一株不吸水链霉菌DL5C及其在防治白粉病中的应用的制作方法

一株不吸水链霉菌dl5c及其在防治白粉病中的应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及一株不吸水链霉菌dl5c及其在防治白粉病中的应用。


背景技术：

2.橡胶树白粉病(rubber powdery mildew)是由橡胶粉孢(oidium heveae steinm)侵染引起的，病原菌为害橡胶树生长的所有阶段，侵染嫩叶、嫩芽、嫩梢、花序。嫩梢受害后枯死，引起色二孢属真菌(diplodia)和可可球二孢(botryodiplodia theobromae)进一步侵染。花序受害导致落花，种子失收。环境条件适宜时，病原菌不断侵染先后长出的新叶，使得植株的蒸腾作用和呼吸作用加强，光合作用显著降低，连续落叶，最后耗尽储藏养分，树势衰落，胶乳产量大减，给橡胶生产造成巨大的经济损失，是橡胶树的重要病害之一。
3.如何防治橡胶树白粉病已经成为橡胶生产中亟待解决的重要问题之一。目前橡胶树白粉病的防治方法主要为农业防治、化学防治以及抗病品种选育，但是农业防治效果慢，可用于防但很难用于治；化学药剂的使用不仅受天气限制，而且易使病原菌产生抗药性，对环境及作业者都具有危害性；橡胶树白粉病是典型的气候型病害，优良抗病品种选育周期长，且受抗风害、寒害、其他病虫害和产量高低的限制，难以选育优良抗病品种。
4.微生物是筛选优良生物农药的重要来源之一，放线菌是一种能够产生种类繁多的生物活性物质，具有良好的抑制植物病原菌生长和促进植物生长作用的重要微生物资源，目前世界上已有许多直接利用拮抗放线菌防治病害的成功事例，但是国内外尚无利用生防放线菌防治橡胶树白粉病的相关报道。
5.因此，提供一株不吸水链霉菌dl5c及其在防治白粉病中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一株不吸水链霉菌dl5c及其在防治白粉病中的应用。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一株不吸水链霉菌(streptomyces ahygroscopicus)dl5c，其保藏编号为cctcc no：m 2021360，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称cctcc，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2021年04月12日，分类命名为不吸水链霉菌dl5c，streptomyces ahygroscopicus dl5c。
9.进一步，所述的不吸水链霉菌dl5c在防治白粉病中的应用。
10.进一步，所述的不吸水链霉菌dl5c的发酵培养液在防治白粉病中的应用。
11.进一步，所述发酵培养基配方为：1l发酵培养基中含玉米粉30.0g、酵母浸膏1.0g、nacl 0.25g、caco
3 0.25g，蒸馏水补至1l。
12.进一步，所述发酵条件为：培养基装液量为150/500ml，起始ph为7.0，接种量为7％，培养温度为28℃，培养时间为5d。
13.进一步，所述的不吸水链霉菌dl5c在防治橡胶树尖孢炭疽病菌、胶孢炭疽病菌、橡胶树白根病菌、橡胶树褐根病菌中的应用。
14.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株不吸水链霉菌dl5c及其在防治白粉病中的应用，拮抗放线菌dl5c(streptomyces ahygroscopicus)培养条件简单，成本较低，对橡胶树白粉病具有良好的防治效果。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
16.图1附图为本发明菌株dl5c对4种病原真菌的抑制作用；
17.其中，a
‑
d，培养基四周接种放线菌，中央接种病原菌，a：尖孢炭疽菌；b：胶孢炭疽菌；c：橡胶白根病菌；d：橡胶褐根病菌；a
‑
d，只接种病原菌，a：尖孢炭疽菌；b：胶孢炭疽菌；c：橡胶白根病菌；d：橡胶褐根病菌；
18.图2附图为本发明菌株dl5c的菌落形态图；
19.图3附图为本发明菌株dl5c的形态特征；
20.其中，a：基内菌丝；b：气生菌丝；c：孢子丝；
21.图4附图为本发明菌株dl5c的系统发育树；
22.图5附图为本发明菌株dl5c发酵培养液对不同指示菌的抑制作用；
23.其中，a为在不加发酵液的pda培养基上接种橡胶树尖孢炭疽病菌；a为在含有发酵培养液的平板上接种橡胶树尖孢炭疽病菌；b为在不加发酵液的pda培养基上接种胶孢炭疽病菌；b为在含有发酵培养液的平板上接种胶孢炭疽病菌；c为在不加发酵液的pda培养基上接种橡胶树褐根病菌；c为在含有发酵培养液的平板上接种橡胶树褐根病菌；d为在不加发酵液的pda培养基上接种橡胶树白根病菌；d为在含有发酵培养液的平板上接种橡胶树白根病菌；
