环状多核糖核苷酸及其药物组合物的制作方法

环状多核糖核苷酸及其药物组合物交叉引用1.本技术要求以下的权益：2019年3月4日提交的美国临时申请号62/813,666、2019年3月28日提交的美国临时申请号62/825,683、2019年4月29日提交的美国临时申请号62/840,174、以及2020年1月29日提交的美国临时申请号62/967,545，将这些临时申请的全部内容通过援引并入。背景2.某些环状多核糖核苷酸普遍存在于人的组织和细胞中，包括健康个体的组织和细胞。概述3.本披露提供了具有特定量或减少量的线性多核糖核苷酸分子的环状多核糖核苷酸分子的药物组合物或制剂、和与其相关的方法。本发明人已经发现环状多核糖核苷酸药物组合物或制剂中的线性多核糖核苷酸分子应被检测、监测和/或控制，例如从这些环状多核糖核苷酸药物组合物或制剂中减少或纯化。药物制剂4.在一方面，环状多核糖核苷酸分子的药物制剂包含当通过规定方法测量时低于预定阈值的水平的线性多核糖核苷酸分子，例如该制剂包含满足药物放行规格的水平的线性多核糖核苷酸分子，例如该制剂包含满足下文所述的规格(例如，w/v规格或w/w规格)的水平的线性多核糖核苷酸分子。在一些情况下，该规格可以是当通过规定方法测量时低于检测限的水平。5.在另一方面，环状多核糖核苷酸分子的药物制剂包含不超过1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200g/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、或2mg/ml的线性多核糖核苷酸分子。6.在另一方面，环状多核糖核苷酸分子的药物制剂包含相对于该药物制剂中的总核糖核苷酸分子至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)、99.1％(w/w)、99.2％(w/w)、99.3％(w/w)、99.4％(w/w)、99.5％(w/w)、99.6％(w/w)、99.7％(w/w)、99.8％(w/w)、99.9％(w/w)、或100％(w/w)的环状多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，该药物制剂中总核糖核苷酸分子的至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)、99.1％(w/w)、99.2％(w/w)、99.3％(w/w)、99.4％(w/w)、99.5％(w/w)、99.6％(w/w)、99.7％(w/w)、99.8％(w/w)、99.9％(w/w)、或100％(w/w)是环状多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，该药物制剂中总核糖核苷酸分子的至少91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)或99％(w/w)是环状多核糖核苷酸分子。7.在另一方面，在纯化步骤之后(例如，在一个或多个纯化步骤之后)环状多核糖核苷酸分子的药物制剂的线性多核糖核苷酸分子水平与在该一个或多个纯化步骤之前该制剂中的该线性多核糖核苷酸分子水平相比降低至少30％(w/w)、至少40％(w/w)、至少50％(w/w)、至少60％(w/w)、至少70％(w/w)、至少80％(w/w)、至少90％(w/w)、或至少95％(w/w)。8.在另一方面，环状多核糖核苷酸分子的药物制剂包含环状多核糖核苷酸分子和占该药物制剂中的总核糖核苷酸分子不超过5％(w/w)的带切口多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，该药物组合物包含占该药物制剂中的总核糖核苷酸分子不超过9％(w/w)、8％(w/w)、7％(w/w)、6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)、1％(w/w)、或0.5％(w/w)的带切口多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，该药物组合物包含占该药物制剂中的总核糖核苷酸分子不超过2％(w/w)的带切口多核糖核苷酸分子。9.在另一方面，环状多核糖核苷酸分子的药物制剂包含环状多核糖核苷酸分子和占该制剂中的总核糖核苷酸分子不超过0.5％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、或10％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子。10.在以上叙述的每个方面的一些实施例中，该环状多核糖核苷酸分子的药物制剂包含环状多核糖核苷酸分子和占该制剂中的总核糖核苷酸分子不超过0.5％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、或5％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子。11.在以上叙述的每个方面的一些实施例中，这些环状多核糖核苷酸分子包含编码一种或多种表达产物(例如，治疗性表达产物)，例如编码治疗性蛋白质或核酸的一个序列、或多个序列。在以上叙述的每个方面的一些实施例中，这些环状多核糖核苷酸分子包含含有支架(例如，适体序列)的一个序列、或多个序列。12.在以上叙述的每个方面的一些实施例中，环状多核糖核苷酸分子的药物制剂中的该线性多核糖核苷酸分子水平可以通过任何适合方法测量，该任何适合方法包括显微镜法、分光光度法、荧光测定法、变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳成像、uv‑vis分光光度法、rna电泳、rna酶h分析、uv光谱或荧光检测器、光散射技术、使用或不使用分离方法包括hplc的表面等离子体共振(spr)、通过hplc、使用或不使用分离前或分离后衍生化方法的基于芯片或凝胶的电泳、使用利用银或染料染色或放射性衰变用于检测线性多核糖核苷酸分子的检测方法、或利用显微镜、目测法或分光光度计的方法、或其任何组合。13.在以上叙述的每个方面的一些实施例中，当环状多核糖核苷酸分子的药物制剂已经历过富集或纯化步骤(或多个纯化步骤)以减少线性多核糖核苷酸时，该药物制剂在施用至受试者之后还产生与在该一个或多个纯化步骤之前相比降低水平的免疫或炎性应答的一种或多种标记物。在一些实施例中，该免疫或炎性应答的一种或多种标记物是细胞因子或免疫原性相关基因的表达。在一些实施例中，该免疫或炎性应答的一种或多种标记物是选自由rig‑i、mda5、pkr、ifn‑β、oas、和oasl组成的组的基因的表达。14.在以上叙述的每个方面的一些实施例中，环状多核糖核苷酸分子的药物制剂进一步基本上不含杂质，例如工艺相关杂质或产品相关物质。在一些实施例中，该工艺相关杂质包括蛋白质(例如，细胞蛋白质，诸如宿主细胞蛋白质)、脱氧核糖核酸(例如，细胞脱氧核糖核酸，诸如宿主细胞脱氧核糖核酸)、单脱氧核糖核苷酸或双脱氧核糖核苷酸分子、酶(例如，核酸酶或连接酶)、试剂组分、凝胶组分、或色谱材料。在一些实施例中，该杂质选自：缓冲试剂、连接酶、核酸酶(例如，核酸外切酶或核酸内切酶)、rna酶抑制剂、rna酶r、脱氧核糖核苷酸分子、丙烯酰胺凝胶碎片、和单脱氧核糖核苷酸分子。在一些实施例中，该药物制剂包含少于0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、或500ng蛋白质污染物/毫克(mg)这些环状多核糖核苷酸分子的蛋白质污染物。15.在以上叙述的每个方面的一些实施例中，该药物制剂进一步基本上不含药物杂质或污染物，例如该药物制剂如通过鲎变形细胞裂解物测试所测量包含少于10eu/kg的内毒素、或缺少内毒素。在一些实施例中，该药物制剂在灭菌之前包含少于100cfu/100ml或少于10cfu/100ml的生物负荷。在一些实施例中，该药物制剂是无菌药物制剂。在一些实施例中，该无菌药物制剂如在无菌条件下所测试支持少于100个活微生物的生长。在一些实施例中，该药物制剂满足截止本技术的提交日期公布的美国药典(u.s.pharmacopeia)第71章(usp<71>)的标准。在一些实施例中，该药物制剂满足截止本技术的提交日期公布的美国药典第85章(usp<85>)的标准。16.在以上叙述的每个方面的一些实施例中，该制剂的线性多核糖核苷酸分子包括这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子对应物或这些环状多核糖核苷酸分子的该线性多核糖核苷酸分子对应物的片段。在以上叙述的每个方面的一些实施例中，该制剂的线性多核糖核苷酸分子包括这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子对应物(例如，环化前形式)。在一些实施例中，这些线性多核糖核苷酸分子包括环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子对应物或其片段、该环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子非对应物或其片段、或其组合。在一些实施例中，这些线性多核糖核苷酸分子包括环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子对应物(例如，环化前形式)、该环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子非对应物、或其组合。在以上叙述的每个方面的一些实施例中，线性多核糖核苷酸分子片段是长度为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000个、或更多个核苷酸、或其间的任何核苷酸数的片段。17.在以上叙述的每个方面的一些实施例中，这些环状多核糖核苷酸分子包含准螺旋结构。在一些实施例中，这些环状多核糖核苷酸分子包含准双链二级结构。在以上叙述的每个方面的一些实施例中，这些环状多核糖核苷酸分子包含一个或多个表达序列和在至少一个表达序列的3’端的交错元件。在以上叙述的每个方面的一些实施例中，这些环状多核糖核苷酸分子包含一种或多种适体序列。在以上叙述的每个方面的一些实施例中，这些环状多核糖核苷酸分子具有编码内源性或天然存在的环状多核糖核苷酸序列的序列。18.在以上叙述的每个方面的一些实施例中，该药物制剂是最终环状多核糖核苷酸成品药的中间体药物制剂。在一些实施例中，该药物制剂是原料药或活性药物成分(api)。在一些实施例中，该药物制剂是用于施用至受试者的成品药。19.在以上叙述的每个方面的一些实施例中，该药物制剂包含浓度为至少0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、或500mg/ml的环状多核糖核苷酸分子。20.在以上叙述的每个方面的一些实施例中，该药物制剂包含零的dna，基本上不含dna，或是不超过1pg/ml、10pg/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、或1μg/ml的dna。在一些实施例中，dna包括单脱氧核糖核苷酸、双脱氧核糖核苷酸分子、聚脱氧核糖核苷酸分子、或其任何组合。在一些实施例中，该药物制剂具有如通过分光光度计测量的从约1.6至2.3的a260/a280吸光度比。在一些实施例中，该药物制剂的dna浓度是在通过消化核苷的酶进行总dna消化之后通过定量液体色谱法‑质谱法(lc‑ms)测量的，其中dna的含量从如通过lc‑ms测量的每种碱基(即，a、c、g、t)的标准曲线反演计算出。21.在以上叙述的每个方面的一些实施例中，线性多核糖核苷酸分子相比于环状多核糖核苷酸分子的量使用实例2或实例3的方法确定。在一些实施例中，该药物制剂中线性多核糖核苷酸分子的量使用实例2的方法确定。在一些实施例中，该药物制剂中环状多核糖核苷酸分子的量使用实例3的方法确定。制备多核糖核苷酸的药物制剂的方法22.在另一方面，制备药物组合物的方法包括：a)提供环状多核糖核苷酸分子的制剂；b)处理该制剂以减少线性多核糖核苷酸分子的量；c)任选地评价在该处理步骤之前、期间和/或之后该制剂中线性多核糖核苷酸分子的量；并且d)进一步处理该制剂以产生用于药物用途的药物组合物。在一些实施例中，该步骤d)的进一步处理包括以下项中的一种或多种：i)处理该制剂以基本上去除dna和/或蛋白质(例如，细胞蛋白质诸如宿主细胞蛋白质)和/或内毒素；ii)评价该制剂中dna和/或蛋白质(例如，细胞蛋白质诸如宿主细胞蛋白质)和/或内毒素的量；iii)将该制剂与药物赋形剂一起配制；并且iv)任选地，浓缩该制剂。23.在另一方面，制备药物原料药的方法包括：a)提供环状多核糖核苷酸分子的制剂；b)评价该制剂中线性多核糖核苷酸分子的量；并且c)如果该环状多核糖核苷酸分子的制剂满足关于该制剂中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准(例如，药物放行标准，例如本文所述的药物放行标准或参考标准)，则将该制剂处理为药物原料药。24.在另一方面，制备药物原料药的方法包括：a)提供多个线性多核糖核苷酸分子；b)使该多个线性多核糖核苷酸分子环化以提供环状多核糖核苷酸分子的制剂；c)评价该制剂中剩余的线性多核糖核苷酸分子的量；并且d)如果该环状多核糖核苷酸分子的制剂满足关于该制剂中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准，则将该制剂处理为药物原料药。25.在另一方面，制备药物原料药的方法包括a)提供多个线性多核糖核苷酸分子；b)使该多个线性多核糖核苷酸分子环化以提供环状多核糖核苷酸分子的制剂；c)评价该制剂中剩余的线性和/或带切口多核糖核苷酸分子的量；并且d)如果该环状多核糖核苷酸分子的制剂满足关于该制剂中存在的线性和/或带切口多核糖核苷酸分子的量的参考标准，则将该制剂处理为药物原料药。26.在另一方面，制备药物成品药的方法包括：a)提供多个线性多核糖核苷酸分子；b)使该多个线性多核糖核苷酸分子环化以提供环状多核糖核苷酸分子的制剂；c)测量该制剂中线性和/或带切口多核糖核苷酸分子的量；d)如果该环状多核糖核苷酸分子的制剂满足关于该制剂中存在的线性和/或带切口多核糖核苷酸分子的量的参考标准，则将该制剂配制为药物成品药；并且e)如果该药物成品药满足关于该药物成品药中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准，则标记和运送该药物成品药。27.在另一方面，制备药物成品药的方法包括：a)提供环状多核糖核苷酸分子的制剂；b)如果该环状多核糖核苷酸分子的制剂满足关于该制剂中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准，则将该制剂配制为药物成品药；c)测量药物成品药的样品中线性多核糖核苷酸分子的量；并且d)如果该药物成品药满足关于该药物成品药中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准，则配制、标记和/或运送该药物成品药。28.在另一方面，制备药物成品药的方法包括：a)提供多个线性多核糖核苷酸分子；b)使该多个线性多核糖核苷酸分子环化以提供环状多核糖核苷酸分子的制剂；c)测量该制剂中线性多核糖核苷酸分子的量；d)如果该环状多核糖核苷酸分子的制剂满足关于该制剂中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准，则将该制剂配制为药物成品药；并且e)如果该药物成品药满足关于该药物成品药中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准，则标记并运送该药物成品药。29.在另一方面，制备药物组合物的方法包括：a)提供多个线性多核糖核苷酸分子；b)使这些线性多核糖核苷酸分子环化以提供环状多核糖核苷酸分子的制剂；c)处理该制剂以基本上去除该制剂中剩余的线性多核糖核苷酸分子；d)任选地评价在该处理步骤之后剩余的该制剂中线性多核糖核苷酸分子的量；并且e)进一步处理该制剂以产生用于药物用途的该药物组合物。在一些实施例中，该方法进一步包括以下项中的一种或多种：f)处理该制剂以基本上去除脱氧核糖核苷酸分子；g)评价该制剂中脱氧核糖核苷酸分子的量；h)将该制剂与药物赋形剂一起配制；i)浓缩该制剂；并且j)将该制剂中脱氧核糖核苷酸分子的量记录在印刷或数字媒介中。在一些实施例中，该方法进一步包括：f)处理该制剂以基本上去除蛋白质污染物；g)评价该制剂中蛋白质污染物的量；h)将该制剂与药物赋形剂一起配制；并且i)浓缩该制剂。在一些实施例中，该步骤d)的进一步处理包括以下项中的一种或多种：f)处理该制剂以基本上去除内毒素；g)评价该制剂中内毒素的量；h)将该制剂与药物赋形剂一起配制；并且i)浓缩该制剂。30.在以上方面中的每一个的一些实施例中，该环化步骤通过夹板连接进行。在以上方面中的每一个的一些实施例中，该配制该环状多核糖核苷酸分子的制剂包括将该环状多核糖核苷酸分子的制剂与药物赋形剂组合。31.在以上方面中的每一个的一些实施例中，该方法进一步包括将该制剂中多核糖核苷酸分子(例如，线性多核糖核苷酸分子和/或环状多核糖核苷酸分子)的量记录在印刷或数字媒介中，例如该制剂的分析证书中。32.在以上方面中的每一个的一些实施例中，该配制步骤包括将该环状多核糖核苷酸分子的制剂与药物赋形剂组合。33.在以上方面中的每一个的一些实施例中，该参考标准是环状多核糖核苷酸分子的制剂的药物放行规格。例如，该参考标准可以是以下项中的一种或多种：(a)该药物制剂中存在的线性多核糖核苷酸分子的量不超过一定量，例如1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200ug/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml、600mg/ml、700mg/ml、或750mg/ml的线性多核糖核苷酸分子；(b)该药物成品药或药物原料药包含浓度为至少一定量，例如0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、500mg/ml、600mg/ml、700mg/ml、或750mg/mll的环状多核糖核苷酸分子；或者(c)该药物成品药或药物原料药包含相对于该药物制剂中的总核糖核苷酸分子至少一定量，例如至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)、99.1％(w/w)、99.2％(w/w)、99.3％(w/w)、99.4％(w/w)、99.5％(w/w)、99.6％(w/w)、99.7％(w/w)、99.8％(w/w)、99.9％(w/w)、或100％(w/w)的环状多核糖核苷酸分子。34.在以上方面中的每一个的一些实施例中，关于该制剂中存在的线性和/或带切口多核糖核苷酸分子的量的参考标准选自：a)相对于该制剂中的总核糖核苷酸分子不超过20％、15％、10％、5％、2％、1％、或0.5％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子；b)相对于该制剂中的总核糖核苷酸分子不超过5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、或0.1％(w/w)的带切口多核糖核苷酸分子；或c)相对于该制剂中的总核糖核苷酸分子不超过20％、15％、10％、5％、2％、1％、或0.5％(w/w)的组合的线性和带切口多核糖核苷酸分子。35.在以上方面中的每一个的一些实施例中，该药物制剂中总核糖核苷酸分子的至少80％(w/w)是环状多核糖核苷酸分子。在以上方面中的每一个的一些实施例中，该药物组合物包含占该制剂中的总核糖核苷酸分子不超过20％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子。在以上方面中的每一个的一些实施例中，该药物组合物包含占该制剂中的总核糖核苷酸分子不超过10％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子。36.在以上方面中的每一个的一些实施例中，该药物制剂中的环状多核糖核苷酸分子(例如，相对于总核糖核苷酸分子)通过以下项来测量：显微镜法、分光光度法、荧光测定法、变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳成像、uv‑vis分光光度法、rna电泳、rna酶h分析、uv光谱或荧光检测器、光散射技术、使用或不使用分离方法包括hplc的表面等离子体共振(spr)、hplc、使用或不使用分离前或分离后衍生化方法的基于芯片或凝胶的电泳、使用利用银或染料染色或放射性衰变用于检测线性多核糖核苷酸分子的检测方法、或利用显微镜、目测法或分光光度计的方法。例如，环状多核糖核苷酸相对于总核糖核苷酸分子的量可以使用实例2或实例3的方法确定。37.在以上方面中的每一个的一些实施例中，该药物成品药或药物原料药进一步：(a)如通过鲎变形细胞裂解物测试所测量包含少于10eu/kg的内毒素或缺少内毒素；(b)在灭菌之前包含少于100cfu/100ml或少于10cfu/100ml的生物负荷；(c)是无菌成品药或无菌原料药；(d)如在无菌条件下所测试支持少于100个活微生物的生长；和/或(e)满足usp<71>或usp<85>的标准。38.在以上方面中的每一个的一些实施例中，这些环状多核糖核苷酸分子包含一个或多个表达序列和在至少一个表达序列的3’端的交错元件。39.在以上方面中的每一个的一些实施例中，该制剂进一步满足关于该制剂中存在的dna(例如，细胞dna诸如宿主细胞dna)的量的参考标准。在一些实施例中，关于该制剂中存在的dna分子的量的该参考标准是存在不超过一定量的，例如零的dna的分子，基本上不含dna分子，或是不超过1pg/ml、10pg/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、或500ng/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、或100μg/ml的dna分子。40.在以上方面中的每一个的一些实施例中，该制剂进一步满足关于该制剂中存在的蛋白质污染物(例如，细胞蛋白质(诸如宿主细胞蛋白质)或工艺相关蛋白质杂质(例如，酶))的量的参考标准。在一些实施例中，关于该制剂中存在的蛋白质污染物的量的该参考标准是少于一定量，例如少于0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、或500ng的蛋白质污染物/毫克(mg)环状多核糖核苷酸分子。在以上方面中的每一个的一些实施例中，蛋白质污染物包括酶。41.在以上方面中的每一个的一些实施例中，该药物成品药或药物原料药包含如通过分光光度计测量的从约1.6至2.3的a260/a280吸光度比。42.在以上方面中的每一个的一些实施例中，这些线性多核糖核苷酸分子包括这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子对应物或这些环状多核糖核苷酸分子的该线性多核糖核苷酸分子对应物的片段。在以上方面中的每一个的一些实施例中，这些线性多核糖核苷酸分子包括这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子对应物(例如，环化前形式)。在以上方面中的每一个的一些实施例中，这些线性多核糖核苷酸分子包括这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子对应物或其片段、这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子非对应物或其片段、或其组合。在以上方面中的每一个的一些实施例中，这些线性多核糖核苷酸分子包括这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子对应物(例如，环化前形式)、这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子非对应物、或其组合。43.在以上叙述的每个方面的一些实施例中，这些环状多核糖核苷酸分子包含编码一种或多种表达产物(例如，治疗性表达产物)，例如编码治疗性蛋白质或核酸的一个序列、或多个序列。在以上叙述的每个方面的一些实施例中，这些环状多核糖核苷酸分子具有含有支架(例如，适体序列)的序列。在以上方面中的每一个的一些实施例中，这些环状多核糖核苷酸分子具有编码内源性或天然存在的环状多核糖核苷酸序列的序列。在此类实施例中，该药物制剂可以进一步满足关于环状多核糖核苷酸分子具有一定序列的参考标准，例如序列与编码该表达产物的参考序列具有至少80％(例如，85％、90％、95％、97％、99％、100％、或其间的任何百分比)序列同一性。使用方法44.在另一方面，将环状多核糖核苷酸分子递送至受试者的细胞或组织、或受试者的方法包括将如本文所述的药物制剂、如本文所述的药物组合物、如本文所述的药物原料药、或如本文所述的药物成品药施用至该受试者的该细胞或组织、或该受试者，其中例如在该施用步骤之后至少3天(例如，至少4、5、6、7、10、12、15、20、24天或更多天、或其间的任一天)在该细胞、组织、或受试者中检测到该环状多核糖核苷酸分子。45.在另一方面，将环状多核糖核苷酸分子递送至受试者的细胞或组织、或受试者的方法包括将如本文所述的药物制剂、如本文所述的药物组合物、如本文所述的药物原料药、或如本文所述的药物成品药施用至该受试者的该细胞或组织、或该受试者，其中在该施用步骤之后至少3天在该细胞、组织、或受试者中检测到该环状多核糖核苷酸或从该环状多核糖核苷酸翻译的产物。46.在另一方面，将治疗性产物递送至受试者的细胞或组织、或有需要的受试者的方法包括将如本文所述的药物制剂、如本文所述的药物组合物、如本文所述的药物原料药、或如本文所述的药物成品药施用至该受试者的该细胞或组织、或该受试者。在每个以上方面的一些实施例中，该组合物或制剂的这些环状多核糖核苷酸分子包括具有包含该治疗性产物的序列的环状多核糖核苷酸分子，并且例如在该施用步骤之后至少3天(例如，至少4、5、6、7、10、12、15、20、24天或更多天、或其间的任一天)在该细胞、组织、或受试者中检测到从这些环状多核糖核苷酸分子转录或翻译的该治疗性产物。在此方面的一些实施例中，该组合物或制剂的这些环状多核糖核苷酸分子包括具有包含适体的序列的环状多核糖核苷酸分子，并且在该施用步骤之后至少3天(例如，至少4、5、6、7、10、12、15、20、24天或更多天、或其间的任一天)在该细胞、组织、或受试者中检测到该环状多核糖核苷酸分子。在此方面的一些实施例中，该组合物或制剂的这些环状多核糖核苷酸包括具有内源性或天然存在的环状多核糖核苷酸分子序列的环状多核糖核苷酸分子，并且在该施用步骤之后至少3天(例如，至少4、5、6、7、10、12、15、20、24天或更多天、或其间的任一天)在该细胞、组织、或受试者中检测到该内源性或天然存在的环状多核糖核苷酸分子。47.在另一方面，肠胃外核酸递送系统包含(i)如本文所述的药物制剂、如本文所述的药物组合物、如本文所述的药物原料药、或如本文所述的药物成品药，和(ii)肠胃外可接受的稀释剂。在该方面的一些实施例中，该药物制剂、该药物组合物、该药物原料药、或该药物成品药不含任何载体。48.在另一方面，递送环状多核糖核苷酸的方法包括向有需要的受试者肠胃外施用如本文所述的药物制剂、如本文所述的药物组合物、如本文所述的药物原料药、或如本文所述的药物成品药。在此方面的一些实施例中，该环状多核糖核苷酸是处于有效引起或诱导该受试者中的生物学应答的量下。在此方面的一些实施例中，该环状多核糖核苷酸是处于有效对该受试者中的细胞或组织具有生物学效应的量下。在此方面的一些实施例中，肠胃外施用是以静脉内、肌肉内、眼科或局部方式。49.在另一方面，将环状多核糖核苷酸递送至受试者的细胞或组织的方法包括向该细胞或组织肠胃外施用如本文所述的药物制剂、如本文所述的药物组合物、如本文所述的药物原料药、或如本文所述的药物成品药。在此方面的一些实施例中，肠胃外施用是以静脉内、肌肉内、眼科或局部方式。50.在每个以上方面的一些实施例中，该方法进一步包括在该施用步骤之前评价该细胞、组织或受试者中这些环状多核糖核苷酸分子或从这些环状多核糖核苷酸分子翻译的产物的存在。在每个以上方面的一些实施例中，该方法进一步包括在该施用步骤之后(例如，在该施用步骤之后24小时、48小时、72小时、4天、7天、14天或更长时间、或其间的任一天)评价该细胞、组织或受试者中这些环状多核糖核苷酸分子或从这些环状多核糖核苷酸分子翻译的产物的存在。在以上方面中的每一个的一些实施例中，该药物制剂、该药物组合物、该药物原料药、或该药物成品药包含稀释剂(例如，肠胃外可接受的稀释剂)并且不含任何载体。定义51.本发明将针对特定实施例并参考某些附图进行描述，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求书来限定。除非另有说明，否则下文陈述的术语通常应以其常见意义来理解。52.术语“通过……可获得”、“通过……可产生”等用于表明权利要求或实施例是指化合物、组合物、产品等本身，即化合物、组合物、产品等可以通过描述用于制造该化合物、组合物、产品等的方法获得或产生，但化合物、组合物、产品等也可以通过所描述的方法以外的其他方法获得或产生。术语“通过……获得”、“通过……产生”等指示化合物、组合物、产品是通过所叙述的具体方法获得或产生的。应理解，术语“通过……可获得”、“通过……可产生”等还披露了术语“通过……获得”、“通过……产生”等作为“通过……可获得”、“通过……可产生”等的优选实施例。53.词语“用于治疗、调节等的化合物、组合物、产品等”应理解为是指本身适合于所指示的治疗、调节等目的的化合物、组合物、产品等。词语“用于治疗、调节等的化合物、组合物、产品等”另外披露了，作为优选实施例，这种化合物、组合物、产品等用于治疗、调节等。54.词语“用于在……中使用的化合物、组合物、产品等”或“化合物、组合物、产品等在制造用于……的药物、药物组合物、兽用组合物、诊断组合物等中的用途”指示此类化合物、组合物、产品等将用于可在人体或动物体上实践的治疗性方法中。它们被认为是涉及治疗方法等的实施例和权利要求的等同披露。如果实施例或权利要求因此是指“用于在治疗疑似患有疾病的人或动物中使用的化合物”，则这也被认为是披露“化合物在制造用于治疗疑似患有疾病的人或动物的药物中的用途”或“通过向疑似患有疾病的人或动物施用化合物的治疗方法”。词语“用于治疗、调节等的化合物、组合物、产品等”应理解为是指本身适合于所指示的治疗、调节等目的的化合物、组合物、产品等。55.术语“药物组合物”旨在还披露包含在药物组合物中的环状多核糖核苷酸可用于通过疗法治疗人体或动物体。因此，这意味着等同于“用于在疗法中使用的环状多核糖核苷酸”。56.如本文所述的环状多核糖核苷酸分子、包含此类环状多核糖核苷酸分子的组合物、制备和使用此类环状多核糖核苷酸的方法等部分地基于以下实例，这些实例说明了线性rna分子在环状rna制剂中的效应(例如，实例1‑12)，和(例如，实例13及以下)包含不同的元件，例如复制元件、表达序列、交错元件和加密原(encryptogen)(参见例如，实例13)或例如表达序列、交错元件和调控元件(参见例如，实例34和44)的环状多核糖核苷酸效应子的制备和使用，以及其技术效果(例如，实例43和44中与线性对应物相比增加的翻译效率以及实例33和实例60中相比于线性对应物增加的半衰期)。