一种子痫前期诊断标志物及其在制备靶点药物中的应用的制作方法

1.本发明属于生物学技术领域，尤其涉及一种子痫前期诊断标志物及其在制备靶点药物中的应用。


背景技术：

2.子痫前期是女性妊娠期所特有的一种疾病，该疾病的特点为女性妊娠20周后新发高血压和尿蛋白。根据发病时间的不同，子痫前期分为早发型子痫前期和晚发型子痫前期。子痫前期是孕产妇发病率和死亡率高的主要原因，因此实现子痫前期的早诊断和早治疗对于患者来说十分的重要。
3.目前，关于子痫前期产生的原因有多种机制，如胎盘氧化应激，螺旋动脉重塑，内皮功能障碍和全身炎症中。但是不管是那种机制，均与胎盘的发生发展相关，因此，更加详细的研究胎盘发生发展的原因对于更好的治疗子痫前期具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种子痫前期诊断标志物及其在制备靶点药物中的应用。为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：首先，本发明提供了检测linc01516基因表达水平的试剂在制备子痫前期诊断试剂盒中的应用。
5.优选地，所述检测linc01516基因表达水平的试剂是指特异性检测linc01516基因表达水平的引物。
6.优选地，所述引物的序列如seq id no.1
‑
2所示。
7.其次，本发明提供了一种筛选子痫前期候选治疗药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）使用待筛选的药物处理人绒毛膜滋养层细胞htr
‑
8/svneo；（2）检测人绒毛膜滋养层细胞htr
‑
8/svneo中linc01516的表达水平；其中，如果待筛选的药物可以抑制linc01516的表达水平，则该药物是子痫前期的候选治疗药物。
8.其次，本发明提供了抑制linc01516表达的抑制剂在制备子痫前期治疗药物中的应用。
9.优选地，所述抑制剂为sirna，所述sirna的序列如seq id no.6
‑
7所示。
10.其次，本发明提供了抑制linc01516表达的抑制剂在制备人绒毛膜滋养层细胞htr
‑
8/svneo增殖促进剂中的应用，其特征在于，所述抑制剂为sirna，所述sirna的序列如seq id no.6
‑
7所示。
11.其次，本发明提供了抑制linc01516表达的抑制剂在制备促增殖蛋白cyclin
‑
d1蛋白表达促进剂中的应用，其特征在于，所述抑制剂为sirna，所述sirna的序列如seq id no.6
‑
7所示。
12.除此之外，本发明提供了抑制linc01516表达的抑制剂在制备抑增殖蛋白p21蛋白表达抑制剂中的应用，其特征在于，所述抑制剂为sirna，所述sirna的序列如seq id no.6
‑
7所示。
13.本发明的有益效果是：本发明的有益效果在于，本发明通过实验发现基因linc01516在子痫前期患者的胎盘组织中高表达，因此可将其用于检测子痫前期疾病。其次，使用sirna抑制linc01516表达后，可以有效的促进人绒毛膜滋养层细胞htr
‑
8/svneo的增殖，并且能够有效的促进cyclin
‑
d1蛋白表达并抑制p21蛋白表达。
附图说明
14.图1 linc01516在正常胎盘组织和子痫前期胎盘组织中的表达差异；图2 表达差异的roc曲线。
15.图3 sirna
‑
1和si
‑
rna
‑
2的抑制效果检测；图4 集落形成实验的检测结果；图5 western blot实验的检测结果。
具体实施方式
16.为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
17.收集本院2020年1月
‑
2020年12月间首次接受剖宫产分娩的35例子痫前期患者（pe组）和35例正常产妇（正常组）的胎盘组织。两组均排除多胎妊娠、感染性疾病、化学药物依赖、孕妇吸烟、胎儿先天畸形以及其他妊娠合并症及并发症。pe患者的诊断标准为：20孕周后第一次出现高血压综合征，至少2次连续测量血压≥140/90mmhg，母体蛋白尿≥300mg/24h或随机尿蛋白（ ）。组织收集和实验均经医院伦理委员会批准，并获得所有患者的书面知情同意。
