一种稀土三元配合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于医学检测材料技术领域，尤其涉及一种稀土三元配合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.近几十年来，镧系发光由于其优越的发光性能和独特的结构广泛应用于固体发光、分子检测、生物成像等领域中。然而，限于无机纳米晶和镧系化合物的结构较为单一且难得，镧系元素的研究受到严重阻碍。稀土配位聚合物的诞生打破了这个僵局，把稀土元素的研究领域进行了有效的扩大。其中，镧系配合物(lncps)是镧系离子与有机配体通过配位键自组装而成，在微纳米尺度上高度地结合了无机材料与有机材料的特性。相比起镧系化合物，lncps具有更高的稳定性能与便捷的加工特性，可以对配体进行选择从而达到理想的性能。到目前为止lncps在离子检测、小分子检测领域中均有大量研究，而在大分子领域却较为罕见。
3.金属有机配合物(mocps)已经被证明是dna和蛋白质荧光检测的优秀传感平台。适配体作为一类能与特定目标物进行高亲和力和强特异性结合的寡链dna(ssdna)，通常有20
‑
100个核苷酸长。适配体的高亲和力和强特异性源于其具有较大表面积和大量受体结合位点且空间三维构型易形成螺旋、发卡、茎环、凸环、三叶草和假结等结构，能够与靶标物质基于范德华力、氢键和疏水作用等紧密结合，并可以区分结构类似物质。指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，selex)方案和其他体外选择相关组合方法可以获得适配体。由于其高选择性和合成简单的特点，适配体已广泛应用于分析检测、生物医疗诊断等各领域中。
4.肿瘤标志物是人体存在异常细胞发生癌变时大量存在的生物大分子，通常被认为是医疗系统中肿瘤检测的有效方法，更快地识别到人体指标异常代表着生命体拥有更大的概率被治愈。随着人们生活质量的提升，人口老龄化问题越来越突出，同时环境污染和食品安全问题日益影响人类生活，导致人类患癌几率逐年上升。前列腺癌是前列腺上皮性恶性肿瘤，是男性常见的癌肿，进展缓慢，在大于65岁的男性，发病猛增，因此前列腺癌是威胁50岁以上男性生命的主要癌症。前列腺特异性抗原(psa)是前列腺癌的肿瘤标志物，正常男性血液中含量低于4ng/ml。因此，发展高灵敏度的psa浓度检测方法至关重要，也顺理成章地成为了当下研究热点之一。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明第一个方面提出一种稀土三元配合物，该稀土三元聚合物具有富含共轭电子体系的结构，能有效吸附单链dna。
6.本发明的第二个方面提出了一种上述稀土三元配合物的制备方法。
7.本发明的第三个方面提出了一种上述稀土三元配合物的应用。
8.根据本发明的第一个方面，提出了一种稀土三元配合物，包括镧系金属、苹果酸和邻菲罗啉，所述镧系金属通过所述苹果酸桥联所述邻菲罗啉。
9.本发明中，邻菲罗啉能提供富含共轭电子体系的结构，利用π
‑
π堆积增强稀土三元配合物的堆叠作用，且所形成的稀土配合带正电荷，使其能有效吸附具有大量碱基且带负电荷的单链dna。
10.在本发明的一些实施方式中，所述稀土三元配合物为粒径是1μm～10μm的球状聚合物。
11.在本发明的一些优选的实施方式中，所述镧系金属、所述苹果酸和所述邻菲罗啉的摩尔比为(1.5～2.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)。
12.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述镧系金属选自eu
3
、tb
3
、ce
3
中的任意一种；进一步的，所述镧系金属为eu
3
。
13.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述苹果酸为选自左旋苹果酸、右旋苹果酸、消旋苹果酸的至少一种；进一步优选为消旋苹果酸。
14.根据本发明的第二个方面，提出了一种稀土三元配合物的制备方法，包括以下步骤：可溶性镧系金属盐、苹果酸和邻菲罗啉溶于有机溶剂和水的混合溶液中，加热反应，冷却后得到稀土三元配合物。
15.在本发明的一些实施方式中，所述可溶性镧系金属盐选自eu(no3)3·
6h2o、tb(no3)3·
6h2o、ce(no3)3·
6h2o中的任意一种。
16.在本发明的一些优选的实施方式中，所述混合溶液中有机溶剂和水的体积比为(0.5～3)：(0.5～3)。
17.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙醚、乙腈中的至少一种。