基于尤其这些实例，下文中的描述设想了实例中所考虑的具体发现和组合的各种变型。57.如本文使用的，术语“总核糖核苷酸分子”意指如通过核糖核苷酸分子的总质量测量的任何核糖核苷酸分子的总量，这些任何核糖核苷酸分子包括线性多核糖核苷酸分子、环状多核糖核苷酸分子、单体核糖核苷酸、其他多核糖核苷酸分子、其片段及其修饰变型。58.如本文使用的，术语“circrna”或“环状多核糖核苷酸”或“环状rna”或“环状多核糖核苷酸分子”可互换使用，并且意指具有没有游离端(即，没有游离3’和/或5’端)的结构的多核糖核苷酸分子，例如通过共价或非共价键形成环状或环形结构的多核糖核苷酸分子。59.如本文使用的，术语“片段”意指核苷酸分子的任何部分，该任何部分是短于核苷酸分子的至少一个核苷酸。例如，核苷酸分子可以是线性多核糖核苷酸分子并且其片段可以是作为线性多核糖核苷酸分子的一部分的单核糖核苷酸或任何数量的连续多核糖核苷酸。作为另一个实例，核苷酸分子可以是环状多核糖核苷酸分子并且其片段可以是作为环状多核糖核苷酸分子的一部分的多核糖核苷酸或任何数量的连续多核糖核苷酸。60.如本文使用的，术语“加密原”是环状多核糖核苷酸的核酸序列或结构，该核酸序列或结构有助于降低、逃避和/或避免免疫细胞的检测和/或降低针对环状多核糖核苷酸的免疫应答的诱导。61.如本文使用的，术语“表达序列”是编码产物(例如肽或多肽)的核酸序列、或调控核酸。编码肽或多肽的示例性表达序列可以包含多个核苷酸三联体，其中每一个都可以编码氨基酸，并且被称为“密码子”。62.如本文使用的，术语“免疫蛋白结合位点”是与免疫蛋白结合的核苷酸序列。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点有助于将环状多核糖核苷酸掩蔽成外源性的，例如，免疫蛋白结合位点可以被蛋白质(例如，竞争性抑制剂)结合，从而阻止环状多核糖核苷酸被免疫蛋白识别和结合，从而降低或避免针对环状多核糖核苷酸的免疫应答。如本文使用的，术语“免疫蛋白”是与免疫应答(例如像针对免疫原，例如环状多核糖核苷酸)相关的任何蛋白质或肽。免疫蛋白的非限制性实例包括t细胞受体(tcr)、抗体(免疫球蛋白)、主要组织相容性复合体(mhc)蛋白、补体蛋白和rna结合蛋白。63.如本文使用的，术语“线性rna”或“线性多核糖核苷酸”或“线性多核糖核苷酸分子”可互换使用，并且意指具有5’和3’端的多核糖核苷酸分子。5’和3’端中的一者或两者可以是游离端或接合至另一个部分。如本文使用的，线性rna未经历过环化(例如，是环化前的)并且可用作通过例如夹板连接，或化学、酶促、核酶或剪接催化的环化方法进行环化的起始材料。64.如本文使用的，术语“带切口rna”或“带切口线性多核糖核苷酸”或“带切口线性多核糖核苷酸分子”可互换使用，并且意指由环状rna的切口或降解产生的具有5’和3’端的多核糖核苷酸分子。65.如本文使用的，术语“非环状rna”意指总的带切口rna和线性rna。66.如本文使用的，术语“核糖核苷酸”是具有至少一个针对糖、核碱基或核苷间键的修饰的核苷酸。67.如本文使用的，短语“准螺旋结构”是环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分折叠成螺旋结构。68.如本文使用的，短语“准双链二级结构”是环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分产生内部双链。69.如本文使用的，术语“调控元件”是修饰环状多核糖核苷酸内表达序列的表达的部分，诸如核酸序列。70.如本文使用的，术语“重复核苷酸序列”是一段dna或rna内或整个基因组内的重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚ca序列或聚tg(ug)序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括内含子alu家族中的重复序列。71.如本文使用的，术语“复制元件”是可用于复制或者起始环状多核糖核苷酸转录的序列和/或基序。72.如本文使用的，术语“交错元件”是在翻译期间诱导核糖体暂停的部分，诸如核苷酸序列。在一些实施例中，交错元件是具有强α‑螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，其后接共有序列‑d(v/i)exnpgp，其中x＝任何氨基酸。在一些实施例中，交错元件可以包括化学部分，诸如甘油、非核酸连接部分、化学修饰、经修饰的核酸、或其任何组合。73.如本文使用的，术语“基本上对……有抗性”是相比于参考物对效应子具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％抗性的物质。74.如本文使用的，术语“化学计量翻译”是从环状多核糖核苷酸翻译的表达产物的基本当量的产生。例如，对于具有两个表达序列的环状多核糖核苷酸，环状多核糖核苷酸的化学计量翻译意指两个表达序列的表达产物具有基本当量的量，例如两个表达序列之间的量差(例如，摩尔差)可以是约0，或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％、或其间的任何百分比。75.如本文使用的，术语“翻译起始序列”是起始环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译的核酸序列。76.如本文使用的，术语“终止元件”是终止环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译的部分，诸如核酸序列。77.如本文使用的，术语“翻译效率”是从核糖核苷酸转录物产生蛋白质或肽的速率或量。在一些实施例中，翻译效率可以表示为给定量的编码蛋白质或肽的转录物产生的蛋白质或肽的量，例如在给定的时间段内，例如在给定的翻译系统中，例如体外翻译系统(像兔网织红细胞裂解物)或体内翻译系统(像真核细胞或原核细胞)。78.如本文使用的，术语“环化效率”是所得环状多核糖核苷酸相对于其非环状起始材料的测量。79.如本文使用的，术语“免疫原性”是针对物质诱导免疫应答的潜力。在一些实施例中，当生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞暴露于免疫原性物质时，可以诱导免疫应答。术语“非免疫原性”是对于物质缺少或不存在高于可检测阈值的免疫应答。在一些实施例中，当生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞暴露于非免疫原性物质时，未检测到免疫应答。在一些实施例中，当通过免疫原性测定测量时，如本文提供的非免疫原性环状多核糖核苷酸不会诱导超过预定阈值的免疫应答。例如，当使用免疫原性测定来测量针对环状多核糖核苷酸或炎性标记物产生的抗体时，本文提供的非免疫原性多核糖核苷酸可以导致水平低于预定阈值的抗体或标记物的产生。预定阈值可以是例如由对照参考物产生的抗体或标记物水平的至多1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍。作为另一个实例，当使用免疫原性测定来测量针对环状多核糖核苷酸的先天性免疫应答(诸如测量炎性标记物)时，如本文提供的非免疫原性多核糖核苷酸可以导致水平低于预定阈值的先天性免疫应答的产生。预定阈值可以是例如由针对对照参考物的先天性应答产生的标记物水平的至多1.5倍、2倍、3倍、4倍或5倍。80.如本文使用的，术语“杂质”是组合物，例如如本文所述的药物组合物中存在的不期望物质。在一些实施例中，杂质是工艺相关杂质。在一些实施例中，杂质是最终组合物中除期望产物之外，例如除如本文所述的活性药物成分(例如，环状多核糖核苷酸)之外的产品相关物质。如本文所用，术语“工艺相关杂质”是在组合物、制剂、或产品的制造中使用、存在或生成的物质，除本文所述的线性多核糖核苷酸之外，该物质在最终组合物、制剂、或产品中是不期望的。在一些实施例中，工艺相关杂质是在合成或环化多核糖核苷酸中使用的酶。如本文所用，术语“产品相关物质”是在组合物、制剂、或产品、或其任何中间体的合成过程中产生的物质或副产品。在一些实施例中，产品相关物质是脱氧核糖核苷酸片段。在一些实施例中，产品相关物质是脱氧核糖核苷酸单体。在一些实施例中，产品相关物质是以下项中的一种或多种：本文所述的多核糖核苷酸的衍生物或片段，例如10、9、8、7、6、5或4核糖核酸、单核糖核酸、二核糖核酸、或三核糖核酸的片段。81.如本文使用的，术语“基本上不含”是组合物、制剂、或产品、或其任何中间体中组分的水平低于诱导生物学、化学、物理、和/或药理效应所需的水平。在一些实施例中，如果组分的水平通过相关检测技术(例如，色谱法(使用柱、使用纸、使用凝胶、使用hplc、使用uhplc等，或通过ic、通过sec、通过反相、通过阴离子交换、通过混合模式等)或使用或不使用分离前或分离后衍生化方法的电泳(尿素page、基于芯片的、聚丙烯酰胺凝胶、rna、毛细管、c‑ief等))，使用基于质谱法、uv‑vis、荧光、光散射、折射率，或利用银或染料染色或放射性衰变用于检测的检测技术仅可以痕量检测到或者水平小于可检测的水平，则组合物、制剂、或产品基本上不含该组分。替代性地，组合物、制剂、或产品是否基本上不含组分可以在不使用分离技术的情况下通过质谱法、显微镜法、圆二色性(cd)光谱法、uv或uv‑vis分光光度法、荧光法(例如，qubit)、rna酶h分析、表面等离子体共振(spr)、或利用银或染料染色或放射性衰变用于检测的方法来确定。82.如本文使用的，术语“线性对应物”是与环状多核糖核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或其间的任何百分比序列相似性)的多核糖核苷酸分子(及其片段)并且具有两个游离端(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))。在一些实施例中，线性对应物(例如，环化前形式)是与环状多核糖核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或其间的任何百分比序列相似性)并且具有相同或相似的核酸修饰的多核糖核苷酸分子(及其片段)并且具有两个游离端(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))。在一些实施例中，线性对应物是与环状多核糖核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％或其间的任何百分比序列相似性)并且具有不同的核酸修饰或不具有核酸修饰的多核糖核苷酸分子(及其片段)并且具有两个游离端(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))。在一些实施例中，作为线性对应物的多核糖核苷酸分子的片段是线性对应物多核糖核苷酸分子的任何部分，该任何部分短于线性对应物多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，线性对应物进一步包含5’帽。在一些实施例中，线性对应物进一步包含聚腺苷尾。在一些实施例中，线性对应物进一步包含3’utr。在一些实施例中，线性对应物进一步包含5’utr。83.如本文使用的，术语“适体序列”是特异性结合至靶分子的非天然存在、或合成的寡核苷酸。典型地，适体是从20至500个核苷酸。典型地，适体通过二级结构而非序列同源性结合至其靶标。在一些实施例中，合成寡核苷酸可以具有与特异性结合至靶分子的天然存在的寡核苷酸相同的序列。84.如本文使用的，术语“载体”意指通过经由部分或完全包封剂或其组合共价修饰环状多核糖核苷酸来促进将组合物(例如，环状多核糖核苷酸)转运或递送至细胞中的化合物、组合物、试剂、或分子。载体的非限制性实例包括碳水化合物载体(例如，酸酐修饰的植物糖原或糖原型材料)、纳米颗粒(例如，包封或共价连接结合至环状多核糖核苷酸的纳米颗粒)、脂质体、融合体、离体分化的网织红细胞、外来体、蛋白质载体(例如，共价连接至环状多核糖核苷酸的蛋白质)、或阳离子载体(例如，阳离子脂质聚合物或转染试剂)。85.如本文使用的，术语“裸递送”意指用于在不借助载体并且不对部分进行有助于递送至细胞的共价修饰的情况下递送至细胞的配制品。裸递送配制品不含任何转染试剂、阳离子载体、碳水化合物载体、纳米颗粒载体、或蛋白质载体。例如，环状多核糖核苷酸的裸递送配制品是包含无共价修饰的环状多核糖核苷酸并且不含载体的配制品。86.术语“稀释剂”意指包含本文所述的组合物(例如，包含环状多核糖核苷酸的组合物)可以稀释或溶解于其中的非活性溶剂的媒介物。稀释剂可以是rna增溶剂、缓冲液、等渗剂、或其混合物。稀释剂可以是液体稀释剂或固体稀释剂。液体稀释剂的非限制性实例包括水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3‑丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯、和1,3‑丁二醇。固体稀释剂的非限制性实例包括碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、或糖粉。87.如本文所用，术语“肠胃外可接受的稀释剂”是用于肠胃外施用组合物(例如，包含环状多核糖核苷酸的组合物)的稀释剂。通过援引并入88.本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过援引并入本文，其程度如同明确地和单独地指示将每篇单独的公开、专利或专利申请通过援引并入本文。附图说明89.当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的实施例的以下详细描述。出于说明本发明的目的，在附图中示出了本发明示例的实施例。然而，应理解，本发明不限于附图中所示实施例的精确安排和手段。90.图1示出了探针与环状和线性rna的结合以及rna酶h对rna的随后降解。与检测为多个条带的线性和连环化rna相比，环状rna被检测为单一裂解线性条带。通过以下方式来检测降解：在变性聚丙烯酰胺凝胶上运行样品并且比较在添加或不添加rna酶h的情况下的降解条带。91.图2示出了通过将线性rna条带强度与线性rna标准品进行比较而在变性聚丙烯酰胺凝胶上定量的线性rna含量。92.图3示出了从变性聚丙烯酰胺凝胶的不同条带中提取的rna的定量。93.图4示出了与未纯化的环状rna制剂相比，经纯化的环状rna制剂在bj成纤维细胞中随时间的持续性。94.图5示出了与含有不同量的线性rna的环状rna制剂相比，经纯化的环状rna制剂在bj成纤维细胞中随时间的表达水平。95.图6显示，经纯化的环状rna在注射至小鼠中后具有更高的表达并且具有如在施用后14天在离体肝脏中测量的更长的表达。96.图7示出了如通过测量6％尿素page凝胶中的条带强度计算的纯化之前和之后环状rna与线性rna的比率的图。条带的定量如下：在纯化之前，42.6％的rna产物是环状rna，并且57.4％的rna产物是线性rna(未纯化的rna)；在纯化之后，50.4％的rna产物是环状rna，并且49.6％的rna产物是线性rna(经纯化的circrna)。97.图8示出了在使用84％纯度的环状rna、71％纯度的环状rna、和仅媒介物的实验中转染后6、24、48、72、96和120小时的细胞中的高斯萤光素酶活性。98.图9示出了与用组合的环状rna和线性对应物rna两者转染的细胞相比，用单独的凝胶纯化的环状rna制剂转染的细胞。与组合的环状rna和线性对应物rna制剂相比，仅circrna以剂量依赖性方式显示出更高的稳定性。99.图10示出了与用组合的环状rna和线性对应物rna两者转染的细胞(以剂量依赖性方式展现出对这些先天性免疫基因的上调)相比，用仅凝胶纯化的环状rna制剂转染的细胞显示出先天性免疫基因诸如rig‑i、mda‑5、oas和ifn‑b的最低表达。100.图11示出了具有内含子并且表达gfp的对照环状rna的示意图。101.图12示出了示例性环状rna的示意图，该示例性环状rna具有在存在或不存在核糖开关配体时调控来自环状rna的gfp的表达的合成核糖开关(用红色表示)。102.图13是展示了在小鼠模型中具有加密原(内含子)的示例性环状rna的体内蛋白质表达的示意图。103.图14示出了具有一个双链rna区段的示例性环状rna的示意图，可以对该示例性环状rna进行其结构信息的斑点印迹分析。104.图15示出了具有准螺旋结构(hdvmin)的示例性环状rna的示意图，可以对该示例性环状rna进行其结构信息的shape分析。105.图16示出了具有功能性准螺旋结构(hdvmin)的示例性环状rna的示意图，该示例性环状rna展示了hdag结合活性。106.图17是展示了示例性的可自复制的环状rna的转录、自裂解和连接的示意图。107.图18示出了示例性环状rna的示意图，该示例性环状rna在有丝分裂期间被保留并且在子细胞中持续存在。如图所示的brdu脉冲被用于标记分裂的细胞。108.图19是展示了不同的示例性环状rna的体外产生的变性page凝胶图像。109.图20是汇总了不同示例性环状rna的环化效率的图。110.图21是展示了示例性环状rna与其线性对应物相比降解易感性降低的变性page凝胶图像。111.图22是展示了在示例性纯化过程之后的示例性环状rna的变性page凝胶图像。112.图23是展示了通过示例性环状rna(缺少ires、帽、5'和3'utr)的flag蛋白(约15kda)表达的蛋白质印迹图像。113.图24是展示了示例性环状rna的滚环翻译的蛋白质印迹图像。114.图25示出了蛋白质印迹图像，这些蛋白质印迹图像展示了来自具有或不具有示例性交错元件的不同示例性环状rna的离散蛋白或连续长肽的产生。115.图26是蛋白质印迹图像，该蛋白质印迹图像展示了具有示例性交错元件或终止元件(终止密码子)的不同示例性环状rna之间的蛋白质表达的比较。116.图27是汇总了来自从两种示例性环状rna翻译的蛋白质产物的蛋白质印迹分析的信号强度的图。117.图28是汇总了与媒介物对照相比，示例性环状rna及其线性对应物的翻译产物的萤光素酶活性的图。118.图29是汇总了与线性rna相比，在测试示例性环状rna的半衰期的时程实验中在不同采集时间点的rna数量的图。119.图30a是示出了使用捕获线性和环状rna两者的引物进行的对递送至细胞后24小时的线性和环状rna水平的qrt‑pcr分析的图。120.图30b是示出了使用对环状rna具有特异性的引物进行的对线性和环状rna水平的qrt‑pcr分析的图。121.图31是示出了针对egf蛋白和β‑微管蛋白上样对照探测的来自环状rna和线性rna的细胞裂解物的印迹的图像。122.图32是示出了对来自用环状rna或线性rna转染的293t细胞的免疫相关基因的qrt‑pcr分析的图。123.图33是示出了由环状rna经由滚环翻译表达的蛋白质的萤光素酶活性的图。124.图34是示出了由环状rna或线性rna表达的蛋白质的萤光素酶活性的图。125.图35是示出了由线性rna或环状rna经由滚环翻译表达的蛋白质的萤光素酶活性的图。126.图36是示出了由环状rna经由ires翻译起始表达的蛋白质的萤光素酶活性的图。127.图37是示出了由环状rna经由ires起始和滚环翻译表达的蛋白质的萤光素酶活性的图。128.图38是示出了环状rna或线性rna的表达产物的蛋白质印迹的图像。129.图39是示出了具有交错元件的环状rna或线性rna的表达产物的蛋白质印迹的图像。130.图40示出了示例性环状rna的具有准双链结构的预测结构。131.图41示出了示例性环状rna的具有准螺旋结构的预测结构。132.图42示出了示例性环状rna的具有与重复序列连接的准螺旋结构的预测结构。133.图43展示了如下的实验数据，即通过示例性环状rna的rna酶h降解产生的核酸降解产物与环状rna(而非连环化rna)一致。134.图44示出了用于产生各种rna长度所生成的不同长度dna的电泳图像。135.图45示出了如下的实验数据，即使用rna酶r处理和针对各种长度的环状接合点的qpcr分析证实了rna环化。136.图46示出了具有mirna结合位点的示例性环状rna的生成。137.图47示出了通过自剪接对示例性环状rna的生成。138.图48示出了具有蛋白质结合位点的示例性环状rna的生成。139.图49示出了如下的实验数据，该数据展示了与线性对照相比，环状rna在正进行分裂的细胞中有更高的稳定性。140.图50示出了如下的实验数据，该数据展示了具有多个表达序列的示例性环状rna的蛋白质表达以及具有多个表达序列的示例性环状rna的滚环翻译。141.图51示出了如下的实验数据，该数据展示了与线性对照相比，示例性环状rna对转染细胞的毒性降低。142.图52显示，在应激状态下，与线性rna相比，示例性环状rna以更高的水平翻译。143.图53示出了具有核糖开关的环状rna的生成。144.图54a、图54b和图54c显示，经修饰的环状rna在细胞中被翻译。145.图55a、图55b和图55c显示，与未修饰的环状rna相比，如通过转染细胞中的mda5、oas和ifn‑β表达评估的，经修饰的环状rna对细胞具有降低的免疫原性。146.图56显示，在注射至小鼠中之后，在注射后3天、4天和7天在小鼠肝脏中检测到的环状rna水平高于线性rna。147.图57a和图57b显示，在将表达高斯萤光素酶的环状rna或线性rna注射至小鼠中之后，在给予环状rna后1天、2天、7天、11天、16天和23天在血浆中检测到高斯萤光素酶活性，而仅在给予经修饰的线性rna后1天和2天在血浆中检测到其活性。148.图58显示，在注射rna之后，在施用rna后16天在肝脏和脾脏中检测到环状rna而非线性rna。149.图59示出了在注射rna之后，如通过rig‑i、mda‑5、ifn‑b和oas评估的，线性rna而非环状rna显示出免疫原性。具体实施方式150.本发明总体上涉及环状多核糖核苷酸的药物组合物和制剂及其用途。151.在一些方面，本文所述的发明包括环状rna组合物、制剂以及使用和制备具有降低、控制或规定水平的线性rna的环状rna组合物和制剂、特别是药物环状rna组合物和制剂的方法。如本文例如在实例1‑12中所述，环状rna制剂中线性rna的存在可能影响例如环状rna的表达水平、持续性、半衰期、和/或稳定性；和/或对制剂的免疫应答。152.表1旨在提供具体实施方式的内容的简单概要，决不具有排他性或限制性。具体实施方式的某些方面可能未反映在表1具体实施方式概要中。表1.具体实施方式概要环状多核糖核苷酸153.在一些实施例中，环状rna具有编码一种或多种表达产物(例如，一种或多种治疗性表达产物)的一个序列、或多个序列，例如，环化rna编码治疗性蛋白质或核酸。在一些实施例中，环状rna具有包含适体的一个序列、或多个序列。在一些实施例中，环状rna具有编码与内源性或天然存在的环状多核糖核苷酸序列具有至少80％(例如，85％、90％、95％、97％、99％、100％或其间的任何百分比)序列同一性的序列的序列。在一些实施例中，环状rna和制剂未在哺乳动物例如人中引起不需要的免疫应答。154.在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的半衰期至少是其线性对应物(例如，线性表达序列或线性多核糖核苷酸)的半衰期。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的半衰期大于其线性对应物的半衰期。在一些实施例中，半衰期大了约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多、或其间的任何百分比。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性是至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性是不超过约10分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在正进行细胞分裂的细胞中具有半衰期或持续性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在分裂后细胞中具有半衰期或持续性。在某些实施例中，环状多核糖核苷酸在正进行分裂的细胞中的半衰期或持续性大于约10分钟至约30天，或是至少约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天、或更长时间或其间的任何时间。155.在一些实施例中，环状多核糖核苷酸例如瞬时地或长期地调节细胞功能。在某些实施例中，细胞功能发生稳定改变，诸如调节持续存在至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，细胞功能发生瞬时改变，诸如调节持续存在不超过约30分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。156.在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约1,000个核苷酸、至少约2,000个核苷酸、至少约5,000个核苷酸、至少约6,000个核苷酸、至少约7,000个核苷酸、至少约8,000个核苷酸、至少约9,000个核苷酸、至少约10,000个核苷酸、至少约12,000个核苷酸、至少约14,000个核苷酸、至少约15,000个核苷酸、至少约16,000个核苷酸、至少约17,000个核苷酸、至少约18,000个核苷酸、至少约19,000个核苷酸、或至少约20,000个核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以具有足够的大小以容纳核糖体的结合位点。本领域技术人员可以理解，环状多核糖核苷酸的最大大小可以与产生环状多核糖核苷酸和/或使用环状多核糖核苷酸的技术限制内的一样大。不受理论的束缚，有可能的是，可以从dna产生rna的多个区段并且其5'游离端和3'游离端退火以产生一“串”rna，当仅留有一个5'游离端和一个3'游离端时，该“串”rna最终可以被环化。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大大小受包装rna并且将其递送至靶标的能力所限制。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的大小是足以编码有用的多肽的长度，并且因此至少20,000个核苷酸、至少15,000个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸或至少5,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少500个核苷酸、至少400个核苷酸、至少300个核苷酸、至少200个核苷酸、至少100个核苷酸的长度可能是有用的。157.在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个本文其他处所述的元件。在一些实施例中，这些元件可以通过间隔子序列或接头彼此隔开。在一些实施例中，这些元件可以被1个核糖核苷酸、2个核苷酸、约5个核苷酸、约10个核苷酸、约15个核苷酸、约20个核苷酸、约30个核苷酸、约40个核苷酸、约50个核苷酸、约60个核苷酸、约80个核苷酸、约100个核苷酸、约150个核苷酸、约200个核苷酸、约250个核苷酸、约300个核苷酸、约400个核苷酸、约500个核苷酸、约600个核苷酸、约700个核苷酸、约800个核苷酸、约900个核苷酸、约1000个核苷酸、最多约1kb、至少约1000个核苷酸、其间任何量的核苷酸彼此分开。在一些实施例中，一个或多个元件彼此连续，例如，缺少间隔子元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸中的一个或多个元件是构象柔性的。在一些实施例中，构象柔性是由于序列基本上不含二级结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含二级或三级结构，该二级或三级结构容纳本文所述的一种或多种期望的功能或特征，例如容纳核糖体的结合位点，例如翻译，例如滚环翻译。158.在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含特定的序列特征。例如，环状多核糖核苷酸可以包含特定的核苷酸组成。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个嘌呤富集区(腺嘌呤或鸟苷)。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个嘌呤富集区(腺嘌呤或鸟苷)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个au富集区或元件(are)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个腺嘌呤富集区。159.在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个本文其他处所述的重复元件。160.在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个本文其他处所述的修饰。161.在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列，并且被配置用于在受试者体内细胞中的持续表达。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被配置为使得一个或多个表达序列在细胞中在较晚的时间点的表达等于或高于较早的时间点的表达。在此类实施例中，一个或多个表达序列的表达可以维持在相对稳定的水平或可以随时间增加。表达序列的表达可以在延长的时间段内相对稳定。例如，在一些情况下，一个或多个表达序列在细胞中在至少7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23或更多天的时间段内的表达不会减少50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。在一些情况下，在一些情况下，一个或多个表达序列在细胞中在至少7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23或更多天的表达维持在变化不超过50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％的水平。162.