一种共价光交联多肽、共价光交联多肽自组装形成的胶原蛋白仿生材料的制作方法

1.本发明属于胶原蛋白仿生材料技术领域，具体涉及一种共价光交联多肽、共价光交联多肽自组装形成的胶原蛋白仿生材料。


背景技术：

2.作为细胞外基质的主要组成部分，胶原蛋白因其独特的结构和良好的生物学性能，在再生医学和组织工程领域被广泛应用。但是天然胶原蛋白存在提取质量难以控制、病毒隐患、免疫源性等问题，极大地限制了天然胶原蛋白材料的应用。因此，构建新的策略来仿生天然胶原蛋白的结构和功能，是生物材料领域里的研究热点。在分子水平上序列特殊设计的胶原多肽，具有易于合成和修饰、生物相容性好、无病毒传播隐患等优点，在胶原蛋白仿生领域越来越受关注。
3.目前已经开发了多种非共价相互作用的胶原多肽自组装策略来构建胶原蛋白的仿生材料，包括π
‑
π堆积作用、金属离子
‑
配体相互作用、阳离子
‑
π相互作用、两亲性多肽等。π
‑
π堆积作用一般需要引入非天然氨基酸，金属离子
‑
配体相互作用和阳离子
‑
π相互作用则需要依赖金属离子的驱动。同时，两亲性多肽的自组装，大多通过加入疏水性的合成高分子材料来介导组装的进行。这些策略中应用的非天然氨基酸、金属离子、合成的高分子材料，可能存在生物相容性、降解性等潜在风险。不仅如此，非共价的胶原多肽组装体在环境发生变化时，容易发生微/纳米结构的不良转变，极大的影响了其稳定性和生物功能，限制了非共价胶原多肽材料的临床应用。
4.相对于非共价自组装策略，共价自组装体系通过形成不可逆键，可以得到极为稳定的组装体结构。目前蛋白质的共价交联主要通过化学交联剂来进行，但是交联剂的选择性不佳，并存在残留毒性的风险。通过半胱氨酸之间二硫键的形成也被用来介导多肽自组装，然而二硫键形成具有自发性，使得其组装体系难以控制。因此，亟待开发新的共价自组装策略，来构建胶原蛋白仿生材料。
5.发明人意外发现，一种共价光交联多肽、共价光交联多肽自组装形成的胶原蛋白仿生材料。所述共价光交联多肽为能够形成三重螺旋结构的多肽序列，包括两端包含连续的tyr的t1和t2结构域，包含重复的gly
‑
xaa
‑
yaa和/或gly
‑
xaa
‑
xaa的n1和n2结构域，以及n1和n2结构域之间的含有tyr的m结构域。所述中间结构域m包含至少一个gly
‑
tyr
‑
yaa序列。所述共价光交联多肽，在光催化下自组装形成可以仿生天然胶原蛋白结构和功能的仿生材料。中间结构域m可方便引入具有生物功能的多肽片段，不影响自组装的进行，具有广泛的适用性和灵活性；而且制备的仿生材料生物相容性好，可以作为细胞生长的支架材料，在组织工程和再生医学领域具有广泛的应用前景。


技术实现要素：

6.针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种共价光交联多肽、共价光交
联多肽自组装形成的胶原蛋白仿生材料。所述共价光交联多肽，在光催化下，自组装形成可以仿生天然胶原蛋白结构和功能的仿生材料。所述胶原蛋白仿生材料生物相容性好，稳定性高，可以作为细胞生长的支架材料，促进细胞黏附。
7.本发明的目的通过以下技术方案实现：
8.第一方面，本发明提供了一种共价光交联多肽，所述共价光交联多肽为能够形成三重螺旋构象的多肽序列，所述多肽序列具有下式(ⅰ)所示结构：
9.t1
‑
n1
‑
m
‑
n2
‑
t2
ꢀꢀ
式(ⅰ)；
10.其中，所述m包含至少1个gly
‑
tyr
‑
yaa，和/或gly
‑
xaa
‑
tyr；
11.所述n1包含至少3个重复的gly
‑
xaa
‑
yaa，和/或gly
‑
xaa
‑
xaa；
12.所述n2包含至少3个重复的gly
‑
xaa
‑
yaa，和/或gly
‑
xaa
‑
xaa；
13.所述t1包含至少2个连续的tyr；
14.所述t2包含至少2个连续的tyr；
15.所述xaa和yaa为任一不同的氨基酸。
16.优选地，所述共价光交联多肽还包括具有生物活性功能的多肽片段。
17.优选地，所述具有生物活性功能的多肽片段包括如下所示的序列：
18.gly
‑
phe
‑
hyp
‑
gly
‑
glu
‑
arg；
19.和/或gly
‑
arg
‑
hyp
‑
gly
‑
glu
‑
arg；
20.和/或gly
‑
leu
‑
hyp
‑
gly
‑
glu
‑
arg；
21.和/或gly
‑
met
‑
hyp
‑
gly
‑
glu
‑
arg；
22.和/或gly
‑
ala
‑
hyp
‑
gly
‑
glu
‑
arg；
23.和/或gly
‑
leu
‑
lys
‑
gly
‑
glu
‑
asn；
24.和/或gly
‑
leu
‑
hyp
‑
gly
‑
glu
‑
asn；
25.和/或gly
‑
val
‑
met
‑
gly
‑
phe
‑
hyp；
26.和/或gly
‑
pro
‑
leu
‑
gly
‑
ile
‑
ala
‑
gly
‑
ile
‑
thr
‑
gly
‑
ala
‑
arg；
27.和/或gly
‑
pro
‑
gln
‑
gly
‑
ile
‑
ala
‑
gly
‑
gln
‑
arg
‑
gly
‑
val
‑
val；
28.和/或gly
‑
pro
‑
gln
‑
gly
‑
leu
‑
leu
‑
gly
‑
ala
‑
hyp
‑
gly
‑
ile
‑
leu；
29.和/或gly
‑
pro
‑
gln
‑
gy
‑
leu
‑
ala
‑
gly
‑
gln
‑
arg
‑
gly
‑
ile
‑
val；
30.和/或gly
‑
arg
‑
hyp
‑
gly
‑
lys
‑
arg
‑
gly
‑
lys
‑
gln
‑
gly
‑
gln
‑
lys；
31.和/或gly
‑
leu
‑
hyp
‑
gly
‑
gln
‑
arg
‑
gly
‑
glu
‑
arg。
32.优选地，所述具有生物活性功能的多肽片段为gly
‑
phe
‑
hyp
‑
gly
‑
glu
‑
arg。
33.优选地，所述xaa为pro；所述yaa为hyp。