18.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述加热反应的温度为120℃～200℃，时间为5h～24h。
19.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述稀土三元配合物的制备方法还包括在所述冷却后对产物进行提纯，所述提纯采用离心、沉淀、洗涤进行。
20.根据本发明的第三个方面，提出了一种检测试剂盒，包括所述稀土三元配合物和适配体(pa)，所述适配体的序列为：5
′‑
ttattaaagctcgccatcaaatagc
‑3′
。
21.前列腺特异性抗原的适配体(pa)是一种单链dna，能有效吸附在稀土三元配合物(lncps)表面，形成lncps
‑
pa复合物。在加入前列腺特异性抗原(psa)后，pa与psa特异性结合，从lncps表面脱附存在于lncps周围，从而导致各lncps间距减小。由于发光材料微观结构之间距离拉近，造成稀土中心离子易于产生浓度淬灭效应或交叉弛豫过程，其中一个稀土离子组份的能量传递给相邻离子，因此影响到自身激发态能量的辐射，最终使lncps的荧光猝灭，从而达到检测psa的目的。
22.在本发明的一些实施方式中，所述稀土三元配合物与所述适配体的质量摩尔比为1：(3～20)mg/umol。
23.在本发明的一些优选的实施方式中，所述检测试剂盒还包括tris
‑
hcl缓冲液，进一步优选的，所述tris
‑
hcl缓冲液的浓度为(1～8)mg/ml。
24.本发明的有益效果为：
25.1.本发明的稀土三元配合物具有富含共轭电子体系的结构，能有效吸附单链dna。
26.2.本发明将稀土三元配合物与适配体结合起来，通过荧光光谱的变化可对目标大分子前列腺特异性抗原进行强特异性识别，达到高分辨的检测目的。
27.3.本发明稀土三元配合物的制备方法，方法简单、操作方便，合成速度快，产物稳定。
28.4.本发明中水热法合成的稀土配合物粒径均匀且能耗较低，合成实验可重复性极高。
29.5.本发明利用的稀土三元配合物有效地结合了无机有机的优势，提高了稀土发光效率，psa的检测限可达0.5ng/ml。
30.6.本发明稀土三元配合物的制备方法中反应无任何有害气液体产生，符合绿色安全环保理念。
附图说明
31.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
32.图1为本发明实施例1中稀土三元配合物(lncps)的元素分析图。
33.图2为本发明实施例1中稀土三元配合物(lncps)的紫外光谱图。
34.图3为本发明实施例1中稀土三元配合物(lncps)的红外光谱图。
35.图4为本发明实施例1中稀土三元配合物(lncps)的激发光谱与发射光谱。
36.图5为lncps利用pa检测psa的实验示意图。
37.图6为lncps(a)、lncps pa(b)、lncps pa psa(c)的电镜扫描图。
38.图7为lncps、lncps pa、lncps pa psa的zeta电位图。
39.图8为lncps、lncps pa、lncps pa psa的荧光发射光谱图(a)和lncps pa(左)、lncps pa psa(右)在276nm激发波长下照射下的实物图(b)。
40.图9为lncps pa在加入不同浓度psa后的荧光发射光谱图。
41.图10为lncps pa加入0
‑
40ng/ml psa后的荧光线型图。
具体实施方式
42.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
43.下列实施例中，tris
‑
hcl缓冲液的ph为7.4，包含150mm nacl,5mm kcl,和5mm mgcl2。
44.pa使用液的配置方法如下：(pa由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)(1)向合成好的pa中加入36μl tris
‑
hcl缓冲液配置成pa储存液。(2)取2μl pa储存液加入198μl tris
‑
hcl缓冲液配置成200μl 1μm pa使用液。
45.psa(psa由生工生物工程(上海)股份有限公司提取)系列浓度分别为：0ng/ml；1ng/ml；2ng/ml；5ng/ml；10ng/ml；20ng/ml；40ng/ml；60ng/ml；80ng/ml；100ng/ml；150ng/ml；200ng/ml。
46.实施例1
47.本实施例制备了一种稀土三元配合物，具体过程为：
48.分别称量0.064g消旋苹果酸(dl
‑
ma)、0.092g邻菲罗啉(phen)、0.1g六水合硝酸铕(eu(no3)3
·