24.图6附图为本发明菌株dl5c抑菌物质对热处理的稳定性；
25.图7附图为本发明菌株dl5c抑菌物质对酸碱处理的稳定性；
26.图8附图为本发明菌株dl5c抑菌物质对紫外处理的稳定性；
27.图9附图为本发明菌株dl5c抑菌物质传代培养的稳定性。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例1菌株dl5c的分离鉴定
30.1)菌株分离
31.采用平板梯度稀释法，将供试土壤(云南省打洛农场橡胶垦区土壤)风干磨碎，称
取1g细土样于99ml无菌水中，振荡混匀，梯度稀释，取200μl稀释液涂布于含重铬酸钾(终浓度为50μg/ml)的高氏一号培养基上，28℃倒置培养4
‑
7d，待菌落长出后，根据菌落形态、色泽、气生菌丝有无、色素产生情况等特点进行编号，进行多次划线分离纯化，纯化培养后的放线菌于甘油管保存、备用。
32.高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，氯化钠0.5g，硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.5g，硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g，蒸馏水1000ml，ph 7.2
‑
7.4。
33.2)拮抗放线菌的筛选
34.为获得具有广谱抗性的菌株，利用橡胶树主要病害病原菌筛选拮抗菌；但由于橡胶树白粉病病原菌不能离体培养，因此未采用橡胶树白粉病病原菌。
35.利用平板对峙培养法，将橡胶树主要病害病原菌菌饼(直径为5mm，作为指示菌)接种于pda培养基中央，培养基四周接种放线菌，28℃培养5d后观测抑菌直径，筛选出有拮抗作用的放线菌。试验设3个重复，以只接种病原菌为对照。
36.pda培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15
‑
20g，蒸馏水1000ml，自然ph。
37.通过平板对峙法从云南主要植胶区土壤中筛选到一株对橡胶树尖孢炭疽病菌(colletotrichum acutatum)、胶孢炭疽病菌(colletotrichum gloeosporioides)、橡胶树白根病菌(rigidoporus lignosus)、橡胶树褐根病菌(phellinus noxius)均有较好抑制效果的放线菌，抑菌率分别为58.35
±
0.55％、60.97
±
0.56％、60.03
±
1.95％、74.00
±
0.28％(图1)。将该放线菌编号为dl5c。
[0038][0039]
3)菌株鉴定
[0040]
(1)菌株的形态特征、培养特征及生理生化特性采用常规微生物鉴定方法及其推荐的培养基，菌株形态观察在leica dm6b显微镜下进行。
[0041]
①
dl5c菌株在高氏一号培养基上生长良好，菌落形态见图2。菌落规则圆形，起初为白色，之后气生菌丝由白色逐渐变为浅灰褐色，干燥不透明、边缘有白斑。基内菌丝体无色。在显微镜下观察，气生菌丝发达，基内菌丝无横隔，不断裂；气生菌丝上都有孢子形成，孢子丝3～6圈松敞螺旋形。孢子丝分枝，形成圈数不等的螺旋，螺旋多松敞。菌株dl5c的形态特征见图3。
[0042]
②
培养特征培养基：国际链霉菌计划(isp)推荐的7种培养基，蛋白胨酵母膏琼脂(isp1)、酵母膏
‑
麦芽膏琼脂(isp2)、燕麦琼脂(isp3)、无机盐淀粉琼脂(isp4)、甘油天冬酰胺琼脂(isp5)、蛋白胨酵母膏铁盐琼脂(isp6)、酪氨酸琼脂(isp7)，用于放线菌dl5c培养特征的观察，结果见表1。
[0043]
表1拮抗放线菌dl5c的培养特征
[0044][0045]
表1结果表明，dl5c在国际链霉菌计划建议的7种培养基上生长良好且均无吸水现象。
[0046]
③
生理生化试验培养基：石蕊牛奶、明胶液化、淀粉水解、产h2s、产黑色素和卵黄培养基；碳、氮源利用培养基：普戈二氏培养基。
[0047]
参照shirking与gottlieb(shirking eb，gottlieb d，1966)的方法对菌株dl5c进行生理生化鉴定，结果见表2。
[0048]
表2拮抗放线菌dl5c生理生化特征
[0049]
[0050][0051]
表2结果表明：拮抗放线菌dl5c能使硝酸盐还原，能产生氧化酶、过氧化氢酶、脲酶、脂酶，能使明胶液化，能使牛奶凝固与胨化，但不能水解淀粉，不能使纤维素分解，不能分解色氨酸，甲基红试验及v