34.优选地，所述n1与n2相同。
35.优选地，所述n1和n2为(gly
‑
pro
‑
hyp)
n
，或(gly
‑
pro
‑
pro)
n
，所述n为大于等于3的任一整数。
36.优选地，所述n为3到5的任一整数，包括3，或4，或5。
37.优选地，所述t1和t2相同。
38.优选地，所述t1和t2均为(tyr)
m
，所述m为大于等于2的任一整数。
39.优选地，所述m为2，或3，或4，或5。
40.优选地，所述共价光交联多肽的序列如下所示：
41.(tyr)2(gly
‑
pro
‑
hyp)3(gly
‑
tyr
‑
hyp)(gly
‑
pro
‑
hyp)3(tyr)2；
42.(tyr)2(gly
‑
pro
‑
hyp)4(gly
‑
tyr
‑
hyp)(gly
‑
pro
‑
hyp)4(tyr)2；
43.(tyr)2(gly
‑
pro
‑
hyp)5(gly
‑
tyr
‑
hyp)(gly
‑
pro
‑
hyp)5(tyr)2；
44.(tyr)5(gly
‑
pro
‑
hyp)4(gly
‑
tyr
‑
hyp)(gly
‑
pro
‑
hyp)4(tyr)5；
45.(tyr)2(gly
‑
pro
‑
hyp)4(gly
‑
tyr
‑
hyp)(gly
‑
pro
‑
hyp)(gly
‑
phe
‑
hyp
‑
gly
‑
glu
‑
arg)(gly
‑
pro
‑
hyp)4(tyr)2；
46.(tyr)2(gly
‑
pro
‑
hyp)4(gly
‑
tyr
‑
hyp)(gly
‑
pro
‑
hyp)(gly
‑
tyr
‑
hyp)(gly
‑
pro
‑
hyp)4(tyr)2。
47.第二方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的共价光交联多肽在制备胶原蛋白仿生材料中的应用。
48.第三方面，本发明提供了一种由上述第一方面所述的共价光交联多肽自组装形成的胶原蛋白仿生材料。
49.本发明的有益效果是：
50.(1)本发明提供了一种新的共价光交联多肽自组装体系；
51.(2)所述共价光交联多肽，在光催化下，自组装形成可以仿生天然胶原蛋白结构和功能的仿生材料，为仿生胶原蛋白提供了一种新的多肽设计策略；
52.(3)本发明所述的共价光交联多肽，相对于非共价自组装多肽，具有超高的稳定性，不受外界ph或溶剂的影响；
53.(4)本发明所述的共价光交联多肽完全由天然氨基酸组成，生物相容性好，制备的胶原蛋白仿生材料，可以促进细胞黏附，有广泛的临床应用潜力；
54.(5)本发明所述的共价光交联多肽的中间结构域m方便引入其它氨基酸序列，具有广泛的灵活性和适用性，并且易于加入具有生物功能的序列，赋予多肽自组装材料良好的生物功能；
55.(6)本发明所述的共价光交联多肽仿生材料，自组装材料的制备方法简单，条件温和，在组织工程和再生医学领域具有广泛的应用前景。
附图说明
56.图1本发明实施例1
‑
6所述共价光交联多肽的圆二色谱图；
57.图2本发明实施例1
‑
6所述共价光交联多肽组装材料的sem图；
58.图3本发明实施例2中所述共价光交联多肽组装材料在不同ph和不同溶剂下的sem图；
59.图4本发明实施例6中所述胶原蛋白仿生材料基于hela细胞的细胞毒性图、细胞黏附图和免疫荧光成像图以及基于hff
‑
1细胞的细胞黏附图和免疫荧光成像图；
60.图5本发明对比例1
‑
6所述多肽的圆二色谱图；
61.图6本发明对比例1
‑
6所述多肽组装材料的sem图。
具体实施方式
62.以下具体结合实施例进一步描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
63.以下实施例中所涉及到的共价光交联多肽的序列如下表1所示，但并不局限于表1所述的序列。其中，所述的gpo序列即为本技术所述的(gly
‑
pro
‑
hyp)序列；所述y为tyr；所述的gyo为(gly
‑
tyr
‑
hyp)；所述的gfoger为(gly
‑
phe
‑
hyp
‑
gly
‑
glu
‑
arg)。并且所述共价光交联多肽序列均通过经典的固相合成法合成，所述固相合成方法具体为：
64.(1)将100mg rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5ml二氯甲烷溶胀树脂；
65.(2)由20％哌啶/n,n
‑
二甲基甲酰胺(dmf)溶液脱除n末端fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
66.(3)将n末端由fmoc保护的氨基酸(4eq)与hobt(4eq)和hbtu(4eq)由dmf溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加diea(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3h。
67.(4)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5ml dmf和dcm洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/dmf溶液处理3次，分别为5min、5min和15min。树脂分别由5ml dmf和dcm洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
68.(5)重复步骤(3)和(4)，直到完成目标肽序列。
69.(6)25％乙酸酐(dmf)将n端封端25分钟。
70.(7)对目标肽进行切割：室温下，用tfa(三氟乙酸):三异丙基硅烷:h2o＝95:2.5:2.5，振荡树脂3h，完成肽的切割。冰乙醚沉淀、离心、洗涤，最终得到表1所示目标多肽。
71.表1共价光交联多肽的序列表
[0072][0073]
定义：
[0074]
