一株德氏根霉Lut-8-53及其在生物转化法制备木犀草素中的应用的制作方法

一株德氏根霉lut
‑8‑
53及其在生物转化法制备木犀草素中的应用
(一)技术领域
1.本发明属于生物化工技术领域，具体地说，是关于一种以木犀草苷为原料微生物转化制备木犀草素的方法。
(二)

背景技术：

2.木犀草素(luteolin)，化学名3',4',5,7
‑
四羟基黄酮，cas号491
‑
70
‑
3，分子式为c
15
h
10
o6，分子量为286.24，是一种天然的黄酮类化合物，其结构见图1。因最初从木犀草科的木犀草(reseda odorata linn.)中分离出而得名。现代药理学研究表明木犀草素有多种药理活性，如消炎、抗过敏、降尿酸、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等，临床可用于止咳、祛痰、消炎、降尿酸、治疗心血管疾病等。
3.木犀草素天然存在于金银花、杜虹花、叶青兰、锦灯笼、鹿茸草、黄芩、半枝莲、紫苏和独一味等多种植物中，因此可以从这些植物中分离获得，但其含量相对较低，如金银花中木犀草素含量仅为0.05～0.08％[胥秀英,郑一敏,傅善权,等.高效液相色谱法测定金银花中木犀草素的含量.食品科学,2006,27(5):221
‑
222]；异叶青兰植株不同部位中的木犀草素平均含量为0.31％[王晓娟,白音夫.hplc法测定民族药材异叶青兰不同部位中木犀草素的含量.中国民族医药杂志,2015,21(2):55
‑
56]；半枝莲中木犀草素含量为0.052％[程迪迪,刘彩红.hplc法测定半枝莲中木犀草素和芹菜素的含量.泰山医学院学报,2016,37(12):1340
‑
1341]。在植物中，木犀草素更多的是与葡萄糖结合成苷存在，即木犀草素
‑7‑
o
‑
β
‑
d葡萄糖苷，又称木犀草苷(luteoloside,cynaroside，cas号为5373
‑
11
‑
5，分子式为c
21
h
20
o
11
，分子量为448.4)。在一些植物中，木犀草苷含量显著高于木犀草素，如金银花叶中的木犀草素含量为0.0266％，而木犀草苷的含量为0.323％，后者是前者的12.1倍[王柯,王艳艳,赵东保,等.hplc法测定金银花不同部位中木犀草素及其苷的含量.河南大学学报(自然科学版),2011,41(1):39
‑
43]；从中药材酸浆宿萼中提取木犀草苷的得率可以达到1.28％[邓亚雷,王飞飞,曲丽萍.酸浆中木犀草苷提取工艺优化.食品安全质量检测学报,2021,12(4):1332
‑
1337]。木犀草苷具有木犀草素类似的生理活性，但某些活性远不如木犀草素，如李惠香等研究表明，木犀草素的抗炎活性显著优于木犀草苷[李惠香,张倩,柳亚男,等.木犀草素与木犀草苷的抗炎活性对比研究.烟台大学学报,2018,31(2):114
‑
120]。
[0004]
木犀草素作为药物或保健食品应用的前景广阔，但从植物材料中提取生产木犀草素的产率低，致使其价格较高。虽然有半合成方法的报道，但是半合成的前体仍然是植物来源的橙皮苷，原料成本较高。如上所述，有些植物材料中木犀草苷含量较高，其生产成本相对较低，如果以木犀草苷为原料，水解切除葡萄糖残基而转化为木犀草素，则可以拓宽其生产的途径。采用酸水解法，往往存在苷元结构容易被破坏，产生较多的副产物，导致产物收率低等问题，相比之下，酶法水解具有不破坏苷元结构、转化率高、副产物少的优点。目前，已有将酶法转化应用于木犀草素提取的研究报道，如孟庆焕等用果胶酶辅助乙醇提取法，从牡丹种皮中提取木犀草素的得率提高了4.3倍[孟庆焕,祖元刚,王化,等.酶解辅助乙醇
0.5g/l溶剂为自来水，初始ph 6.0
–
6.5。
[0015]
所述的德氏根霉lut
‑8‑
53菌株在发酵前，通常需要先经平板培养基活化培养制备孢子悬液，或经过种子培养基扩大培养制备种子液，然后用孢子悬液或种子液以体积浓度5％
‑
10％的量(优选5％)，接入产酶培养基进行产酶培养，所述德氏根霉lut
‑8‑
53发酵培养方法为：
[0016]
(1)活化培养：将德氏根霉lut
‑8‑
53接种于马铃薯平板培养基(pda)，于28
–
30℃恒温培养1
–
2d，获得德氏根霉lut
‑8‑
53孢子，加无菌生理盐水制备孢子悬液；所述的pda平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，溶剂为自来水，ph自然(实测6.5)；
[0017]
(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后德氏根霉lut
‑8‑
53孢子，加无菌生理盐水制备的孢子悬液，以体积浓度5％
–
10％的量(优选5％)接入马铃薯液体培养基(pdb)中，于30℃、200
–
250r/min恒温振荡条件下培养1
–
2d，得种子液；所述pdb液体培养基终浓度组成为：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，溶剂为自来水，ph自然(实测6.5)；
[0018]
(3)发酵培养：用步骤(1)活化培养后德氏根霉lut
‑8‑
53孢子悬液，或步骤(2)制备的种子液按体积浓度5％
–
10％的接种量接入产酶培养基，于30℃、200
–
250r/min恒温振荡条件下培养2
–
3d，获得发酵液(优选干菌体浓度为3.26
