经修饰用于转谷氨酰胺酶缀合的抗体、其缀合物以及方法和用途与流程

经修饰用于转谷氨酰胺酶缀合的抗体、其缀合物以及方法和用途
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2018年12月12日提交的美国临时申请序列号62/778,437的35 u.s.c.
§
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2.通过引用以其整体并入本文的是命名为“181031_seqt_13143wopct_yc.txt”的序列表，其包含包括本文公开的核酸和/或氨基酸序列的seq id no:1至seq id no:103。序列表已经通过efs
‑
web以ascii文本格式随同提交，因此构成了其纸质和计算机可读形式。序列表最初是在2018年10月31日使用patentin 3.5创建的，并且大小为约39kb。


背景技术：

3.本公开文本涉及可由酶即转谷氨酰胺酶缀合的经修饰的抗体和由此类抗体制备的缀合物。
4.已引起目前强烈关注的一种类型的生物制剂是其中抗体与配偶体分子共价连接的生物制剂(“抗体
‑
药物缀合物”、“adc”、“缀合物”或“免疫缀合物”)。因此，缀合物包含三种组分：(1)所述抗体、(2)所述配偶体分子和(3)共价接合前两种组分的接头。
5.所述配偶体分子可以是治疗剂，如抗癌药物、佐剂、另一种蛋白质或放射性同位素。所述抗体是其抗原由靶细胞或组织表达的抗体。所述抗体通过其与抗原的结合而用于将所述缀合物递送至靶标。一旦到达那里，共价连接的切割或抗体的降解导致治疗剂在靶标位置处的释放。相反，当所述缀合物在血液系统中循环时，所述治疗剂由于其与抗体的共价连接而保持无活性，从而降低了副作用的风险。关于在抗癌治疗中的缀合物的综述，参见gerber等人2013。
6.作为治疗剂的替代，所述配偶体分子可以是用于诊断、定位疾病部位或监测医学状况的测定剂。在此类情况下，所述测定剂可以是例如生物素、荧光标记、放射性标记或氘代聚合物。smith等人2019披露了用于mri成像的包含氘代聚合物的缀合物。在此类情况下，在靶位点处的接头的切割不是必需的，并且实际上可能是不希望的。对于此类用途，可以将接头设计为不可切割的类型。
7.在制备缀合物中的关键步骤是共价连接步骤，也称为缀合步骤。已经披露了用于实现缀合的许多方法。最近引起人们极大兴趣的方法是由酶即转谷氨酰胺酶(ec 2.3.2.13)介导的缀合。
8.已知许多转谷氨酰胺酶变体，其由不同的生物体自然产生或由生物工程制备。食品工业中常用于组织化(texturing)蛋白质的转谷氨酰胺酶变体是通过发酵或重组表达获得的茂原链霉菌(streptomyces mobaraensis)转谷氨酰胺酶。在本文中，除非指明特定的类型或来源，否则通常使用术语“转谷氨酰胺酶”。
9.转谷氨酰胺酶在谷氨酰胺(胺受体，或相对地，酰基供体)的甲酰胺侧链与赖氨酸(胺供体，或相对地，酰基受体)的ε
‑
氨基基团之间形成酰胺键。就特异性而言
(specificity
‑
wise)，转谷氨酰胺酶关于谷氨酰胺残基具有选择性，要求所述谷氨酰胺残基位于蛋白质环的柔性部分中，并且侧接某些氨基酸，但是关于赖氨酸残基则是各式各样的，例如容易接受亚烷基氨基化合物的氨基基团作为赖氨酸ε
‑
氨基替代物。参见fontana等人2008。
10.在典型的转谷氨酰胺酶介导的缀合中，谷氨酰胺残基位于抗体上，而氨基基团位于接头
‑
配偶体分子部分上，如下所示：
11.谷氨酰胺残基在多肽链上的定位对其作为胺受体的可行性具有很大影响。通常，抗体上的谷氨酰胺残基均不可用，并且需要抗体的一些修饰以使其可用。典型地，使抗体在重链的天冬酰胺297(n297)处糖基化(n
‑
连接的糖基化)。jeger等人2010披露了通过n297a取代消除糖基化位点或翻译后酶促去糖基化进行的抗体的去糖基化使得附近的谷氨酰胺295(q295)可用于通过茂原链霉菌(s.mobaraensis)转谷氨酰胺酶的转酰胺基反应。他们进一步显示n297q取代不仅消除糖基化，而且还引入也作为胺受体的第二谷氨酰胺残基(在位置297处)。因此，简单的去糖基化产生每个抗体两个转谷氨酰胺酶反应性谷氨酰胺残基(每条重链一个，在q295处)，而具有n297q取代的抗体具有四个此类谷氨酰胺残基(每条重链两个，在q295和q297位置处)。
12.除了由jeger等人2010披露的n297a和n297q取代外，存在关于修饰抗体或另一种蛋白质以使其成为转谷氨酰胺酶的底物的其他公开文本。(a)strop等人2017和farias等人2016披露了用含有谷氨酰胺的标签(如llqgg、lslsqg、gggllqgg、gllqg等)工程化的抗体fc区，其中所述标签中的谷氨酰胺可以充当胺受体并且位于抗体重链或轻链的多个位置(包括其羧基末端)处。(b)chen等人2005披露了用qskvx标签修饰蛋白质，其中x是l或i，然后所述蛋白质可以与转谷氨酰胺酶缀合。(c)fischer等人2015披露了将下式的含有谷氨酰胺(q)的标签掺入缺乏fc结构域的抗体片段中：(q)
‑
nh
‑
(c)
‑
x
‑
l
‑
(v
‑
(y
‑
(m或z)
z
)
q
)
r
。(d)rao
‑
naik等人2018披露了将含有谷氨酰胺的重链c末端延伸附加到抗体上以使其具有转谷氨酰胺酶反应性。
13.在修饰抗体以使其具有转谷氨酰胺酶反应性的补充方法中，rao
‑
naik等人2017披露了修饰转谷氨酰胺酶以使其能够与野生型抗体缀合。
14.还已经使用含有小肽的分子研究了转谷氨酰胺酶的底物特异性：ando等人1989、kamiya等人2011、ohtsuka等人2000。