除非另外定义，本发明使用的所有技术和科学术语具有的含义与所述方法所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所述的类似或等同的任何方法和组合物也可用于胶原多肽实现自组装，但不局限于以下实施例中描述具有代表性的示例方法和组合物。并且也应了解本发明所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不限制本发明及随附权利要求的保护范围。
[0075]
必须注意，除非上下文另外明确规定，否则如本文以及随附权利要求中所用，单数形式“一个/一种”和“所述”包括复数个(种)指示物。举例来说，提及“一种胶原多肽”包括多种所述胶原多肽，提及“所述胶原多肽”是提及一种或多种胶原多肽及其为本领域技术人员所知的等效物，依此类推。
[0076]“包含(包括)”意指“包括但不限于”，并且不意图排除例如其它组分、整数等。特定来说，在陈述为“包括至少3个重复的gly
‑
pro
‑
hyp序列”，明确涵盖包括所列内容(除非包括
限制性术语诸如“由
……
组成”)，这意味着不意图排除未列于所述步骤中的其它组分、整数。
[0077]
在提供范围值的情况下，应理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述或中间值包含在所述方法和组合物内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围内，并且也包括在所述方法和组合物内，受所述范围中任何特别排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些所包括的限制之一或两者的范围也包括在方法和组合物中。
[0078]
应当理解，为了清楚起见，在单独的实施方式的上下文中描述的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的方法和组合物的各种特征也可单独提供或以任何合适的次组合提供。
[0079]
对于本领域技术人员在阅读本公开内容时将显而易见的是，本文描述和表示出的每个单独实施方式具有可以容易地与任何其他实施例的特征分离或组合的独立组件和特征，而不脱离本方法的范围或精神。任何列举的方法可以按照所述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。
[0080]
术语“胶原蛋白”是动物结缔组织中的主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，由三条肽链组成的三聚体结构，包括ⅰ型、ⅱ型、ⅲ型、
ⅴ
型和
ⅺ
型胶原蛋白。
[0081]
术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指通过肽键或修饰的肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或更多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，也适用于天然存在的氨基酸聚合物，它们含有经修饰的残基和非天然存在的氨基酸聚合物。
[0082]
术语“热变温度”是指胶原多肽三重螺旋结构一半转变为无规卷曲时的温度。热变温度可以通过圆二色谱(cd)等公知的结构解析方法测定，但也并不限于这些，也可以通过其它公知的方法进行测定。本领域人员公知，具有热变温度的胶原多肽均具有三重螺旋结构。
[0083]
术语“仿生材料”是指模仿生物的各种特点或特性而研制开发的材料。通常把仿照生命系统的运行模式和生物材料的结构规律而设计制造的人工材料称为仿生材料，在本说明书中所述的仿生材料具有胶原蛋白的结构特性。
[0084]
实施例1共价光交联多肽yy(gpo)3gyo(gpo)3yy的性质表征
[0085]
1.圆二色谱
[0086]
圆二色谱(cd)是在配备有peltier温度控制器的chirascan cd色谱仪(applied photophysics，england)上获得的。在ph10条件下，制备浓度为300μm的多肽水溶液。在进行测量之前，样品需要在4℃下平衡至少24小时。使用路径长度为1mm的比色皿。热变曲线通过监测波长225nm处的特征cd峰值随温度的变化得到，温度变化范围是4℃至80℃，升温速率为10℃/小时。对热变曲线进行一阶求导，极值对应的温度即为热变温度(tm)。
[0087]
结果如图1中a所示，在225nm处，共价光交联多肽yy(gpo)3gyo(gpo)3yy的cd值随温度变化，呈现“z字型”变化，表明该多肽形成了稳定的三重螺旋结构，对其热变曲线求一阶导数得到该多肽的热变温度为25℃。
[0088]
2.自组装材料的制备
[0089]
将0.2ml，1mm的ru(bpy)3cl2水溶液，0.6ml，10mm的过硫酸铵水溶液和0.2ml，1mg/ml溶解在ph10缓冲液中的共价光交联多肽yy(gpo)3gyo(gpo)3yy混合。随后将其暴露于白光灯下6分钟，离心，得到沉淀，然后用水反复离心洗涤3次，得胶原蛋白仿生材料。
[0090]
3.自组装材料的sem表征
[0091]
取20μl上述胶原蛋白仿生材料，滴在硅片上，置于25℃恒温培养箱，至完全干燥，将干燥后的样品进行喷金处理，利用hitachi s
‑
4800扫描电子显微镜(hitachi limited,japan)，操作电压为5.1～5.3kv，进行扫描电镜表征。结果如图2中a所示，共价光交联多肽yy(gpo)3gyo(gpo)3yy自组装形成了类似天然胶原蛋白的纤维网状结构。
[0092]
实施例2共价光交联多肽yy(gpo)4gyo(gpo)4yy的性质表征
[0093]
1.圆二色谱
[0094]
