菇单核体的生长。
43.在一些实施例中，再次灭菌是在121
‑
125℃的条件下灭菌20
‑
25min。具体地，灭菌温度可以为121℃、123℃、125℃等，也可以为以上相邻温度值之间的任意值；灭菌时间为20min、23min、25min等，也可以为以上相邻时间值之间的任意值。
44.本发明实施例还提供一种香菇单核体培养基，其可以通过以上制备方法制备而得，培养基中存在常规的pda培养基的成分，还存在木屑粉，适合于香菇单核体使用，促进香菇单核体生长。
45.本发明实施例还提供上述香菇单核体培养基在培养香菇单核体中的应用，以减缓香菇单核体菌丝衰老，提高菌丝生长速度，从而有效改善后续育种速度缓慢的情况。
46.本发明实施例提供的香菇单核体培养基是一种低成本、快捷、简单、实用的香菇单核体培养基，本方法可用于香菇单核体菌丝的培养，还可广泛应用于其它木腐性真菌的培养，具有较好的实用意义，以期为香菇产业的杂交育种提供参考。
47.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
48.实施例1
49.本实施例提供一种香菇单核体培养基的制备方法，包括如下步骤：
50.(1)取碎木屑烘干后粉碎过30目筛，在121℃条件下灭菌3h，备用；
51.(2)取200g马铃薯切块，置于800ml蒸馏水中煮沸至马铃薯块软而不烂，8层纱布过滤得滤液；
52.(3)将马铃薯滤液与20g葡萄糖、20g琼脂混合，加水补足1l，获得pda培养基本体；
53.(4)将步骤(1)灭菌后的木屑粉添加至步骤(3)pda培养基本体中，摇晃均匀，然后在121℃的条件下20min灭菌，控制木屑粉的加入量与pda培养基本体的质量比为1:100(木屑粉的加入量大致为10g)；
54.(5)灭菌后的培养基倒在90mm
×
90mm培养皿中，过夜放置后使用。
55.实施例2
56.本实施例提供一种香菇单核体培养基的制备方法，与实施例1的区别仅在于：步骤(4)中控制木屑粉的加入量与pda培养基本体的质量比为1.5:100(木屑粉的加入量大致为15g)。
57.实施例3
58.本实施例提供一种香菇单核体培养基的制备方法，与实施例1的区别仅在于：步骤(4)中控制木屑粉的加入量与pda培养基本体的质量比为2:100(木屑粉的加入量大致为20g)。
59.需要说明的是，pda培养基本体中的原料用量可以控制在本发明所限定的范围内即可，不限于实施例1，其他仅在本技术所限定的范围内改变pda培养基本体配方的实施例与实施例1效果大致相同，在此不做一一列举。
60.对比例1
61.本对比例提供一种香菇单核体培养基的制备方法，与实施例1的区别仅在于：步骤(4)中控制木屑粉的加入量与pda培养基本体的质量比为0.5:100(木屑粉的加入量大致为0.5g)。
62.对比例2
63.本对比例提供一种香菇单核体培养基的制备方法，其采用pda培养基本体 木屑滤汁得到，具体步骤如下：
64.取90g木屑置于400ml水中煮沸20分钟，四层纱布过滤得滤液1；取200g去皮马铃薯置于400ml水中煮沸，过滤得滤液2；将滤液1与滤液2混合定容至1000ml,依此添加20g葡萄糖、20g琼脂混合，在121℃的条件下灭菌40min。
65.试验例1
66.测试本发明实施例和对比例中制备得到的培养基对香菇单核体的培养效果，测试方法如下：
67.为了比较单核体菌株在不同类型培养基、不同木屑添加比例培养基上的生长速度，取8mm单核体菌株fjwf
‑4‑
4、fjwf
‑4‑
3、y0040
‑
3、y0040
‑1‑
2、y0107
‑
12
‑
2、y0107
‑1‑
3接种块置于实施例和对比例中所制备的培养基中，25℃恒温培养箱避光培养11天，每个样品3个平行，除培养基以外，对照组其它条件和实验组均相同。
68.其中，fjwf
‑4‑
4和fjwf
‑4‑
3为分离出的一组单核体，以采摘的香菇为原料采用如下方法进行分离：从双核体fjwf
‑
4通过原生质体方法分离获得获得一对亲和的单核体fjwf
‑4‑
4和fjwf
‑4‑
3。
69.y0040
‑
3和y0040
‑1‑
2为分离出的一组单核体，以采摘的香菇为原料采用如下方法进行分离：从双核体y0040通过原生质体方法分离获得获得一对亲和的单核体y0040
‑
1和y0040
‑1‑
2。
70.y0107
‑
12
‑
2和y0107
‑1‑
3为分离出的一组单核体，以采摘的香菇为原料采用如下方法进行分离：从双核体y0107通过原生质体方法分离获得一对亲和的单核体y0107
‑
12
‑
2和y0107
‑1‑
3。
71.测试结果见附图1
‑
12，附图1
‑
6为对比例2和对比例1的培养基的培养效果对比(左为对比例2，右为对比例1)，附图7
‑
12为对比例2培养基和实施例2的培养效果对比(左为对比例2，右为实施例3)。
72.通过对比可知，本发明实施例中提供的培养基对单核体培养基的培养效果相比于对比例2中的培养基能够显著提升生长速率，效果非常明显。
73.试验例2
74.测试本发明实施例和对比例中制备得到的培养基对香菇单核体的培养效果，测试方法参照试验例1，测试菌丝的半径生长长度结果见表1；计算不同比例木屑粉添加量培养基菌丝生长长度与对照组菌丝生长的增长率结果见表2。
75.其中，半径生长长度的计算方法如下：单核体菌株培养至第5d开始十字划线并标记菌丝生长尖端的最长半径生长位置。待菌丝生长至第11d，在菌丝生长尖端第二次标记最长半径生长位置。测量第二次标记与第一次标记间距即为菌丝6d生长长度，每个平板围绕十字中心记录4个半径，最终计算1d菌丝的半径生长长度，见表1(单位：mm)。
76.不同比例木屑粉添加量培养基菌丝生长长度与对照组菌丝生长的增长率按照如下公式计算：
77.增长率＝(实验组菌丝平均生长半径
‑
对照组平均生长长度)/对照组平均生长长度*100)，对照组为对比例2的培养基，结果见下表2(单位：％)。
78.表11d菌丝的半径生长长度测试结果
79.编号对比例2对比例1实施例1实施例2实施例3fjwf
‑4‑
42.532.892.922.952.99fjwf
‑4‑
32.353.723.853.984.25y0040
‑1‑
23.323.474.014.054.04y0040
‑
31.211.722.032.202.44y0107
‑
12
‑
21.822.692.792.723.04y0107
‑1‑
31.862.612.883.103.39
80.表2相比于对比例2的增长率测试结果
[0081][0082][0083]
从表1和表2的测试数据可知，本发明实施例中提供的培养基可以提供香菇单核体菌丝生长所需要的天然木质纤维素，有效减缓菌丝的老化，提高菌丝生长速度。本发明实施例中提供的培养基相比于对比例2中的培养基，日均生长速度增长18％～102％，木屑粉添加量2％最佳。
[0084]
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。