384至402处的氨基酸；(xii)用seq id no:65、seq id no:66、seq id no:67、seq id no:68或seq id no:69的氨基酸替代重链的eu 414至419处的氨基酸；(xiii)用seq id no:70、seq id no:71或seq id no:72的氨基酸替代轻链的eu 122至126处的氨基酸；(xiv)用seq id no:73、seq id no:74或seq id no:75的氨基酸替代轻链的eu 152至155处的氨基酸；(xv)用seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:81或seq id no:82的氨基酸替代轻链的eu 167至170处的氨基酸；(xvi)用seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85、seq id no:86或seq id no:87的氨基酸替代轻链的eu 182至190处的氨基酸；以及(xvii)用seq id no:89、seq id no:90、seq id no:91、sseq id no:92、seq id no:93、seq id no:94、seq id no:95或seq id no:96的氨基酸替代轻链的eu 199至204处的氨基酸。
20.在另一个实施方案中，提供了一种igg全长抗体，所述igg全长抗体具有选自以下的替代序列：(i)用seq id no:9或seq id no:10的氨基酸替代重链的eu 131至135处的氨基酸；(ii)用seq id no:18的氨基酸替代重链的eu 175至177处的氨基酸；(iii)用seq id no:22的氨基酸替代重链的eu 190至196处的氨基酸；(iv)用seq id no:27或seq id no:28的氨基酸替代重链的eu 264至269处的氨基酸；(v)用seq id no:34、seq id no:35、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、sseq id no:41、seq id no:42、seq id no:43、seq id no:44、seq id no:45、seq id no:100、seq id no:101、seq id no:102或seq id no:103的氨基酸替代重链的eu 292至297处的氨基酸；(vi)用seq id no:51、seq id no:52或seq id no:53的氨基酸替代重链的eu 330至331处的氨基酸；(vii)用seq id no:57、seq id no:58或seq id no:63的氨基酸替代重链的eu 384至402处的氨基酸；(viii)用seq id no:66或seq id no:68的氨基酸替代重链的eu 414至419处的氨基酸；(ix)用seq id no:73或seq id no:75的氨基酸替代轻链的eu 152至155处的氨基酸；(x)用seq id no:78或seq id no:82的氨基酸替代轻链的eu 167至170处的氨基酸；以及(xi)用seq id no:92、seq id no:93或seq id no:94的氨基酸替代轻链的eu 199至204处的氨基酸。
21.在另一方面，本说明书提供了一种式(iv)的缀合物
其中ab是具有根据上述分段(i)
‑
(xvii)的替代序列的全长抗体；l是经由与所述替代序列中的谷氨酰胺的酰胺键而与ab键合的接头部分；并且d选自蛋白质、放射性同位素、测定剂和治疗剂。
22.在另一方面，本说明书提供了一种制备抗体缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，将具有根据上述分段(i)
‑
(xvii)的替代序列的全长抗体与包含伯胺和选自蛋白质、放射性同位素、测定剂和治疗剂的部分的胺供体化合物混合；以及(b)允许所述转谷氨酰胺酶催化在所述替代序列的谷氨酰胺的侧链甲酰胺与所述胺供体化合物的伯胺之间形成酰胺键，从而制备所述抗体缀合物。
23.在另一方面，本说明书提供了一种制备抗体缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，将具有根据上述分段(i)
‑
(xvii)的替代序列的全长抗体与第一化合物混合，所述第一化合物是具有伯胺和第一反应性官能团的胺供体化合物；(b)允许所述转谷氨酰胺酶催化在所述替代序列的谷氨酰胺的侧链甲酰胺与所述第一化合物的伯胺之间形成酰胺键，以制备所述抗体与所述第一化合物的加合物；(c)使所述加合物与第二化合物接触，所述第二化合物具有第二反应性官能团和选自蛋白质、放射性同位素、测定剂和治疗剂的部分；所述第二反应性官能团能够与所述第一反应性官能团反应以在其间形成共价键；以及(d)允许所述第一反应性官能团与所述第二反应性官能团反应并且在其间形成共价键，从而制备所述抗体缀合物。
24.在部分(在所述第一化合物或第二化合物中，视情况而定)是蛋白质的情况下，所得的缀合物是融合蛋白。在所述部分是放射性同位素的情况下，所得的缀合物可以用于放射疗法或放射成像。所述部分可以是测定剂，如荧光标记、氘代聚合物或配体(像生物素)，在这种情况下，所述缀合物可以用于诊断医学状况、监测治疗或分析应用。优选地，所述部分是治疗剂(在这种情况下，所述产物也被称为抗体
‑
药物缀合物或adc)，所述治疗剂可以用于医学治疗，尤其是癌症治疗。
附图说明
25.图1是显示在人igg1的ch1区中环的位置的示意图，在所述位置处可以如本文所公开的进行修饰。
26.图2是显示在人igg1的ch2区中环的位置的示意图，在所述位置处可以如本文所公
开的进行修饰。
27.图3是显示在人igg1的ch3区中环的位置的示意图，在所述位置处可以如本文所公开的进行修饰。
28.图4a、图4b和图4c组合显示了对于人igg1抗体重链恒定区的seq id no:1的顺序氨基酸编号与eu编号之间的关联以及其中的环相关氨基酸。