–
3.82g/l)。所述产酶培养基终浓度组成为：蔗糖10
–
15g/l，蛋白胨5
–
10g/l，酵母浸粉3
–
5g/l，nacl 5g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，cacl
2 0.5g/l溶剂为自来水，初始ph 6.0
–
6.5。
[0019]
进一步，优选所述产酶培养基终浓度组成为：蔗糖15g/l，蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，nacl 5g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，cacl
2 0.5g/l，溶剂为自来水，初始ph 6.0。
[0020]
本发明所述的木犀草素分离纯化的方法为：在生物转化反应结束后，转化体系用等体积的乙酸乙酯萃取1
–
2次，合并萃取液于圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，加入原转化体系体积1/10
–
1/5的甲醇溶解残留物；甲醇溶液用滤纸过滤，滤液于45℃下减压干燥，(优选滤液转入另一洁净圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干甲醇后，加少量甲醇溶解残留物，甲醇溶液转入洁净培养皿中，减压干燥后)，即得木犀草素粗品。
[0021]
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种利用德氏根霉lut
‑8‑
53发酵获得生物催化剂，以木犀草苷为底物，在底物浓度为5g/l时，木犀草素的转化得率为85.2％。本发明的技术优势有：(1)相比于酸水解法转化，转化专一性好，转化效率高，副产物少。(2)相比于纯酶法转化，生物催化剂的制备成本低，底物投料浓度高，产物得率高。本发明以及价格较低的木犀草苷为原料，微生物转化获得木犀草素，是一种可选的木犀草素生产方法，工艺具有生产成本低、生产效率高、环境污染小等优点。
(四)附图说明
[0022]
图1木犀草苷转化为木犀草素的化学反应式。
[0023]
图2德氏根霉lut
‑8‑
53菌落照片。
[0024]
图3hplc法分析木犀草素浓度的标准曲线。
[0025]
图4转化样品的hplc分析图谱，a为标准品木犀草苷和木犀草素的hplc图谱；b为实施例6的木犀草苷转化0h的hplc图谱；c为实施例6的木犀草苷经生物转化8h的hplc图谱。
(五)具体实施方式
[0026]
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0027]
实施例1转化菌株的分离与筛选
[0028]
将干燥的花生壳粉碎并过40目筛，得到花生壳粉。取25g花生壳粉于三角瓶中，加入25ml无菌水润湿(保持疏松状态)，于28℃恒温培养5d，再加入100ml无菌水制成悬液，然后用无菌水分别稀释1
×
10
‑6、1
×
10
‑7、1
×
10
‑8倍后，分别吸取0.1ml稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(pda)上，于28℃恒温培养2d，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜pda平板，置于28℃恒温培养2d，得孢子丰富的菌株13株(菌株编号见表1)，保存于4℃冰箱中备用。
[0029]
接种环分别挑取上述各个菌株的平板培养基上的孢子3环，接种到装有50ml初始产酶培养基中(250ml三角瓶装)，于30℃、200r/min振荡培养2d，加入木犀草苷甲醇溶液(即1mg的木犀草苷溶于0.5ml甲醇)，使转化体系中木犀草苷浓度为20mg/l。转化体系于30℃、150r/min恒温振荡12h。转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体，用50ml乙酸乙酯萃取1次，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干后用1ml甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤后，hplc分析样品中木犀草素的浓度。
[0030]
hplc分析不同菌株发酵液转化样品中木犀草素浓度，计算木犀草素的转化得率(表1)，由此比较不同菌株产酶转化木犀草苷为木犀草素的能力。13个菌株中，编号为lut
‑
8的菌株转化木犀草苷生成木犀草素得率最高，转化液中木犀草素的浓度为7.96mg/l，转化得率为62.4％。
[0031]
表1 不同菌株转化木犀草苷生成木犀草素的浓度和得率
[0032][0033]
所述的pda平板培养基，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成边长约为1cm的小方块，称取200g，加自来水1000ml，煮沸20min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到
1000ml，再加入20g葡萄糖、20g琼脂，ph自然(实测6.5)，加热至琼脂溶化后分装于三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9cm的无菌培养皿，每皿15
