一种直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂及转染方法与流程

1.本发明属于生物工程的技术领域，具体涉及一种直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂及转染方法。


背景技术：

2.杆状病毒(baculovirus)由壳、内核和壳外包膜结构组成，形态为杆状。杆状病毒主要是鳞翅目昆虫的病原体，同时也感染膜翅目，双翅目，鞘翅目和毛鳞翅目等节肢动物。杆状病毒根据形态和结构被分为三个属：核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，npvs)，颗粒性病毒(granulosis virus，gvs)，非封闭杆状病毒(nonoccluded baculoviruses，nobs)。野生核型多角体病毒被29kda多角体蛋白包被，形成多角体结构。多角体非常稳定，能长久保存在植物表面和土壤中。但受到鳞翅目昆虫中肠的高ph>10影响时，会溶解并释放出感染性病毒粒子，从而感染宿主。核型多角体病毒由于容易获得，因此得到广泛研究和应用。
3.核型多角体病毒(npv)在感染晚期大量表达多角体蛋白，杆状病毒表达载体系统利用这一特征，通过强多角体蛋白启动子来驱动外源基因的表达。随着基因工程技术的发展，核型多角体病毒表达载体系统的构建越来越完善，目前已和酵母、大肠杆菌和哺乳动物并称为四大表达系统。
4.柞蚕核型多角体病毒(antheraea pemyi nuclearpolyhedrosisvirus，apnpv)是危害柞蚕的主要病原体之一，具有高度的特异性。随着基因工程的发展，柞蚕核型多角体表达系统日益完善，利用该系统已成功表达绿色荧光蛋白和人生长激素等多种蛋白。柞蚕蛹作为表达蛋白的宿主，个体大，具有滞育的特性，使其更易于长期保存。bac
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to
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bac技术的产生极大提高了构建柞蚕核型多角体重组病毒的效率，缩短了表达外源蛋白周期，对工业化生产有很大意义。
5.目前在利用apnpv于柞蚕蛹体内进行蛋白表达的过程中，需要经过基因克隆、构建载体、细胞转染、重组病毒包装与筛选、外源蛋白表达等步骤。其中细胞转染、重组病毒包装与筛选不仅是此过程的重点，也是难点。原因主要有：
6.1、由于柞蚕核型多角体病毒的寄主专一性，目前还没有发现对该病毒特别敏感的细胞用来进行转染、形成病毒包装等实验。
7.2、转染实践中，昆虫细胞培养条件非常复杂、成本也特别昂贵。
8.3、目前的tn5细胞虽然能够被柞蚕核型多角体病毒感染，但转染效率普遍较低，操作也特别复杂，且重组病毒感染柞蚕时病毒活性较低。
9.综上，如何解决在柞蚕蛹体内进行蛋白表达过程中获得重组病毒是本领域急需解决的问题。