圆二色谱(cd)是在配备有peltier温度控制器的chirascan cd色谱仪(applied photophysics，england)上获得的。在ph10条件下，制备浓度为300μm的多肽水溶液。在进行测量之前，样品需要在4℃下平衡至少24小时。使用路径长度为1mm的比色皿。热变曲线通过监测波长225nm处的特征cd峰值随温度的变化得到，温度变化范围是4℃至80℃，升温速率为10℃/小时。对热变曲线进行一阶求导，极值对应的温度即为热变温度(tm)。
[0095]
结果如图1中b所示，在225nm处，共价光交联多肽yy(gpo)4gyo(gpo)4yy的cd值随温度变化，呈现“z字型”变化，表明该多肽形成了稳定的三重螺旋结构，对其热变曲线求一阶导数得到该多肽的热变温度为47℃。
[0096]
2.自组装材料的制备
[0097]
将0.2ml，1mm的ru(bpy)3cl2水溶液，0.6ml，10mm的过硫酸铵水溶液和0.2ml，1mg/ml溶解在ph10缓冲液中的共价光交联多肽yy(gpo)4gyo(gpo)4yy混合。随后将其暴露于白光灯下6分钟，离心，得到沉淀，然后用水反复离心洗涤3次，得胶原蛋白仿生材料。
[0098]
3.自组装材料的sem表征
[0099]
取20μl上述胶原蛋白仿生材料，滴在硅片上，置于25℃恒温培养箱，至完全干燥，将干燥后的样品进行喷金处理，利用hitachi s
‑
4800扫描电子显微镜(hitachi limited,japan)，操作电压为5.1～5.3kv，进行扫描电镜表征。结果如图2中b所示，共价光交联多肽yy(gpo)4gyo(gpo)4yy自组装形成了类似天然胶原蛋白的纤维网状结构。
[0100]
实施例3共价光交联多肽yy(gpo)5gyo(gpo)5yy的性质表征
[0101]
1.圆二色谱
[0102]
圆二色谱(cd)是在配备有peltier温度控制器的chirascan cd色谱仪(applied photophysics，england)上获得的。在ph10条件下，制备浓度为300μm的多肽水溶液。在进行测量之前，样品需要在4℃下平衡至少24小时。使用路径长度为1mm的比色皿。热变曲线通过监测波长225nm处的特征cd峰值随温度的变化得到，温度变化范围是4℃至80℃，升温速率为10℃/小时。对热变曲线进行一阶求导，极值对应的温度即为热变温度(tm)。
[0103]
结果如图1中c所示，在225nm处，共价光交联多肽yy(gpo)5gyo(gpo)5yy的cd值随温度变化，呈现“z字型”变化，表明该多肽形成了稳定的三重螺旋结构，对其热变曲线求一阶导数得到该多肽的热变温度为57℃。
[0104]
2.自组装材料的制备
[0105]
将0.2ml，1mm的ru(bpy)3cl2水溶液，0.6ml，10mm的过硫酸铵水溶液和0.2ml，1mg/
ml溶解在ph10缓冲液中的共价光交联多肽yy(gpo)5gyo(gpo)5yy混合。随后将其暴露于白光灯下6分钟，离心，得到沉淀，然后用水反复离心洗涤3次，得胶原蛋白仿生材料。
[0106]
3.自组装材料的sem表征
[0107]
取20μl上述胶原蛋白仿生材料，滴在硅片上，置于25℃恒温培养箱，至完全干燥，将干燥后的样品进行喷金处理，利用hitachi s
‑
4800扫描电子显微镜(hitachi limited,japan)，操作电压为5.1～5.3kv，进行扫描电镜表征。结果图如2中c所示，共价光交联多肽yy(gpo)5gyo(gpo)5yy自组装形成了类似天然胶原蛋白的纤维网状结构。
[0108]
实施例4共价光交联多肽yy(gpo)4gyogpogyo(gpo)4yy的性质表征
[0109]
1.圆二色谱
[0110]
圆二色谱(cd)是在配备有peltier温度控制器的chirascan cd色谱仪(applied photophysics，england)上获得的。在ph10条件下，制备浓度为300μm的多肽水溶液。在进行测量之前，样品需要在4℃下平衡至少24小时。使用路径长度为1mm的比色皿。热变曲线通过监测波长225nm处的特征cd峰值随温度的变化得到，温度变化范围是4℃至80℃，升温速率为10℃/小时。对热变曲线进行一阶求导，极值对应的温度即为热变温度(tm)。
[0111]
结果如图1中d所示，在225nm处，共价光交联多肽yy(gpo)4gyogpogyo(gpo)4yy的cd值随温度变化，呈现“z字型”变化，表明该多肽形成了稳定的三重螺旋结构，对其热变曲线求一阶导数得到该多肽的热变温度为52℃。
[0112]
2.自组装材料的制备
[0113]
将0.2ml，1mm的ru(bpy)3cl2水溶液，0.6ml，10mm的过硫酸铵水溶液和0.2ml，1mg/ml溶解在ph10缓冲液中的共价光交联多肽yy(gpo)4gyogpogyo(gpo)4yy混合。随后将其暴露于白光灯下6分钟，离心，得到沉淀，然后用水反复离心洗涤3次，得胶原蛋白仿生材料。
[0114]
3.自组装材料的sem表征
[0115]
取20μl上述胶原蛋白仿生材料，滴在硅片上，置于25℃恒温培养箱，至完全干燥，将干燥后的样品进行喷金处理，利用hitachi s
‑
4800扫描电子显微镜(hitachi limited,japan)，操作电压为5.1～5.3kv，进行扫描电镜表征。结果如图2中d所示，共价光交联多肽yy(gpo)4gyogpogyo(gpo)4yy自组装形成了类似天然胶原蛋白的纤维网状结构。
[0116]
4.不同ph和不同有机溶剂中样品的稳定性研究
[0117]
以共价光交联多肽yy(gpo)4gyogpogyo(gpo)4yy为例，研究了ph对材料的影响。将组装好的胶原蛋白仿生材料浸泡在ph 4、6、8和10的水溶液里培养24小时，观察胶原蛋白仿生材料的形貌的变化。同样以共价光交联多肽yy(gpo)4gyogpogyo(gpo)4yy为例，研究了不同有机溶剂对材料的影响。将组装好的胶原蛋白仿生材料浸泡在乙腈、四氢呋喃、二氯甲烷和二甲苯里培养24小时，观察材料形貌的变化。
[0118]