29.图5a和图5b组合显示了对于人igg1(seq id no:1)、igg2(seq id no:2)、igg3(seq id no:3)和igg4(seq id no:4)恒定区的环相关氨基酸的比对。
30.图6是覆盖人κ和λ轻链恒定区的示意图，显示了可以如本文所公开的进行修饰的环的比对。
31.图7显示了对于人抗体κ轻链恒定区的seq id no:5的顺序氨基酸编号与eu编号之间的关联以及其中的环相关氨基酸。
32.图8显示了人κ恒定区(seq id no:5)与人λ(seq id no:6)恒定区的环相关氨基酸之间的比对。
33.图9是说明可以如何修饰环以使其含有转谷氨酰胺酶反应性谷氨酰胺的示意图。
34.图10示意性地比较了使用转谷氨酰胺酶制备缀合物的一步式方法和两步式方法。
35.图11a、图11b和图11c比较了抗间皮素抗体与其抗体药物缀合物(adc)对各种人癌细胞系的结合。
具体实施方式
定义
[0036]“抗体”意指完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链变体。完整抗体是包含通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链的蛋白质。每条重链包含重链可变区(v
h
)和包含三个结构域c
h1
、c
h2
和c
h3
的重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区(v
l
或v
k
)和包含一个单结构域的轻链恒定区c
l
。v
h
区和v
l
区可以进一步细分为高变性区域，称为互补决定区(cdr)，散布有较保守的框架区(fr)。每个v
h
和v
l
包含三个cdr和四个fr，按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。恒定区可以介导抗体与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(clq)。如果抗体以5x10
‑8m或更小、更优选1x10
‑8m或更小、更优选6x10
‑9m或更小、更优选3x10
‑9m或更小、甚至更优选2x10
‑9m或更小的k
d
与抗原x结合，则认为所述抗体与抗原x“特异性地结合”。所述抗体可以是嵌合的、人源化的或优选地是人的。重链恒定区可以经工程化以影响糖基化类型或程度，以延长抗体的半衰期、增强或减少与效应细胞或补体系统的相互作用、或调节一些其他特性。工程化可以通过替代、添加或缺失一个或多个氨基酸或通过用来自另一种免疫球蛋白类型的结构域替代结构域或前述的组合来完成。
[0037]
抗体的“抗原结合片段”和“抗原结合部分”(或简单地，“抗体部分”或“抗体片段”)意指抗体的保留与抗原特异性结合的能力的一个或多个片段。已经显示，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行，所述片段如(i)fab片段，为由v
l
、v
h
、c
l
和c
h1
结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，为包含在铰链区通过二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(iii)fab’片段，其实质上是具有铰链区的一部分的fab(参见例如，abbas等人,
cellular and molecular immunology,第6版,saunders elsevier2007)；(iv)由v
h
结构域和c
h1
结构域组成的fd片段；(v)由抗体的单臂的v
l
结构域和v
h
结构域组成的fv片段，(vi)dab片段(ward等人,(1989)nature341:544
‑
546)，其由v
h
结构域组成；(vii)分离的互补决定区(cdr)；和(viii)纳米抗体，为含有单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。优选的抗原结合片段是fab、f(ab’)2、fab’、fv和fd片段。此外，尽管fv片段的两个结构域v
l
和v
h
由分开的基因编码，但是可以使用重组方法通过合成接头将它们连接，所述合成接头能够将它们制成单个蛋白质链，在所述单个蛋白质链中v
l
区和v
h
区配对形成单价分子(称为单链fv或scfv)；参见例如，bird等人(1988)science 242:423
‑
426；和huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:5879
‑
5883)。此类单链抗体也涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”范围内。
[0038]
除非另外指示(例如通过引用seq id no:列表中的线性编号)，否则对抗体重链或轻链可变区(v
h
或v
l
)中氨基酸位置的编号的引用是根据kabat系统的(kabat等人,“sequences of proteins of immunological interest,第5版,公开号91
‑
3242,u.s.dept.health&human services,nih,贝塞斯达,马里兰州,1991，下文称为“kabat”)并且对抗体重链或轻链恒定区(c
h1
、c
h2
、c
h3
或c
l
)中氨基酸位置的编号的引用是根据如kabat中列出的eu索引。参见lazar等人,us 2008/0248028 a1，将其公开内容通过引用并入本文，例如此类使用。此外，immunogenetics信息系统(imgt)在其网站上提供了标题为“imgt scientific chart:correspondence between c numberings”的表，其示出了对于重链恒定区，其编号系统eu编号与kabat编号之间的对应关系。