18.实施例1qrt
‑
pcr检测linc01516在胎盘组织中的基因表达情况（1）总rna提取1.称取50mg胎盘组织于液氮预冷处理的研钵中，快速研磨为粉末，加入1ml trizol，使用移液枪快速的吹打混匀；2.静置10min后，转移至离心管中，将离心管放入到低温高速离心机中，4℃ 12000rpm转速离心10min；3.离心后，将上清转移至新的离心管中，加入200μl氯仿，颠倒混匀30s，室温静置5min；4.将离心管放入到低温高速离心机中，4℃ 12000rpm转速离心15min，离心完成后可见溶液分为三层，吸取400μl上层的上清至新的离心管中，加入400μl预冷的异丙醇，混匀后室温静置10min；5.将离心管放入到低温高速离心机中，4℃ 12000rpm离心15min，弃去上清，加入1mldepc水配置的75%乙醇重悬沉淀；6.将离心管放入到低温高速离心机中，4℃ 7500rpm离心15min，去除上清，超净工
作台中静置待乙醇完全蒸发，加入40μl depc水溶解沉淀，并测定rna的浓度和纯度。
19.（2）qrt
‑
pcr检测1.按照如下反应系统配置反应液：试剂名称添加量5
×
primescriptbuffer4μlprimescriptrtenzymemixi1μloligodtprimer1μlrandom6primers1μltotalrna1μgrnasefreedh2o补足至20μl2.按照如下反应条件进行逆转录反应：37℃ 15min；85℃ 5s；4℃ 保持；3.按照如下反应系统配置反应液：成分体积sybr
⑩
premixextaqii10μlpcrforwardprimer0.8μlpcrreverseprimer0.8μlroxreferencedye0.4μldna模板2μldh2o6μltotal
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20μllinc01516的引物序列如下：forward primer: 5
’‑
ttaggagaggaagccctgct
‑3’
,seq id no.2；reverse primer: 5
’‑
gcacactggcagggaatagt
‑3’
,seq id no.3；β
‑
actin的引物序列如下：forward primer: 5
’‑
cttccagccttccttcctgg
‑3’
，seq id no.4；reverse primer: 5
’‑
aatgccagggtacatggtgg
‑3’
，seq id no.5；4.按照如下反应条件进行qrt
‑
pcr反应：95℃ 60s预变性；95℃ 15s，60℃ 40s，重复38个循环；5. 以β
‑
actin为内参，采用2
‑∆∆
ct 的方法计算linc01516的相对表达量。
20.实验结果如图1所示，其中，pe组中linc01516的相对表达量为2.487
±
0.899，说明linc01516在子痫前期标本中的表达量显著高于正常对照组标本。
21.绘制roc曲线，曲线如图2所示，结果如下：预测变量预测结局曲线下面积(auc)置信区间(ci)linc01516pevsnc0.9510.909
‑
0.993auc越接近于1，说明诊断效果越好。auc在 0.5～0.7时有较低准确性，auc在0.7～0.9时有一定准确性，auc在0.9以上时有较高准确性。
22.从上表可以看出，在预测nc和pe结局上，变量linc01516的预测能力有较高准确性（auc = 0.951，ci = 0.909
‑
0.993），因此可将其用于辅助诊断子痫前期。
23.实施例2设计linc01516的sirna由于胎盘的发生发展主要与人绒毛膜滋养层细胞有关，因此（1）设计2条linc01516的sirna，详细的序列如下：si