‑
p试验均呈阴性，不能产生h2s、黑色素，不能生长在nacl含量大于7％的培养基上；能利用d
‑
半乳糖、d
‑
葡萄糖、d
‑
甘露醇、肌醇、d
‑
山梨醇、d
‑
木糖、鼠李糖、果糖、乳糖和蔗糖，但不能利用l
‑
阿拉伯糖；可以利用l
‑
精氨酸、l
‑
丝氨酸、l
‑
苯基丙氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、缬氨酸、组氨酸、氯化铵作为氮源，却不能利用l
‑
半胱氨酸。
[0052]
(2)分子鉴定：菌株基因组提取采用细菌基因组提取试剂盒并参照相关步骤，应用16s rrna通用引物进行pcr扩增，扩增产物送上海华大基因科技有限公司进行测序。
[0053]
16s rrna通用引物的引物序列如下：
[0054]
16sf:5
’‑
agagtttgatcctggctcag
‑3’
；seq id no.1；
[0055]
16sr:5
’‑
aaggaggtgatccagccgca
‑3’
；seq id no.2。
[0056]
将测序所得序列提交ncbi数据库，应用blast程序与数据库中已有的16s rrna序列进行相似性比较分析，利用megax neighbor
‑
joining法进行聚类分析和系统进化树构建。
[0057]
菌株dl5c基因组用16s rrna基因通用引物进行序列扩增并测序得到1492bp的序列，如seq id no.3所示。
[0058]
gagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacgatgaacct
ccttcgggaggggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgcccttcactctgggacaagccctggaaacggggtctaataccggatatgacacggggtcgcatgatctccgtgtggaaagctccggcggtgaaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtgaggtagtggctcaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgagagtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcgagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcacgtcggatgtgaaagcccggggcttaaccccgggtctgcattcgatacgggcaggctagagttcggtaggggagatcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctgggccgatactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgttgggaactaggtgtgggcgacattccacgtcgtccgtgccgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatacaccggaaaaccgtggagacacggtcccccttgtggtcggtgtacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgttctgtgttgccagcatgcctttcggggtgatggggactcacaggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtcttgggctgcacacgtgctacaatggccggtacaatgagctgcgataccgcgaggtggagcgaatctcaaaaagccggtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagttgctagtaatcgcagatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcccaaccccttgtgggagggaatcgtcgaaggtgggactggcgattgggacgaactcgtaacaaggtagccgta；seq id no.3。
[0059]