[0039]“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合抗原x的分离的抗体基本上不含特异性结合除抗原x外的抗原的抗体)。然而，特异性结合抗原x的分离的抗体可以与其他抗原(如来自其他物种的抗原x分子)具有交叉反应性。在某些实施方案中，分离的抗体与人抗原x特异性结合并且不与其他(非人)抗原x抗原交叉反应。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物。
[0040]“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”意指单一分子组成的抗体分子制剂，其对特定表位展示单一结合特异性和亲和力。
[0041]“人抗体”意指具有可变区的抗体，其中框架区和cdr区(以及恒定区，如果存在的话)均源自人种系免疫球蛋白序列。人抗体可以包含随后的修饰，所述修饰包括天然修饰或合成修饰。人抗体可以包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，“人抗体”不包括其中源自另一种哺乳动物物种(如小鼠)的种系的cdr序列已经被移植到人框架序列上的抗体。
[0042]“人单克隆抗体”意指显示出单一结合特异性的具有可变区的抗体，其中框架区和cdr区均源自人种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体是由杂交瘤产生的，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的获自具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(例如转基因小鼠)的b细胞。实施方案
[0043]
通常，转谷氨酰胺酶反应性谷氨酰胺需要位于蛋白质链的某个区域中，所述区域是突出的(即暴露的且可接近的)并且是柔性的。尽管野生型抗体重链具有约十二个谷氨酰胺，而另外六个左右存在于轻链中，但只有重链中的一个即q295可以通过转谷氨酰胺酶进
行转酰胺基反应，如jeger等人2010所示。并且即便如此，q295转谷氨酰胺反应也需要消除附近位置s297处的糖基化。
[0044]
重链的ch1、ch2和ch3结构域以及轻链的恒定区具有突出序列，我们将其称为环。尽管这些环不具有除q295以外的转谷氨酰胺酶反应性谷氨酰胺，但我们发现它们可能是对于蛋白质工程化以将可转酰胺的谷氨酰胺引入其中的合适位点。所述环通常是重链和轻链恒定区中的突出区域(可以说是亚结构域)，所述突出区域如果存在适当定位的谷氨酰胺，则可能是转谷氨酰胺酶更易接近的。
[0045]
我们已经鉴定出人igg1(higg1)的ch1结构域中的五个环，其是对于修饰的候选物。图1是显示这些环的位置的示意图。我们还鉴定出在higg1的ch2结构域中的六个这样的环和ch3结构域中的五个，其位置分别示于图2和图3的示意图中。
[0046]
图4a、图4b和图4c组合显示了使用顺序编号(seq id no:1)与eu编号的人igg1中的氨基酸之间的关联。另外，与每个环(即在每个环内或与每个环相邻)相关的氨基酸被突出显示。四种人igg同种型即igg1(seq id no:1)、igg2(seq id no:2)、igg3(seq id no:3)和igg4(seq id no:4)在其ch1、ch2和ch3结构域中高度同源，主要在其铰链区不同。当如图5a和图5b中所示根据eu编号比对时，四种同种型之间的环相关氨基酸的高度同源性是很明显的。(可以关于在图4a
‑
图4c中对于igg1提供的关联或通过参考出版物如lazar等人,us 2008/0248028 a1来得出higg2、higg3和igg4中氨基酸的eu编号。)在优选的实施方案中，将所述替代序列插入igg1抗体中。在另一个优选的实施方案中，将所述替代序列插入igg4抗体中。
[0047]
轻链中还存在这样的环，其可以被工程化以使谷氨酰胺可用作转谷氨酰胺酶底物。尽管κ与轻链类型之间的氨基酸序列同源性小于四种igg重链之间的氨基酸序列同源性，但仍具有良好的结构同源性。图6显示了κ和λ轻链恒定结构域的叠加示意图以及环区域如何重叠。图7显示了使用顺序编号(seq id no:5)与eu编号的人κ轻链恒定结构域(cκ)中氨基酸之间的关联，并且还突出显示了环相关氨基酸。图8显示了根据κ和λ轻链恒定结构域的eu编号系统的比对。(可以从图7或通过参考来源如lazar等人,us2008/0248028a1得出λ链恒定结构域(cλ)中氨基酸的eu编号。)
[0048]
表a列出了使用eu编号的每个环的相关氨基酸。
[0049]
有多种方法用于将环工程化，使其含有可用作转谷氨酰胺酶底物的谷氨酰胺。所述工程化可以在环内或其周围进行。
[0050]
一些环包含螺旋，其盘绕性质抑制转酰胺基反应，即使存在天然谷氨酰胺如在ch3环4的情况下，也是如此。螺旋的破坏导致扩展的柔性环，其中谷氨酰胺可以是可转酰胺的。丝氨酸、脯氨酸或甘氨酸可以用于破坏所述环。这种概念示意性地示于图8中。(视角与图3的视角不同)
[0051]
替代序列中的谷氨酰胺优选地在氨基侧侧接缬氨酸和亮氨酸，如以
–
vlq
‑
的形式，作为转谷氨酰胺酶的优选底物基序。因此，优选的替代序列包含三肽
–
vlq
‑
。
[0052]
可以用不同的氨基酸替代天然存在于环中但在对于转酰胺基反应不利的位置的谷氨酰胺，并且可以将另一个谷氨酰胺插入环中更有利的位置处。或者，可以设计替代序列以使天然谷氨酰胺位于更有利于转酰胺基反应的位置。
[0053]
作为证明，我们修饰了与terrett等人,us 8,268,970 b2(2012)的抗体6a4具有相同的重链和轻链cdr的igg1抗间皮素抗体。其重链和轻链序列分别提供为seq id no:98和seq id no:99。表b列出了在其ch1结构域中进行的替代。
[0054]
表c列出了在其ch2结构域中进行的替代。
[0055]