‑
rna
‑
1sense:gguuuguucuaaguacaaaca, seq id no.6；antisense:uuuguacuuagaacaaaccag, seq id no.7；si
‑
rna
‑
2sense: gcucaaaugacaaguuuaaau,seq id no.8；antisense: uuaaacuugucauuugagcag，seq id no.9；（2）将人绒毛膜滋养层细胞htr
‑
8/svneo接种于6孔板中，过夜培养后，按照lip2000说明书指示转染si
‑
nc和si
‑
rna
‑
1和si
‑
rna
‑
2,对照组只添加脂质体；（3）转染48h后，去除培养基，提取rna并且检测linc01516的表达水平。
24.实验结果如图3所示，可以看出，si
‑
nc（0.984
±
0.046）对于linc01516的表达水平没有明显的效果，而si
‑
rna
‑
1（0.245
±
0.045）和si
‑
rna
‑
2（0.384
±
0.067）均能够抑制linc01516的表达水平，因为si
‑
rna
‑
1的抑制效果更加的显著，所以选择其进行后续的细胞机制实验。
25.实施例3克隆形成实验检测linc01516对于滋养层细胞细胞增殖的影响（1）将约800个转染si
‑
nc和si
‑
rna
‑
1的htr
‑
8/svneo的细胞接种于6孔细胞培养板中；（2）将细胞培养板置于细胞培养箱中进行培养，每2
‑
3天进行一次换液；（3）培养10天后，去除培养基，使用pbs进行轻轻的清洗细胞；（4）加入4%多聚甲醛固定细胞20min，去除多聚甲醛，使用pbs清洗；（5）加入结晶紫染色液染色30min，去除染色液，使用pbs清洗后，于显微镜下进行拍照。
26.实验结果如图4所示，可以看出，抑制了linc01516之后，滋养层细胞的增殖能力明显加强，说明抑制linc01516可以有效的促进滋养层细胞的增殖能力。
27.实施例4western blot检测linc01516对于滋养层细胞cyclin
‑
d1和p21蛋白表达的影响（1）取出分别转染si
‑
nc和si
‑
rna
‑
1的细胞，吸取培养基，加入pbs洗涤细胞，加入100ul含1%蛋白酶抑制剂的ripa裂解液；（2）冰上静置30min，使用细胞刮板刮下贴壁细胞，转移至ep管中，4℃ 12500rpm离心15min，将上清转移已至新的ep管中；（3）每组取出5ul使用碧云天bca蛋白质定量试剂盒测定蛋白浓度，添加5
×
sds上样缓冲液，煮沸5min，得到蛋白样品；（4）配置12%分离胶，充分混匀后，灌胶至玻璃板的2/3处，加入无水乙醇，室温下聚合30min；（5）去除无水乙醇，配置5%浓缩胶，充分混匀后，将分离胶灌满玻璃板，插好梳子，
室温下静置20min；（6）加入蛋白样品10ul，蛋白marker 5ul，调整电压为恒压80v，待样品在浓缩胶和分离胶交界处被压成整齐的条带后，调整电压为110v,直至上样缓冲液的蓝色条带接近胶的下缘为止；（7）裁剪和胶大小相对应的pvdf膜，将其浸泡于甲醇中10s，然后浸泡于缓冲液中，在转膜夹上，垫上一张海绵垫，三层滤纸，将胶平铺于滤纸上，将浸泡后的pvdf膜盖于胶上，盖上三层滤纸，最后盖上一张海绵垫，将电转夹放入电转槽中，80v电转80min；（8）电转结束后，将pvdf膜放入适量的封闭液，室温置于摇床上封闭1h；（9）封闭后，将裁剪pvdf膜，将膜放入cylin
‑
d1，p21和gapdh一抗稀释液中，4℃孵育过夜，使用tbst洗膜3次；（10）加入二抗，室温置于摇床上孵育1h，tbst洗膜3次；（11）进行显影曝光，保存图片。
28.实验结果如图5所示，从图中可以看出，抑制了linc01516之后，促进细胞增殖的cyclind1蛋白的表达量上调，而抑制细胞增殖的p21蛋白的表达下调，说明抑制linc01516能够提供促进cyclin
‑
d1和抑制p21来促进滋养层细胞的增殖。