将序列seq id no.3提交到genbank(登录号为mw785574)，在ncbi、ezbiocloud数据库中进行同源性比对，选取相似性较高且有效发表的菌株构建系统发育树，见图4。从聚类结果可以看出菌株dl5c与不吸水链霉菌(streptomyces ahygroscopicus)聚在同一个分支上，且序列相似性为99.93％。综合菌株形态、生理生化特征、16s rrna系统发育分析结果，将菌株dl5c鉴定为不吸水链霉菌(streptomyces ahygroscopicus)。
[0060]
实施例2
[0061]
1)种子液的制备
[0062]
土壤放线菌dl5c于高氏一号固体培养基上28℃培养5d进行活化，挑取单菌落接种于高氏一号液体培养基，装液量为100ml/500ml，28℃、160rpm振荡培养5d，获得种子液。
[0063]
2)抑菌物质的发酵
[0064]
按7％(体积分数)的接种量接种于液体发酵培养基(1l发酵培养基中含玉米粉30.0g、酵母浸膏1.0g、nacl 0.25g、caco
3 0.25g，蒸馏水补至1l)中，培养基装液量为150/500ml，起始ph为7.0；每一处理3个重复，28℃、160rpm振荡培养5d，获得发酵培养液。
[0065]
3)抑菌活性的测定：
[0066]
将dl5c发酵培养液3900r/min离心10min，上清液用0.22μm的微孔滤器过滤，取1ml滤液与99ml冷却至60℃的已灭菌pda培养基混匀制成平板，分别接入直径为5mm预先活化好的指示菌块(橡胶树尖孢炭疽病菌、胶孢炭疽病菌、橡胶树白根病菌、橡胶树褐根病菌)，以不加发酵液的pda培养基为对照，设置3个重复，28℃培养7d测量菌落生长直径，并计算抑菌率。结果见表3和图5。
[0067][0068]
表3
[0069]
植物病原真菌菌株橡胶树尖孢炭疽病菌胶孢炭疽病菌橡胶树褐根病菌橡胶树白根病菌抑菌率(％)82.65
±
0.6857.91
±
1.2591.76
±
0.5861.93
±
1.50
[0070]
实施例3拮抗放线菌dl5c抑菌物质稳定性研究
[0071]
抑菌率测定方法同实施例2的步骤3)，以直径为5mm预先活化好的橡胶树尖孢炭疽病病原菌为指示菌块；发酵培养液为实施例2步骤2)制得的。
[0072]
(1)热稳定性：取拮抗放线菌dl5c发酵培养液于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、121℃作用30min后冷却至室温，通过测定橡胶树尖孢炭疽病病原菌的抑菌率，确定热稳定性；结果见图6。
[0073]
图6结果表明，当作用温度大于70℃时，抑菌效果减弱，但仍有23％的抑菌率，说明拮抗放线菌dl5c抑菌物质具有一定的热稳定性。
[0074]
(2)酸碱稳定性：取拮抗放线菌dl5c发酵培养液将ph调至2、4、6、8、10、12、14，作用1h然后调回自然ph，通过测定抑菌率确定酸碱稳定性；结果见图7。
[0075]
图7结果表明，拮抗放线菌dl5c发酵培养液在中性偏酸的条件下，抑菌活性较好，而在偏碱性条件下，抑菌活性减弱，但不显著，说明对酸碱具有一定的耐受性。
[0076]
(3)紫外线稳定性：取拮抗放线菌dl5c发酵培养液于紫外灯(30w)下作用1、2、3h，通过测定抑菌率确定紫外线稳定性；结果见图8。
[0077]
图8结果表明，经紫外线处理后，拮抗放线菌dl5c发酵培养液的抑菌率急剧下降，抑菌率都在5％以下，说明抑菌物质不具备紫外稳定性。
[0078]
(4)遗传稳定性：将拮抗放线菌dl5c转接10代，并分别测定抑菌率，确定其遗传稳定性；结果见图9。
[0079]
图9结果表明，将菌株dl5c转接10代，每一代的抑菌活性均为50％左右，无显著性差异，说明拮抗放线菌dl5c具有较好的遗传稳定性。
[0080]
实施例4拮抗放线菌发酵培养液对橡胶树白粉病的田间防效评价
[0081]
以橡胶增殖圃中云研77
‑
2品系为试验材料，设置3个处理，每一处理10棵树，随机取100片叶按中华人民共和国农业行业标准(ny/t 1089
‑
2015)橡胶树白粉病测报技术规程进行分级，将放线菌dl5c发酵培养液按100倍稀释，喷施于白粉病侵染的橡胶树叶片上，以湿而不滴为宜；对照喷施清水，7d后观察效果，根据施药前病情分级、施药后病情分级情况，计算病情指数及相对防治效果，结果见表4。
[0082]
表4生防菌剂对橡胶树白粉病的防效
[0083][0084]
将放线菌dl5c发酵液的100倍稀释液喷施于橡胶树白粉病叶片上，7天后观察结果，发现施用生防菌剂后橡胶树叶片上的新鲜活动斑明显消褪，且叶片不再受病原菌侵染产生新鲜活动斑，相对防效为80.93％，具有较好的防治效果。
[0085]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。
对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。