表d列出了在其ch3结构域中进行的替代。
[0056]
表e列出了在其轻链(κ)恒定结构域中进行的替代。
[0057]
本发明的抗体可以是同二聚体或异二聚体。如果是同二聚体，则两个轻
‑
重链对是相同的；也就是说，每个轻
‑
重链对含有相同的替代序列和相同的可变区。异二聚体抗体可以是这样的含义，即虽然两个轻
‑
重链对具有相同的可变区，但两个轻
‑
重链对中只有一个含有替代序列，或者每个轻
‑
重链对含有不同的替代序列。可替代地，异二聚体抗体可以是双特异性的含义，也就是说每个轻
‑
重链对具有不同的可变区以使得其特异性地结合不同的抗原，同时具有相同的替代序列。最后，异二聚体抗体可以是在两种含义上的异二聚体。
[0058]
可以通过本公开文本的方法修饰和缀合的抗体包括识别以下抗原的那些：间皮素、前列腺特异性膜抗原(psma)、cd19、cd22、cd30、cd70、b7h3、b7h4(也称为o8e)、蛋白酪氨酸激酶7(ptk7)、磷脂酰肌醇聚糖
‑
3、rg1、岩藻糖基
‑
gm1、ctla
‑
4和cd44。抗体可以是动物的(例如，鼠)、嵌合的、人源化的或优选地是人的。抗体优选地是单克隆的，尤其是单克隆人抗体。以下文献中披露了针对前述一些抗原的人单克隆抗体的制备：korman等人,us 8,609,816 b2(2013；b7h4，也称为08e；特别是抗体2a7、1g11、和2f9)；rao
‑
naik等人,8,097,703b2(2012；cd19；特别是抗体5g7、13f1、46e8、21d4、21d4a、47g4、27f3、和3c10)；king等人,us 8,481,683b2(2013；cd22；特别是抗体12c5、19a3、16f7、和23c6)；keler等人,us 7,387,776 b2(2008；cd30；特别是抗体5f11、2h9、和17g1)；terrett等人,us 8,124,738 b2(2012；cd70；特别是抗体2h5、10b4、8b5、18e7、和69a7)；korman等人,us 6,984,720 b1(2006；ctla
‑
4；特别是抗体10d1、4b6、和1e2)；vistica等人,us 8,383,118 b2(2013，岩藻糖基
‑
gm1，特别是抗体5b1、5b1a、7d4、7e4、13b8、和18d5)；korman等人,us 8,008,449 b2(2011；
pd
‑
1；特别是抗体17d8、2d3、4h1、5c4、4a11、7d3、和5f4)；huang等人,us 2009/0297438 a1(2009；psma，特别是抗体1c3、2a10、2f5、2c6)；cardarelli等人,us 7,875,278 b2(2011；psma；特别是抗体4a3、7f12、8c12、8a11、16f9、2a10、2c6、2f5、和1c3)；terrett等人,us 8,222,375b2(2012；ptk7；特别是抗体3g8、4d5、12c6、12c6a、和7c8)；terrett等人,us 8,680,247 b2(2014；磷脂酰肌醇聚糖
‑
3；特别是抗体4a6、11e7、和16d10)；harkins等人,us 7,335,748 b2(2008；rg1；特别是抗体a、b、c、和d)；terrett等人,us 8,268,970 b2(2012；间皮素；特别是抗体3c10、6a4、和7b1)；xu等人,us 2010/0092484 a1(2010；cd44；特别是抗体14g9.b8.b4、2d1.a3.d12、和1a9.a6.b9)；deshpande等人,us 8,258,266 b2(2012；ip10；特别是抗体1d4、1e1、2g1、3c4、6a5、6a8、7c10、8f6、10a12、10a12s、和13c4)；kuhne等人,us 8,450,464 b2(2013；cxcr4；特别是抗体f7、f9、d1、和e2)；和korman等人,us 7,943,743 b2(2011；pd
‑
l1；特别是抗体3g10、12a4、10a5、5f8、10h10、1b12、7h1、11e6、12b7、和13g4)；将其公开内容通过引用并入本文。
[0059]
关于式(iv)的缀合物(a)在一个实施方案中，d优选地是细胞毒性药物。(b)在另一个优选的实施方案中，d是tlr7、sting、nrlp3或rig
‑
1激动剂。(c)在优选的实施方案中，l是
‑
(ch2)2‑6‑
。(d)在另一个优选的实施方案中，l是其中t是自我牺牲基团；t是0或1；aa
a
和每个aa
b
独立地选自丙氨酸、β
‑
丙氨酸、γ
‑
氨基丁酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、γ
‑
羧基谷氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；p是1、2、3或4；q是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且r是1、2、3、4或5。
[0060]
总体上，转谷氨酰胺酶介导的抗体缀合物的制备可以通过一步式方法或两步式方法进行，如图2中示意性展示的。在一步式方法中，转谷氨酰胺酶使在延伸上的谷氨酰胺甲酰胺(充当胺受体)与胺供体化合物h2n
‑
l
‑
d偶联，以直接形成缀合物，在所述胺供体化合物中，l是接头部分，并且配偶体分子d是蛋白质、放射性同位素、测定剂或治疗剂。在两步式方法中，转谷氨酰胺酶催化在延伸上的谷氨酰胺甲酰胺(充当胺受体)与第一化合物(h2n
‑
l'
‑
r')之间形成初始转酰胺基反应加合物，所述第一化合物是胺供体化合物，其中l'是第一接头部分并且r'是第一反应性官能团。随后，所述加合物与第二化合物(r"
‑
l"
‑
d)反应，在所述第二化合物中，r"是能够与r'反应的第二反应性官能团，l"是第二接头部分，并且d是如