技术实现要素：

10.鉴于此，本发明提供了一种直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂及转染方法。该方法通过以疏水性化合物对聚乙烯亚胺进行疏水修饰所得到的两亲性共聚物为转染试剂，将柞蚕核型多角体重组病毒杆粒dna与转染试剂混合，直接注入柞蚕蛹体内进行体内转染获得重组杆状病毒，进而表达外源蛋白，从而跳过转染细胞进行病毒包装这个步骤。该方法不仅解决了细胞转染过程中的难点，同时简化了实验流程，提高了工作效率，节约了经济成本，为昆虫杆状病毒表达载体在柞蚕体内进行蛋白表达的研究奠定了基础。
11.第一方面，本发明提供一种直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂，所述的转染试剂为一种两亲性聚合物，其为以疏水性化合物对聚乙烯亚胺进行疏水修饰的聚乙烯亚胺衍生物，结构如下式i所示：
[0012][0013]
式中r代表疏水性化合物，n代表不同分子量的聚乙烯亚胺。
[0014]
本发明的实施方案中，所述的疏水性化合物选自胆酸、油酸、聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物和脂肪酸。
[0015]
本发明的实施方案中，所述的聚乙烯亚胺的分子量为1800
‑
50000，所述聚乙烯亚胺为线性聚乙烯亚胺或支化聚乙烯亚胺。
[0016]
本发明一个优选的实施方案中，所述的转染试剂为以聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物对支化聚乙烯亚胺进行疏水修饰所得到，其中聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物结构如下式ii所示。
[0017][0018]
式中x，y代表聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物中乳酸与羟基乙酸的摩尔比不同，作为优选，乳酸与羟基乙酸的摩尔比为50：50。
[0019]
第二方面，本发明提供了上述的直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂的制备方法，其包括以下步骤：
[0020]
(1)将疏水性化合物溶于无水n，n
‑
二甲基甲酰胺(dmf)中，终浓度为10～100mg/
ml，在反应液中加入n
‑
羟基丁二酰亚胺(nhs)与二环己基碳二亚胺(dcc)，两者的终浓度分别为1～10mg/ml与2～20mg/ml，搅拌3
‑
5h使其充分溶解。
[0021]
(2)将聚乙烯亚胺溶于无水dmf中，搅拌1
‑
2h，终浓度为10～100mg/ml。
[0022]
(3)用0.45μm的滤膜过滤步骤1)中获得的疏水性化合物溶液，除去反应生成的杂质，将过滤后的溶液滴加到和步骤2)中获得的聚乙烯亚胺溶液中，室温搅拌24
‑
48h。
[0023]
(4)将步骤3)中反应后的溶液用8000
‑
14000的透析袋透析48
‑
72h，除去dmf溶剂，将透析后的溶液过0.45μm的滤膜除去未反应的疏水性化合物。
[0024]
(5)将步骤4)中过滤后的溶液进行冷冻干燥，得到转染试剂，将转染试剂置于
‑
20℃存储备用。
[0025]
第三方面，本发明提供一种直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染方法，其包括以下步骤：
[0026]
(1)分别准备dna、待转染宿主柞蚕蛹，其中dna为柞蚕核型多角体重组病毒杆粒dna，待转染宿主柞蚕蛹为滞育柞蚕蛹。
[0027]
(2)将步骤1)中准备的dna缓慢加入转染试剂中，混匀后37℃孵育30min，得到转染试剂与dna复合物。
[0028]
(3)将转染试剂与dna复合物注射到柞蚕蛹体内。
[0029]
所述步骤2)中转染试剂与dna溶液的质量比为0.1～20，dna加入转染试剂中使dna的终浓度为0.1
‑
0.3mg/ml。
[0030]
所述步骤3)中每只柞蚕蛹的转染试剂与dna复合物注射量为50～150μl。
[0031]
本发明与现有技术相比具有如下优点：
[0032]
本发明所提供的直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染试剂，通过疏水性化合物对聚乙烯亚胺进行疏水修饰的得到，原料成本低廉，制备方法简单。
[0033]
本发明所提供的直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒的转染方法，省去了在细胞内进行病毒包装、筛选的步骤，简化了原有的实验流程，提高了工作效率，节约了经济成本，为昆虫杆状病毒表达载体在柞蚕体内进行蛋白表达的研究奠定了基础，也为杆状病毒在昆虫中的应用指明了一条新的方向。
附图说明
[0034]
图1：bpei与bpei
‑
plga的红外光谱图。
[0035]
图2：bpei
‑
plga与质粒dna形成复合物在不同质量比时的平均粒径图。
[0036]
图3：bpei
‑
plga与质粒dna形成复合物在不同质量比时的zeta电位图。
[0037]
图4：bpei
‑
plga与质粒dna形成复合物在不同质量比时的凝胶电泳图。
[0038]
图5：绿色荧光蛋白egfp在柞蚕蛹中表达，其中a为荧光视野；b为白光视野。
具体实施方式
[0039]
以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规
方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040]
具体地，以支化聚乙烯亚胺结合聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物(bpei
‑
plga)为实施例对本发明作进一步详细说明。
[0041]
实施例1：转染试剂bpei
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plga的制备
[0042]
将600mg分子量为4000的聚乳酸
‑
羟基乙酸共聚物(plga)溶于15ml无水n，n
‑
二甲基甲酰胺(dmf)中，在反应液中加入n
‑
羟基丁二酰亚胺(nhs)27.6mg，与二环己基碳二亚胺(dcc)49.6mg，搅拌4h以活化plga的羧基端基。将分子量为25000的支化聚乙烯亚胺(bpei)625mg溶于15ml无水dmf中，搅拌1h使bpei充分溶解。其中plga购于济南岱罡生物，bpei、nhs、dcc购于sigma。
[0043]
用0.45μm滤膜过滤活化后的plga溶液，除去反应生成杂质，将过滤后的plga溶液滴加到bpei溶液中，室温下搅拌反应36h。用截留分子量为8000
‑
14000的透析袋透析反应后的溶液，透析48h以除去dmf溶剂，将透析后的溶液过0.45μm滤膜除去未反应的plga。最后，将过滤后的溶液进行冷冻干燥，得到转染试剂bpei
‑
plga，将转染试剂置于
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20℃存储备用。转染试剂bpei
‑
plga的红外光谱如图1所示。图中可以看出，plga中的羧基与bpei上伯胺结合生成了酰胺键。
[0044]
实施例2：转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒
[0045]
(1)bpei
‑
plga/dna复合物的制备
[0046]
取2μg apnpv
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bacmid
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egfp杆粒dna，与不同质量bpei
‑
plga混合，制备不同质量比的bpei
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plga/dna复合物，37℃孵育30min，用马尔文粒径仪测量不同质量比的bpei
‑
plga/dna复合物的粒径分布及zeta电势，结果如图2、图3所示。
[0047]
称取700mg琼脂糖，加入到70ml tae缓冲液中，微波炉加热煮沸，冷却后配置凝胶，将不同质量比的bpei
‑
plga/dna复合物混合液上样，110v电泳30min，结果如图4所示。
[0048]
(2)转染柞蚕蛹
[0049]
取滞育期的柞蚕蛹，用75％酒精轻轻擦拭蛹表皮，使其消毒。将制备的质量比5：1的bpei
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plga/dna复合物150μl/只注射到柞蚕蛹中，注射150μl/只的不含重组病毒的grace’s insect medium作为对照组，注意不要注射到中肠等器官中。将注射bpei
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plga/dna复合物的柞蚕蛹室温培育12天，取血淋巴进行荧光观测，结果如图5所示。
[0050]
以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。