–
20ml。
[0034]
所述的初始产酶培养基按如下组成和方法配制：蔗糖10g/l，蛋白胨5g/l，酵母浸粉3g/l，nacl 5g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，溶剂为自来水，初始ph 6.0。
[0035]
所述hplc分析方法为：lc
‑
20ad高效液相色谱仪(日本岛津仪器有限公司)，色谱柱为phenomenex luna c18柱(5μm，250mm
×
4.6mm)，柱温为室温；体积比20∶80的乙腈和双蒸水(含0.5％体积浓度的冰醋酸)混合液为流动相，流速1.0ml/min，检测波长350nm，进样量20μl。由相同分析条件下的标准品木犀草素浓度—峰面积标准曲线(图3)，计算出测定样品中的木犀草素的浓度。
[0036]
所述的木犀草素转化得率按以下公式计算：
[0037][0038]
式中，286.2为木犀草素的分子量，448.4为木犀草苷的分子量。
[0039]
实施例2：转化菌种的诱变选育
[0040]
对菌株lut
‑
8进行紫外线照射诱变，筛选转化木犀草苷为木犀草素得率高的突变菌株，具体方法为：
[0041]
(1)孢子液的制备：菌株lut
‑
8接种pda平板，28℃培养2d后，平板中加5ml无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮后，全部孢子悬液转入含45ml无菌生理盐水的三角瓶中，室温振荡15min。孢子悬液经过滤除去菌丝(三角漏斗垫2层擦镜纸过滤)，在显微镜下用血球计数板对悬液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子数量在1
×
108个/ml。
[0042]
(2)诱变：诱变在红光下操作。分别取2.0ml上述孢子悬液和一枚无菌回形针于直径6cm的无菌培养皿中(共5皿)，培养皿置于磁力搅拌器上，在预热30min的15w紫外灯下，距离30cm分别照射1、2、3、4、5min。取0.5ml上述照射处理后的孢子液，用无菌水作适当倍数稀释后，分别移取0.1ml涂布pda平板。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的pda平板用黑布包裹，于28℃培养1d，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。
[0043]
(3)筛选：挑取致死率在90％以上pda平板上的菌落转接新鲜pda平板，按实施例1所述的方法，对突变菌株进行筛选。经过2轮筛选，从85个菌株中筛选获得一株编号为lut
‑8‑
53的菌株。将菌株lut
‑8‑
53孢子接种到装有50ml初始产酶培养基中(250ml三角瓶装，组成同实施例1)，于30℃、200r/min振荡培养2d，获得含菌体的发酵液。向50ml含菌体的发酵液中加入不同浓度的木犀草苷甲醇溶液(分别用0.5ml甲醇溶解的1mg木犀草苷，使木犀草苷加入浓度为20mg/l；用1.0ml甲醇溶解的0.15g木犀草苷，使木犀草苷加入浓度为3g/l；用1.0ml甲醇溶解的0.25g木犀草苷，使木犀草苷加入浓度为5g/l)，转化体系于30℃、150r/min恒温振荡12h，同实施例1方法计算木犀草素的转化得率。在木犀草苷浓度为20mg/l时，转化12h，木犀草素的转化得率达到97.3％，是出发菌株转化得率62.4％的1.56倍；在木犀草苷浓度为3g/l时，转化12h，木犀草素的转化得率达到82.2％，是出发菌株转化得率37.2％的2.21倍。在木犀草苷浓度为5g/l时，转化12h，木犀草素的转化得率达到68.1％，是出发菌株转化得率26.6％的2.56倍，可以看出，筛选获得的菌株lut
‑8‑
53产酶转化木犀草
苷为木犀草素的活力大幅度提高。
[0044]
菌株lut
‑8‑
53经过转接传代5次，每代菌株发酵制备的发酵液转化木犀草苷，木犀草素的转化得率波动范围小于10％，说明该菌株遗传稳定性良好。
[0045]
实施例3：转化菌株的分类鉴定
[0046]
菌株lut
‑8‑
53接种于马铃薯琼脂平板培养基上，于28℃培养2d，形成铺满全部培养皿的菌落，菌丝稠密，生长初期呈灰白色，后逐渐变为灰棕色；表面孢子囊丰富，匍匐菌丝和假根较多；孢囊梗直立或弯曲，有分枝；孢子囊呈球形，灰褐色或褐色；孢囊孢子呈球形或椭圆形，直径6
–
10μm。德氏根霉lut
‑8‑
53的菌落照片见图2。
[0047]
将菌株lut
‑8‑
53交由生工生物工程(上海)有限公司测得其rdna核糖体内转录间隔区(rdna
‑
its)的核苷酸序列如seq id no.1所示。该序列在ncbi(national center for biotechnology information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行blast比对，与31株已知的德氏根霉(rhizopus delemar)有大于99％的同源性。根据菌株lut
‑8‑
53菌落特征和rdna
‑
its核苷酸序列比对结果，可以确定菌株lut
‑8‑