在一些实施例中，环状多核糖核苷酸能够在来自水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)的细胞、哺乳动物细胞(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎和熊等)的细胞、来自农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)的细胞、人细胞)、培养的细胞、原代细胞或细胞系、干细胞、祖细胞、分化细胞、生殖细胞、癌细胞(例如，致瘤的、转移的)、非致瘤细胞(正常细胞)、胎儿细胞、胚胎细胞、成年细胞、有丝分裂细胞、非有丝分裂细胞、或其任何组合中复制或者在其中复制。在一些实施例中，本发明包括包含本文所述的环状多核糖核苷酸的细胞，其中该细胞是来自水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)的细胞、哺乳动物细胞(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎和熊等)的细胞、来自农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)的细胞、人细胞)、培养的细胞、原代细胞或细胞系、干细胞、祖细胞、分化细胞、生殖细胞、癌细胞(例如，致瘤的、转移的)、非致瘤细胞(正常细胞)、胎儿细胞、胚胎细胞、成年细胞、有丝分裂细胞、非有丝分裂细胞、或其任何组合。在一些实施例中，细胞被修饰以包含环状多核糖核苷酸。制备环状rna的方法163.在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的制备包括制备脱氧核糖核酸序列，该脱氧核糖核酸序列是非天然存在的并且可以使用重组技术(以下描述的方法；例如，使用dna质粒体外衍生)或化学合成产生。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸的环化通过夹板连接进行。164.在本发明的范围内，用于产生rna环的dna分子可以包括天然存在的原始核酸序列的dna序列、其修饰形式、或编码通常未在自然中发现的合成多肽的dna序列(例如，嵌合分子或融合蛋白)。dna和rna分子可以使用多种技术修饰，这些多种技术包括但不限于经典诱变技术和重组技术，诸如定点诱变、化学处理核酸分子以诱导突变、限制性酶裂解核酸片段、连接核酸片段、聚合酶链式反应(pcr)扩增和/或诱变核酸序列的选定区域、合成寡核苷酸混合物以及连接混合物基团以“建造”核酸分子混合物、及其组合。165.环状多核糖核苷酸可以根据任何可用的技术制备，该技术包括但不限于化学合成和酶促合成。在一些实施例中，线性初级构建体或线性mrna可以被环化、或连环化以产生本文所述的环状多核糖核苷酸。环化或连环化的机制可以通过诸如但不限于化学、酶促、夹板连接或核酶催化的方法来发生。新形成的5'‑/3'‑键可以是分子内键或分子间键。166.制备本文所述的环状多核糖核苷酸的方法描述于以下文献中：例如，khudyakov和fields,artificialdna:methodsandapplications[人工dna：方法与应用],crcpress[crc出版社](2002)；zhao,syntheticbiology:toolsandapplications[合成生物学：工具与应用](第一版),academicpress[学术出版社](2013)；以及egli和herdewijn,chemistryandbiologyofartificialnucleicacids[人工核酸的化学与生物学],(第一版),wiley‑vch[威利‑vch出版社](2012)。[0167]多种合成环状多核糖核苷酸的方法也在本领域中进行了描述(参见例如，美国专利号us6210931、美国专利号us5773244、美国专利号us5766903、美国专利号us5712128、美国专利号us5426180、美国公开号us20100137407、国际公开号wo1992001813、国际公开号wo2016197121、国际公开号wo2010084371；将这些专利中的每一篇的内容通过援引以其全文并入本文)。[0168]例如，本文的实例13及以下描述了制备和表征药物环状rna制剂的方法。线性和环状rna的检测[0169]本发明人已经发现，药物环状rna制剂中线性rna的存在可能具有意想不到的且有时不期望的影响。因此，本发明的特征尤其在于其中环状rna相对于线性rna富集、分离、和/或纯化的药物组合物和制剂；可以监测、评价和/或控制线性rna的方法(例如，制造环状rna制剂的方法)；以及使用此类药物组合物和制剂例如将效应子，诸如治疗性效应子或支架(例如，适体序列)递送至细胞、组织或受试者的方法。在一些实施例中，环状rna制剂具有不超过阈值水平的线性rna，例如环状rna制剂相对于线性rna经富集或经纯化以减少线性rna。[0170]通常，药物制剂中元素的检测和定量包括使用参考标准品，该参考标准品是目的组分(例如，环状rna、线性rna、片段、杂质等)或是类似材料(例如，使用与环状rna结构相同序列的线性rna结构作为环状rna的标准品)；或包括使用内标或来自测试样品的信号。在一些实施例中，标准品用于建立检测器对已知或相对量的材料的响应(响应因子)。在一些实施例中，响应因子是从一个或多个浓度的标准品确定的(例如，使用线性回归分析)。在一些实施例中，然后使用响应因子来从由于目的材料引起的信号确定该组分量。在一些实施例中，响应因子是值1或假设具有值1。[0171]在一些实施例中，使用与环状多核糖核苷酸的线性形式的比较来确定药物组合物中线性相对于环状rna的检测和定量。在一些实施例中，药物组合物中总核糖核苷酸的质量使用标准曲线确定，该标准曲线使用环状多核糖核苷酸的线性形式并且假设响应因子为1而生成。在一些实施例中，药物制剂中环状多核糖核苷酸的w/w百分比通过以下方式来确定：将通过多种已知量的环状多核糖核苷酸的线性形式的条带强度生成的标准曲线与药物制剂中环状多核糖核苷酸的条带强度进行比较。在一些实施例中，条带在基于凝胶的电泳期间产生，并且条带强度通过凝胶成像仪(例如，e‑凝胶成像仪)来测量。例如，可以使用实例2和/或实例3的方法确定线性多核糖核苷酸相比于环状多核糖核苷酸的量。在一些实施例中，当如本文所述评价时，环状多核糖核苷酸制剂包含小于阈值量(例如，其中阈值量是参考标准，例如关于环状多核糖核苷酸制剂的药物放行规格)的线性多核糖核苷酸分子。[0172]在一些实施例中，药物组合物中带切口rna相对于总rna的检测和定量通过在凝胶提取包含环状rna的制剂之后测序来确定。在一些实施例中，药物组合物中带切口rna相对于线性rna的检测和定量通过在凝胶提取包含环状rna的制剂之后测序来确定。例如，可以使用实例5的方法确定带切口多核糖核苷酸相比于总rna的量。例如，可以使用实例5的方法确定带切口多核糖核苷酸相比于线性rna的量。在一些实施例中，当如本文所述评价时，环状多核糖核苷酸制剂包含小于阈值量(例如，其中阈值量是参考标准，例如关于环状多核糖核苷酸制剂的药物放行规格)的带切口rna、线性rna或组合的线性和带切口rna。例如，关于制剂中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准是相对于制剂中的总核糖核苷酸分子不超过30％、20％、15％、10％、1％、0.5％或0.1％、或其间的任何百分比的线性多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，关于制剂中存在的带切口多核糖核苷酸分子的量的参考标准是相对于制剂中的总核糖核苷酸分子不超过30％、20％、15％、10％、1％、0.5％或0.1％、或其间的任何百分比的带切口多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，关于制剂中存在的线性和带切口多核糖核苷酸分子的量的参考标准是相对于制剂中的总核糖核苷酸分子不超过40％、30％、20％、15％、10％、1％、0.5％或0.1％、或其间的任何百分比的组合的线性多核糖核苷酸分子和带切口多核糖核苷酸分子。[0173]在一些实施例中，将标准品在与样品相同的条件下运行。例如，使用与样品相同类型的凝胶、相同的缓冲液和相同的暴露来运行标准品。在进一步的实施例中，将标准品与样品平行运行。在一些实施例中，在来自主题制剂的多个样品中重复(例如，两次或一式三份)对元素的定量以获得平均结果。在一些实施例中，对线性rna的定量使用平行毛细管电泳(例如，使用具有uv检测的片段分析仪或分析型hplc)测量。环状rna的纯化[0174]可以从不需要的物质(诸如不需要的(例如，线性)rna、酶、dna)中分离、富集或纯化环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，不需要的物质存在于、或源自制备和/或制造环状多核糖核苷酸的工艺中。可以在配制为药物制剂、药物组合物、药物原料药、或药物成品药之前富集和/或纯化本文所述的环状多核糖核苷酸。可以在配制为药物制剂、药物组合物、药物原料药、或药物成品药期间或之后富集和/或纯化本文所述的环状多核糖核苷酸。[0175]在一些实施例中，可以在生产期间或之后纯化环状rna，以去除不期望的元素，例如线性rna或带切口rna，以及公认的杂质，例如游离核糖核酸(例如，单核糖核酸、二核糖核酸、或三核糖核酸)、dna(例如，细胞dna，诸如宿主细胞dna)、细胞或工艺相关蛋白质杂质(例如，细胞或工艺相关杂质)等。在一些实施例中，杂质是工艺相关杂质。在一些实施例中，工艺相关杂质是蛋白质(例如，细胞蛋白质)、核酸(例如，细胞核酸)、缓冲液或缓冲试剂、酶、培养基/试剂组分(例如，培养基、培养基添加剂、过渡金属、或维生素)、制备性或分析性凝胶组分(例如，丙烯酰胺碎片)、dna、或色谱材料。缓冲试剂可以是mgcl2、dtt、atp、sds、na、糖原、tris‑hcl、或etoh。缓冲试剂可以包括但不限于乙酸盐、tris、碳酸氢盐、磷酸盐、柠檬酸、乳酸盐、或tea。酶可以是连接酶。连接酶可以是t4rna连接酶2。在一些实施例中，杂质是缓冲试剂、培养基/试剂组分、盐、连接酶、核酸酶、rna酶抑制剂、rna酶r、线性多核糖核苷酸分子、脱氧核糖核苷酸分子、丙烯酰胺碎片、或单核苷酸分子。[0176]在一些实施例中，可以通过本领域中常用的任何已知方法富集或纯化环状多核糖核苷酸。非限制性纯化方法的实例包括柱色谱法、凝胶切除、尺寸排阻等。[0177]在一些实施例中，通过凝胶纯化例如尿素凝胶分离来纯化环状多核糖核苷酸，例如如实例3中所述。例如，可以在变性page上解析环状rna，并且可以切除对应于环状rna的条带，并且可以使用已知方法从条带中洗脱环状rna。然后可以分析洗脱的环状rna。[0178]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸通过色谱法纯化，该色谱法例如疏水相互作用色谱法(hic)、混合模式色谱法、液相色谱法(例如，反相离子对色谱法(ip‑rp))、离子交换色谱法(ie)、亲和色谱法(ac)和尺寸排阻色谱法(sec)、及其任何组合。[0179]在一些实施例中，通过利用环状多核糖核苷酸的结构特征将其与线性rna或杂质分离来纯化环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，通过诸如实例9中所述利用结构特征(例如，缺少游离端)来纯化环状多核糖核苷酸。例如，利用线性rna对应物或其片段的聚腺苷酸化，从包含含有相同核苷酸序列的环状rna和线性rna对应物的混合池的制剂中富集环状rna。可以使用聚(a)聚合酶将线性rna对应物或其片段的3’端聚腺苷酸化，从而导致3’聚腺嘌呤尾的添加。在一些实施例中，3’聚腺嘌呤尾使得能够使用柱(诸如亲和柱)下拉线性rna及其片段，以富集环状rna。聚(a)聚合酶还可以掺入修饰的腺嘌呤，诸如生物素化n6‑atp类似物。将生物素化n6‑atp类似物向3’聚腺嘌呤尾中的这种添加使得能够在系统(诸如生物素‑链霉亲和素结合系统)中下拉线性rna及其片段。相比之下，环化rna没有3’端，并且因此不被聚(a)聚合酶聚腺苷酸化、没有用于缀合的聚腺苷酸尾、且不被在下拉中捕获。因此，在下拉后的制剂中富集了环状rna。[0180]在一些实施例中，通过利用线性rna的结构特征(例如，游离端的存在)来纯化环状多核糖核苷酸。例如，利用线性rna对应物的聚腺苷酸化，从包含含有相同核苷酸序列的环状rna和线性rna对应物的混合池的制剂中富集环状rna。可以将核酸外切酶添加至混合池中以水解线性rna。在一些实施例中，核酸外切酶可以是3’核酸外切酶或5’核酸外切酶。在一些实施例中，可以使用3’核酸外切酶和5’核酸外切酶。[0181]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)是基于质量至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)、或100％(w/w)纯的。纯度可以通过本领域技术人员已知的多种分析技术中的任一种来测量，这些分析技术诸如但不限于使用分离技术，诸如色谱法(使用柱、使用纸、使用凝胶、使用hplc、使用uhplc等，或通过ic、通过sec、通过反相、通过阴离子交换、通过混合模式等)或使用或不使用分离前或分离后衍生化方法的电泳(尿素page、基于芯片的、聚丙烯酰胺凝胶、rna、毛细管、c‑ief等)，使用基于质谱法、uv‑vis、荧光、光散射、折射率，或利用银或染料染色或放射性衰变用于检测的检测技术。替代性地，纯度可以在不使用分离技术的情况下通过质谱法、显微镜法、圆二色性(cd)光谱法、uv或uv‑vis分光光度法、荧光法(例如，qubit)、rna酶h分析、表面等离子体共振(spr)、或利用银或染料染色或放射性衰变用于检测的方法。[0182]在一些实施例中，可以通过生物学测试方法(例如，基于细胞的或基于受体的测试)来测量纯度。在一些实施例中，本文所述的制剂中总质量核糖核苷酸的至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)或100％(w/w)以环状多核糖核苷酸分子包含。该百分比可以通过本领域技术人员已知的多种分析技术中的任一种来测量，这些分析技术诸如但不限于使用分离技术，诸如色谱法(使用柱、使用纸、使用凝胶、使用hplc、使用uhplc等，或通过ic、通过sec、通过反相、通过阴离子交换、通过混合模式等)或使用或不使用分离前或分离后衍生化方法的电泳(尿素page、基于芯片的、聚丙烯酰胺凝胶、rna、毛细管、c‑ief等)，使用基于质谱法、uv‑vis、荧光、光散射、折射率，或利用银或染料染色或放射性衰变用于检测的检测技术。替代性地，纯度可以在不使用分离技术的情况下通过质谱法、显微镜法、圆二色性(cd)光谱法、uv或uv‑vis分光光度法、荧光法(例如，qubit)、rna酶h分析、表面等离子体共振(spr)、或利用银或染料染色或放射性衰变用于检测的方法。[0183]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有至少0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、5000μg/ml、10,000μg/ml、100,000μg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml、600mg/ml、650mg/ml、700mg/ml、或750mg/ml的环状多核糖核苷酸浓度。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)基本上不含单核苷酸或具有不超过1pg/ml、10pg/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1000μg/ml、5000μg/ml、10,000μg/ml、或100,000μg/ml的单核苷酸含量。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有从检测限至1pg/ml、10pg/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1000μg/ml、5000μg/ml、10,000μg/ml、或100,000μg/ml的单核苷酸含量。[0184]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有基于质量占总核苷酸不超过0.1％(w/w)、0.2％(w/w)、0.3％(w/w)、0.4％(w/w)、0.5％(w/w)、0.6％(w/w)、0.7％(w/w)、0.8％(w/w)、0.9％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、或其间的任何百分比的单核苷酸含量，其中总核苷酸含量是脱氧核糖核苷酸分子和核糖核苷酸分子的总质量。[0185]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有不超过1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200g/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml、600mg/ml、650mg/ml、700mg/ml、或750mg/ml的线性rna含量，例如线性rna对应物或rna片段。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有从检测限至1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200g/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml、600mg/ml、650mg/ml、700mg/ml、或750mg/ml的线性rna含量，例如线性rna对应物或rna片段。[0186]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有不超过10％(w/w)、9.9％(w/w)、9.8％(w/w)、9.7％(w/w)、9.6％(w/w)、9.5％(w/w)、9.4％(w/w)、9.3％(w/w)、9.2％(w/w)、9.1％(w/w)、9％(w/w)、8％(w/w)、7％(w/w)、6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)、1％(w/w)、0.5％(w/w)、或0.1％(w/w)、或其间的百分比的带切口rna含量。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有低至零的带切口rna含量或基本上不含带切口rna。[0187]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有不超过30％(w/w)、25％(w/w)、20％(w/w)、15％(w/w)、10％(w/w)、9％(w/w)、8％(w/w)、7％(w/w)、6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)、1％(w/w)、0.5％(w/w)、或0.1％(w/w)、或其间的百分比的组合的线性rna和带切口rna含量。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有低至零的组合的带切口rna和线性rna含量或基本上不含带切口和线性rna。[0188]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有不超过分析方法的检测限的线性rna含量，例如线性rna对应物或rna片段，这些分析方法诸如利用以下项的方法：质谱法、uv光谱或荧光检测器、光散射技术、使用或不使用分离方法包括hplc的表面等离子体共振(spr)、通过hplc、使用或不使用分离前或分离后衍生化方法的基于芯片或凝胶的电泳、使用银或染料染色或放射性衰变的检测方法、或显微镜、目测法或分光光度计。[0189]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有例如如通过实例2中的方法测量的不超过0.1％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、35％(w/w)、40％(w/w)、45％(w/w)、50％(w/w)的线性rna。[0190]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂的线性多核糖核苷酸分子包括环状多核糖核苷酸分子的线性对应物或其片段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂的线性多核糖核苷酸分子包括线性对应物(例如，环化前形式)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂的线性多核糖核苷酸分子包括环状多核糖核苷酸的非对应物或其片段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂的线性多核糖核苷酸分子包括环状多核糖核苷酸的非对应物。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸分子包括环状多核糖核苷酸的对应物和环状多核糖核苷酸的非对应物或其片段的组合。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸分子包括环状多核糖核苷酸的对应物和环状多核糖核苷酸的非对应物的组合。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸分子片段是长度为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000个、或更多个核苷酸、或其间的任何核苷酸数的片段。[0191]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有例如如通过分光光度计测量的从约1.6至约2.3的a260/a280吸光度比。在一些实施例中，a260/a280吸光度比是约1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、或其间的任何数。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸生产中的中间体)具有例如如通过分光光度计测量的大于约1.8的a260/a280吸光度比。在一些实施例中，a260/a280吸光度比是约1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、或更大。[0192]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)基本上不含杂质。在各种实施例中，包含环状多核糖核苷酸的组合物中至少一种杂质的水平与在去除杂质的纯化或处理之前组合物的该水平相比降低至少30％(w/w)、至少40％(w/w)、至少50％(w/w)、至少60％(w/w)、至少70％(w/w)、至少80％(w/w)、至少90％(w/w)、或至少95％(w/w)。在一些实施例中，至少一种工艺相关杂质的水平与在去除杂质的纯化或处理之前组合物的该水平相比降低至少30％(w/w)、至少40％(w/w)、至少50％(w/w)、至少60％(w/w)、至少70％(w/w)、至少80％(w/w)、至少90％(w/w)、或至少95％(w/w)。在一些实施例中，至少一种产品相关物质的水平与在去除杂质的纯化或处理之前组合物的该水平相比降低至少30％(w/w)、至少40％(w/w)、至少50％(w/w)、至少60％(w/w)、至少70％(w/w)、至少80％(w/w)、至少90％(w/w)、或至少95％(w/w)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)进一步基本上不含工艺相关杂质。在一些实施例中，工艺相关杂质包括蛋白质(例如，细胞蛋白质，诸如宿主细胞蛋白质)、脱氧核糖核酸(例如，细胞脱氧核糖核酸，诸如宿主细胞脱氧核糖核酸)、单脱氧核糖核苷酸或双脱氧核糖核苷酸分子、酶(例如，核酸酶(诸如核酸内切酶或核酸外切酶)、或连接酶)、试剂组分、凝胶组分、或色谱材料。在一些实施例中，该杂质选自：缓冲试剂、连接酶、核酸酶、rna酶抑制剂、rna酶r、脱氧核糖核苷酸分子、丙烯酰胺凝胶碎片、和单脱氧核糖核苷酸分子。在一些实施例中，药物制剂包含少于0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、或500ng蛋白质污染物/毫克(mg)环状多核糖核苷酸分子的蛋白质(例如，细胞蛋白质，诸如宿主细胞蛋白质)污染物。[0193]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)基本上不含dna含量，例如模板dna或细胞dna(例如，宿主细胞dna)，或具有低至零的dna含量，或具有不超过1pg/ml、10pg/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1000μg/ml、5000μg/ml、10,000μg/ml、或100,000μg/ml的dna含量。[0194]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)基本上不含dna含量，具有低至零的dna含量，或具有基于质量占总核苷酸不超过0.001％(w/w)、0.01％(w/w)、0.1％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、35％(w/w)、40％(w/w)、45％(w/w)、50％(w/w)的dna含量，其中总核苷酸分子是脱氧核糖核苷酸含量和核糖核苷酸分子的总质量。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)基本上不含dna含量，具有低至零的dna含量，或具有基于质量占总核苷酸不超过0.001％(w/w)、0.01％(w/w)、0.1％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、3％(w/w)、4％(w/w)、5％(w/w)、6％(w/w)、7％(w/w)、8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、35％(w/w)、40％(w/w)、45％(w/w)、50％(w/w)的dna含量，如在通过消化核苷的酶进行总dna消化后通过定量液体色谱法‑质谱法(lc‑ms)测量的，其中dna的含量从如通过lc‑ms测量的每种碱基(即，a、c、g、t)的标准曲线反演计算出。[0195]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有不超过0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、或500ng/ml的蛋白质(例如，细胞蛋白质(cp)(例如，酶)、生产相关蛋白(例如，载体蛋白))污染物。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸生产中的中间体)具有从检测限至0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、或500ng/ml的蛋白质(例如，生产相关蛋白诸如细胞蛋白质(cp)，例如酶)污染物。[0196]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有少于0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、或500ng/毫克(mg)环状多核糖核苷酸的蛋白质(例如，生产相关蛋白诸如细胞蛋白质(cp)，例如酶)污染物。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸生产中的中间体)具有从检测水平至0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、或500ng/毫克(mg)环状多核糖核苷酸的蛋白质(例如，生产相关蛋白诸如细胞蛋白质(cp)，例如酶)污染物。[0197]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)具有低水平的内毒素或基本上不存在内毒素，例如如通过鲎变形细胞裂解物(lal)测试测量的。在一些实施例中，药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸生产中的中间体如通过鲎变形细胞裂解物测试所测量包含少于20eu/kg(重量)、10eu/kg、5eu/kg、1eu/kg的内毒素，或缺少内毒素。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸组合物具有低水平或不存在的核酸酶或连接酶。[0198]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)包含不大于约50％(w/w)、45％(w/w)、40％(w/w)、35％(w/w)、30％(w/w)、25％(w/w)、20％(w/w)、19％(w/w)、18％(w/w)、17％(w/w)、16％(w/w)、15％(w/w)、14％(w/w)、13％(w/w)、12％(w/w)、11％(w/w)、10％(w/w)、9％(w/w)、8％(w/w)、7％(w/w)、6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)、1％(w/w)的至少一种酶，例如聚合酶，例如rna聚合酶。[0199]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)是无菌的或基本上不含微生物，例如组合物或制剂如在无菌条件下所测试支持少于100个活微生物的生长，组合物或制剂满足usp<71>的标准，和/或组合物或制剂满足usp<85>的标准。在一些实施例中，药物制剂在灭菌之前包含少于100cfu/100ml、50cfu/100ml、40cfu/100ml、30cfu/100ml、200cfu/100ml、10cfu/100ml、或10cfu/100ml的生物负荷。[0200]在一些实施例中，可以使用本领域中已知的去除杂质的技术(诸如柱色谱法或ph/小瓶灭活)进一步纯化环状多核糖核苷酸制剂。[0201]在一些实施例中，当环状多核糖核苷酸制剂已经历过纯化步骤(或多个纯化步骤)时，环状多核糖核苷酸制剂在施用至受试者之后产生与在该一个或多个纯化步骤之前相比降低水平的免疫或炎性应答的一种或多种标记物。纯化可以如本文例如如在实例1‑8中所述进行。在一些实施例中，该免疫或炎性应答的一种或多种标记物是细胞因子或免疫应答相关基因。在一些实施例中，该免疫或炎性应答的一种或多种标记物是诸如rig‑i、mda5、pkr、ifn‑β、oas、和oasl等基因的表达。[0202]在一个实施例中，环状多核糖核苷酸制剂(例如，环状多核糖核苷酸药物制剂或组合物或环状多核糖核苷酸制剂生产中的中间体)表达表达产物，例如蛋白质，例如体外翻译活性，例如如通过实例3中所述的测定测量的。