上所定义的。有时，将所述一步式方法称为酶促方法，而将所述两步式方法称为化学酶促方法，因为它需要化学步骤和酶促步骤二者。l、l'和l”中的每一个均可以是烷基链
‑
(ch2)
m
‑
，其中m是2至10(包含端值)的整数，或可以是(特别是在l和l”的情况下)更复杂的结构，如下所讨论。
[0061]
胺供体(h2n
‑
l
‑
d或h2n
‑
l
’‑
r’)经常大量过量使用以抑制在谷氨酰胺甲酰胺与抗体赖氨酸的ε
‑
氨基基团之间的不希望的转酰胺基反应。如果部分d昂贵或难以获得，则大量过量的使用可能是不切实际的。在这种情况下，所述两步式方法可能是优选的，即使它需要另外的步骤。
[0062]
在优选的实施方案中，一步式方法中的胺供体化合物由式(i)表示：h2n
‑
(ch2)2‑6d
ꢀꢀꢀꢀ
(i)其中d是蛋白质、放射性同位素、测定剂或治疗剂。
[0063]
在另一个优选的实施方案中，用于所述一步式方法的胺供体化合物具有由式(ia)表示的结构：其中d是蛋白质、放射性同位素、测定剂或治疗剂；t是自我牺牲基团；t是0或1；aa
a
和每个aa
b
独立地选自丙氨酸、β
‑
丙氨酸、γ
‑
氨基丁酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、γ
‑
羧基谷氨酸、瓜氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；p是1、2、3或4；q是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且r是1、2、3、4或5。
[0064]
在本文的式(ia)、(ia’)和(iii)中，
‑
aa
a
‑
[aa
b
]
p
‑
表示多肽，其长度由p值确定(如果p是1，则是二肽；如果p是3，则是四肽等)。aa
a
是多肽的羧基末端并且其羧基基团与d(或t，如果存在)的胺氮形成肽(酰胺)键。相反，最后的aa
b
在多肽的氨基末端处并且其α
‑
氨基基团优选的多肽
‑
aa
a
‑
[aa
b
]
p
‑
是val
‑
cit、val
‑
lys、lys
‑
val
‑
ala、asp
‑
val
‑
ala、val
‑
ala、lys
‑
val
‑
cit、ala
‑
val
‑
cit、val
‑
gly、val
‑
gln和asp
‑
val
‑
cit，以常规的n
‑
至
‑
c方向书写，如在h2n
‑
val
‑
cit
‑
co2h中)。更优选地，所述多肽是val
‑
cit、val
‑
lys或val
‑
ala。优选地，多肽
‑
aa
a
‑
[aa
b
]
p
‑
可以通过在靶细胞内发现的酶(例如组织蛋白酶，并且尤其是组织蛋白酶b)或在靶器官或组织周围的酶切割。
[0065]
如果下标s是1，则化合物(ia)含有聚(乙二醇)(peg)基团，所述聚(乙二醇)基团可
以有利地改善化合物(ia)的溶解度，从而促进与抗体的缀合
‑
在水性介质中进行的步骤。同样，peg基团可以用作抗体与肽
‑
aa
a
‑
[aa
b
]
p
‑
之间的间隔子，因此抗体的大部分不会在空间上干扰肽切割酶的作用。
[0066]
如下标t等于0或1所示，任选地存在自我牺牲基团t。自我牺牲基团是这样的基团：从aa
a
或aa
b
(视情况而定)切割引发反应序列，从而导致所述自我牺牲基团自身破坏与d的键合(disbonding)并且释放后者以发挥其治疗功能。存在时，自我牺牲基团t优选是对氨基苄基氧基羰基(pabc)基团，其结构如下所示，星号(*)表示键合至d的胺氮的pabc的末端，并且波浪线表示键合至多肽
‑
aa
a
‑
[aa
b
]
p
‑
的末端。pabc基团可以被取代，如2019年5月29日提交的美国申请序列号16/425,596中所披露。
[0067]
可以使用的另一个自我牺牲基团是取代的噻唑，如feng,us7,375,078b2(2008)中所披露。
[0068]
在两步缀合中，可以使用基团r’和r”的许多组合。r’和r”(或反之亦然，r”和r’)的合适的组合包括：(a)马来酰亚胺基团和巯基基团，以形成迈克尔加成加合物，如在以下中：(b)二苯并环辛炔基团和叠氮基团，以经由“点击”化学形成环加成产物，如在以下中：(c)n
‑
羟基琥珀酰亚胺酯和胺，以形成酰胺，如在以下中：以及(d)醛或酮(其中“烷基”优选是c1‑3烷基)和羟胺，以形成肟，如在以下中：
[0069]
因此，r’可以选自
然而相对地，r”可以选自
[0070]
式(ii)中描绘了用于两步式方法的合适的胺供体第一化合物h2n
‑
(ch2)2‑8‑
r
′ꢀꢀꢀꢀ
(ii)其中r’是如上所定义的并且优选是
[0071]
相应的合适的化合物r
”‑
l
”‑
d示于式(iii)中其中r”是如上所定义的并且优选是并且r、q、aa
b
、p、aa
a
、t、t和d是如上关于式(ia)所定义的。
[0072]
在缀合物旨在用于癌症治疗的情况下，所述治疗剂可以是导致靶向的癌细胞死亡的细胞毒性药物。可用于缀合物的细胞毒性药物包括以下类型的化合物及其类似物和衍生物：(a)烯二炔，如卡奇霉素(参见例如，lee等人,j.am.chem.soc.1987,109,3464和3466)和尤西拉霉素(uncialamycin)(参见例如，davies等人,wo 2007/038868 a2(2007)；chowdari等人,us 8,709,431 b2(2012)；和nicolaou等人,wo 2015/023879 a1(2015))；(b)微管溶素(参见例如，domling等人,us 7,778,814 b2(2010)；cheng等人,us 8,394,922 b2(2013)；和cong等人,us 8,980,824 b2(2015))；(c)dna烷基化剂如cc
‑