扫描电子显微镜的实验结果如图3所示。其中a为ph4，b为ph6，c为ph8，d为ph10，e为乙腈，f为四氢呋喃，g为二氯甲烷，h为二甲苯。不同ph和不同有机溶剂条件下，胶原蛋白仿生材料的形貌没有发生改变，表明其在不同ph和多种有机溶剂中都具有良好的稳定性。
[0119]
实施例5共价光交联多肽y5(gpo)4gyo(gpo)4y5的性质表征
[0120]
1.圆二色谱
[0121]
圆二色谱(cd)是在配备有peltier温度控制器的chirascan cd色谱仪(applied photophysics，england)上获得的。在ph10条件下，制备浓度为300μm的多肽水溶液。在进行
测量之前，样品需要在4℃下平衡至少24小时。使用路径长度为1mm的比色皿。热变曲线通过监测波长225nm处的特征cd峰值随温度的变化得到，温度变化范围是4℃至70℃，升温速率为10℃/小时。对热变曲线进行一阶求导，极值对应的温度即为热变温度(tm)。
[0122]
结果如图1中e所示，在225nm处，共价光交联多肽y5(gpo)4gyo(gpo)4y5的cd值随温度变化，呈现“z字型”变化，表明该多肽形成了稳定的三重螺旋结构，对其热变曲线求一阶导数得到该多肽的热变温度为41℃。
[0123]
2.自组装材料的制备
[0124]
将0.2ml，1mm的ru(bpy)3cl2水溶液，0.6ml，10mm的过硫酸铵水溶液和0.2ml，1mg/ml溶解在ph10缓冲液中的共价光交联多肽y5(gpo)4gyo(gpo)4y5混合。随后将其暴露于白光灯下6分钟，离心，得到沉淀，然后用水反复离心洗涤3次，得胶原蛋白仿生材料。
[0125]
3.自组装材料的sem表征
[0126]
取20μl上述胶原蛋白仿生材料，滴在硅片上，置于25℃恒温培养箱，至完全干燥，将干燥后的样品进行喷金处理，利用hitachi s
‑
4800扫描电子显微镜(hitachi limited,japan)，操作电压为5.1～5.3kv，进行扫描电镜表征。结果如图2中e所示，共价光交联多肽y5(gpo)4gyo(gpo)4y5自组装形成了类似天然胶原蛋白的纤维网状结构。
[0127]
实施例6共价光交联多肽yy(gpo)4gyogpogfoger(gpo)4yy的性质表征
[0128]
1.圆二色谱
[0129]
圆二色谱(cd)是在配备有peltier温度控制器的chirascan cd色谱仪(applied photophysics，england)上获得的。在ph10条件下，制备浓度为300μm的多肽水溶液。在进行测量之前，样品需要在4℃下平衡至少24小时。使用路径长度为1mm的比色皿。热变曲线通过监测波长225nm处的特征cd峰值随温度的变化得到，温度变化范围是4℃至80℃，升温速率为10℃/小时。对热变曲线进行一阶求导，极值对应的温度即为热变温度(tm)。
[0130]
结果如图1中f所示，在225nm处，共价光交联多肽yy(gpo)4gyogpogfoger(gpo)4yy(以下简称gyogfoger)的cd值随温度变化，呈现“z字型”变化，表明该多肽形成了稳定的三重螺旋结构，对其热变曲线求一阶导数得到该多肽的热变温度为28℃。
[0131]
2.自组装材料的制备
[0132]
将0.4ml，1mm的ru(bpy)3cl2水溶液，1.2ml，10mm的过硫酸铵水溶液和0.4ml，2mg/ml溶解在ph10缓冲液中的共价光交联多肽gyogfoger混合。随后将其暴露于白光灯下6分钟，离心，得到沉淀，然后用水反复离心洗涤3次，得胶原蛋白仿生材料。
[0133]
3.自组装材料的sem表征
[0134]
取20μl上述胶原蛋白仿生材料，滴在硅片上，置于25℃恒温培养箱，至完全干燥，将干燥后的样品进行喷金处理，利用hitachi s
‑
4800扫描电子显微镜(hitachi limited,japan)，操作电压为5.1～5.3kv，进行扫描电镜表征。结果如图2中f所示，共价光交联多肽gyogfoger自组装形成了类似天然胶原蛋白的纤维网状结构。
[0135]
4.细胞实验
[0136]
4.1细胞毒性实验
[0137]
利用cck
‑
8的方法测定上述胶原蛋白仿生材料对hela细胞的细胞毒性。hela细胞(含有10％胎牛血清和1％双抗的dmem培养基)在含有5％co2的恒温培养箱(温度设定37℃)中培养。将体积为100μl的hela细胞悬浮液(每孔5
×
103个细胞的密度)接种于96微孔中，并
孵育24小时(37℃，5％co2)以保证完全贴壁。然后在96微孔板中分别加入100μl不同初浓度(0.05、0.1、0.15和0.2mg/ml)的gyogfoger组装体的悬浮液，对照孔中加入100μl dmem培养基，在37℃继续温育24小时。然后向各孔中加入100μl 10％的cell counting kit
‑
8(cck
‑
8)，置于细胞培养箱中培养，用tecan infinite f200/m200多功能酶标仪(tecan,switzerland)测量其在450nm处的od值，摸索合适时间，当只有细胞不含材料的孔od值达到1左右时，停止培养。hela细胞的活性计算为每种条件三次测量的平均吸收值。
[0138]
细胞毒性实验结果如图4中a所示，gyogfoger组装体在不同浓度下均显示出与未加材料相似的细胞存活率，表明该胶原蛋白仿生材料具有良好的生物相容性。
[0139]
4.2细胞黏附实验
[0140]
96微孔板(组织未处理)分别被i型胶原蛋白、bsa、gyogfoger组装体包被。bsa作为对照。在加入hela细胞之前，用pbs缓冲液(10mm)洗涤包被孔三次。然后取100μl(1
×
106细胞/ml，无血清培养基)hela细胞悬浮液接种于96微孔板中，并在37℃孵育4小时，最后用10mm pbs缓冲液洗涤未附着的hela细胞。通过对黏附的细胞进行总脱氧核糖核酸(dna)定量测定(hoechst 33258，solarbio)来比较材料黏附细胞的能力。步骤如下：使用反复冰冻
‑