药物组合物[0203]本发明包括与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的组合物。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的活性物质，例如治疗和/或预防活性物质。药物组合物可以任选地包含充当本文所述的组合物(例如，包含环状多核糖核苷酸的组合物)的媒介物或介质的非活性物质，诸如由美国食品和药品管理局(unitedstatesfoodanddrugadministration)(fda)批准并且在非活性成分数据中列出的任一种非活性成分。本发明的药物组合物可以是无菌的和/或无热原的。可以在以下中找到药剂的配制和/或制造中的一般考虑：例如，remington:thescienceandpracticeofpharmacy[雷明顿：药物科学与实践]第21版,lippincottwilliams&wilkins[利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司],2005(通过援引并入本文)。非活性物质的非限制性实例包括溶剂、水性溶剂、非水性溶剂、分散介质、稀释剂、分散体、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、制粒剂、崩解剂、粘结剂、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲盐水(pbs))、润滑剂、油、及其混合物。[0204]尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适合于施用至人的药物组合物，但是本领域技术人员应理解，此类组合物通常适合于施用至任何其他动物，例如非人动物，例如非人哺乳动物。为了使组合物适合于施用给各种动物而对适合于施用至人的药物组合物的修饰是熟知的，并且普通兽医药理师可以仅通过普通的实验(如果有的话)来设计和/或进行这种修饰。设想施用药物组合物的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类动物；哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，诸如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括商业相关的鸟类，诸如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。[0205]本文所述的药物组合物的配制品可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，并且然后，如果必要和/或期望的话，将产品分开、成形和/或包装。制造药物环状rna制剂的方法[0206]用于制造如本文披露的药物组合物、药物原料药、或药物成品药的方法可以包括处理环状多核糖核苷酸的制剂以减少线性rna和/或带切口rna；评价剩余的线性rna和/或带切口rna的量；并且进一步处理该制剂以产生用于药物用途的药物组合物、原料药、或成品药。[0207]用于制造如本文披露的药物组合物、药物原料药、或药物成品药的方法可以包括提供环状多核糖核苷酸的制剂；评估该制剂的线性rna和/或带切口rna的量；并且如果该评估满足关于线性rna和/或带切口的预定参考标准，诸如药物放行规格，则处理该制剂以产生用于药物用途的药物组合物、原料药、或成品药。[0208]用于测试如本文披露的药物组合物、药物原料药、或药物成品药的方法可以包括提供环状多核糖核苷酸的制剂；评估该制剂的线性rna的量；并且确定该评估是否满足关于线性rna的预定参考标准，诸如药物放行规格。[0209]用于测试如本文披露的药物组合物、药物原料药、或药物成品药的方法可以包括提供环状多核糖核苷酸的制剂；评估该制剂的带切口rna的量；并且确定该评估是否满足关于带切口rna的预定参考标准，诸如药物放行规格。[0210]例如，关于制剂中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准是存在不超过1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200g/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、或2mg/ml的线性多核糖核苷酸分子。[0211]例如，关于制剂中存在的环状多核糖核苷酸分子的量的参考标准是占药物制剂中的总核糖核苷酸分子至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、99％(w/w)、99.1％(w/w)、99.2％(w/w)、99.3％(w/w)、99.4％(w/w)、99.5％(w/w)、99.6％(w/w)、99.7％(w/w)、99.8％(w/w)、99.9％(w/w)、或100％(w/w)的分子。[0212]例如，关于制剂中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准是占药物制剂中的总核糖核苷酸分子不超过0.5％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、5％(w/w)、10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子。[0213]例如，关于制剂中存在的带切口多核糖核苷酸分子的量的参考标准是占药物制剂中的总核糖核苷酸分子不超过0.5％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、5％(w/w)、10％(w/w)、或15％(w/w)的带切口多核糖核苷酸分子。[0214]例如，关于制剂中存在的组合的带切口和线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准是占药物制剂中的总核糖核苷酸分子不超过0.5％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、5％(w/w)、10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)的组合的带切口和线性多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，药物制剂是最终环状多核糖核苷酸成品药的中间体药物制剂。在一些实施例中，药物制剂是原料药或活性药物成分(api)。在一些实施例中，药物制剂是用于施用至受试者的成品药。[0215]在一些实施例中，对环状多核糖核苷酸的制剂(在减少线性rna之前、期间或之后)进一步处理以基本上去除dna、蛋白质污染物(例如，细胞蛋白质(诸如宿主细胞蛋白质)或蛋白质工艺杂质)、内毒素、单核苷酸分子、和/或工艺相关杂质。[0216]在一些实施例中，例如如果环状多核糖核苷酸的制剂满足关于线性rna水平的规格，则随后将该制剂与药物赋形剂组合。在一些实施例中，药物赋形剂包括控制ph的无机或有机缓冲液，用于环状多核糖核苷酸稳定性的糖、氨基酸或任何其他材料，用于调整张力的氯化钠或任何其他材料，或表面活性剂如非离子表面活性剂。在一些实施例中，药物赋形剂包括单糖、二糖(例如，蔗糖、乳糖或海藻糖)、三糖、多糖、氨基糖(例如，葡甲胺)、多元醇、盐(例如，碳酸氢钠、磷酸盐或氯化钠)、硬脂酸镁、氨基酸(例如，组氨酸或精氨酸)、表面活性剂(例如，甘油或聚山梨醇酯80)、螯合剂(例如，edta)、樟脑磺酸、或冻干保护剂(例如，环糊精)。在一些实施例中，药物赋形剂包括柠檬酸盐缓冲液。在一些实施例中，药物赋形剂包括甲基基团供体s‑腺苷甲硫氨酸(sam)。在一些实施例中，药物赋形剂包括α‑松油醇；α‑生育酚；α‑生育酚乙酸酯；α‑生育酚；1,2,6‑己三醇；1,2‑二肉豆蔻酰基‑sn‑甘油‑3‑(磷酸‑s‑)1‑甘油；1,2‑二肉豆蔻酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱；1,2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱；1,2‑二棕榈酰基‑sn‑甘油‑3‑(磷酸‑)外消旋‑(1‑甘油)；1,2‑二硬脂酰基‑sn‑甘油‑3‑(磷酸‑外消旋‑)；1,2‑二硬脂酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱；1‑邻甲苯基双胍；2‑乙基‑1,6‑己二醇；乙酸；冰乙酸；乙酸酐；丙酮；丙酮合亚硫酸氢钠；乙酰化羊毛脂醇；乙酰化单甘油酯；乙酰半胱氨酸；dl‑乙酰色氨酸；丙烯酸酯共聚物；丙烯酸‑丙烯酸异辛酯共聚物；丙烯酸粘合剂788；活性炭；adcote72a103；己二酸；aerotex树脂3730；丙氨酸(输注剂)；聚集的白蛋白；白蛋白胶体；人白蛋白；醇；脱水醇；变性醇；稀释醇；阿法环糊精(alfadex)；海藻酸；烷基铵磺酸甜菜碱；烷基芳基磺酸钠；尿囊素；烯丙基α‑紫罗兰酮；杏仁油；乙酸铝；尿囊素氯羟基铝；氢氧化铝；水合氢氧化铝‑蔗糖；氢氧化铝凝胶；氢氧化铝凝胶f500；氢氧化铝凝胶f5000；单硬脂酸铝；氧化铝；铝聚酯；硅酸铝；淀粉辛烯基琥珀酸铝；硬脂酸铝；亚乙酸铝；无水硫酸铝；爱美高(amerchol)c；爱美高‑cab；氨基甲基丙醇；氨；氨溶液；浓的氨溶液；乙酸铵；氢氧化铵；月桂基硫酸铵；壬苯醇醚‑4硫酸铵；c‑12‑c‑15线性伯醇乙氧基化物的铵盐；硫酸铵；ammonyx；两性(amphoteric)‑2；两性‑9；茴香脑；无水柠檬酸；无水右旋糖；无水乳糖；无水柠檬酸三钠；大茴香油；anoxidsbn；消泡剂；安替比林(antipyrine)；阿帕氟烷(apaflurane)；杏桃仁油peg‑6酯；aquaphor；精氨酸；arlacel；抗坏血酸；棕榈酸抗坏血酸酯；天冬氨酸；秘鲁香脂；硫酸钡；蜂蜡；合成蜂蜡；山嵛醇聚醚‑10；膨润土；苯扎氯铵；苯磺酸；苄索氯铵；苯度溴铵；苯甲酸；苄醇；苯甲酸苄酯；苄基氯；倍他环糊精(betadex)；二聚阿普西肽(bibapcitide)；碱式没食子酸铋；硼酸；溴克利那(brocrinat)；丁烷；丁基醇；乙烯基甲基醚的丁基酯/马来酸酐共聚物(125000mw)；硬脂酸丁酯；丁基羟基茴香醚；丁羟甲苯；丁二醇；对羟基苯甲酸丁酯；丁酸；c20‑40链烷醇聚醚‑24；咖啡因；钙；碳酸钙；氯化钙；葡庚糖酸钙；氢氧化钙；乳酸钙；考布曲钙(calcobutrol)；卡地胺钠(caldiamidesodium)；钙塞酸三钠(caloxetatetrisodium)；钙立醇钙；加拿大香脂；辛酸/癸酸甘油三酯；辛酸/癸酸/硬脂酸甘油三酯；卡普坦(captan)；captisol；焦糖；卡波姆1342；卡波姆1382；卡波姆934；卡波姆934p；卡波姆940；卡波姆941；卡波姆980；卡波姆981；b型卡波姆均聚物(烯丙基)；季戊四醇(交联的)；c型卡波姆均聚物(烯丙基)；季戊四醇(交联的)；二氧化碳；羧基乙烯基共聚物；羧甲基纤维素；羧甲基纤维素钠；羧基聚亚甲基；角叉菜胶；角叉菜胶盐；蓖麻油；雪松叶油；纤维素；微晶纤维素；cerasynt‑se；地蜡(ceresin)；鲸蜡硬脂醇聚醚‑12；鲸蜡硬脂醇聚醚‑15；鲸蜡硬脂醇聚醚‑30；鲸蜡硬脂醇/鲸蜡硬脂醇聚醚‑20；鲸蜡硬脂基乙基己酸酯；鲸蜡醇聚醚‑10；鲸蜡醇聚醚‑2；鲸蜡醇聚醚‑20；鲸蜡醇聚醚‑23；鲸蜡硬脂醇；西曲氯铵；鲸蜡醇；鲸蜡酯蜡l；棕榈酸鲸蜡酯；十六烷基氯化吡啶鎓；氯丁醇；氯丁醇半水合物i；无水氯丁醇；氯甲酚；氯二甲酚；胆固醇；胆甾醇聚醚；胆甾醇聚醚‑24；柠檬酸盐；柠檬酸；柠檬酸一水合物；含水柠檬酸；椰油酰胺醚硫酸盐；椰油胺氧化物；椰油基甜菜碱；椰油基二乙醇酰胺；椰油基单乙醇酰胺；可可脂；椰油甘油酯；椰子油；氢化椰子油；氢化椰子油/棕榈仁油甘油酯；椰油酰基辛酰癸酸酯；光亮可乐果(colanitida)种子提取物；胶原；着色悬浮液；玉米油；棉籽油；膏基；肌酸；肌酸酐；交联羧甲基纤维素钠；交聚维酮；硫酸铜；无水硫酸铜；环聚甲基硅氧烷；环聚甲基硅氧烷/聚二甲基硅氧烷共聚多元醇；半胱氨酸；盐酸半胱氨酸；无水盐酸半胱氨酸；d&c红28号；d&c红33号；d&c红36号；d&c红39号；d&c黄10号；达伐吡啶(dalfampridine)；daubert1‑5pestr(哑光)164z；癸基甲基亚砜；dehydag蜡sx；脱氢乙酸；dehymulse；苯甲地那铵；脱氧胆酸；右旋糖酐；右旋糖酐40；糊精；右旋糖；右旋糖一水合物；右旋糖溶液；泛影酸；重氮烷基脲；二氯苄醇；二氯二氟甲烷；二氯四氟乙烷；二乙醇胺；焦碳酸二乙酯；癸二酸二乙酯；二乙二醇单乙基醚；邻苯二甲酸二乙基己酯；氨基乙酸二羟基铝；二异丙醇胺；己二酸二异丙酯；二亚油酸二异丙酯；聚二甲基硅氧烷350；聚二甲基硅氧烷共聚多元醇；聚二甲基硅氧烷mdx4‑4210；聚二甲基硅氧烷医学流体360；二甲基异山梨醇；二甲基亚砜；甲基丙烯酸二甲氨基乙酯‑甲基丙烯酸丁酯‑甲基丙烯酸甲酯共聚物；二甲基双十八烷基铵膨润土；二甲基硅氧烷/甲基乙烯基硅氧烷共聚物；地乐酚铵盐；二棕榈酰磷脂酰甘油；二丙二醇；椰油酰两性基二乙酸二钠；月桂醇聚醚磺基琥珀酸二钠；月桂基磺基琥珀酸二钠；磺基水杨酸二钠；地索苯宁(disofenin)；二乙烯基苯苯乙烯共聚物；dmdm乙内酰脲；二十二烷醇；多库酯钠；duro‑tak280‑2516；duro‑tak387‑2516；duro‑tak80‑1196；duro‑tak87‑2070；duro‑tak87‑2194；duro‑tak87‑2287；duro‑tak87‑2296；duro‑tak87‑2888；duro‑tak87‑2979；依地酸钙二钠；依地酸二钠；无水依地酸二钠；依地酸钠；蛋磷脂；辛苯氧磺(entsufon)；辛苯氧磺；表乳糖(epilactose)；盐酸表四环素；香精花束9200；乙醇胺盐酸盐；乙酸乙酯；油酸乙酯；乙基纤维素；乙二醇；乙烯乙酸乙烯酯共聚物；乙二胺；乙二胺二盐酸盐；乙烯‑丙烯共聚物；乙烯‑乙酸乙烯酯共聚物；乙烯‑乙酸乙烯酯共聚物；羟基硬脂酸乙基己酯；对羟基苯甲酸乙酯；桉叶脑；依沙美肟(exametazime)；可食用脂肪；硬脂肪；脂肪酸酯；脂肪酸季戊四醇酯；脂肪酸；脂肪醇柠檬酸盐；脂肪醇；fd&c蓝1号；fd&c绿3号；fd&c红4号；fd&c红40号；fd&c黄10号；fd&c黄5号；fd&c黄6号；氯化铁；氧化铁；风味剂89‑186；风味剂89‑259；风味剂df‑119；风味剂df‑1530；风味增强剂；风味无花果827118；风味覆盆子pfc‑8407；风味剂罗地亚制药(rhodiapharmaceutical)rf451号；氟氯烃；甲醛；甲醛；分级椰子油；芳香剂3949‑5；芳香剂520a；芳香剂6.007；芳香剂91‑122；芳香剂9128‑y；芳香剂93498g；芳香剂松香脂5124号；芳香剂花束10328；芳香剂chemoderm6401‑b；芳香剂chemoderm6411；芳香剂膏73457号；芳香剂cs‑28197；芳香剂菲露顿(felton)066m；芳香剂芬美意(firmenich)47373；芳香剂奇华顿(givaudan)香精9090/1c；芳香剂h‑6540；芳香剂草本10396；芳香剂nj‑1085；芳香剂pofl‑147；芳香剂pa52805；芳香剂peradermd；芳香剂rbd‑9819；芳香剂shawmudgeu‑7776；芳香剂tf044078；芳香剂恩格乐(ungerer)金银花k2771；芳香剂恩格乐n5195；果糖；氧化钆；半乳糖；γ环糊精；明胶；交联明胶；明胶海绵；结冷胶(低酰基)；gelva737；龙胆酸；龙胆酸乙醇酰胺；葡庚糖酸钠；葡庚糖酸钠二水合物；葡糖酸内酯；葡糖醛酸；谷氨酸；谷胱甘肽；甘油；氢化松香甘油酯；柠檬酸甘油酯；异硬脂酸甘油酯；月桂酸甘油酯；单硬脂酸甘油酯；油酸甘油酯；油酸甘油酯/丙二醇；棕榈酸甘油酯；蓖麻油甘油酯；硬脂酸甘油酯；硬脂酸甘油酯‑月桂醇聚醚‑23；硬脂酸甘油酯/聚乙二醇硬脂酸酯；硬脂酸甘油酯/peg‑100硬脂酸酯；甘油硬脂酸酯/peg‑40硬脂酸酯；硬脂酸甘油酯‑硬脂酰胺基乙基；二乙胺；三油酸甘油酯；甘氨酸；甘氨酸盐酸盐；二硬脂酸乙二醇酯；硬脂酸乙二醇酯；胍盐酸盐；瓜尔胶；护发素(18nl95‑lm)；庚烷；羟乙基淀粉；己二醇；高密度聚乙烯；组氨酸；人白蛋白微球；透明质酸钠；烃；增塑的烃凝胶；盐酸；稀盐酸；氢化可的松；水凝胶聚合物；过氧化氢；氢化蓖麻油；氢化棕榈油；氢化棕榈/棕榈仁油peg‑6酯；氢化聚丁烯635‑690；氢氧根离子；羟乙基纤维素；羟乙基哌嗪乙烷磺酸；羟甲基纤维素；羟基硬脂酸羟基二十八烷醇酯；羟丙基纤维素；羟丙基甲基纤维素2906；羟丙基‑β‑环糊精；羟丙甲纤维素2208(15000mpa.s)；羟丙甲纤维素2910(15000mpa.s)；羟丙甲纤维素；咪脲；碘；碘沙酸；碘非他胺盐酸盐；爱尔兰苔藓提取物；异丁烷；异鲸蜡醇聚醚‑20；异亮氨酸；丙烯酸异辛酯；异丙醇；异硬脂酸异丙酯；肉豆蔻酸异丙酯；肉豆蔻酸异丙酯‑肉豆蔻醇；棕榈酸异丙酯；硬脂酸异丙酯；异硬脂酸；异硬脂醇；等渗氯化钠溶液；久莲(jelene)；高岭土；kathoncg；kathoncgii；乳酸盐；乳酸；乳酸；乳酸；乳糖酸；乳糖；乳糖一水合物；含水乳糖；羊毛脂醇聚醚；羊毛脂；羊毛脂醇‑矿物油；羊毛脂醇；无水羊毛脂；羊毛脂胆固醇；羊毛脂非离子衍生物；乙氧基化羊毛脂；氢化羊毛脂；劳拉氯铵(lauralkoniumchloride)；月桂基胺氧化物；月桂基二甲基铵水解动物胶原蛋白；月桂醇聚醚硫酸盐；月桂醇聚醚‑2；月桂醇聚醚‑23；月桂醇聚醚‑4t；月桂酸二乙醇酰胺；月桂酸肉豆蔻二乙醇酰胺；月桂酰肌氨酸；乳酸月桂酯；月桂基硫酸盐；薰衣草(lavandulaangustifolia)开花；卵磷脂；未漂白的卵磷脂；蛋卵磷脂；氢化卵磷脂；氢化大豆卵磷脂；大豆卵磷脂；柠檬油；亮氨酸；乙酰丙酸；利多苯宁(lidofenin)；轻质矿物油；轻质矿物油(85ssu)；( /‑)‑柠檬烯；lipocolsc‑15；赖氨酸；赖氨酸乙酸盐；赖氨酸一水合物；硅酸铝镁；硅酸铝镁水合物；氯化镁；硝酸镁；硬脂酸镁；马来酸；甘露醇；maprofix；甲溴菲宁(mebrofenin)；医用粘合剂改性的s‑15；医用消泡a‑f乳剂；亚甲基二磷酸二钠(medronatedisodium)；亚甲基二磷酸；葡甲胺；薄荷醇；间甲酚；偏磷酸；甲磺酸；蛋氨酸；甲醇；甲基葡糖醇聚醚‑10；甲基葡糖醇聚醚‑20；甲基葡糖醇聚醚‑20倍半硬脂酸酯；甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯；月桂酸甲酯；甲基吡咯烷酮；水杨酸甲酯；硬脂酸甲酯；甲基硼酸；甲基纤维素(4000mpa.s)；甲基纤维素；甲基氯异噻唑啉酮；亚甲蓝；甲基异噻唑啉酮；对羟基苯甲酸甲酯；微晶蜡；矿物油；甘油单酯和甘油二酯；柠檬酸单硬脂酯；单硫代甘油；多甾醇提取物；肉豆醇；乳酸肉豆蔻酯；肉豆蔻基‑γ‑甲基吡啶氯化物；n‑(氨基甲酰基‑甲氧基peg‑40)‑1,2‑二硬脂酰基‑脑磷脂钠；n,n‑二甲基乙酰胺；烟酰胺；镍肟(nioxime)；硝酸；peg‑2硬脂酸酯；乙酸苯汞；硝酸苯汞；蛋磷脂酰甘油；磷脂；蛋磷脂；磷脂90g；磷酸；松针油(樟子松(pinussylvestris))；哌嗪六水合物；plastibase‑50w；波拉克林(polacrilin)离子电渗疗法；泊利氯铵；泊洛沙姆124；泊洛沙姆181；泊洛沙姆182；泊洛沙姆188；泊洛沙姆237；泊洛沙姆407；聚(双(对羧基苯氧基)丙烷酸酐癸二酸；聚(二甲基硅氧烷/甲基乙烯基硅氧烷/甲基氢硅氧烷)二甲基乙烯基、二甲基羟基或三甲基封端；聚(dl‑乳酸‑共‑乙醇酸)；聚(dl‑乳酸‑共‑乙醇酸)；聚丙烯酸(250000mw)；聚丁烯(1400mw)；聚卡波非；聚酯；聚酯多胺共聚物；聚酯人造丝；聚乙二醇1000；聚乙二醇1450；聚乙二醇1500；聚乙二醇1540；聚乙二醇200；聚乙二醇300；聚乙二醇300‑1600；聚乙二醇3350；聚乙二醇400；聚乙二醇4000；聚乙二醇540；聚乙二醇600；聚乙二醇6000；聚乙二醇8000；聚乙二醇900；含氧化铁黑(<1％)的高密度聚乙烯；低密度聚乙烯，硫酸钡(20％‑24％)；聚乙烯t；聚对苯二甲酸乙二醇酯；聚乳酸羟基乙酸(polyglactin)；聚甘油基‑3油酸酯；聚甘油基‑4油酸酯；聚甲基丙烯酸羟乙酯；聚异丁烯；聚异丁烯(1100000mw)；聚异丁烯(35000mw)；聚异丁烯178‑236；聚异丁烯241‑294；聚异丁烯35‑39；聚异丁烯低分子量；聚异丁烯中等分子量；聚异丁烯/聚丁烯粘合剂；聚交酯；多元醇；聚氧乙烯‑聚氧丙烯1800；聚氧乙烯醇；聚氧乙烯脂肪酸酯；聚氧乙烯丙烯；聚氧基20鲸蜡硬脂基醚；聚氧基35蓖麻油；聚氧基40氢化蓖麻油；聚氧基40硬脂酸酯；聚氧基400硬脂酸酯；聚氧基6和聚氧基32棕榈酰硬脂酸酯；聚氧基二硬脂酸酯；聚氧基甘油基硬脂酸酯；聚氧基羊毛脂；聚氧基棕榈酸酯；聚氧基硬脂酸酯；聚丙烯；聚丙二醇；聚季铵盐‑10；聚季铵盐‑7；丙烯酰胺/dadmac；聚硅氧烷；聚山梨醇酯20；聚山梨醇酯40；聚山梨醇酯60；聚山梨醇酯65；聚山梨醇酯80；聚氨酯；聚乙酸乙烯酯；聚乙烯醇；聚氯乙烯；聚氯乙烯‑聚乙酸乙烯酯共聚物；聚乙烯基吡啶；罂粟籽油；钾碱；乙酸钾；钾明矾；碳酸氢钾；亚硫酸氢钾；氯化钾；柠檬酸钾；氢氧化钾；焦亚硫酸钾；磷酸氢二钾；磷酸二氢钾；钾皂；山梨酸钾；聚维酮丙烯酸酯共聚物；聚维酮水凝胶离子电渗疗法；聚维酮k17；聚维酮k25；聚维酮k29/32；聚维酮k30；聚维酮k90；聚维酮k90f；聚维酮/二十碳烯共聚物；聚维酮；ppg‑12/smdi共聚物；ppg‑15硬脂基醚；ppg‑20甲基葡萄糖醚二硬脂酸酯；ppg‑26油酸酯；产品wat；脯氨酸；promulgend；promulgeng；丙烷；推进剂a‑46；没食子酸丙酯；碳酸丙烯酯；丙二醇；二乙酸丙二醇酯；二辛酸丙二醇酯；单月桂酸丙二醇酯；单棕榈酰硬脂酸丙二醇酯；棕榈酰硬脂酸丙二醇酯；蓖麻酸丙二醇酯；丙二醇/重氮烷基脲/对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯；对羟基苯甲酸丙酯；鱼精蛋白硫酸盐；蛋白质水解物；pvm/ma共聚物；季铵盐‑15；季铵盐‑15顺式形式；季铵盐‑52；ra‑2397；ra‑3011；糖精；糖精钠；无水糖精钠；红花油；sd醇3a；sd醇40；sd醇40‑2；sd醇40b；sepineop600；丝氨酸；芝麻油；牛油树脂；硅橡胶医用粘合剂；硅酮a型；硅石；硅；二氧化硅；硅酮；硅酮粘合剂4102；硅酮粘合剂4502；硅酮粘合剂bio‑psaq7‑4201；硅酮粘合剂bio‑psaq7‑4301；硅酮乳液；硅酮/聚酯薄膜带；二甲基硅油；二甲基硅油乳液；siponls20np；苏打粉；乙酸钠；无水乙酸钠；烷基硫酸钠；抗坏血酸钠；苯甲酸钠；碳酸氢钠；硫酸氢钠；亚硫酸氢钠；硼酸钠；硼酸钠十水合物；碳酸钠；碳酸钠十水合物；碳酸钠一水合物；鲸蜡硬脂基硫酸钠；氯酸钠；氯化钠；胆固醇硫酸钠；柠檬酸钠；椰油酰肌氨酸钠；脱氧胆酸钠；连二亚硫酸钠；十二烷基苯磺酸钠；甲醛次硫酸氢钠；葡糖酸钠；氢氧化钠；次氯酸钠；碘化钠；乳酸钠；l‑乳酸钠；月桂醇聚醚‑2硫酸钠；月桂醇聚醚‑3硫酸钠；月桂醇聚醚‑5硫酸钠；月桂酰肌氨酸钠；月桂基硫酸钠；月桂基磺基乙酸钠；焦亚硫酸钠；硝酸钠；磷酸钠；磷酸钠二水合物；磷酸氢二钠；无水磷酸氢二钠；磷酸氢二钠二水合物；磷酸氢二钠十二水合物；磷酸氢二钠七水合物；磷酸二氢钠；无水磷酸二氢钠；磷酸二氢钠二水合物；磷酸二氢钠或一水合物；聚丙烯酸钠(2500000mw)；焦磷酸钠；吡咯烷酮羧酸钠；淀粉乙醇酸钠；琥珀酸钠六水合物；硫酸钠；无水硫酸钠；硫酸钠十水合物；亚硫酸钠；磺基琥珀酸化十一碳烯或单烷基醇酰胺钠；酒石酸钠；硫代乙醇酸钠；硫代苹果酸钠；硫代硫酸钠；无水硫代硫酸钠；三偏磷酸钠；二甲苯磺酸钠；somay44；山梨酸；脱水山梨糖醇；脱水山梨糖醇异硬脂酸酯；脱水山梨糖醇单月桂酸酯；脱水山梨糖醇单油酸酯；脱水山梨糖醇单棕榈酸酯；脱水山梨糖醇单硬脂酸酯；脱水山梨糖醇倍半油酸酯；脱水山梨糖醇三油酸酯；脱水山梨糖醇三硬脂酸酯；山梨糖醇；山梨糖醇溶液；大豆粉；大豆油；绿薄菏油；鲸蜡；角鲨烷；稳定的氧氯配合物；2‑乙基己酸亚锡；氯化亚锡；无水氯化亚锡；氟化亚锡；酒石酸亚锡；淀粉；预胶化淀粉1500；玉米淀粉；司拉氯铵(stearalkoniumchloride)；司拉氯铵水辉石/碳酸丙烯酯；硬脂酰胺基乙基二乙胺；硬脂醇聚醚‑10；硬脂醇聚醚‑100；硬脂醇聚醚‑2；硬脂醇聚醚‑20；硬脂醇聚醚‑21；硬脂醇聚醚‑40；硬脂酸；硬脂酸二乙醇酰胺；硬脂氧基三甲基硅烷；硬脂基三甲基铵水解动物；胶原；硬脂醇；无菌水；苯乙烯/异戊二烯/苯乙烯嵌段共聚物；琥巯酸；琥珀酸；三氯蔗糖；蔗糖；蔗糖二硬脂酸酯；蔗糖聚酯；磺乙酰胺钠；肌肉内磺丁基醚β‑环糊精；二氧化硫；硫酸；亚硫酸；表面活性剂qs；d‑塔格糖；滑石；妥尔油；牛油甘油酯；酒石酸；酒石酸；tenox；tenox‑2；叔丁基醇；叔丁基氢过氧化物；叔丁基氢醌；四(2‑甲氧基异丁基异氰化物)铜(i)；四氟硼酸酯；四丙基原硅酸盐；替曲膦(tetrofosmin)；茶碱；硫柳汞；苏氨酸；百里酚；锡；二氧化钛；生育酚；托可索仑(tocophersolan)；三醋精；三辛精；三氯一氟甲烷；十三烷醇聚醚‑10；三乙醇胺月桂基硫酸盐；三氟乙酸；中链甘油三酸酯；三羟基硬脂精；三羊毛脂醇聚醚‑4磷酸酯；三月桂醇聚醚‑4磷酸酯；柠檬酸三钠二水合物；hedta三钠；曲通(triton)720；曲通x‑200；三乙醇胺；曲金刚胺；氨丁三醇；色氨酸；泰洛沙泊；酪氨酸；十一碳烯酸；联合(union)76amsco‑res6038；尿素；缬氨酸；植物油；氢化植物油甘油酯；氢化植物油；维塞胺(versetamide)；viscarin；纤维胶/棉；维生素e；乳化蜡；wecobeefs；白地蜡；白蜡；黄原胶；锌；乙酸锌；碳酸锌；氯化锌；或氧化锌。在一些实施例中，将环状多核糖核苷酸的制剂与脂质纳米颗粒(lnp)组合。[0217]在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括二糖(诸如蔗糖、乳糖或海藻糖)的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括蔗糖的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括多糖的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括表面活性剂(诸如甘油或聚山梨醇酯80)的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括α‑生育酚的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括磷酸胆碱的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括醇的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括异丙醇的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括羊毛脂醇的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括人白蛋白的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括氢氧化铝凝胶f500的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括天冬氨酸的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括硫酸钡的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括苯甲酸的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括钙的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括氯化钙的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括羧甲基纤维素的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括柠檬酸的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括乙二醇的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括氯化铁的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括烃凝胶的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括氯化镁的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括烟酰胺的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括聚乙二醇的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括氯化钾的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括丙二醇的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括碳酸钠的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括氯化钠的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括乳酸钠的药物赋形剂组合。在一些实施例中，随后将环状多核糖核苷酸的制剂与包括乙酸锌的药物赋形剂组合。[0218]在一些实施例中，测量杂质(例如，细胞蛋白质、细胞核酸、酶、试剂组分、凝胶组分、或色谱材料、蛋白质污染物或内毒素污染物)的量以确定药物组合物、药物原料药或药物成品药是否符合参考标准。[0219]例如，关于制剂中存在的dna的量的参考标准是存在零的dna分子，基本上不含dna分子，或是不超过1pg/ml、10pg/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、或500ng/ml、1000μg/ml、5000μg/ml、10,000μg/ml、或100,000μg/ml的dna。[0220]例如，关于制剂中存在的蛋白质污染物的量的参考标准是存在少于0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、或500ng蛋白质污染物/毫克(mg)环状多核糖核苷酸分子的蛋白质污染物。[0221]在一些实施例中，药物组合物、药物原料药或药物成品药中存在的内毒素的量少于20eu/kg(重量)、10eu/kg、5eu/kg、1eu/kg，或低于预定阈值，例如制剂包含低于规定方法的检测限的水平的内毒素。