1065的类似物和杜卡霉素(duocarmycin)(参见例如，yang等人,us 2018/0051031 a1(2018)；boger,us 6,5458,530 b1(2003)；sufi等人,us 8,461,117 b2(2013)；和zhang等人,us 8,852,599 b2(2014))；(d)埃博霉素(参见例如，vite等人,us 2007/0275904 a1(2007)和us re42930 e(2011))；(e)奥瑞他汀(auristatins)(参见例如senter等人,us 6,844,869 b2(2005)和doronina等人,us 7,498,298 b2(2009))；(f)苯并二氮杂卓二聚体(参见例如，zhang等人,us 9,527,871 b2(2016)；zhang等人,us 9,688,694 b2(2017)；mcdonald等人,us 9,526,801 b2(2016)；howard等人,us 2013/0059800 a1(2013)；us 2013/0028919 a1(2013)；和wo 2013/041606 a1(2013))；以及(g)美登木素生物碱，如dm1和dm4(参见例如，chari等人,us 5,208,020(1993)和amphlett等人,us 7,374,762 b2(2008))。
[0073]
优选地，所述药物是dna烷基化剂、微管溶素、奥瑞他汀、吡咯并苯并二氮杂卓、烯二炔或美登木素生物碱化合物。通过说明而不是限制的方式，具体的例子是
[0074]
免疫系统具有这样的受体，其天然配体是病原体相关分子模式(pamp)。pamp与其同源受体的结合激活免疫系统，以防御相关病原体的感染。此外，这些受体还可以被合成激动剂激活，所述合成激动剂对疫苗和在治疗除实际病原体感染以外的多种病症中的免疫治疗剂的作用具有佐剂效应。特别地，免疫肿瘤学药剂(如伊匹单抗、纳武单抗和派姆单抗)可以从这种佐剂效应中受益。可以被合成激动剂激活的受体包括tlr3、tlr7、tlr9(分别为toll样受体
‑
3、
‑
7和
‑
9)、sting(干扰素基因的刺激物；也称为mpys、tmem173、mita或eris)、nlrp3(nod样受体蛋白3)和rig
‑
i(视黄酸诱导型基因i)。因此，在可替代的实施方案中，所述治疗剂是tlr3、tlr7、tlr9、sting、nlrp3或rig
‑
i激动剂。特别地，所述治疗剂可以是如披露于以下文献的tlr7激动剂：poudel等人,us 2019/0055243 a1(2019)；young等人,us 2019/0055244 a1(2019)；poudel等人,us 2019/0055245 a1(2019)；he等人,us 2019/0055246 a1(2019)；he等人,us 2019/0055247 a1(2019)；和purandare等人,pct申请pct/us2019/028697，2019年4月23日提交。实施例
[0075]
通过参考以下实施例可以进一步理解本发明的实践，所述实施例是作为说明而非限制来提供的。实施例1
‑
经修饰的抗体的缀合
[0076]
本文公开的经修饰的抗体与化合物a缀合(2019年6月11日提交的young等人,美国申请序列号16/437047)，所述化合物a具有作为抗癌药物的微管溶素类似物和可用作胺供体的用烷基氨基基团封端的二肽接头：
[0077]
通过以下所列方案使用重组细菌转谷氨酰胺酶进行如本文所述修饰的抗体与作为胺供体的化合物a的缀合。
[0078]
通过以下所列方案使用转谷氨酰胺酶进行如本文所述修饰的抗体与胺供体的缀
合。我们使用分散酶激活具有v65i和y75f点突变的btg酶。在使用前将其透析至来自配制品(缓冲液20mm乙酸盐、10％甘油(ph4))的50mm乙酸钠(ph 5.5)中。
[0079]
在对于每个抗体存在0.2摩尔过量转谷氨酰胺酶的情况下，在50mm tris
‑
hcl(ph 8.0)或20mm组氨酸、50mm咪唑、10％蔗糖(ph约7.8)中，使抗体以约2mg/ml与每个位点过量10倍摩尔的胺供体反应。允许在连续的温和混合的情况下在37℃下反应过夜。
[0080]
将抗体药物缀合物进行0.2μm过滤并且使用mab select sure
tm
柱(ge healthcare)纯化。将缀合物装载到用50mm tris
‑
hcl(ph 8.0)预平衡的柱上，并且用10cv(柱体积)的平衡缓冲液洗涤，接着用10cv的50mm tris
‑
hcl、17％乙腈(ph 8.0)洗涤，以去除未反应的胺供体。将所述柱用50mm tris
‑
hcl(ph 8.0)重新平衡，然后用0.1m柠檬酸盐(ph 3.5)在1ml级分中洗脱，并且用1m tris(ph 8.0)以1/10的洗脱体积中和。将所希望的级分在配制品缓冲液20mm组氨酸、10％蔗糖(ph 6.0)中透析，并且通过lc
‑
ms(esi
‑
qtof)、rp
‑
hplc和sds
‑
page分析纯度和药物与抗体比率(dar)。实施例2
‑
缀合的经修饰的抗体的表征
[0081]
terrett等人,us 8,268,970 b2(2012)的抗间皮素抗体6a4用作模型抗体，以用于评价本文公开的替代序列在能够通过转谷氨酰胺酶与化合物a缀合时的性能。为了防止酶介导的缀合，所述抗体含有k222r位点特异性突变。
[0082]
在对于每个抗体存在0.2摩尔过量重组细菌转谷氨酰胺酶的情况下，在50mm咪唑、10％蔗糖(ph 8)中，使抗体以5mg/ml与每个位点10倍摩尔的胺供体反应。在连续的温和混合的情况下在37℃下过夜孵育后，将反应混合物通过lc
‑
ms(esi
‑
qtof)分析以用于dar评价。
[0083]
通过上述程序被鉴定为已通过转谷氨酰胺酶缀合的抗体列于表f中。药物
‑
抗体比率或dar是附接至每种抗体的药物部分(微管溶素类似物)的数量。未糖基化抗体具有q295a和n297a突变，从而去除野生型n297a糖基化位点。
[0084]