融化裂解微孔板中黏附的细胞，向细胞裂解物中加入终浓度为5μg/ml的hoechst 33258染料，并将混合物在黑暗中温育1小时，最后在激发波长为360mm下利用酶标仪(tecaminfimite m200)测定它们在发射波长为465mm下的荧光强度。平行测定三次。
[0141]
细胞黏附实验结果如图4中b所示，将hela细胞与天然胶原蛋白的黏附数值作为100％参考，hela细胞与bsa的黏附能力是天然胶原蛋白的18.7％，与胶原蛋白仿生材料yy(gpo)4gyogpogfoger(gpo)4yy的黏附能力为87.8％。该结果表明，bsa对hela细胞黏附能力不佳，而胶原蛋白仿生材料对hela细胞则表现出良好的黏附能力。
[0142]
同时，我们还研究hff
‑
1细胞在以上三种材料表面的粘附情况，结果如图4中c所示，hff
‑
1细胞对bsa的黏附百分比为19.4％，与胶原蛋白仿生材料的黏附百分比约为83.2％，表明bsa对hff
‑
1细胞黏附能力不佳，而胶原蛋白仿生材料对hff
‑
1细胞则表现出良好的黏附能力。
[0143]
5.免疫荧光实验
[0144]
5.1 hela细胞免疫荧光实验
[0145]
24孔板(组织未处理)分别被牛血清白蛋白(bsa)和gyogfoger组装体包被。加入hela细胞之前，用10mm pbs缓冲液(10mm，ph7.2～7.4)洗涤24孔板三次。然后将～600个细胞/mm2密度的hela细胞悬液加到培养皿中，并在37℃下孵育4小时。将黏附的hela细胞用4.0％甲醛溶液固定10分钟，用0.1％tritom x
‑
100溶液透化hela细胞5分钟，并在室温下加入含有1％bsa的pbs缓冲液(10mm，ph7.2～7.4)封闭0.5小时。将固定的hela细胞与鬼笔环肽
‑
四甲基罗丹明异硫氰酸酯(索莱宝，中国)(1ml，100mm的pbs溶液)(10mm，ph7.2～7.4)避光共孵育1小时，然后加入hoechst 33258(sigma
‑
aldrich)(1ml，5μg/ml在超纯水)在37℃下孵育10分钟，分别染色细胞肌动蛋白和细胞核。利用徕卡(leica microsystems imc.,wetzlar,germamy)荧光显微镜获得成像结果。
[0146]
从荧光显微镜成像图中可以看出，bsa包被的表面的hela细胞呈球形，表明其细胞黏附能力不佳(结果如图4中d所示)；而gyogfoger组装体包被的24孔板表面的hela细胞呈现铺展开的形貌(结果如图4中e
‑
f所示)，表明该组装材料具有良好的促进细胞黏附的性
能，很好地仿生了天然胶原蛋白的生物功能。
[0147]
5.2 hff
‑
1细胞免疫荧光实验
[0148]
24孔板(组织未处理)分别被牛血清白蛋白(bsa)和gyogfoger组装体包被。加入hff
‑
1细胞之前，用10mm pbs缓冲液(10mm，ph7.2～7.4)洗涤24孔板三次。然后将～1200个细胞/mm2密度的hff
‑
1细胞悬液加到培养皿中，并在37℃下孵育12小时。将黏附的hff
‑
1细胞用4.0％甲醛溶液固定10分钟，用0.1％triton x
‑
100溶液通透hela细胞5分钟，并在室温下加入含有1％bsa的pbs缓冲液(10mm，ph7.2～7.4)封闭0.5小时。将固定的hff
‑
1细胞与鬼笔环肽
‑
四甲基罗丹明异硫氰酸酯(索莱宝，中国)(1ml，100mm的pbs溶液)(10mm，ph7.2～7.4)避光共孵育1小时，然后加入hoechst 33258(sigma
‑
aldrich)(1ml，5μg/ml在超纯水)在37℃下孵育10分钟，分别染色细胞肌动蛋白和细胞核。成像的结果利用徕卡(leica microsystems inc.,wetzlar,germany)荧光显微镜获得。
[0149]
从荧光显微镜成像图中可以看出，bsa包被的表面的hff
‑
1细胞呈球形，表明其细胞黏附能力不佳(结果如图4中g所示)；而gyogfoger组装体包被的24孔板表面的hff
‑
1细胞呈现铺展开的形貌(结果如图4中h
‑
i所示)，表明该组装材料具有良好的促进细胞黏附的性能，很好地仿生了天然胶原蛋白的生物功能。
[0150]
对比例
[0151]
以下对比例中所涉及到的多肽的序列如下表2所示。其中，所述的gpo序列即为本技术所述的(gly
‑
pro
‑
hyp)序列；所述y为tyr；所述的gyo为(gly
‑
tyr
‑
hyp)。并且所述多肽序列均通过经典的固相合成法合成，所述固相合成方法具体为：
[0152]
(1)将100mg rink氨树脂加入具有筛板的反应器中，使用5ml二氯甲烷溶胀树脂；
[0153]
(2)由20％哌啶/n,n
‑
二甲基甲酰胺(dmf)溶液脱除n末端fmoc保护基，显色反应检测保护基脱除完全；
[0154]
(3)将n末端由fmoc保护的氨基酸(4eq)与hobt(4eq)和hbtu(4eq)由dmf溶解，低温活化20min后，向溶液中滴加diea(6eq)，溶液混合后加入到反应器中，反应3h。
[0155]
(4)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由5ml dmf和dcm洗3次。显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由20％哌啶/dmf溶液处理3次，分别为5min、5min和15min。树脂分别由5ml dmf和dcm洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；
[0156]
(5)重复步骤(3)和(4)，直到完成目标肽序列。
[0157]
(6)25％乙酸酐(dmf)将n端封端25分钟。
[0158]
(7)对目标肽进行切割：室温下，用tfa(三氟乙酸):三异丙基硅烷:h2o＝95:2.5:2.5，振荡树脂3h，完成肽的切割。冰乙醚沉淀、离心、洗涤，最终得到表2所示目标多肽。
[0159]
表2多肽的序列表
[0160][0161]
对比例1多肽yygyoyy的性质表征