在一些实施例中，参考标准是药物放行规格。[0222]在一些实施例中，药物组合物、药物原料药或药物成品药是无菌药物产品或基本上不含微生物(例如，如在无菌条件下所测试支持少于100个活微生物的生长)。在一些实施例中，药物组合物、药物原料药或药物成品药满足usp<71>的标准和/或usp<85>的标准。在一些实施例中，药物组合物、药物原料药或药物成品药进一步被标记和运送以用于药物用途。在一些实施例中，药物组合物、药物原料药或药物成品药在灭菌之前包含少于100cfu/100ml、50cfu/100ml、40cfu/100ml、30cfu/100ml、200cfu/100ml、10cfu/100ml、或10cfu/100ml的生物负荷。[0223]在一些实施例中，药物组合物、药物原料药或药物成品药包含浓度为至少0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、100mg/ml、或500mg/ml的环状多核糖核苷酸分子。[0224]在一些实施例中，可以使用本领域中已知的去除杂质的技术(诸如柱色谱法或ph/小瓶灭活)进一步纯化药物组合物、药物原料药或药物成品药。环化[0225]在一个实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以被环化、或连环化。在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以在配制和/或递送之前被体外环化。在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以在细胞内环化。细胞外环化[0226]在一些实施例中，使用化学方法环化、或连环化线性环状多核糖核苷酸以形成环状多核糖核苷酸。在一些化学方法中，核酸(例如，线性环状多核糖核苷酸)的5'端和3'端包括化学反应性基团，当这些化学反应性基团彼此靠近时，可以在分子的3'端与5'端之间形成新的共价键。5'端可以含有nhs酯反应性基团，并且3'端可以含有3'‑氨基末端的核苷酸，使得在有机溶剂中，线性rna分子3'端上的3'‑氨基末端的核苷酸将在5'‑nhs‑酯部分上经历亲核攻击，从而形成新的5'‑/3'‑酰胺键。[0227]在一个实施例中，dna或rna连接酶可以用于将5'‑磷酸化的核酸分子(例如，线性环状多核糖核苷酸)酶促连接至核酸(例如，线性核酸)的3'‑羟基，从而形成新的磷酸二酯键。在示例性反应中，根据制造商的说明，将线性环状多核糖核苷酸与1至10单位的t4rna连接酶(新英格兰生物学实验室公司(newenglandbiolabs)，马萨诸塞州伊普斯威奇(ipswich,ma))在37℃下孵育1小时。连接反应可以在存在线性核酸时发生，该线性核酸能够与并列的5'和3'区域两者碱基配对，以辅助酶促连接反应。在一个实施例中，连接是夹板连接。例如，可以使用夹板连接酶(像rna连接酶2)进行夹板连接。对于夹板连接，单链多核苷酸(夹板)(像单链dna)可以被设计成与线性多核糖核苷酸的两个末端杂交，使得在与单链夹板杂交时可以将两个末端并列。因此，rna连接酶2可以催化线性多核糖核苷酸并列的两个末端的连接，从而生成共价连接的环状多核糖核苷酸。[0228]在一个实施例中，dna或rna连接酶可用于环状多核苷酸的合成。作为一个非限制性实例，连接酶可以是circ连接酶或环状连接酶。[0229]在一个实施例中，线性环状多核糖核苷酸的5'或3'端可以编码连接酶核酶序列，使得在体外转录期间，所得线性环状多核糖核苷酸包括活性核酶序列，该活性核酶序列能够连接线性环状多核糖核苷酸的5'端至线性环状多核糖核苷酸的3'端。连接酶核酶可以衍生自第i组内含子、丁型肝炎病毒、发夹核酶，或者可以通过selex(通过指数富集进行的配体系统进化)进行选择。核酶连接酶反应在0℃与37℃之间的温度下可能需要1至24小时。[0230]在一个实施例中，可以通过使用至少一个非核酸部分将线性环状多核糖核苷酸环化或连环化。在一方面，至少一个非核酸部分可以与线性环状多核糖核苷酸的5'末端附近和/或3'末端附近的区域或特征反应，以环化或连环化线性环状多核糖核苷酸。在另一方面，至少一个非核酸部分可以位于或连接至或邻近线性环状多核糖核苷酸的5'末端和/或3'末端。设想的非核酸部分可以是同源或异源的。作为一个非限制性实例，非核酸部分可以是键，诸如疏水键、离子键、可生物降解的键和/或可裂解的键。作为另一个非限制性实例，非核酸部分是连接部分。作为又另一个非限制性实例，非核酸部分可以是寡核苷酸或肽部分，诸如本文所述的适体或非核酸接头。[0231]在一个实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以由于非核酸部分而被环化或连环化，该非核酸部分引起位于、邻近或连接至线性环状多核糖核苷酸的5'和3'端的原子、分子表面之间的吸引力。作为一个非限制性实例，可以通过分子间作用力或分子内作用力将一个或多个线性环状多核糖核苷酸环化或连环化。分子间作用力的非限制性实例包括偶极‑偶极力、偶极诱导偶极力、诱导偶极诱导偶极力、范德华力和色散力。分子内作用力的非限制性实例包括共价键、金属键、离子键、共振键、抓氢键(agnosticbond)、偶极键、缀合、超缀合和反向键。[0232]在一个实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以在5'末端附近和3'末端附近包含核酶rna序列。当序列暴露于核酶的其余部分时，核酶rna序列可以共价地连接至肽。在一方面，共价地连接至5'末端和3'末端附近的核酶rna序列的肽可以彼此缔合，从而引起线性环状多核糖核苷酸环化或连环化。在另一方面，共价地连接至核酶rna序列5'末端和3'末端附近的肽可以引起线性初级构建体或线性mrna在使用本领域已知的方法(诸如但不限于蛋白连接)进行连接后环化或连环化。用于在本发明的线性初级构建体或线性rna中使用的核酶的非限制性实例，或掺入和/或共价地连接肽的方法的非穷举列表在美国专利申请号us20030082768中描述，将该专利申请的内容通过援引以其全文并入本文。[0233]在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以包括例如通过以下方式被转化为5'单磷酸的核酸的5'三磷酸：使5'三磷酸与rna5'焦磷酸水解酶(rpph)或atp二磷酸水解酶(三磷酸腺苷双磷酸酶)接触。替代性地，将线性环状多核糖核苷酸的5'三磷酸转化为5'单磷酸可以通过两步反应发生，该两步反应包括：(a)使线性环状多核糖核苷酸的5'核苷酸与磷酸酶(例如，热敏磷酸酶、虾碱性磷酸酶或小牛肠磷酸酶)接触以去除所有三个磷酸；以及(b)在步骤(a)之后，使5'核苷酸与添加单一磷酸的激酶(例如，多核苷酸激酶)接触。[0234]在一些实施例中，本文提供的环化方法的环化效率是至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或100％。在一些实施例中，本文提供的环化方法的环化效率是至少约40％。剪接元件[0235]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个剪接元件。在如本文提供的环状多核糖核苷酸中，剪接元件可以是可以介导环状多核糖核苷酸的剪接的完整剪接元件。替代性地，剪接元件也可以是来自完成的剪接事件的剩余剪接元件。例如，在一些情况下，线性多核糖核苷酸的剪接元件可以介导导致线性多核糖核苷酸环化的剪接事件，从而所得的环状多核糖核苷酸包含来自这种剪接介导的环化事件的剩余剪接元件。在一些情况下，剩余剪接元件无法介导任何剪接。在其他情况下，剩余剪接元件在某些情况下仍可以介导剪接。在一些实施例中，剪接元件与至少一个表达序列相邻。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与每个表达序列相邻的剪接元件。在一些实施例中，剪接元件在每个表达序列的一侧或两侧，导致例如一种或多种肽和/或一种或多种多肽的表达产物的隔开。[0236]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括内部剪接元件，该内部剪接元件在被复制时，剪接端部被连接在一起。一些实例可以包括具有剪接位点序列和短反向重复序列(30‑40nt)的微型内含子(<100nt)，诸如alusq2、alujr和alusz、侧接内含子中的反向序列、侧接内含子中的alu元件以及在反向剪接事件近侧的(suptable4富集基序)顺式序列元件中发现的基序，诸如带有侧接外显子的反向剪接位点之前(上游)或之后(下游)200bp中的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个本文其他处所述的重复核苷酸序列作为内部剪接元件。在此类实施例中，重复核苷酸序列可以包括来自内含子alu家族的重复序列。在一些实施例中，剪接相关核糖体结合蛋白可以调控环状多核糖核苷酸的生物发生(例如，盲肌蛋白和震动蛋白(qki)剪接因子)。[0237]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括侧接环状多核糖核苷酸的头尾接合点处的典范剪接位点。[0238]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括隆起‑螺旋‑隆起基序，该基序包含侧接两个3‑核苷酸隆起的4‑碱基对茎。裂解发生在隆起区域的一个位点处，生成末端为5′‑羟基和2′,3′‑环状磷酸酯的特征片段。通过将5′‑oh基团亲核攻击到形成3′,5′‑磷酸二酯桥的同一分子的2′,3′‑环状磷酸酯上来进行环化。[0239]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括具有hpr元件的多聚重复rna序列。hpr包含2′,3′‑环状磷酸酯和5′‑oh末端。hpr元件自处理线性环状多核糖核苷酸的5′和3′端，从而将端部连接在一起。[0240]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括介导自连接的序列。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括hdv序列(例如，hdv复制结构域保守序列，ggcucaucucgacaagaggcggcaguccucaguacucuuacucuuuucuguaaagaggagacugcuggacucgccgcccaaguucgagcaugagcc或ggcuagaggcggcaguccucaguacucuuacucuuuucuguaaagaggagacugcuggacucgccgcccgagcc)以进行自连接。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括环e序列(例如，在pstvd中)以进行自连接。在另一个实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括自环化内含子，例如5′和3′剪接接合点，或自环化催化性内含子，诸如i型、ii型或iii型内含子。i型内含子自剪接序列的非限制性实例可以包括衍生自t4噬菌体基因td的自剪接置换内含子‑外显子序列、和四膜虫的插入序列(ivs)rrna。其他环化方法[0241]在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以包括互补序列，包括单独内含子内或跨侧接内含子的重复或非重复核酸序列。重复核酸序列是在环状多核糖核苷酸的区段内出现的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚ca序列或聚ug序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与环状多核糖核苷酸的另一区段中的互补重复核酸序列杂交的至少一个重复核酸序列，其中杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，来自两个单独的环状多核糖核苷酸的重复核酸序列和互补重复核酸序列杂交以生成单一环化多核糖核苷酸，其中杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，互补序列存在于线性环状多核糖核苷酸的5’端和3’端。在一些实施例中，互补序列包括约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、或更多个配对的核苷酸。[0242]在一些实施例中，环化化学方法可用于生成环状多核糖核苷酸。此类方法可以包括但不限于点击化学(例如，基于炔烃和叠氮化物的方法，或可点击的碱基)、烯烃复分解、氨基磷酸酯连接、半亚胺‑亚胺交联、碱基修饰、及其任何组合。[0243]在一些实施例中，环化酶促方法可用于生成环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，连接酶(例如dna或rna连接酶)可用于生成环状多核糖核苷酸或互补体的模板、环状多核糖核苷酸的互补链、或环状多核糖核苷酸。[0244]环状多核糖核苷酸的环化可以通过本领域已知的方法完成，这些方法例如，petkovic和muller,“rnacircularizationstrategiesinvivoandinvitro[体内外核糖核酸环化策略]”nucleicacidsres[核酸研究],2015,43(4):2454‑2465；以及muller和appel,“invitrocircularizationofrna[核糖核酸的体外环化]”rnabiol[rna生物学],2017,14(8):1018‑1027中描述的那些方法。表达序列肽或多肽[0245]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个编码肽或多肽的表达序列。这种肽可以包括但不限于小肽、拟肽(例如，类肽)、氨基酸、和氨基酸类似物。肽可以是直链或支链的。这种肽可以具有小于约5,000克/摩尔的分子量、小于约2,000克/摩尔的分子量、小于约1,000克/摩尔的分子量、小于约500克/摩尔的分子量和此类化合物的盐、酯和其他药学上可接受的形式。这种肽可以包括但不限于神经递质、激素、药物、毒素、病毒或微生物颗粒、合成分子及其激动剂或拮抗剂。[0246]多肽可以是直链或支链的。多肽的长度可以是从约5个至约40,000个氨基酸、约15个至约35,000个氨基酸、约20个至约30,000个氨基酸、约25个至约25,000个氨基酸、约50个至约20,000个氨基酸、约100个至约15,000个氨基酸、约200个至约10,000个氨基酸、约500个至约5,000个氨基酸、约1,000至约2,500个氨基酸、或其间的任何范围。在一些实施例中，长度少于约40,000个氨基酸、少于约35,000个氨基酸、少于约30,000个氨基酸、少于约25,000个氨基酸、少于约20,000个氨基酸、少于约15,000个氨基酸、少于约10,000个氨基酸、少于约9,000个氨基酸、少于约8,000个氨基酸、少于约7,000个氨基酸、少于约6,000个氨基酸、少于约5,000个氨基酸、少于约4,000个氨基酸、少于约3,000个氨基酸、少于约2,500个氨基酸、少于约2,000个氨基酸、少于约1,500个氨基酸、少于约1,000个氨基酸、少于约900个氨基酸、少于约800个氨基酸、少于约700个氨基酸、少于约600个氨基酸、少于约500个氨基酸、少于约400个氨基酸、少于约300个氨基酸、或更少的多肽可能是有用的。[0247]由主题环状多核糖核苷酸中的表达序列表达的肽或多肽的非限制性实例包括国际专利公开号wo2019118919a1的[0149]、[0150]和[0152]中所述的那些，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。[0248]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括编码蛋白质例如治疗性蛋白质的表达序列。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的治疗性蛋白质具有抗氧化活性、结合活性、运货受体活性、催化活性、分子载体活性、分子功能调节剂、分子换能器(moleculartransducer)活性、营养储库活性、蛋白质标签、结构分子活性、毒素活性、转录调节剂活性、翻译调控剂活性、或转运蛋白活性。治疗性蛋白质的一些实例可以包括但不限于酶替代蛋白质、用于补充的蛋白质、蛋白疫苗、抗原(例如，肿瘤抗原、病毒、细菌)、激素、细胞因子、抗体、免疫疗法(例如，癌症)、细胞重编程/转分化因子、转录因子、嵌合抗原受体、转座酶或核酸酶、免疫效应子(例如，影响对免疫应答/信号的易感性)、经调控的死亡效应子蛋白(例如，细胞凋亡或坏死的诱导物)、肿瘤的非溶解性抑制剂(例如，癌蛋白抑制剂)、表观遗传修饰剂、表观遗传酶、转录因子、dna或蛋白质修饰酶、dna嵌入剂、外排泵抑制剂、核受体激活剂或抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶竞争性抑制剂、蛋白质合成效应剂或抑制剂、核酸酶、蛋白质片段或结构域、配体或受体、以及crispr系统或其组分。[0249]在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括细胞内蛋白质或胞质蛋白质。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达报告分子，例如萤光素酶(nluc)。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括分泌蛋白，例如分泌酶。在一些情况下，环状多核糖核苷酸表达如下的分泌蛋白，该分泌蛋白可以在血液中具有较短半衰期，或者可以是具有亚细胞定位信号的蛋白，或者是具有分泌信号肽的蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达高斯萤光素酶(gluc)。在一些情况下，环状多核糖核苷酸表达非人蛋白，例如荧光蛋白、能量转移受体或蛋白标签像flag、myc或his。在一些实施例中，可以由环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括gfp。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达标签蛋白，例如含有蛋白标签的融合蛋白或工程化蛋白，例如几丁质结合蛋白(cbp)、麦芽糖结合蛋白(mbp)、fc标签、谷胱甘肽‑s‑转移酶(gst)、snap标签、串联蛋白a(zz)标签、卤素标签、avi标签(glndifeaqkiewhe)、钙调蛋白标签(krrwkknfiavsaanrfkkisssgal)、聚谷氨酸标签(eeeeee)、e标签(gapvpypdplepr)、flag标签(dykddddk)、ha标签(ypydvpdya)、his标签(例如，hhhhhh)、myc标签(eqkliseedl)、ne标签(tkenprsnqeesyddnes)、s标签(ketaaakferqhmds)、sbp标签(mdekttgwrgghvveglageleqlrarlehhpqgqrep)、sof标签1(slaellnaglggs)、sof标签3(tqdpsrvg)、spot标签(pdrvravshwss)、strep标签(strep标签ii：wshpqfek)、tc标签(ccpgcc)、ty标签(evhtnqdpld)、v5标签(gkpipnpllgldst)、vsv标签(ytdiemnrlgk)、或xpress标签(dlyddddk)。[0250]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗原结合蛋白，例如抗体，例如抗体片段或其一部分。在一些实施例中，由环状多核糖核苷酸表达的抗体可以是任何同种型，诸如iga、igd、ige、igg、igm。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体的一部分，诸如轻链、重链、fc片段、cdr(互补决定区)、fv片段、或fab片段、其另一部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体的一个或多个部分。例如，环状多核糖核苷酸可以包含多于一个表达序列，其中每一个表达抗体的一部分，并且其总和可以构成抗体。在一些情况下，环状多核糖核苷酸包含一个编码抗体重链的表达序列和另一个编码抗体轻链的表达序列。在一些情况下，当环状多核糖核苷酸在细胞或无细胞环境中表达时，轻链和重链可以经受适当的修饰、折叠或其他翻译后修饰以形成功能性抗体。调控元件[0251]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含调控元件，例如修饰环状多核糖核苷酸内表达序列的表达的序列。[0252]调控元件可以包括与编码表达产物的表达序列相邻定位的序列。调控元件可以可操作地连接至相邻序列。与不存在调控元件时表达的产物的量相比，调控元件可以增加表达的产物的量。另外，一个调控元件可以增加串联连接的多个表达序列表达的产物的量。因此，一种调控元件可以增强一个或多个表达序列的表达。多个调控元件是本领域普通技术人员熟知的。[0253]如本文提供的调控元件可以包括选择性翻译序列。如本文使用的，术语“选择性翻译序列”可以是指在环状多核糖核苷酸中选择性地起始或激活表达序列的翻译的核酸序列，例如某些核糖开关适体酶。在一些实施例中，调控元件是翻译调节子。翻译调节子可以调节环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译。翻译调节子可以是翻译增强子或翻译抑制子。在一些实施例中，翻译起始序列可以充当调控元件。已知侧接起始翻译的密码子(诸如但不限于起始密码子或替代性起始密码子)的核苷酸会影响环状多核糖核苷酸的翻译效率、长度和/或结构。(参见，例如，matsuda和mauro,plosone[公共科学图书馆综合],20105:11；其内容通过援引以其全文并入本文)。掩蔽侧接起始翻译的密码子的任何核苷酸可用于改变环状多核糖核苷酸的翻译起始位置、翻译效率、长度和/或结构。[0254]在一个实施例中，可以在起始密码子或替代性起始密码子附近使用掩蔽剂，以掩蔽或隐藏密码子，从而降低在被掩蔽的起始密码子或替代性起始密码子处起始翻译的可能性。在另一个实施例中，掩蔽剂可用于掩蔽环状多核糖核苷酸的起始密码子，以增加翻译将在替代性起始密码子处起始的可能性。[0255]如本文提供的调控元件可以包括国际专利公开号wo2019118919a1的156.‑[0161]中所述的任一种调控元件，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。翻译起始序列[0256]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码多肽并且可以包含翻译起始序列，例如起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列包括科扎克(kozak)或夏因‑达尔加诺(shine‑dalgarno)序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的翻译起始序列，例如科扎克序列。在一些实施例中，翻译起始序列是非编码起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列(例如，科扎克序列)存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致表达产物的隔开。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个翻译起始序列。在一些实施例中，翻译起始序列为环状多核糖核苷酸提供构象柔性。在一些实施例中，翻译起始序列基本上在环状多核糖核苷酸的单链区域内。[0257]环状多核糖核苷酸可以包括多于1个起始密码子，诸如但不限于至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少50个、至少60个或多于60个起始密码子。翻译可以在第一个起始密码子上起始或可以在第一个起始密码子的下游起始。[0258]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以起始于不是第一起始密码子的密码子，例如aug。环状多核糖核苷酸的翻译可以在替代性翻译起始序列，诸如国际专利公开号wo2019118919a1的[0164]中所述的那些处起始，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。[0259]在一些实施例中，翻译是通过用rocaglates处理真核起始因子4a(eif4a)来起始的(通过阻断43s扫描来阻遏翻译，导致过早的上游翻译起始以及携带roca‑eif4a靶序列的转录物的蛋白质表达降低，参见例如，www.nature.com/articles/nature17978)。ires[0260]在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸包含内部核糖体进入位点(ires)元件。在环状多核糖核苷酸中包括的适合ires元件包括能够接合真核核糖体的rna序列，诸如国际专利公开号wo2019118919a1的166.‑[0167]中所述的那些，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。[0261]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括侧接至少一个(例如2、3、4、5或更多个)表达序列的至少一个ires。在一些实施例中，ires侧接至少一个(例如，2、3、4、5或更多个)表达序列的两侧。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在每个表达序列的一侧或两侧上包括一个或多个ires序列，导致所得肽和/或多肽的隔开。终止元件[0262]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个表达序列，并且每个表达序列可以具有或可以不具有终止元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个表达序列，并且表达序列缺少终止元件，使得环状多核糖核苷酸被连续翻译。由于缺少核糖体停滞或脱落，终止元件的排除可能导致表达产物例如肽或多肽的滚环翻译或连续表达。在这种实施例中，滚环翻译通过每个表达序列表达连续表达产物。在一些其他实施例中，表达序列的终止元件可以是交错元件的一部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸中的一个或多个表达序列包含终止元件。然而，在环状多核糖核苷酸中进行滚环翻译或后继(例如，第二、第三、第四、第五等)表达序列的表达。在此类情况下，当核糖体遇到终止元件(例如，终止密码子)并终止翻译时，表达产物可以从核糖体上脱落。在一些实施例中，在核糖体例如核糖体的至少一个亚基与环状多核糖核苷酸保持接触时翻译终止。[0263]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在一个或多个表达序列的端部包括终止元件。在一些实施例中，一个或多个表达序列连续包含两个或更多个终止元件。在此类实施例中，翻译终止并且滚环翻译终止。在一些实施例中，核糖体与环状多核糖核苷酸完全脱离。在一些此类实施例中，在环状多核糖核苷酸中后继(例如，第二、第三、第四、第五等)表达序列的产生可能需要核糖体在起始翻译之前与环状多核糖核苷酸重新接合。通常，终止元件包括发出翻译终止信号的框内核苷酸三联体，例如uaa、uga、uag。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸中的一个或多个终止元件是阅读框移位的终止元件，诸如但不限于，可以终止翻译的脱框(off‑frame)或‑1和 1移位的阅读框(例如，隐藏的终止)。阅读框移位的终止元件包括出现在表达序列的第二阅读框和第三阅读框中的核苷酸三联体，taa、tag和tga。阅读框移位的终止元件可能对防止通常对细胞有害的mrna误读很重要。交错元件[0264]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个交错元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与每个表达序列相邻的交错元件。在一些实施例中，交错元件存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致例如一种或多种肽和/或一种或多种多肽的表达产物的隔开。在一些实施例中，交错元件是一个或多个表达序列的一部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列，并且一个或多个表达序列中的每一个通过环状多核糖核苷酸的交错元件与后继的表达序列隔开。在一些实施例中，交错元件阻止由(a)单个表达序列的两轮翻译或(b)两个或更多个表达序列的一轮或多轮翻译生成单一多肽。在一些实施例中，交错元件是与一个或多个表达序列隔开的序列。在一些实施例中，交错元件包括一个或多个表达序列的表达序列的一部分。[0265]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括交错元件。为了避免在保持滚环翻译的同时产生连续表达产物，例如肽或多肽，可以包括交错元件以在翻译期间诱导核糖体暂停。在一些实施例中，交错元件在一个或多个表达序列中的至少一个的3’端。交错元件可以被配置为在环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间使核糖体停滞。交错元件可以包括但不限于2a样或chysel(顺式作用的水解酶元件)序列。在一些实施例中，交错元件编码具有c末端共有序列为x1x2x3ex5npgp的序列，其中x1不存在或是g或h，x2不存在或d或是g，x3是d或v或i或s或m，x5是任何氨基酸。在一些实施例中，此序列包含具有强α‑螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，其后接共有序列‑d(v/i)exnpgp，其中x＝任何氨基酸。交错元件的一些非限制性实例包括gdvesnpgp、gdieenpgp、vepnpgp、ietnpgp、gdiesnpgp、gdvelnpgp、gdietnpgp、gdvenpgp、gdveenpgp、gdveqnpgp、iesnpgp、gdielnpgp、hdietnpgp、hdvetnpgp、hdvemnpgp、gdmesnpgp、gdvetnpgp、gdieqnpgp、和dsefnpgp。[0266]在一些实施例中，本文所述的交错元件裂解表达产物，诸如在本文所述的共有序列的g与p之间。作为一个非限制性实例，环状多核糖核苷酸包括至少一个交错元件以裂解表达产物。