53的生物学分类位置为(参考mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(fungi)，毛霉门(mucoromycota)，毛霉纲(mucoromycetes)，毛霉目(mucorales)，毛霉科(mucoraceae)，根霉属(rhizopus)，德氏根霉(rhizopus delemar)。
[0048]
rdna
‑
its序列为：
[0049]
gtggaagtaaaaatcgtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaattatgttaaagcgccttacctcttagggtttcctctggggtaagtgattgcttctacactgtgaaaatttggctgagagactcagactggtcatgggtagacctatctggggtttgatcgatgccactcctggtttcaggagcacccttcataataaacctagaaattcagtattataaagtttaataaaaaacaacttttaacaatggatctcttggttctcgcatcgatgaagaacgtagcaaagtgcgataactagtgtgaattgcatattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcagcttgcactctatggtttttctatagagtacgcctgctgcagtatcatcacaaacccacacataacatttgtttatgtggtaatgggtcgcatcgctgttttattacagtgagcacctaaaatgtgtgtgattttctgtctggcttgctaggcaggaatattacgctggtctcaggatctttttctttggttcgcccaggaagtaaagtacaagagtataatccagcaactttcaaactatgatctgaagtcaggtgggattacccgctgaacttaagcatatcaataggccggagga。
[0050]
综上，从花生壳粉的微生物富集物中分离的菌株lut
‑
8，经紫外线诱变后，筛选获得了菌株lut
‑8‑
53，即德氏根霉(rhizopus delemar)lut
‑8‑
53，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：gdmcc no:61727，保藏日期2021年6月21日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
[0051]
实施例4：转化工艺1
[0052]
以德氏根霉lut
‑8‑
53为转化菌种，制备含菌体的发酵液转化木犀草苷为木犀草素，优选的工艺可以按如下步骤操作：
[0053]
(1)将4℃冰箱中保存的德氏根霉lut
‑8‑
53平板菌种接种于新鲜pda平板，于28℃恒温培养2d，所述的pda平板培养基组成和制备方法同实施例1；
[0054]
(2)加5ml的无菌生理盐水于步骤(1)制备的lut
‑8‑
53平板培养物中，用接种环搅动菌丝，使孢子悬浮到生理盐水中，吸取2.5ml孢子悬液接种至50ml产酶培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养3d后，得干菌体浓度为3.37g/l的发酵液。所述的产酶培养基终浓度组成为：蔗糖15g/l，蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，nacl 5g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，
cacl
2 0.5g/l，溶剂为自来水，初始ph 6.0。250ml的三角瓶装50ml产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
[0055]
(3)0.25g的木犀草苷溶于1ml甲醇中，加入步骤(2)制备的50ml发酵液中构成转化体系，使转化体系中木犀草苷的浓度为5g/l(转化体系体积按50ml计)。转化体系于30℃、150r/min恒温振荡12h。
[0056]
(4)转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体，滤液用50ml乙酸乙酯萃取2次，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后，用5ml甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液采用hplc分析样品中木犀草素的浓度。
[0057]
hplc分析表明，按本实施例方法，用含德氏根霉lut
‑8‑
53菌体的发酵液转化木犀草苷，在其浓度为5g/l时，转化结束后，转化体系中的木犀草素浓度为2.83g/l，转化得率为88.7％。
[0058]
实施例5：转化工艺2
[0059]
以德氏根霉lut
‑8‑
53为转化菌种，制备含菌体的发酵液转化木犀草苷为木犀草素，优选的工艺可以按如下步骤操作：
[0060]
(1)将4℃冰箱中保存的德氏根霉lut
‑8‑
53平板菌种接种于新鲜pda平板培养基，平板于30℃恒温培养2d，所述的pda平板培养基组成和制备方法同实施例1；
[0061]
(2)加5ml的无菌生理盐水于步骤(1)制备lut
‑8‑