[0162]
1.圆二色谱
[0163]
圆二色谱(cd)是在配备有peltier温度控制器的chirascan cd色谱仪(applied photophysics，england)上获得的。在ph10条件下，制备浓度为300μm的多肽水溶液。在进行测量之前，样品需要在4℃下平衡至少24小时。使用路径长度为1mm的比色皿。热变曲线通过监测波长225nm处的特征cd峰值随温度的变化得到，温度变化范围是4℃至60℃，升温速率为10℃/小时。对热变曲线进行一阶求导，极值对应的温度即为热变温度(tm)。
[0164]
结果如图5中a所示，在225nm处，多肽yygyoyy的cd值随着温度的升高呈线性降低，表明这该多肽不能形成三重螺旋结构。
[0165]
2.自组装材料的制备
[0166]
将0.2ml，1mm的ru(bpy)3cl2水溶液，0.6ml，10mm的过硫酸铵水溶液和0.2ml，1mg/ml溶解在ph10缓冲液中的目标多肽yygyoyy混合。随后将其暴露于白光灯下6分钟，离心，得到沉淀，然后用水反复离心洗涤3次，得到自组装材料。
[0167]
3.自组装材料的sem表征
[0168]
取20μl上述产物，滴在硅片上，置于25℃恒温培养箱，至完全干燥，将干燥后的样品进行喷金处理，利用hitachi s
‑
4800扫描电子显微镜(hitachi limited,japan)，操作电压为5.1～5.3kv，进行扫描电镜表征。结果如图6中a所示，多肽yygyoyy自组装形成了球形结构。
[0169]
对比例2多肽yygpogyogpoyy的性质表征
[0170]
1.圆二色谱
[0171]
圆二色谱(cd)是在配备有peltier温度控制器的chirascan cd色谱仪(applied photophysics，england)上获得的。在ph10条件下，制备浓度为300μm的多肽水溶液。在进行测量之前，样品需要在4℃下平衡至少24小时。使用路径长度为1mm的比色皿。热变曲线通过监测波长225nm处的特征cd峰值随温度的变化得到，温度变化范围是4℃至60℃，升温速率为10℃/小时。对热变曲线进行一阶求导，极值对应的温度即为热变温度(tm)。
[0172]
结果如图5中b所示，在225nm处，多肽yygpogyogpoyy的cd值随着温度的升高呈线性降低，表明这该多肽不能形成三重螺旋结构。
[0173]
2.自组装材料的制备
[0174]
将0.2ml，1mm的ru(bpy)3cl2水溶液，0.6ml，10mm的过硫酸铵水溶液和0.2ml，1mg/
ml溶解在ph10缓冲液中的目标多肽yygpogyogpoyy混合。随后将其暴露于白光灯下6分钟，离心，得到沉淀，然后用水反复离心洗涤3次，得到自组装材料。
[0175]
3.自组装材料的sem表征
[0176]
取20μl上述材，滴在硅片上，置于25℃恒温培养箱，至完全干燥，将干燥后的样品进行喷金处理，利用hitachi s
‑
4800扫描电子显微镜(hitachi limited,japan)，操作电压为5.1～5.3kv，进行扫描电镜表征。结果如图6中b所示，多肽yygpogyogpoyy自组装形成了球形结构。
[0177]
对比例3多肽yy(gpo)2gyo(gpo)2yy的性质表征
[0178]
1.圆二色谱
[0179]
圆二色谱(cd)是在配备有peltier温度控制器的chirascan cd色谱仪(applied photophysics，england)上获得的。在ph10条件下，制备浓度为300μm的多肽水溶液。在进行测量之前，样品需要在4℃下平衡至少24小时。使用路径长度为1mm的比色皿。热变曲线通过监测波长225nm处的特征cd峰值随温度的变化得到，温度变化范围是4℃至60℃，升温速率为10℃/小时。对热变曲线进行一阶求导，极值对应的温度即为热变温度(tm)。
[0180]
结果如图5中c所示，在225nm处，多肽yy(gpo)2gyo(gpo)2yy的cd值随着温度的升高呈线性降低，表明这该多肽不能形成三重螺旋结构。
[0181]
2.自组装材料的制备
[0182]
将0.2ml，1mm的ru(bpy)3cl2水溶液，0.6ml，10mm的过硫酸铵水溶液和0.2ml，1mg/ml溶解在ph10缓冲液中的目标多肽yy(gpo)2gyo(gpo)2yy混合。随后将其暴露于白光灯下6分钟，离心，得到沉淀，然后用水反复离心洗涤3次，得到自组装材料。
[0183]
3.自组装材料的sem表征
[0184]
取20μl上述材料，滴在硅片上，置于25℃恒温培养箱，至完全干燥，将干燥后的样品进行喷金处理，利用hitachi s
‑
4800扫描电子显微镜(hitachi limited,japan)，操作电压为5.1～5.3kv，进行扫描电镜表征。结果如图6中c所示，多肽yy(gpo)2gyo(gpo)2yy自组装形成了球形结构。
[0185]
对比例4多肽(gpo)4gyo(gpo)4的性质表征
[0186]
1.圆二色谱
[0187]
圆二色谱(cd)是在配备有peltier温度控制器的chirascan cd色谱仪(applied photophysics，england)上获得的。在ph10条件下，制备浓度为300μm的多肽水溶液。在进行测量之前，样品需要在4℃下平衡至少24小时。使用路径长度为1mm的比色皿。热变曲线通过监测波长225nm处的特征cd峰值随温度的变化得到，温度变化范围是4℃至80℃，升温速率为10℃/小时。对热变曲线进行一阶求导，极值对应的温度即为热变温度(tm)。
[0188]
结果如图5中d所示，在225nm处，多肽(gpo)4gyo(gpo)4的cd值随温度变化，呈现“z字型”变化，表明该多肽形成了稳定的三重螺旋结构，对其热变曲线求一阶导数得到该多肽的热变温度为51℃。
[0189]
2.自组装材料的制备
[0190]