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与至少一个表达序列相邻的交错元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括在每个表达序列后的交错元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括存在于每个表达序列的一侧或两侧的交错元件，导致由每个表达序列翻译一种或多种单独肽和/或多肽。[0267]在一些实施例中，交错元件包含一个或多个在翻译过程中诱导核糖体暂停的经修饰的核苷酸或非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括肽核酸(pna)、吗啉代和锁核酸(lna)、以及乙二醇核酸(gna)和苏糖核酸(tna)。诸如此类的实例通过改变分子主链而不同于天然存在的dna或rna。示例性修饰可以包括对糖、核碱基、核苷间键(例如对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)及其任何组合进行的可在翻译期间诱导核糖体暂停的任何修饰。本文提供的一些示例性修饰在本文其他处描述。[0268]在一些实施例中，交错元件以其他形式存在于环状多核糖核苷酸中。例如，在一些示例性环状多核糖核苷酸中，交错元件包含环状多核糖核苷酸中的第一表达序列的终止元件，和将终止元件与第一表达序列后继表达的第一翻译起始序列隔开的核苷酸间隔子序列。在一些实例中，第一表达序列的第一交错元件在环状多核糖核苷酸中的第一表达序列后继表达的第一翻译起始序列的上游(5')。在一些情况下，第一表达序列和第一表达序列后继表达序列是环状多核糖核苷酸中的两个隔开的表达序列。第一交错元件与第一翻译起始序列之间的距离可以使得第一表达序列及其后继表达序列能够连续翻译。在一些实施例中，第一交错元件包括终止元件，并且将第一表达序列的表达产物与其后继表达序列的表达产物隔开，从而产生离散的表达产物。在一些情况下，在环状多核糖核苷酸中后继序列的第一翻译起始序列上游包含第一交错元件的环状多核糖核苷酸被连续翻译，而在第二表达序列后继表达序列的第二翻译起始序列的上游包含第二表达序列的交错元件的对应环状多核糖核苷酸不被连续翻译。在一些情况下，环状多核糖核苷酸中仅存在一个表达序列，并且第一表达序列及其后继表达序列是相同的表达序列。在一些示例性环状多核糖核苷酸中，交错元件包含环状多核糖核苷酸中第一表达序列的第一终止元件，和将终止元件与下游翻译起始序列隔开的核苷酸间隔子序列。在一些此类实例中，环状多核糖核苷酸中第一交错元件在第一表达序列的第一翻译起始序列的上游(5’)。在一些情况下，第一交错元件和第一翻译起始序列之间的距离使得能够连续翻译第一表达序列和任何后继表达序列。在一些实施例中，第一交错元件将第一表达序列的一轮表达产物与第一表达序列的下一轮表达产物隔开，从而产生离散的表达产物。在一些情况下，在环状多核糖核苷酸中的第一序列的第一翻译起始序列上游包含第一交错元件的环状多核糖核苷酸被连续翻译，而在相应环状多核糖核苷酸中的第二表达序列的第二翻译起始序列上游包含交错元件的相应环状多核糖核苷酸不被连续翻译。在一些情况下，相应环状多核糖核苷酸中第二交错元件与第二翻译起始序列之间的距离是环状多聚核苷酸中第一交错元件与第一翻译起始序列之间的距离的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍大。在一些情况下，第一交错元件与第一翻译起始之间的距离是至少2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、或更大。在一些实施例中，第二交错元件与第二翻译起始之间的距离是至少2nt、3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、55nt、60nt、65nt、70nt、75nt、或大于第一交错元件与第一翻译起始之间的距离。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含多于一个表达序列。调控核酸[0269]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一种或多种编码调控核酸(例如，修饰内源性基因和/或外源性基因的表达)的表达序列。在一些实施例中，如本文提供的环状多核糖核苷酸的表达序列可以包括与调控核酸像非编码rna诸如但不限于trna、lncrna、mirna、rrna、snrna、microrna、sirna、pirna、snorna、snrna、exrna、scarna、yrna和hnrna反义的序列。[0270]在一个实施例中，调控核酸靶向基因，诸如宿主基因。调控核酸可以包括国际专利公开号wo2019118919a1的[0177]和[0181]‑[0189]中所述的任一种调控核酸，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。[0271]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含指导rna(grna)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含指导rna或编码指导rna。grna短合成rna由与不完整的效应子部分结合所必需的“支架”序列和用于基因组靶标的用户定义的约20个核苷酸靶向序列构成。在实践中，指导rna序列通常被设计为具有17‑24个核苷酸(例如，19、20或21个核苷酸)的长度，并且与靶向性核酸序列互补。定制的grna生成器和算法可从商业上获得，用于设计有效的指导rna。还已经使用嵌合的“单指导rna”(“sgrna”)(一种模拟天然存在的crrna‑tracrrna复合物并包含tracrrna(用于结合核酸酶)和至少一个crrna(以将核酸酶指导至被靶向进行编辑的序列)的工程化(合成)单rna分子)实现了基因编辑。也已经证明，在基因组编辑中，化学修饰的sgrna是有效的；参见例如，hendel等人(2015)naturebiotechnol.[自然生物技术],985‑991。[0272]grna可以识别特定的dna序列(例如，与基因的启动子、增强子、沉默子或阻遏子相邻或在其内的序列)。[0273]在一个实施例中，grna被用作crispr系统的一部分用于基因编辑。出于基因编辑的目的，可以将环状多核糖核苷酸设计为包含一个或多个与所期望的靶dna序列相对应的指导rna序列；参见例如，cong等人(2013)science[科学],339:819‑823；ran等人(2013)natureprotocols[自然实验手册],8:2281‑2308。为了发生dna裂解，cas9需要grna序列的至少约16或17个核苷酸；对于cpf1，需要grna序列的至少约16个核苷酸来实现可检测的dna裂解。[0274]环状多核糖核苷酸可以调节基因编码的rna的表达。因为多个基因可能彼此共享一定程度的序列同源性，所以在一些实施例中，可以设计环状多核糖核苷酸以靶向具有充分序列同源性的一类基因。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以含有与在不同基因靶标中共享的序列或对于特异性基因靶标而言是独特的序列具有互补性的序列。在一些实施例中，可以设计环状多核糖核苷酸以靶向在若干基因之间具有同源性的rna序列的保守区，从而靶向一个基因家族中的若干基因(例如，不同基因同种型、剪接变体、突变基因等)。在一些实施例中，可以将环状多核糖核苷酸设计为靶向单一基因的特定rna序列所特有的序列。[0275]在一些实施例中，表达序列的长度少于5000bp(例如，少于约5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp、50bp、40bp、30bp、20bp、10bp、或更少)。在一些实施例中，表达序列独立地或额外地具有大于10bp的长度(例如，至少约10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、3.9kb、4kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb、4.8kb、4.9kb、5kb、10kb、20kb或更大)。[0276]在一些实施例中，表达序列包括本文所述的一种或多种特征，例如，编码一种或多种肽或蛋白质的序列、一种或多种调控元件、一种或多种调控核酸(例如，一种或多种非编码序列rna)、其他表达序列及其任何组合。翻译效率[0277]在一些实施例中，如本文提供的环状多核糖核苷酸的翻译效率大于参考物，例如线性对应物、线性表达序列、或线性环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，如本文提供的环状多核糖核苷酸的翻译效率比参考物的翻译效率高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、70％、800％、900％、1000％、2000％、5000％、10000％、100000％、或更高。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的翻译效率比线性对应物的翻译效率高10％。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的翻译效率比线性对应物的翻译效率高300％。[0278]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸产生化学计量比的表达产物。滚环翻译连续地以基本上当量的比率产生表达产物。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有化学计量的翻译效率，使得表达产物以基本上当量的比率产生。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有多种表达产物(例如，来自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个表达序列的产物)的化学计量翻译效率。滚环翻译[0279]在一些实施例中，一旦起始环状多核糖核苷酸的翻译，在完成环状多核糖核苷酸的至少一轮翻译之前，结合至环状多核糖核苷酸的核糖体不会与环状多核糖核苷酸脱离。在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸能够滚环翻译。在一些实施例中，在滚环翻译期间，一旦起始环状多核糖核苷酸的翻译，在完成环状多核糖核苷酸的至少2轮、至少3轮、至少4轮、至少5轮、至少6轮、至少7轮、至少8轮、至少9轮、至少10轮、至少11轮、至少12轮、至少13轮、至少14轮、至少15轮、至少20轮、至少30轮、至少40轮、至少50轮、至少60轮、至少70轮、至少80轮、至少90轮、至少100轮、至少150轮、至少200轮、至少250轮、至少500轮、至少1000轮、至少1500轮、至少2000轮、至少5000轮、至少10000轮、至少105轮或至少106轮翻译之前，结合至环状多核糖核苷酸的核糖体不会与环状多核糖核苷酸脱离。[0280]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的滚环翻译导致生成多肽产物，该多肽产物由环状多核糖核苷酸的多于一轮翻译出(“连续”表达产物)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含交错元件，并且环状多核糖核苷酸的滚环翻译导致生成多肽产物，该多肽产物由环状多核糖核苷酸的单轮翻译或少于单轮翻译生成(“离散”表达产物)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被配置为使得环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间生成的总多肽(摩尔/摩尔)中的至少10％、20％、30％、40％、50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％是离散多肽。在一些实施例中，在体外翻译系统中测试离散产物相对于总多肽的量比。在一些实施例中，用于测试量比的体外翻译系统包含兔网织红细胞裂解物。在一些实施例中，在体内翻译系统诸如真核细胞或原核细胞、培养细胞或生物体中的细胞中测试量比。非翻译区[0281]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含非翻译区(utr)。包含基因的基因组区域的utr可以转录但不翻译。在一些实施例中，utr可以被包括在本文所述的表达序列的翻译起始序列的上游。在一些实施例中，utr可以被包括在本文所述的表达序列的下游。在一些情况下，第一表达序列的一个utr与第二表达序列的另一个utr相同或连续或重叠。在一些实施例中，内含子是人内含子。在一些实施例中，内含子是全长人内含子，例如zkscan1。[0282]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含内嵌有一段或多段的腺苷和尿苷的utr。这些au富集签名可能会增加表达产物的转化率。[0283]utrau富集元件(are)的引入、去除或修饰可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性、或免疫原性(例如，免疫或炎性应答的一种或多种标记物的水平)。工程化特定的环状多核糖核苷酸时，可以将are的一个或多个拷贝引入环状多核糖核苷酸中，并且are的这些拷贝可以调节表达产物的翻译和/或产生。同样，可以对are进行鉴定和去除或工程化至环状多核糖核苷酸以调节细胞内稳定性，并且由此影响所得蛋白质的翻译和产生。[0284]应理解，可以将来自任何基因的任何utr掺入环状多核糖核苷酸的相应侧接区中。可以在本文提供的环状多核糖核苷酸中使用的示例性utr可以包括国际专利公开号wo2019118919a1的[0200]‑[0201]中所述的那些，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。聚a序列[0285]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括聚a序列。在一些实施例中，聚a序列的长度大于10个核苷酸。在一个实施例中，聚a序列的长度大于15个核苷酸(例如，至少或大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、和3,000个核苷酸)。在一些实施例中，根据国际专利公开号wo2019118919a1的[0202]‑[0204]中的聚a序列的描述设计聚a序列，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。[0286]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含聚a、缺少聚a、或具有经修饰的聚a以调节环状多核糖核苷酸的一种或多种特征。在一些实施例中，缺少聚a或具有经修饰的聚a的环状多核糖核苷酸改善了一种或多种功能特征，例如免疫原性(例如，免疫或炎性应答的一种或多种标记物的水平)、半衰期、表达效率等。rna结合[0287]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个rna结合位点。微rna(或mirna)是短非编码rna，与核酸分子的3'utr结合并且通过降低核酸分子的稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。环状多核糖核苷酸可以包含一种或多种微rna靶序列、微rna序列或微rna种子。此类序列可以对应于任何已知的微rna，诸如在美国公开us2005/0261218、美国公开us2005/0059005、以及国际专利公开号wo2019118919a1的[0207]‑[0215]中传授的那些，将这些专利的内容通过援引以其全文并入本文。蛋白质结合[0288]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白质结合位点，使得蛋白质例如核糖体能够结合至rna序列中的内部位点。通过将蛋白质结合位点(例如，核糖体结合位点)工程化至环状多核糖核苷酸中，通过掩蔽环状多核糖核苷酸而免受宿主免疫系统组分的影响，环状多核糖核苷酸可以逃避宿主的免疫系统的检测或具有减少的宿主的免疫系统的检测、具有经调节的降解、或经调节的翻译。[0289]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个免疫蛋白结合位点，例如以逃避免疫应答，例如ctl(细胞毒性t淋巴细胞)应答。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并且有助于掩蔽为外源的环状多核糖核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并且有助于隐藏为外源或外来的环状多核糖核苷酸的核苷酸序列。[0290]核糖体与线性rna接合的传统机制包括核糖体与rna的加帽5'端的结合。从5'端，核糖体迁移到起始密码子，于是形成第一肽键。根据本发明，环状多核糖核苷酸的翻译的内部起始(即，非帽依赖性)不需要游离端或加帽端。而是，核糖体结合至未加帽的内部位点，由此核糖体在起始密码子处开始多肽延长。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个rna序列，该一个或多个rna序列包含核糖体结合位点，例如起始密码子。[0291]天然5'utr具有在翻译起始中起作用的特征。它们具有公知参与核糖体启动多种基因的翻译的过程中的签名，像科扎克序列。科扎克序列具有共有ccr(a/g)ccaugg，其中r是起始密码子(aug)的三个碱基上游的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，后接另一个“g”。还已知5'utr形成参与延长因子结合的二级结构。[0292]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码与蛋白质结合的蛋白质结合序列。在一些实施例中，蛋白质结合序列靶向环状多核糖核苷酸或将其定位至特定靶标。在一些实施例中，蛋白结合序列特异性结合蛋白的精氨酸富集区。[0293]在一些实施例中，蛋白质结合位点包括但不限于与蛋白质的结合位点，诸如acin1、ago、apobec3f、apobec3g、atxn2、auh、bccip、caprin1、celf2、cpsf1、cpsf2、cpsf6、cpsf7、cstf2、cstf2t、ctcf、ddx21、ddx3、ddx3x、ddx42、dgcr8、eif3a、eif4a3、eif4g2、elavl1、elavl3、fam120a、fbl、fip1l1、fkbp4、fmr1、fus、fxr1、fxr2、gnl3、gtf2f1、hnrnpa1、hnrnpa2b1、hnrnpc、hnrnpk、hnrnpl、hnrnpm、hnrnpu、hnrnpul1、igf2bp1、igf2bp2、igf2bp3、ilf3、khdrbs1、larp7、lin28a、lin28b、m6a、mbnl2、mettl3、mov10、msi1、msi2、nono、nono‑、nop58、npm1、nudt21、pcbp2、polr2a、prpf8、ptbp1、rbfox2、rbm10、rbm22、rbm27、rbm47、rnps1、safb2、sbds、sf3a3、sf3b4、sirt7、slbp、sltm、smndc1、snd1、srrm4、srsf1、srsf3、srsf7、srsf9、taf15、tardbp、tia1、tnrc6a、top3b、tra2a、tra2b、u2af1、u2af2、unk、upf1、wdr33、xrn2、ybx1、ythdc1、ythdf1、ythdf2、ywhag、zc3h7b、pdk1、akt1、和任何其他结合rna的蛋白质。加密原[0294]如本文所述，环状多核糖核苷酸包含加密原以降低、逃避或避免细胞的先天性免疫应答。在一方面，本文提供了环状多核糖核苷酸，当被递送至细胞时，该环状多核糖核苷酸与由参考化合物(例如对应于所述环状多核糖核苷酸的线性多核苷酸或缺少加密原的环状多核糖核苷酸)引发的应答相比，导致宿主的免疫应答降低。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有比缺少加密原的对应物小的免疫原性(例如，更低水平的免疫或炎性应答的一种或多种标记物)。[0295]在一些实施例中，加密原增强了稳定性。关于utr在核酸分子的稳定性和翻译方面发挥调控作用的证据越来越多。utr的调控特征可以包含在加密原中，以增强环状多核糖核苷酸的稳定性。[0296]在一些实施例中，5’或3’utr可以构成环状多核糖核苷酸中的加密原。例如，utrau富集元件(are)的去除或修饰可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性(例如，调节免疫或炎性应答的一种或多种标记物的水平)。[0297]在一些实施例中，表达序列，例如可翻译区中au富集元件(are)的去除或修饰可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性(例如，调节免疫或炎性应答的一种或多种标记物的水平)。[0298]在一些实施例中，加密原包含mirna结合位点或与任何其他非编码rna的结合位点。例如，将mir‑142位点掺入本文所述的环状多核糖核苷酸中不仅可以调节造血细胞中的表达，还可以降低或消除对环状多核糖核苷酸编码的蛋白质的免疫应答。[0299]在一些实施例中，加密原包含一个或多个蛋白质结合位点，使得蛋白质(例如，免疫蛋白质)能够结合至rna序列。通过将蛋白质结合位点工程化至环状多核糖核苷酸中，通过掩蔽环状多核糖核苷酸而免受宿主免疫系统组分的影响，环状多核糖核苷酸可以逃避宿主的免疫系统的检测或具有减少的宿主的免疫系统的检测、具有经调节的降解、或经调节的翻译。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个免疫蛋白结合位点，例如以逃避免疫应答，例如ctl应答。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并且有助于掩蔽为外源的环状多核糖核苷酸的核苷酸序列。[0300]在一些实施例中，加密原包含一种或多种经修饰的核苷酸。示例性修饰可以包括对糖、核碱基、核苷间键(例如至连接的磷酸酯/至磷酸二酯键/至磷酸二酯主链)及其任何组合进行的可防止或降低针对环状多核糖核苷酸的免疫应答的任何修饰。以下详细描述了本文提供的一些示例性修饰。[0301]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个如本文其他处所述的修饰，以与由参考化合物(例如缺少修饰的环状多核糖核苷酸)引发的应答相比，降低宿主的免疫应答。特别地，已显示添加一个或多个肌苷区分rna是内源性还是病毒性。参见例如，yu,z等人,(2015)rnaeditingbyadar1marksdsrnaas“self”[通过adar1进行的rna编辑将dsrna标记为“自身”].cellres[细胞研究].25,1283‑1284，将该文献通过援引以其全文并入本文。[0302]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个shrna的表达序列或可被加工成sirna的rna序列，并且shrna或sirna靶向rig‑i并降低rig‑i的表达。rig‑i可以感测外来环状rna，并且导致外来环状rna降解。因此，具有靶向rig‑1的shrna、sirna或任何其他调控核酸的序列的环状多核苷酸可以降低针对环状多核糖核苷酸的免疫力，例如宿主细胞免疫力。[0303]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少有助于环状多核糖核苷酸降低、逃避或避免细胞的先天性免疫应答的序列、元件或结构。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可能缺少聚a序列、5’端、3’端、磷酸酯基团、羟基基团或其任何组合。核糖开关[0304]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一种或多种核糖开关。[0305]核糖开关典型地被认为是环状多核糖核苷酸的一部分，该一部分可以直接结合一个小的靶分子，并且其与靶标的结合会影响rna翻译、表达产物的稳定性和活性(tuckerbj,breakerrr(2005),curropinstructbiol[结构生物学新见]15(3):342‑8)。因此，根据靶分子的存在或不存在，包括核糖开关的环状多核糖核苷酸直接参与调控其自身的活性。在一些实施例中，核糖开关具有适体样亲和力区域用于单独的分子。因此，在本发明的更广泛的上下文中，包含在非编码核酸中的任何适体都可以用于从大体积中螯合分子。经由“(核糖)开关”活性的事件的下游报告可能是特别有利的。[0306]在一些实施例中，核糖开关可以对基因表达具有影响，包括但不限于转录终止、翻译起始抑制、mrna自裂解、以及在真核生物中剪接途径的改变。核糖开关可以通过触发分子的结合或去除来控制基因表达。因此，使包括核糖开关的环状多核糖核苷酸经受激活、失活或阻断核糖开关的条件以改变表达。表达可以由于例如转录终止或核糖体与rna结合的阻断而改变。根据核糖开关的性质，触发分子或其类似物的结合可以减少或阻止rna分子的表达或者促进或增加rna分子的表达。本文描述了核糖开关的一些实例。[0307]在一些实施例中，核糖开关是环二‑gmp核糖开关、fmn核糖开关(也称为rfn‑元件)、glms核糖开关、谷氨酰胺核糖开关、甘氨酸核糖开关、赖氨酸核糖开关(也称为l‑盒)、preq1核糖开关(例如，preq1‑l核糖开关和preq1‑ll核糖开关)、嘌呤核糖开关、sah核糖开关、sam核糖开关、sam‑sah核糖开关、四氢叶酸核糖开关、茶碱结合核糖开关、胸腺嘧啶焦磷酸盐结合核糖开关、腾冲嗜热菌(t.tengcongensis)glms催化性核糖开关、tpp核糖开关(也称为thi‑盒)、moco核糖开关、或腺嘌呤感测add‑a核糖开关，其中每一种描述于国际专利公开号wo2019118919a1的[0235]‑[0252]中，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。适体酶[0308]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含适体酶。适体酶是用于条件性表达的开关，在该条件性表达中适体区域用作变构控制元件并且偶联至催化性rna区域(如下所述的“核酶”)。在一些实施例中，适体酶在细胞类型特异性翻译中具有活性。在一些实施例中，适体酶在细胞状态特异性翻译(例如，病毒感染的细胞或存在病毒核酸或病毒蛋白)下具有活性。[0309]核酶(来自核糖核酸酶，也称为rna酶或催化性rna)是催化化学反应的rna分子。核酶的一些非限制性实例包括锤头核酶、vl核酶、先导酶(leadzyme)、发夹核酶、以及国际专利公开号wo2019118919a1的[0254]‑[0259]中所述的其他核酶，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。复制元件[0310]环状多核糖核苷酸可以编码可用于复制的序列和/或基序。环状多核糖核苷酸的复制可以通过生成互补的环状多核糖核苷酸来发生。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括起始转录的基序，其中转录由环状多核糖核苷酸编码的内源性细胞机制(dna依赖性rna聚合酶)或rna依赖性rna聚合酶驱动。滚环转录事件的产物可以被核酶切割，以生成单位长度的互补或增殖环状多核糖核苷酸。核酶可以由环状多核糖核苷酸、其互补体、或由反式rna序列编码。在一些实施例中，编码的核酶可以包括调控(抑制或促进)核酶的活性以控制环状rna增殖的序列或基序。在一些实施例中，单位长度序列可以通过细胞rna连接酶连接成环状形式。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括有助于自扩增的复制元件。此类复制元件的实例包括国际专利公开号wo2019118919a1的[0280]‑[0282]中所述的那些，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。[0311]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸基本上对例如核酸外切酶的降解有抗性。[0312]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞内复制。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞内的复制速率是在约10％‑20％、20％‑30％、30％‑40％、40％‑50％、50％‑60％、60％‑70％、70％‑75％、75％‑80％、80％‑85％、85％‑90％、90％‑95％、95％‑99％之间、或其之间的任何百分比。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞内复制并且传递给子细胞。在一些实施例中，细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％的效率将至少一种环状多核糖核苷酸传递至子细胞。在一些实施例中，正经历减数分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％的效率将环状多核糖核苷酸传递至子细胞。在一些实施例中，正经历有丝分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％的效率将环状多核糖核苷酸传递至子细胞。[0313]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在宿主细胞内复制。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸能够在哺乳动物细胞例如人细胞中复制。[0314]虽然在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在宿主细胞中复制，但是环状多核糖核苷酸未整合到宿主的基因组中，例如未与宿主的染色体整合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有例如与宿主的染色体的可忽略的重组频率。