53平板培养物中，用接种环搅动菌丝，使孢子悬浮到生理盐水中，吸取5.0ml孢子悬液接种至100ml产酶培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养3d后，得干菌体浓度为3.26g/l的发酵液。所述的产酶培养基终浓度组成为：蔗糖15g/l，蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，nacl 5g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，cacl
2 0.5g/l，溶剂为自来水，初始ph 6.0。250ml的三角瓶装100ml产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
[0062]
(3)0.5g的木犀草苷溶于2ml甲醇中，加入步骤(2)制备的100ml发酵液中构成转化体系，使转化体系中木犀草苷的浓度为5g/l(转化体系体积按100ml计)。转化体系于35℃、200r/min恒温振荡8h。
[0063]
(4)转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体，滤液用100ml乙酸乙酯萃取2次，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后，用10ml甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液采用hplc分析样品中木犀草素的浓度。
[0064]
hplc分析表明，按本实施例方法，用含德氏根霉lut
‑8‑
53发酵制备的发酵液转化木犀草苷，在其浓度为5g/l时，转化结束后，转化体系中的木犀草素浓度为2.77g/l，转化得率为86.8％。
[0065]
实施例6：转化放大及木犀草素的分离
[0066]
在实施例5的基础上，增加了德氏根霉lut
‑8‑
53种子扩大培养步骤，发酵和转化体系放大到500ml，具体工艺步骤如下：
[0067]
(1)将4℃冰箱中保存的德氏根霉lut
‑8‑
53平板菌种接种于新鲜pda平板培养基，平板于30℃恒温培养1d，所述的pda平板培养基组成和制备方法同实施例1；
[0068]
(2)加5ml的无菌生理盐水于步骤(1)制备lut
‑8‑
53平板培养物中，用接种环搅动菌丝，使孢子悬浮到生理盐水中，吸取2.5ml孢子悬液接种至50ml马铃薯液体培养基(pdb)中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养1d，得干菌体浓度为1.27g/l的种子液。所述的
pdb配制方法为：马铃薯洗净去皮切成边长约为1cm的小方块，称取200g，加自来水1000ml，煮沸20min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000ml，再加入葡萄糖20g，mgso4·
7h2o 1g，ph自然(实测6.5)。250ml的三角瓶装50ml的pdb培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
[0069]
(3)步骤(2)种子液以体积浓度10％(即50ml)的接种量接种至500ml产酶培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养2d后，得干菌体浓度为3.82g/l的发酵液。所述的产酶培养基终浓度组成为：蔗糖15g/l，蛋白胨10g/l，酵母浸粉5g/l，nacl 5g/l，mgso4·
7h2o 1g/l，cacl
2 0.5g/l，溶剂为自来水，初始ph 6.0。2l的三角瓶装500ml产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
[0070]
(4)2.5g的木犀草苷溶于10ml甲醇中，加入步骤(2)制备的500ml发酵液中构成转化体系，使转化体系中木犀草苷的浓度为5g/l(转化体系体积按500ml计)。转化体系于35℃、200r/min恒温振荡8h。
[0071]
(5)转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体，滤液用500ml乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液于圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，再加入100ml甲醇溶解残留物；甲醇溶液用滤纸过滤后，转入另一洁净圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干甲醇后，加10ml甲醇溶解残留物，甲醇溶液转入洁净培养皿中，减压干燥后得2.71g干燥品。
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称取步骤(5)制备的木犀草素样品1mg溶解于5ml甲醇中，经0.45μm微孔滤膜过滤后，hplc分析样品中木犀草素的浓度，结果表明，按本实施例方法，制备的木犀草素纯度为50.1％，转化得率为85.2％。木犀草素标准品、未转化样品和转化样品的hplc分析图谱见图4。