将0.2ml，1mm的ru(bpy)3cl2水溶液，0.6ml，10mm的过硫酸铵水溶液和0.2ml，1mg/ml溶解在ph10缓冲液中的目标多肽(gpo)4gyo(gpo)4。随后将其暴露于白光灯下6分钟，离心，结果如图6中d所示，无沉淀产生，未发生组装。
[0191]
对比例5多肽(gpo)2gyogpogyo(gpo)3的性质表征
[0192]
1.圆二色谱
[0193]
圆二色谱(cd)是在配备有peltier温度控制器的chirascan cd色谱仪(applied photophysics，england)上获得的。在ph10条件下，制备浓度为300μm的多肽水溶液。在进行测量之前，样品需要在4℃下平衡至少24小时。使用路径长度为1mm的比色皿。热变曲线通过监测波长225nm处的特征cd峰值随温度的变化得到，温度变化范围是4℃至80℃，升温速率为10℃/小时。对热变曲线进行一阶求导，极值对应的温度即为热变温度(tm)。
[0194]
结果如图5中e所示，在225nm处，多肽(gpo)2gyogpogyo(gpo)3的cd值随温度变化，呈现“z字型”变化，表明该多肽形成了稳定的三重螺旋结构，对其热变曲线求一阶导数得到该多肽的热变温度为27℃。
[0195]
2.自组装材料的制备
[0196]
将0.2ml，1mm的ru(bpy)3cl2水溶液，0.6ml，10mm的过硫酸铵水溶液和0.2ml，1mg/ml溶解在ph10缓冲液中的目标多肽(gpo)2gyogpogyo(gpo)3混合。随后将其暴露于白光灯下6分钟，离心，结果如图6中e所示，无沉淀产生，未发生组装。
[0197]
对比例6多肽yy(gpo)8yy的性质表征
[0198]
1.圆二色谱
[0199]
圆二色谱(cd)是在配备有peltier温度控制器的chirascan cd色谱仪(applied photophysics，england)上获得的。在ph10条件下，制备浓度为300μm的多肽水溶液。在进行测量之前，样品需要在4℃下平衡至少24小时。使用路径长度为1mm的比色皿。热变曲线通过监测波长225nm处的特征cd峰值随温度的变化得到，温度变化范围是4℃至80℃，升温速率为10℃/小时。对热变曲线进行一阶求导，极值对应的温度即为热变温度(tm)。
[0200]
结果如图5中f所示，在225nm处，多肽yy(gpo)8yy的cd值随温度变化，呈现“z字型”变化，表明该多肽形成了稳定的三重螺旋结构，对其热变曲线求一阶导数得到该多肽的热变温度为50℃。
[0201]
2.自组装材料的制备
[0202]
将0.2ml，1mm的ru(bpy)3cl2水溶液，0.6ml，10mm的过硫酸铵水溶液和0.2ml，1mg/ml溶解在ph10缓冲液中的目标多肽yy(gpo)8yy混合。随后将其暴露于白光灯下6分钟，离心，得到沉淀，然后用水反复离心洗涤3次，得到自组装材料。
[0203]
3.自组装材料的sem表征
[0204]
取20μl上述材料，滴在硅片上，置于25℃恒温培养箱，至完全干燥，将干燥后的样品进行喷金处理，利用hitachi s
‑
4800扫描电子显微镜(hitachi limited,japan)，操作电压为5.1～5.3kv，进行扫描电镜表征。结果如图6中f所示，多肽yy(gpo)8yy自组装形成了球形结构。
[0205]
上述实施例及对比例中所述共价光交联多肽及胶原多肽的组装结果如表3所示：
[0206]
表3胶原多肽的组装结果及热变温度
[0207][0208]
由上述结果可知，实施例多肽1，2和3具有三重螺旋结构，两端分别含有2个y，中间序列含有一个y，组装形成纤维网络结构；实施例多肽4具有三重螺旋结构，两端分别含有2个y，中间序列含有两个y，组装形成纤维网络结构；实施例多肽5具有三重螺旋结构，两端分别含有5个y，中间序列含有两个y，组装形成纤维网络结构；实施例多肽6在中间引入了具有细胞黏附功能的多肽片段gfoger。引入多肽片段gfog er后，在保证中间序列具有三重螺旋的结构的前提下，该组装体系也能自组装形成纤维状胶原蛋白仿生材料。
[0209]
对比例多肽1，2和3两端含有两个y，但其中间序列不能形成三重螺旋结构，该多肽自组装形成球形结构；对比例多肽4和5，虽然中间序列m能够形成三重螺旋结构，但是由于未在两端序列t1和t2中引入酪氨酸，该共价光交联多肽序列不能进行组装；对比例多肽6，虽然中间序列m能够形成三重螺旋结构并且两端序列t中各含有两个酪氨酸，但中间序列不含y，该共价光交联多肽序列仍然组装形成球形结构。
[0210]
由于天然胶原蛋白大多数以纤维形式存在，因此，本发明所述的共价光交联多肽能够自组装形成与天然胶原蛋白相似的纤维结构，可以更好的模拟天然胶原蛋白的结构和功能。
[0211]
综上所述，只有符合本发明所述的共价光交联多肽：两端序列t1和t2、n1和n2序列、中间序列m；所述中间序列m为能够提供中间交联位点的gly
‑
tyr
‑
hyp序列；所述n1和n2序列包括重复的gly
‑
pro
‑
hyp序列，和/或重复的gly
‑
pro
‑
pro序列，再优选地，所述n1和n2包括至少3个重复的gly
‑
pro
‑
hyp序列；所述两端序列t1和t2含有不同数量的酪氨酸，优选地，所述两端序列t1和t2包括至少2个酪氨酸，能自组装形成具有纳米纤维结构的胶原蛋白仿生材料。
[0212]
但是本发明实施例虽然以包含gpo重复序列的n1和n2为例，但是根据上述结果，在能够保证多肽序列具备三重螺旋结构的基础上，与本发明所述两端序列t和n1和n2以及中间序列m结合获得的胶原多肽均能自组装形成具有纳米纤维结构的胶原蛋白仿生材料。因
此，所述的n1和n2还可以包含具有形成三重螺旋结构的gpp(gly
‑
pro
‑
pro)重复序列以及其他能够形成三重螺旋结构的其他多肽序列。
[0213]
以上所述仅为本发明的个别示范性实施案例的细节，对于本领域的技术人员来说，本发明在实际应用过程中根据具体的制备条件可以有各种更改和变化，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，均应包含在本发明的保护范围之内。