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸例如与宿主的染色体的重组频率例如小于约1.0cm/mb、0.9cm/mb、0.8cm/mb、0.7cm/mb、0.6cm/mb、0.5cm/mb、0.4cm/mb、0.3cm/mb、0.2cm/mb、0.1cm/mb、或更低。支架序列[0315]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸分子包含一个或多个支架序列。支架序列可以是适体序列。在以上叙述的每个方面的一些实施例中，这些环状多核糖核苷酸分子具有编码内源性或天然存在的环状多核糖核苷酸序列的序列。[0316]在一些实施例中，circrna结合一个或多个靶标。在一些实施例中，circrna是环状适体。在一个实施例中，circrna包含与一个或多个靶标结合的一个或多个结合位点。在一个实施例中，circrna包含适体序列。在一个实施例中，circrna结合dna靶标和蛋白靶标两者，并且例如介导转录。在另一个实施例中，circrna使蛋白质复合物聚集在一起，并且例如介导翻译后修饰或信号转导。在另一个实施例中，circrna结合两个或更多个不同的靶标，诸如蛋白质，并且例如，将这些蛋白质穿梭至细胞质，或介导一个或多个靶标的降解。[0317]在一些实施例中，circrna结合dna、rna和蛋白质中的至少一种，从而调控细胞过程(例如，改变蛋白质表达、调节基因表达、调节细胞信号传导等)。在一些实施例中，合成的circrna包括用于与靶标或选择的dna、rna或蛋白质的至少一个部分，例如结合部分相互作用的结合位点，从而与内源性对应物竞争结合。[0318]在一些实施例中，环状rna形成调控细胞过程(例如，改变蛋白质表达、调节基因表达、调节细胞信号传导等)的复合物。在一些实施例中，环状rna通过与靶标(例如，转录因子)结合而使细胞对细胞毒性剂(例如，化学治疗剂)敏感，这导致细胞活力降低。例如，使细胞对细胞毒性剂敏感导致在递送细胞毒性剂和环状rna后细胞活力降低。在一些实施例中，降低的细胞活力是降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％、或其中的任何百分比。[0319]在一些实施例中，在将环状rna递送至细胞后，复合物可检测持续至少5天。在一些实施例中，在将环状rna递送至细胞后，复合物可检测持续6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、或16天。[0320]在一个实施例中，合成的circrna结合和/或螯合mirna。在另一个实施例中，合成的circrna结合和/或螯合蛋白质。在另一个实施例中，合成的circrna结合和/或螯合mrna。在另一个实施例中，合成的circrna结合和/或螯合核糖体。在另一个实施例中，合成的circrna结合和/或螯合circrna。在另一个实施例中，合成的circrna结合和/或螯合长非编码rna(lncrna)或任何其他非编码rna，例如mirna、trna、rrna、snorna、ncrna、sirna、长非编码rna、shrna。除了结合和/或螯合位点，circrna还可以包括降解元件，该降解元件将导致结合和/或螯合的rna和/或蛋白质的降解。[0321]在一个实施例中，circrna包含lncrna或lncrna的序列，例如，circrna包含天然存在的非环状lncrna的序列或其片段。在一个实施例中，在具有或不具有间隔子序列的情况下将lncrna或lncrna的序列环化，以形成合成的circrna。[0322]在一个实施例中，circrna具有核酶活性。在一个实施例中，circrna可以用作核酶并且裂解致病性或内源性rna、dna、小分子或蛋白质。在一个实施例中，circrna具有酶活性。在一个实施例中，合成的circrna能够特异性识别和裂解rna(例如，病毒rna)。在另一个实施例中，circrna能够特异性识别和裂解蛋白质。在另一个实施例中，circrna能够特异性识别和降解小分子。[0323]在一个实施例中，circrna是牺牲型或自裂解或可裂解的circrna。在一个实施例中，circrna可用于递送rna，例如mirna、trna、rrna、snorna、ncrna、sirna、长非编码rna、shrna。在一个实施例中，合成的circrna由被(1)可自裂解的元件(例如，锤头结构、剪接元件)、(2)裂解募集位点(例如，adar)、(3)可降解接头(例如，丙三醇)、(4)化学接头、和/或(5)间隔子序列隔开的微rna构成。在另一个实施例中，合成的circrna由被(1)可自裂解的元件(例如，锤头结构、剪接元件)、(2)裂解募集位点(例如，adar)、(3)可降解接头(例如，丙三醇)、(4)化学接头、和/或(5)间隔子序列隔开的sirna构成。[0324]在一个实施例中，circrna是具有转录/复制能力的circrna。此circrna可以编码任何类型的rna。在一个实施例中，合成的circrna具有反义mirna和转录元件。在一个实施例中，在转录后，从circrna生成线性功能性mirna。在一个实施例中，circrna是不能翻译的环状多核糖核苷酸。[0325]在一个实施例中，circrna具有上述属性中的一种或多种与翻译元件的组合。其他序列[0326]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸还包括另一种核酸序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包含其他序列，这些其他序列包括dna、rna、或人工核酸。其他序列可以包括但不限于基因组dna，cdna或编码trna、mrna、rrna、mirna、grna、sirna、或其他rnai分子的序列。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸包括sirna，以靶向与环状多核糖核苷酸相同的基因表达产物的不同基因座。在一个实施例中，环状多核糖核苷酸包括sirna，以靶向与环状多核糖核苷酸不同的基因表达产物。[0327]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5’‑utr。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少3’‑utr。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚a序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少终止元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少核酸外切酶的降解易感性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少降解易感性的事实可能意味着环状多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解，或在仅存在核酸外切酶时被降解的有限程度与不存在核酸外切酶时相当或相似。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少核酸外切酶的降解。在一些实施例中，当暴露于核酸外切酶时，环状多核糖核苷酸具有减少的降解。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少与帽结合蛋白的结合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5’帽。[0328]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5’‑utr，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少3’‑utr，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚a序列，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少终止元件，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少帽，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5’‑utr、3’‑utr和ires，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包含以下序列中的一种或多种：编码一个或多个mirna的序列、编码一个或多个复制蛋白的序列、编码外源性基因的序列、编码治疗剂的序列、调控元件(例如，翻译调节子，例如翻译增强子或抑制子)、翻译起始序列、靶向内源性基因的一种或多种调控核酸(sirna、lncrna、shrna)和编码治疗性mrna或蛋白质的序列。[0329]其他序列的长度可以是从约2nt至约10000nt、约2nt至约5000nt、约10nt至约100nt、约50nt至约150nt、约100nt至约200nt、约150nt至约250nt、约200至约300nt、约250nt至约350nt、约300nt至约500nt、约10nt至约1000nt、约50nt至约1000nt、约100nt至约1000nt、约1000nt至约2000nt、约2000nt至约3000nt、约3000nt至约4000nt、约4000nt至约5000nt、或其间的任何范围。[0330]作为其环化的结果，环状多核糖核苷酸可能包括某些使其区别于线性rna的特征。例如，与线性rna相比，环状多核糖核苷酸较不易被核酸外切酶降解。这样，环状多核糖核苷酸比线性rna更稳定，尤其是在核酸外切酶存在下孵育时。环状多核糖核苷酸与线性rna相比的增加稳定性使得环状多核糖核苷酸作为生产多肽的细胞转化试剂更加有用，并且与线性rna相比，存储更容易且时间更长。可以使用本领域标准的方法测试用核酸外切酶处理的环状多核糖核苷酸的稳定性，这些方法确定是否已经发生rna降解(例如，通过凝胶电泳)。[0331]此外，与线性rna不同，当环状多核糖核苷酸与磷酸酶诸如小牛肠磷酸酶一起孵育时，环状多核糖核苷酸较不易去磷酸化。核苷酸间隔子序列[0332]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含间隔子序列。[0333]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个间隔子序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7或更多个间隔子序列。[0334]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含根据国际专利公开号wo2019118919a1的[0295]‑[0302]中的描述配置的一个或多个间隔子序列，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。非核酸接头[0335]本文所述的环状多核糖核苷酸还可以包含非核酸接头。在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸在本文所述的一个或多个序列或元件之间具有非核酸接头。在一个实施例中，本文所述的一个或多个序列或元件与接头连接。非核酸接头可以是化学键，例如一个或多个共价键或非共价键。在一些实施例中，非核酸接头是肽接头或蛋白质接头。这种接头可以在2‑30个氨基酸之间，或更长。接头包括柔性、刚性或可裂解接头，诸如国际专利公开号wo2019118919a1的[0304]‑[0307]中所述的那些，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。稳定性/半衰期[0336]在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸制剂具有相比于参考物(例如，具有相同核苷酸序列但未被环化的线性多核糖核苷酸(线性对应物))增加的半衰期。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸对例如核酸外切酶的降解有抗性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸对自降解有抗性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少酶促裂解位点，例如dicer裂解位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的半衰期比参考物(例如线性对应物)长至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约120％、至少约140％、至少约150％、至少约160％、至少约180％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％、至少约1000％或至少约10000％。[0337]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞分裂期间持续存在于细胞中。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在有丝分裂后持续存在于子细胞中。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞内复制并且传递给子细胞。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含介导环状多核糖核苷酸的自复制的复制元件。在一些实施例中，复制元件介导环状多核糖核苷酸转录成与环状多核糖核苷酸互补的线性多核糖核苷酸(线性互补)。在一些实施例中，线性互补的多核糖核苷酸可以在细胞中体内环化为互补的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，互补的多核糖核苷酸可以进一步自复制成另一种环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸具有与起始环状多核糖核苷酸相同或相似的核苷酸序列。一种示例性自复制元件包括hdv复制结构域(如beeharry等人,virol[病毒学],2014,450‑451:165‑173所述)。在一些实施例中，细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％的效率将至少一种环状多核糖核苷酸传递至子细胞。在一些实施例中，正经历减数分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％的效率将环状多核糖核苷酸传递至子细胞。在一些实施例中，正经历有丝分裂的细胞以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％的效率将环状多核糖核苷酸传递至子细胞。修饰[0338]相对于参考序列(特别是亲本多核糖核苷酸)，环状多核糖核苷酸可以包括本发明范围内包括的一个或多个取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰。[0339]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个转录后修饰(例如，加帽、裂解、聚腺苷酸化、剪接、聚a序列、甲基化、酰化、磷酸化、赖氨酸和精氨酸残基的甲基化、乙酰化、以及硫醇基团和酪氨酸残基的亚硝基化等)。该一个或多个转录后修饰可以是任何转录后修饰，诸如已经在rna中鉴定出的多于一百种不同的核苷修饰中的任一种(rozenski,j,crain,p和mccloskey,j.(1999).thernamodificationdatabase:1999update[rna修饰数据库:1999年更新].nuclacidsres[核酸研究]27:196‑197)。在一些实施例中，第一分离核酸包含信使rna(mrna)。在一些实施例中，mrna包含选自诸如国际专利公开号wo2019118919a1的[0311]中所述的那些的组的至少一个核苷，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。[0340]环状多核糖核苷酸可以包括任何有用的修饰，诸如针对糖、核碱基或核苷间键(例如，对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)。嘧啶核碱基的一个或多个原子可以被任选取代的氨基、任选取代的硫醇、任选取代的烷基(例如，甲基或乙基)或卤代(例如，氯代或氟代)替代或取代。在某些实施例中，在糖和核苷间键中的每一个中存在修饰(例如，一个或多个修饰)。修饰可以是对脱氧核糖核酸(dna)、苏糖核酸(tna)、乙二醇核酸(gna)、肽核酸(pna)、锁核酸(lna)或其杂交体的核糖核酸(rna)修饰。本文描述了其他修饰。[0341]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个n(6)甲基腺苷(m6a)修饰以增加翻译效率。在一些实施例中，n(6)甲基腺苷(m6a)修饰可以降低环状多核糖核苷酸的免疫原性(例如，降低免疫或炎性应答的一种或多种标记物的水平)。[0342]在一些实施例中，修饰可以包括化学或细胞诱导的修饰。例如，细胞内rna修饰的一些非限制性实例由lewis和pan,“rnamodificationsandstructurescooperatetoguiderna‑proteininteractions[rna修饰和结构协作指导rna‑蛋白质相互作用]”,natreviewsmolcellbiol[自然评论：分子细胞生物学],2017,18:202‑210所描述。[0343]在一些实施例中，对环状多核糖核苷酸的核糖核苷酸的化学修饰可以增强免疫逃避。环状多核糖核苷酸可以通过本领域充分建立的方法合成和/或修饰，这些方法诸如在currentprotocolsinnucleicacidchemistry[核酸化学实验室指南],beaucage,s.l等人(编辑),johnwiley&sons[约翰威利公司],newyork[纽约州],ny[纽约],usa[美国](通过援引以其全文特此并入本文)中描述的那些。修饰包括例如端部修饰，例如5'端修饰(磷酸化(单、二和三磷酸化)、缀合、反向连接等)、3'端修饰(缀合、dna核苷酸、反向连接等)；碱基修饰(例如，用稳定的碱基、不稳定的碱基或与扩展的配偶体库碱基配对的碱基替代)；碱基去除(脱碱基核苷酸)、或碱基缀合。经修饰的核糖核苷酸碱基还可以包括5‑甲基胞苷和假尿苷。在一些实施例中，碱基修饰可以调节环状多核糖核苷酸的表达、免疫应答、稳定性、亚细胞定位(举几个功能效应)。在一些实施例中，修饰包括双正交核苷酸，例如非天然碱基。参见例如，kimoto等人,chemcommun(camb)[化学通讯(剑桥)],2017,53:12309,doi:10.1039/c7cc06661a，将该文献通过援引以其全文特此并入。[0344]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个核糖核苷酸的糖修饰(例如，在2'位置或4'位置)或糖替代以及主链修饰可以包括磷酸二酯键的修饰或替代。环状多核糖核苷酸的具体实例包括但不限于包括经修饰的主链或非天然核苷间键(诸如核苷间修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替代)的环状多核糖核苷酸。具有经修饰的主链的环状多核糖核苷酸尤其包括在主链中不具有磷原子的那些。出于本技术的目的，并且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的rna也可以被认为是寡核苷。在特定的实施例中，环状多核糖核苷酸将包括在其核苷间主链中具有磷原子的核糖核苷酸。[0345]经修饰的环状多核糖核苷酸主链可以包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(诸如3'‑亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(诸如3'‑氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和具有正常3'‑5'键的硼烷磷酸酯、这些的2'‑5'连接类似物、以及具有其中相邻的核苷单元对是3'‑5'至5'‑3'或2'‑5'至5'‑2'连接的反向极性的那些。也包括各种盐、混合盐和游离酸形式。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以带负电荷或带正电荷。[0346]可掺入环状多核糖核苷酸中的经修饰的核苷酸可以在核苷间键(例如，磷酸酯主链)上被修饰。在本文中，在多核苷酸主链的上下文中，短语“磷酸酯”和“磷酸二酯”可互换使用。可以通过用不同的取代基替代一个或多个氧原子来修饰主链磷酸酯基团。此外，经修饰的核苷和核苷酸可以包括用如本文所述的另一个核苷间键进行的对未修饰的磷酸酯部分的整体替代。经修饰的磷酸酯基团的实例包括但不限于硫代磷酸酯、磷酸硒酸酯(phosphoroselenate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、硼烷磷酸酯(boranophosphateester)、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯、和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧都被硫替代。也可以通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)替代连接氧来修饰磷酸酯接头。[0347]提供a‑硫代取代的磷酸酯部分以通过非天然硫代磷酸酯主链键赋予rna和dna聚合物稳定性。硫代磷酸酯dna和rna具有增加的核酸酶抗性，并且因此在细胞环境中具有更长的半衰期。预期与环状多核糖核苷酸连接的硫代磷酸酯通过细胞先天性免疫分子的更弱结合/激活来降低先天性免疫应答。[0348]在特定的实施例中，经修饰的核苷包括α‑硫代‑核苷(例如，5'‑0‑(1‑硫代磷酸酯)‑腺苷、5'‑0‑(1‑硫代磷酸酯)‑胞苷(a‑硫代胞苷)、5'‑0‑(1‑硫代磷酸酯)‑鸟苷、5'‑0‑(1‑硫代磷酸酯)‑尿苷或5'‑0‑(1‑硫代磷酸酯)‑假尿苷)。[0349]本文描述了可根据本发明使用的其他核苷间键，包括不包含磷原子的核苷间键。[0350]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个细胞毒性核苷。例如，细胞毒性核苷可以被掺入环状多核糖核苷酸中，诸如双功能修饰。细胞毒性核苷可以包括但不限于阿糖腺苷、5‑氮杂胞苷、4'‑硫代‑阿糖胞苷、环戊烯基胞嘧啶、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷、1‑(2‑c‑氰基‑2‑脱氧‑β‑d‑阿拉伯‑戊呋喃糖基)‑胞嘧啶、地西他滨、5‑氟尿嘧啶、氟达拉滨、氟尿苷、吉西他滨、替加氟和尿嘧啶的组合、替加氟((rs)‑5‑氟‑1‑(四氢呋喃‑2‑基)嘧啶‑2,4(1h,3h)‑二酮)、曲沙他滨、替扎西他滨、2'‑脱氧‑2'‑亚甲基胞苷(dmdc)和6‑巯基嘌呤。其他实例包括氟达拉滨磷酸酯、n4‑山嵛酰基‑1‑β‑d‑阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、n4‑十八烷基‑1‑β‑d‑阿拉伯戊呋喃糖基胞嘧啶、n4‑棕榈酰基‑1‑(2‑c‑氰基‑2‑脱氧‑β‑d‑阿拉伯‑戊呋喃糖基)胞嘧啶、和p‑4055(阿糖胞苷5'‑花生酸酯)。[0351]环状多核糖核苷酸沿着分子的整个长度可以被或者可以不被均一地修饰。例如，一种或多种或所有类型的核苷酸(例如，天然存在的核苷酸、嘌呤或嘧啶，或a、g、u、c、i、pu中的任何一种或多种或全部)在环状多核糖核苷酸中、或在其给定的预定序列区域中可以被或者可以不被均一地修饰。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括假尿苷。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括肌苷，肌苷可以帮助免疫系统将环状多核糖核苷酸表征为内源性而不是病毒rna。肌苷的掺入还可以介导改善的rna稳定性/减少的降解。参见例如，yu,z等人,(2015)rnaeditingbyadar1marksdsrnaas“self”[通过adar1进行的rna编辑将dsrna标记为“自身”].cellres[细胞研究].25,1283‑1284，将该文献通过援引以其全文并入本文。[0352]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸(或其给定序列区域)中的所有核苷酸均被修饰。在一些实施例中，修饰可以包括可增强表达的m6a；可减弱免疫应答的肌苷；可增加rna稳定性、或翻译通读(交错元件)的假尿苷；可增加稳定性的m5c；以及有助于亚细胞移位(例如，核定位)的2,2,7‑三甲基鸟苷。[0353]在环状多核糖核苷酸的各个位置上可以存在不同的糖修饰、核苷酸修饰和/或核苷间键(例如，主链结构)。本领域普通技术人员将理解，核苷酸类似物或其他一个或多个修饰可以位于环状多核糖核苷酸的任何一个或多个位置，使得环状多核糖核苷酸的功能基本上不降低。修饰也可以是非编码区修饰。环状多核糖核苷酸可以包括从约1％至约100％的经修饰核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即a、g、u或c中的任何一种或多种)或任何中间百分比(例如，从1％至20％>、从1％至25％、从1％至50％、从1％至60％、从1％至70％、从1％至80％、从1％至90％、从1％至95％、从10％至20％、从10％至25％、从10％至50％、从10％至60％、从10％至70％、从10％至80％、从10％至90％、从10％至95％、从10％至100％、从20％至25％、从20％至50％、从20％至60％、从20％至70％、从20％至80％、从20％至90％、从20％至95％、从20％至100％、从50％至60％、从50％至70％、从50％至80％、从50％至90％、从50％至95％、从50％至100％、从70％至80％、从70％至90％、从70％至95％、从70％至100％、从80％至90％、从80％至95％、从80％至100％、从90％至95％、从90％至100％、和从95％至100％)。结构[0354]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含高阶结构，例如二级或三级结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的互补区段将其自身折叠成双链区段，与氢键一起保持在对(例如，a‑u和c‑g)之间。在一些实施例中，螺旋(也称为茎)在分子内形成，具有连接至端环的双链区段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个具有准双链二级结构的区段。在一些实施例中，具有准双链二级结构的区段具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、或更多个配对的核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有一个或多个具有准双链二级结构的区段(例如，2、3、4、5、6或更多个)。在一些实施例中，区段被3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、或更多个核苷酸隔开。[0355]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个序列包括基本上单链的与双链的区域。在一些实施例中，单链与双链的比率可以影响环状多核糖核苷酸的功能。[0356]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个序列基本上是单链的。在一些实施例中，基本上是单链的环状多核糖核苷酸的一个或多个序列可以包括蛋白质或rna结合位点。在一些实施例中，基本上是单链的环状多核糖核苷酸序列可以是构象柔性的以允许增加相互作用。在一些实施例中，有目的地将环状多核糖核苷酸的序列工程化以包含此类二级结构，从而结合蛋白质或核酸或增加蛋白质或核酸结合。[0357]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸序列基本上是双链的。在一些实施例中，基本上是双链的环状多核糖核苷酸的一个或多个序列可以包括构象识别位点，例如核糖开关或适体酶。在一些实施例中，基本上是双链的环状多核糖核苷酸序列可以是构象刚性的。在一些此类实例中，构象刚性序列可能在空间上阻碍环状多核糖核苷酸结合蛋白质或核酸。在一些实施例中，有目的地将环状多核糖核苷酸的序列工程化以包含此类二级结构，从而避免或减少蛋白质或核酸结合。[0358]有16种可能的碱基配对，但是其中的六种(au、gu、gc、ua、ug、cg)可能形成实际的碱基对。其余的称为错配，并且以极低的频率出现在螺旋中。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的结构不容易被破坏，从而对其功能无影响且无致命后果，这提供了保持二级结构的选择。在一些实施例中，茎的一级结构(即其核苷酸序列)仍可变化，同时仍保持螺旋区。碱基的性质是高阶结构的第二位，并且只要它们保留二级结构，就可以进行取代。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有准螺旋结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个具有准螺旋结构的区段。在一些实施例中，具有准螺旋结构的区段具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、或更多个核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有一个或多个具有准螺旋结构的区段(例如，2、3、4、5、6、或更多个)。在一些实施例中，区段被3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、或更多个核苷酸隔开。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括富u或富a序列或其组合中的至少一种。在一些实施例中，富u和/或富a序列以将产生三联准螺旋结构的方式排列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有双准螺旋结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有一个或多个具有双准螺旋结构的区段(例如，2、3、4、5、6、或更多个)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括富c和/或富g的序列中的至少一种。