6h2o)溶于3ml乙醇与3ml水的混合溶剂中，搅拌20min使其完全溶解。将上述溶液转移至25ml四氟乙烯反应釜中，150℃加热12h后自然冷却至室温。将所得材料进行高速离心(转速为10000r/min，离心时间为10min)，收集沉淀，并用去离子水洗涤三次后进行真空干燥，得到稀土三元配合物(lncps)。
49.对制得的稀土三元配合物(lncps)进行结构鉴定，分别进行元素分析测试、紫外光谱测试、光谱测试、激发光谱和发射光谱测试(发射光谱的激发波长为276nm)，结果分别如图1～4所示。
50.从图1可看出，eu、c、o、n元素含量高，且无其他杂质元素。表明本发明制得的稀土三元配合物纯度高。。
51.从图2可看出，395nm处出现eu的特征吸收峰。表明成功合成含铕的稀土三元配合物。
52.从图3可看出，该物质有
‑
oh、
‑
c
‑
h、
‑
c
‑
n、
‑
c＝c等基团，对应配体dl
‑
ma、phen，表明稀土三元配合物由上述配体与金属中心配位而成。
53.从图4可看出，荧光发射光谱在593nm、615nm、653nm、702nm处出现峰位，对应eu
3
的荧光发射光谱，说明该稀土三元配合物的发光中心为eu
3
。
54.实施例2
55.如图5所示，本实施例对实施例1制得的稀土三元配合物对psa的特异性识别作用进行研究，具体过程为：
56.取实施例1制得的稀土三元配合物(lncps)分散在tris
‑
hcl缓冲溶液中，得到浓度为5mg/ml的lncps使用液，取1μl 3mg/ml的lncps使用液与5μl 1μmol/l荧光素标记前列腺特异性抗原适配体(ned
‑
pa)使用液在室温下孵化30分钟，离心，收集沉淀，并用tris
‑
hcl缓冲溶液洗涤两次，离心后取沉淀。所得沉淀中加入100μl浓度为200ng/ml的psa使用液，孵化两小时后检测其荧光。
57.对实施例2研究过程中涉及的稀土三元配合物(lncps)、稀土三元配合物
‑
适配体(lncps pa)、以及稀土三元配合物
‑
适配体
‑
前列腺特异性抗原(lncps pa psa)进行电镜扫描，结果如图6所示。其中，a为lncps的电镜扫描图，b为lncps pa的电镜扫描图，c为lncps pa psa的电镜扫描图。
58.从图6可看出，lncps呈现出球状，其尺寸较为均匀，大小相对集中在3μm；对比a、b两图，可见pa吸附在lncps表面，对比b、c两图，可见加入psa后，lncps间距变小，发生部分重叠，甚至表面结构由规则球形变为不规则球形。
59.进一步地，对实施例2研究过程中涉及的lncps、lncps pa、lncps pa psa进行zeta电位分析(马尔文纳米粒径电位分析仪)，结果如图7所示。
60.从图7可看出，lncps加入pa之后电位从9.3mv变为
‑
3.1mv，继续加入psa后电位回升到1.2mv，说明在psa诱导下，复合物所带电荷量下降，静电排斥作用力减小。
61.更进一步地，对实施例2研究过程中涉及的lncps、lncps pa、lncps pa psa进行荧光发射光谱分析，结果如图8所示。其中，a为lncps、lncps pa、lncps pa psa的荧光发射光
谱图。b为lncps pa(左)、lncps pa psa(右)在276nm激发波长下照射下的实物图。
62.从图8可看出，在276nm激发波长下照射下，lncps pa在615nm处有较强的荧光，继续加入psa后615nm处的荧光强度显著下降，表明psa导致了荧光猝灭。b为实物图，可见lncps pa显示出粉红色的荧光，而加入psa后，荧光淬灭，lncps的特征荧光明显下降。
63.实施例3
64.本实施例进一步对实施例1制得的稀土三元配合物对psa的特异性识别作用进行分析，具体过程按照实施例2的方法，区别仅在于lncps pa所加入的psa浓度分别为0ng/ml；1ng/ml；2ng/ml；5ng/ml；10ng/ml；20ng/ml；40ng/ml；60ng/ml；80ng/ml；100ng/ml；150ng/ml；200ng/ml。荧光发射光谱图如图9所示。
65.从图9可看出，随着加入psa的量增加，lncps pa所显示的荧光逐渐减小，表明psa可导致lncps pa的荧光发生猝灭。
66.进一步选取所加入的psa浓度分别为0ng/ml；1ng/ml；2ng/ml；5ng/ml；10ng/ml；20ng/ml；40ng/ml的荧光强度，制得荧光线型图，结果如图10所示。
67.从图10可看出，r2＝0.9956，线性较好；psa的检测限为0.5ng/ml(基于3σ/斜率计算)。
68.上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。