对于具有替代序列的所选择的抗体，我们还通过以下方式检查了糖基化的存在对dar的影响：不产生q295a和n297a突变，从而使野生型n297a糖基化位点保持完整。结果列于表g中。
实施例3
‑
经修饰的抗体的缀合物与癌细胞的结合
[0085]
将用ch3
‑
4.14、ch1
‑
4.6或ch3
‑
2.11替代序列修饰的抗间皮素抗体6a4与化合物a缀合。作为同种型对照，制备抗cd70抗体和化合物a的缀合物。抗cd70抗体具有n297a位点特异性取代以消除糖基化并释放附近的q295作为转酰胺基反应位点。
[0086]
细胞系和培养条件。人上皮癌细胞系h226、n87和ovcar3以及仓鼠卵巢细胞系cho
‑
k1是从美国菌种保藏中心(atcc，马里兰州罗克维尔)获得的。在标准条件(37℃，在含有5％co2的加湿气氛中)下在补充有10％的fbs(gibco，美国)的rpmi或dmem(gibco，美国)中培养细胞。在测定时细胞汇合度为80％。使用锥虫蓝排除测定用血细胞计数器测定浓度和活力。
[0087]
表面结合抗体分析。使用具有1％fbs的培养基在96孔板中一式两份地制备测试样品的独立连续稀释液(最终体积50μl)。用cellstripper解离试剂(corning)剥离细胞。用pbs洗涤后，将细胞在25℃下与测试样品的连续稀释液一起孵育1小时，然后用测定缓冲液通过离心洗涤一次。将细胞重悬于检测试剂、pe缀合的山羊f(ab’)2抗人igg(jackson immunoresearch)中，用测定缓冲液以1:50稀释。将板在25℃下孵育30min，然后通过离心用测定缓冲液洗涤一次。将细胞重悬于80μl测定缓冲液中，并通过cytoflex进行分析。
[0088]
图11a、图11b和图11c分别比较了三种缀合物(adc)与未缀合的抗体6a4对h226、ovcar3和n87细胞的结合。这三种细胞系在其细胞表面表达间皮素，但不表达cd70。从图中可以看出，这三种缀合物的结合与未缀合的抗体6a4的结合几乎没有区别。这些结果表明，用替代序列修饰抗体不影响其与其抗原的结合。如预期的那样，具有其抗cd70抗体的同种型对照不与这些细胞结合。实施例4
‑
经修饰的抗体的缀合物的细胞毒性
[0089]
测定了上述实施例的三种缀合物对n87、ovcar3和h226细胞的体外细胞毒性。所有显示出小于1nm的ic
50
，表明高效力。结果示于表h中。
[0090]
体外细胞毒性测定程序如下：评价adc对n87、h226、ovcar3和cho k1细胞(后者为阴性对照)的体外效力。将细胞以104个细胞/孔(对于n87、ovcar3和h226)和1000个细胞/孔(对于cho k1)铺板于96孔平底板中的100μl的含有10％fbs的rpmi
‑
1640培养基中。使细胞在37℃下粘附4小时。将每种adc的3x浓度储备溶液通过1:3系列连续稀释，并添加至细胞中，接着在药物处理后添加50μl另外的生长培养基。将处理的细胞在37℃下培养7天，并使用来自promega的cell titer
‑
glo(ctg)发光活力测定来评估细胞活力。将100μl重构的ctg试剂添加至每个孔中并温和摇动10min。使用cytation 5(biotek instruments)读取发光。细胞活力百分比由下式计算：(处理的样品的平均发光/未处理的对照样品的平均发光)
×
100。使用graphpad prism v7.02软件(美国加利福尼亚州拉荷亚)利用逻辑非线性回归分析确定ec
50
值。adc对不表达间皮素的cho k1细胞的增殖没有抑制作用。实施例5
‑
经修饰的抗体的缀合物的稳定性
[0091]
用作化合物a的抗癌药物的微管溶素类似物具有乙酸盐基团(参见上述结构式中的虚线框)。其因水解(脱乙酰化)而损失，从而导致微管溶素类似物失去其细胞毒性。
[0092]
将用具有本文公开的替代序列的抗间皮素抗体6a4制备的缀合物的稳定性与不具有替代序列的相同抗体的稳定性进行比较。测量了两个参数：(a)脱乙酰化速率和(b)抗体对热诱导的解离的抗性，如通过差示扫描量热法(dsc)所测量的。结果示于表i中。
[0093]
如下测量scid小鼠血清中adc中的微管溶素类似物的脱乙酰化：将adc在500μl scid小鼠血清中稀释至50μg/ml的目标浓度，并在37℃下孵育。在第0、1、2和5天从孵育样品板收集80μl血清样品并立即冷冻。使用“单亲和力”或“双亲和力”捕获方法从血清提取所有adc，并通过lc
‑
hrms进行分析。简言之，使用通用的抗人f(ab’)试剂从血清捕adc。对于lc缀合的adc(lc c
‑
项)，将adc从珠洗脱，接着经由还原链间二硫键分离lc和hc。对于hc
‑
fab缀合的adc(s190)，用ides酶“在珠上”消化固定的adc，接着洗脱f(ab’)并还原链间二硫键以分离lc和fd’。在hc
‑
fc缀合的adc(q295、q418、g385、hc c
‑
项)的情况下，将捕获的adc用ides(去糖基化adc)或ides png酶f(n
‑
glcyan adc)消化，以释放去糖基化的fc片段。将珠丢弃，并通过添加用抗人fc捕获试剂包被的第二组珠进一步捕获消化混合物中存在的fc。
[0094]
前述具体实施方式包括主要或专门涉及本发明的特定部分或方面的段落。应当理解，这是为了清楚和方便，特定特征可能在不只是公开它的段落中是相关的，并且本文所公开的内容包括在不同段落中找到的信息的所有适当组合。类似地，尽管本文中的各种附图和描述涉及本发明的具体实施方案，但是应当理解，在特定附图或实施方案的背景下公开了具体特征的情况下，也可以在另一个附图或实施方案的背景下、与另一个特征组合、或总体上在本发明中在适当的程度上使用此类特征。
[0095]
此外，尽管已经根据某些优选实施方案具体描述了本发明，但是本发明不限于此类优选实施方案。而是，本发明的范围由所附权利要求限定。参考文献
[0096]
以下提供了在本说明书中较早以缩写方式通过第一作者(或发明人)和日期引用