在一些实施例中，富c和/或富g序列以将产生三联准螺旋结构的方式排列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有有助于稳定的分子内三联准螺旋结构。[0359]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个结合位点，例如，至少一个蛋白质结合位点、至少一个mirna结合位点、至少一个lncrna结合位点、至少一个trna结合位点、至少一个rrna结合位点、至少一个snrna结合位点、至少一个sirna结合位点、至少一个pirna结合位点、至少一个snorna结合位点、至少一个snrna结合位点、至少一个exrna结合位点、至少一个scarna结合位点、至少一个yrna结合位点、至少一个hnrna结合位点、和/或至少一个trna基序。[0360]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被配置成用于包含高阶结构，诸如国际专利公开号wo2019118919a1中所述的那些，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。递送[0361]本文所述的环状多核糖核苷酸也可以与载体一起或不与载体一起包含在药物组合物中。[0362]本文所述的药物组合物可以被配制成例如包含载体(诸如药物载体和/或聚合物载体，例如脂质体)，并且通过已知方法递送至有需要的受试者(例如，人或非人农业动物或家畜，例如牛、狗、猫、马、家禽)。此类方法包括但不限于转染(例如，脂质介导的阳离子聚合物、磷酸钙、树状聚合物)；电穿孔或其他破坏膜的方法(例如，核转染)、病毒递送(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、aav)、显微注射、微粒轰击(“基因枪”)、fugene、直接声波加载、细胞挤压、光转染、原生质体融合、刺穿感染、磁转染、外来体介导的转移、脂质纳米颗粒介导的转移、及其任何组合。递送方法也描述于例如gori等人,deliveryandspecificityofcrispr/cas9genomeeditingtechnologiesforhumangenetherapy[用于人类基因疗法的crispr/cas9基因组编辑技术的递送和特异性].humangenetherapy[人类基因疗法疗].2015年7月,26(7):443‑451.doi:10.1089/hum.2015.074；和zuris等人,cationiclipid‑mediateddeliveryofproteinsenablesefficientprotein‑basedgenomeeditinginvitroandinvivo[阳离子脂质介导的蛋白质递送能够在体外和体内实现高效的基于蛋白质的基因组编辑].natbiotechnol[自然生物技术].2014年10月30日；33(1):73‑80。[0363]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以在裸递送配制品中递送。裸递送配制品在不借助载体并且不对环状多核糖核苷酸进行共价修饰或者不部分或完全包封环状多核糖核苷酸的情况下将环状多核糖核苷酸递送至细胞。[0364]裸递送配制品是不含载体的配制品，并且其中环状多核糖核苷酸没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰并且环状多核糖核苷酸未被部分或完全包封。在一些实施例中，没有与有助于递送至细胞的部分结合的共价修饰的环状多核糖核苷酸可以是未与有助于递送至细胞的部分(诸如蛋白质、小分子、颗粒、聚合物、或生物聚合物)共价结合的多核糖核苷酸。没有与有助于递送至细胞的部分结合的共价修饰的多核糖核苷酸可以不含经修饰的磷酸酯基团。例如，没有与有助于递送至细胞的部分结合的共价修饰的多核糖核苷酸可以不含硫代磷酸酯、磷酸硒酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯、或磷酸三酯。[0365]在一些实施例中，裸递送配制品可以不含以下中的任一种或全部：转染试剂、阳离子载体、碳水化合物载体、纳米颗粒载体、或蛋白质载体。例如，裸递送配制品可以不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β‑糊精、酸酐修饰的植物糖原β‑糊精、lipofectamine、聚乙烯亚胺、聚(三亚甲基亚胺)、聚(四亚甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷‑多胺、双脱氧‑二氨基‑b‑环糊精、精胺、亚精胺、聚(2‑二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子化明胶、树状聚合物、壳聚糖、1,2‑二油酰基‑3‑三甲基铵‑丙烷(dotap)、n‑[1‑(2,3‑二油酰基氧基)丙基]‑n,n,n‑三甲基氯化铵(dotma)、1‑[2‑(油酰基氧基)乙基]‑2‑油烯基‑3‑(2‑羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(dotim)、2,3‑二油酰基氧基‑n‑[2(精胺甲酰胺基)乙基]‑n,n‑二甲基‑1‑丙烷铵三氟乙酸酯(dospa)、3b‑[n—(n\n'‑二甲基氨基乙烷)‑氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(dc‑胆固醇hc1)、双十七烷基酰胺基甘氨酰亚精胺(dogs)、n,n‑二硬脂基‑n,n‑二甲基溴化铵(ddab)、n‑(1,2‑二肉豆蔻基氧基丙‑3‑基)‑n,n‑二甲基‑n‑羟乙基溴化铵(dmrie)、n,n‑二油烯基‑n,n‑二甲基氯化铵(dodac)、人血清白蛋白(hsa)、低密度脂蛋白(ldl)、高密度脂蛋白(hdl)、或球蛋白。[0366]裸递送配制品可以包含非载体赋形剂。在一些实施例中，非载体赋形剂可以包括不展现出活性细胞渗透效应的非活性成分。在一些实施例中，非载体赋形剂可以包括缓冲液，例如pbs。在一些实施例中，非载体赋形剂可以是溶剂、非水性溶剂、稀释剂、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、制粒剂、崩解剂、粘结剂、缓冲剂、润滑剂、或油。[0367]在一些实施例中，裸递送配制品可以包含稀释剂，诸如肠胃外可接受的稀释剂。稀释剂(例如，肠胃外可接受的稀释剂)可以是液体稀释剂或固体稀释剂。在一些实施例中，稀释剂(例如，肠胃外可接受的稀释剂)可以是rna增溶剂、缓冲液、或等渗剂。rna增溶剂的实例包括水、乙醇、甲醇、丙酮、甲酰胺、和2‑丙醇。缓冲液的实例包括2‑(n‑吗啉代)乙磺酸(mes)、bis‑tris、2‑[(2‑氨基‑2‑氧乙基)‑(羧甲基)氨基]乙酸(ada)、n‑(2‑乙酰胺基)‑2‑氨基乙烷磺酸(aces)、哌嗪‑n,n′‑双(2‑乙烷磺酸)(pipes)、2‑[[1,3‑二羟基‑2‑(羟甲基)丙‑2‑基]氨基]乙烷磺酸(tes)、3‑(n‑吗啉代)丙磺酸(mops)、4‑(2‑羟乙基)‑1‑哌嗪乙烷磺酸(hepes)、tris、tricine、gly‑gly、bicine或磷酸盐。等渗剂的实例包括甘油、甘露醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖、或蔗糖。[0368]在一些实施例中，如本文披露的药物制剂、如本文披露的药物组合物、如披露的药物原料药或如本文披露的药物成品药是在肠胃外核酸递送系统中。肠胃外核酸递送系统可以包含如本文披露的药物制剂、如本文披露的药物组合物、如披露的药物原料药、或如本文披露的药物成品药，和肠胃外可接受的稀释剂。在一些实施例中，肠胃外核酸递送系统中的如本文披露的药物制剂、如本文披露的药物组合物、如披露的药物原料药或如本文披露的药物成品药不含任何载体。[0369]本发明进一步涉及宿主或宿主细胞，该宿主或宿主细胞包含本文所述的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，宿主或宿主细胞是脊椎动物、哺乳动物(例如，人)、或其他生物体或细胞。[0370]在一些实施例中，与由参考化合物(例如，对应于所述环状多核糖核苷酸的线性多核苷酸或缺少加密原的环状多核糖核苷酸)引发的应答相比，环状多核糖核苷酸具有降低的宿主免疫系统的不期望应答或不能产生该不期望应答。在实施例中，环状多核糖核苷酸在宿主中是非免疫原性的。一些免疫应答包括但不限于体液免疫应答(例如抗原特异性抗体的产生)和细胞介导的免疫应答(例如，淋巴细胞增殖)。[0371]在一些实施例中，使宿主或宿主细胞接触(例如，递送至或施用至)环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，宿主是哺乳动物，诸如人。可以在施用后的任何时间测量宿主中环状多核糖核苷酸、表达产物、或两者的量。在某些实施例中，测定培养物中宿主生长的时程。如果在环状多核糖核苷酸存在时生长增加或减少，则环状多核糖核苷酸或表达产物或两者都被鉴定为在增加或减少宿主的生长方面是有效的。递送方法[0372]将如本文所述的环状多核糖核苷酸分子递送至细胞、组织或受试者的方法包括向该细胞、组织或受试者施用如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药。[0373]在一些实施例中，该递送方法是体内方法。例如，递送如本文所述的环状多核糖核苷酸的方法包括向有需要的受试者肠胃外施用如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药。作为另一个实例，将环状多核糖核苷酸递送至受试者的细胞或组织的方法包括向该细胞或组织肠胃外施用如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是处于有效引起受试者中的生物学应答的量下。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是有效对受试者中的细胞或组织具有生物学效应的量。在一些实施例中，如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药包含载体。在一些实施例中，如本文所述的药物组合物、药物原料药或药物成品药包含稀释剂并且不含任何载体。在一些实施例中，肠胃外施用是以静脉内、肌肉内、眼科、或局部方式。[0374]在一些实施例中，药物组合物、药物原料药或药物成品药以口服方式施用。在一些实施例中，药物组合物、药物原料药或药物成品药以经鼻方式施用。在一些实施例中，药物组合物、药物原料药或药物成品药通过吸入施用。在一些实施例中，药物组合物、药物原料药或药物成品药以局部方式施用。在一些实施例中，药物组合物、药物原料药或药物成品药以眼科方式施用。在一些实施例中，药物组合物、药物原料药或药物成品药以直肠方式施用。在一些实施例中，药物组合物、药物原料药或药物成品药通过注射施用。施用可以是全身性施用或局部施用。在一些实施例中，药物组合物、药物原料药、或药物成品药以肠胃外方式施用。在一些实施例中，药物组合物、药物原料药、或药物成品药以静脉内、动脉内、腹膜内、皮内、颅内、鞘内、淋巴管内、皮下、或肌肉内方式施用。在一些实施例中，药物组合物、药物原料药、或药物成品药经由眼内施用、耳蜗内(耳内)施用、或气管内施用来施用。在一些实施例中，如本文所述的任何递送方法是用载体进行的。在一些实施例中，如本文所述的任何递送方法是在不借助于载体或细胞渗透剂的情况下进行的。[0375]在一些实施例中，在施用步骤之后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、或至少5天在该细胞、组织、或受试者中检测到环状多核糖核苷酸或从环状多核糖核苷酸翻译的产物。在一些实施例中，在施用步骤之前在该细胞、组织或受试者中评价环状多核糖核苷酸或从环状多核糖核苷酸翻译的产物的存在。在一些实施例中，在施用步骤之后在该细胞、组织或受试者中评价环状多核糖核苷酸或从环状多核糖核苷酸翻译的产物的存在。基于细胞和囊泡的载体[0376]可以将本文所述的环状rna组合物或制剂施用至基于囊泡或其他膜的载体中的细胞。[0377]在实施例中，在基于细胞、囊泡或其他膜的载体中或经由该载体施用本文所述的环状rna组合物或制剂。在一个实施例中，环状rna组合物或制剂可以配制在脂质体或其他类似的囊泡中。脂质体是球形囊泡结构，这些球形囊泡结构由围绕内部水性隔室的单层或多层的脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层构成。脂质体可以是阴离子的、中性的或阳离子的。脂质体具有生物相容性，无毒，可以递送亲水性和亲脂性药物分子，保护其货物免受血浆酶的降解，并且将其负载转运穿过生物膜和血脑屏障(bbb)(关于综述，参见例如，spuch和navarro,journalofdrugdelivery[药物递送杂志],第2011卷,文章id469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。[0378]囊泡可以由若干种不同类型的脂质制成；然而，磷脂最常用于生成脂质体作为药物载体。制备多层囊泡脂质的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号6,693,086，其关于多层囊泡脂质制备的教导通过援引并入本文)。尽管当脂质膜与水性溶液混合时，囊泡形成可以是自发的，但也可以通过经由使用均质器、超声波仪或挤压设备以振荡的形式施加力来加快囊泡形成(关于综述，参见例如，spuch和navarro,journalofdrugdelivery[药物递送杂志],第2011卷,文章id469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。可以通过挤出通过具有减小尺寸的过滤器来制备挤出的脂质，如templeton等人,naturebiotech[自然生物技术],15:647‑652,1997中所述，将该文献关于挤出脂质制备的传授内容通过援引并入本文中。[0379]脂质纳米颗粒是为本文所述的环状rna组合物或制剂提供生物相容性和可生物降解递送系统的载体的另一个实例。纳米结构化的脂质载体(nlc)是经修饰的固体脂质纳米颗粒(sln)，这些经修饰的固体脂质纳米颗粒保留了sln的特征、改善了药物稳定性和负载能力、并且防止了药物泄漏。聚合物纳米颗粒(pnp)是药物递送的重要组成部分。这些纳米颗粒可以有效地将药物递送引导至特定靶标并且改善药物稳定性和受控的药物释放。也可以使用脂质聚合物纳米颗粒(pln)，即一种组合了脂质体和聚合物的新型载体。这些纳米颗粒具有pnp和脂质体的互补优势。pln由核‑壳结构构成；聚合物核提供了稳定的结构，并且磷脂壳提供了良好的生物相容性。这样，这两种组分增加了药物包封效率、促进了表面修饰、并且防止了水溶性药物的泄漏。对于综述，参见例如，li等人2017,nanomaterials[纳米材料]7,122；doi:10.3390/nano7060122。[0380]载体的另外的非限制性实例包括碳水化合物载体(例如，酸酐修饰的植物糖原或糖原型材料)、蛋白质载体(例如，共价连接至环状多核糖核苷酸的蛋白质)、或阳离子载体(例如，阳离子脂质聚合物或转染试剂)。碳水化合物载体的非限制性实例包括糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β‑糊精、和酸酐修饰的植物糖原β‑糊精。阳离子载体的非限制性实例包括lipofectamine、聚乙烯亚胺、聚(三亚甲基亚胺)、聚(四亚甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷‑多胺、双脱氧‑二氨基‑b‑环糊精、精胺、亚精胺、聚(2‑二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子化明胶、树状聚合物、壳聚糖、1,2‑二油酰基‑3‑三甲基铵‑丙烷(dotap)、n‑[1‑(2,3‑二油酰基氧基)丙基]‑n,n,n‑三甲基氯化铵(dotma)、1‑[2‑(油酰基氧基)乙基]‑2‑油烯基‑3‑(2‑羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(dotim)、2,3‑二油酰基氧基‑n‑[2(精胺甲酰胺基)乙基]‑n,n‑二甲基‑1‑丙烷铵三氟乙酸酯(dospa)、3b‑[n—(n\n'‑二甲基氨基乙烷)‑氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(dc‑胆固醇hc1)、双十七烷基酰胺基甘氨酰亚精胺(dogs)、n,n‑二硬脂基‑n,n‑二甲基溴化铵(ddab)、n‑(1,2‑二肉豆蔻基氧基丙‑3‑基)‑n,n‑二甲基‑n‑羟乙基溴化铵(dmrie)、和n,n‑二油烯基‑n,n‑二甲基氯化铵(dodac)。蛋白质载体的非限制性实例包括人血清白蛋白(hsa)、低密度脂蛋白(ldl)、高密度脂蛋白(hdl)、或球蛋白。[0381]外来体也可用作本文所述的环状rna组合物或制剂的药物递送媒介物。关于综述，参见ha等人2016年7月.actapharmaceuticasinicab[药学学报b].第6卷,第4期,第287‑296页；https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。[0382]离体分化的红细胞也可用作本文所述环状rna组合物或制剂的载体。参见例如，wo2015073587；wo2017123646；wo2017123644；wo2018102740；wo2016183482；wo2015153102；wo2018151829；wo2018009838；shi等人2014.procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊].111(28):10131‑10136；美国专利9,644,180；huang等人2017.naturecommunications[自然通讯]8:423；shi等人2014.procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊].111(28):10131‑10136。[0383]例如如wo2018208728中所述的融合体组合物也可以用作递送本文所述环状rna组合物或制剂的载体。[0384]病毒体和病毒样颗粒(vlp)也可以用作将本文所述的环状rna组合物或制剂递送至所靶向细胞的载体。[0385]例如如wo2011097480、wo2013070324、wo2017004526、或wo2020041784中所述的植物纳米囊泡和植物信使包(pmp)也可以用作递送本文所述环状rna组合物或制剂的载体。表达方法[0386]本发明包括用于蛋白质表达的方法，该方法包括翻译本文提供的环状多核糖核苷酸的至少一个区域。[0387]在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸的总长度的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％翻译成多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成具有至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸、至少300个氨基酸、至少400个氨基酸、至少500个氨基酸、至少600个氨基酸、至少700个氨基酸、至少800个氨基酸、至少900个氨基酸、或至少1000个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成具有约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约150个氨基酸、约200个氨基酸、约250个氨基酸、约300个氨基酸、约400个氨基酸、约500个氨基酸、约600个氨基酸、约700个氨基酸、约800个氨基酸、约900个氨基酸、或约1000个氨基酸的多肽。在一些实施例中，这些方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成如本文提供的连续多肽、如本文提供的离散多肽、或两者。[0388]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的至少一个区域的翻译在体外，诸如兔网织红细胞裂解物中发生。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的至少一个区域的翻译在体内发生，例如，在真核细胞的转染或原核细胞(诸如细菌)的转化之后。[0389]在一些方面，本披露提供了在受试者体内表达一个或多个表达序列的方法，该方法包括：将环状多核糖核苷酸施用至该受试者的细胞，其中该环状多核糖核苷酸包含该一个或多个表达序列；并且在细胞中表达环状多核糖核苷酸的一个或多个表达序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被配置为使得一个或多个表达序列在细胞中在较晚的时间点的表达等于或高于较早的时间点的表达。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被配置为使得一个或多个表达序列在细胞中的表达在至少7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23、或更多天的时间段内减少不大于约40％。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被配置为使得一个或多个表达序列在细胞中在至少7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23、或更多天的表达维持在变化不超过约40％的水平。在一些实施例中，使用本文所述的任何递送方法进行环状多核糖核苷酸的施用。在一些实施例中，经由静脉内注射向受试者施用环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的施用包括但不限于产前施用、新生儿施用、产后施用、口服、通过注射(例如，静脉内、动脉内、腹膜内、皮内、皮下和肌肉内)、通过眼科施用和通过鼻内施用。[0390]在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括翻译产物的修饰、折叠或其他翻译后修饰。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括体内翻译后修饰，例如经由细胞机制。[0391]本文引用的所有参考文献和出版物均通过援引并入本文。[0392]可以组合上述实施例以实现前述功能特征。以下实例也说明了这一点，这些实例阐述了示例性的组合和所实现的功能特征。编号的实施例组#1[1]一种环状多核糖核苷酸分子的药物制剂，该药物制剂包含不超过1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200g/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、或2mg/ml的线性多核糖核苷酸分子。[2]一种环状多核糖核苷酸分子的药物制剂，该药物制剂包含占该药物制剂中的总核糖核苷酸分子不超过0.5％(w/w)、1％(w/w)、2％(w/w)、5％(w/w)、10％(w/w)、15％(w/w)、20％(w/w)、25％(w/w)、30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子。[3]一种环状多核糖核苷酸分子的药物制剂，其中该药物制剂中总核糖核苷酸分子的至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)或99％(w/w)是环状多核糖核苷酸分子。[4]一种环状多核糖核苷酸分子的药物制剂，在一个或多个纯化步骤之后该药物制剂的线性rna水平与在该一个或多个纯化步骤之前该rna的水平相比降低至少30％(w/w)、至少40％(w/w)、至少50％(w/w)、至少60％(w/w)、至少70％(w/w)、至少80％(w/w)、至少90％(w/w)、或至少95％(w/w)。[5]如段落1、2、3或4所述的药物制剂，该药物制剂在纯化之后与纯化之前相比具有降低水平的免疫或炎性应答的一种或多种标记物。[6]如段落5所述的药物制剂，其中该免疫或炎性应答的一种或多种标记物是细胞因子或免疫原性相关基因。[7]如段落5或6中任一项所述的药物制剂，其中该免疫或炎性应答的一种或多种标记物是选自由rig‑i、mda5、pkr、ifn‑β、oas、和oasl组成的组的基因的表达。[8]一种环状多核糖核苷酸分子的药物制剂，该药物制剂包含占该药物制剂中的总核糖核苷酸分子不超过30％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子，并且基本上不含选自以下项的工艺相关杂质：宿主细胞蛋白质、宿主细胞脱氧核糖核酸、酶、试剂组分、凝胶组分、或色谱材料。[9]如任一项先前段落所述的药物制剂，其中这些线性多核糖核苷酸分子包括这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子对应物。[10]如段落[1]‑[2]或[9]中任一项所述的药物制剂，其中这些线性多核糖核苷酸分子包括这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子对应物、这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子非对应物、或其组合。[11]如段落[1]‑[10]中任一项所述的药物制剂，该药物制剂如通过鲎变形细胞裂解物测试所测量包含少于10eu/kg的内毒素或缺少内毒素。[12]如段落1‑[11]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂在灭菌之前包含少于100cfu/100ml或少于10cfu/100ml的生物负荷。[13]如段落[1]‑[11]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂是无菌药物制剂。[14]如段落[12]所述的药物制剂，其中该无菌药物制剂如在无菌条件下所测试支持少于100个活微生物的生长。[15]如段落[1]‑[14]中任一项所述的药物制剂，该药物制剂满足usp<71>的标准。[16]如段落[1]‑[15]中任一项所述的药物制剂，该药物制剂满足usp<85>的标准。[17]如段落1‑[16]中任一项所述的药物制剂，其中这些环状多核糖核苷酸分子包含准螺旋结构。[18]如段落1‑[17]中任一项所述的药物制剂，其中这些环状多核糖核苷酸分子包含准双链二级结构。[19]如段落[1]‑[18]中任一项所述的药物制剂，其中这些环状多核糖核苷酸分子包含一个或多个表达序列和在至少一个表达序列的3’端的交错元件。[20]如段落[1]‑[19]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂是最终成品药的中间体药物制剂。[21]如段落[1]‑[19]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂是用于施用至受试者的最终成品药。[22]如段落[1]‑[21]中任一项所述的药物制剂，该药物制剂包含浓度为至少0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、或500mg/ml、600mg/ml、650mg/ml、700mg/ml、或750mg/ml的环状多核糖核苷酸分子。[23]如段落[1]‑[22]中任一项所述的药物制剂，该制剂包含不超过1pg/ml、10pg/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、1000μg/ml、5000μg/ml、10,000μg/ml、或100,000μg/ml的脱氧核糖核苷酸分子。[24]如段落[1]‑[23]中任一项所述的药物制剂，该药物制剂包含如通过分光光度计测量的从约1.6至2.3的a260/a280吸光度比。[25]如段落[1]‑[24]中任一项所述的药物制剂，该药物制剂包含少于1pg、10pg、0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、或500ng蛋白质污染物/毫克(mg)这些环状多核糖核苷酸分子的该蛋白质污染物。[26]如段落[23]所述的药物制剂，其中该蛋白质污染物包括酶。[27]如段落[24]所述的药物制剂，其中该酶是核酸酶或连接酶。[28]如段落[1]‑[27]中任一项所述的药物制剂，其中线性多核糖核苷酸分子相比于环状多核糖核苷酸分子的量使用实例2或实例3的方法确定。[29]如段落[1]、[2]或[9]‑[28]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂中线性多核糖核苷酸分子的量使用实例2的方法确定。[30]如段落[3]、[9]或[11]‑[29]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂中环状多核糖核苷酸分子的量使用实例3的方法确定。[31]一种制备药物组合物的方法，该方法包括：a)提供环状多核糖核苷酸分子的制剂；b)处理该制剂以基本上去除该制剂中剩余的线性多核糖核苷酸分子；c)任选地评价在该处理步骤之后该制剂中剩余的线性多核糖核苷酸分子的量；以及d)进一步处理该制剂以产生用于药物用途的该药物组合物。[32]如段落[31]所述的方法，其中步骤d)的进一步处理包括以下项中的一种或多种：e)处理该制剂以基本上去除脱氧核糖核苷酸分子；f)评价该制剂中脱氧核糖核苷酸分子的量；g)将该制剂与药物赋形剂一起配制；h)浓缩该制剂；以及i)将该制剂中脱氧核糖核苷酸分子的量记录在印刷或数字媒介中。[33]如段落[31]‑[32]中任一项所述的方法，其中步骤d)的进一步处理包括以下项中的一种或多种：e)处理该制剂以基本上去除蛋白质污染物；f)评价该制剂中蛋白质污染物的量；g)将该制剂与药物赋形剂一起配制；以及h)浓缩该制剂。[34]如段落[31]‑[33]中任一项所述的方法，其中步骤d)的进一步处理包括以下项中的一种或多种：e)处理该制剂以基本上去除内毒素；f)评价该制剂中内毒素的量；g)将该制剂与药物赋形剂一起配制；以及h)浓缩该制剂。[35]如段落[31]‑[34]中任一项所述的方法，其中这些线性多核糖核苷酸分子包括这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子对应物。[36]如段落[31]‑[35]中任一项所述的方法，其中这些线性多核糖核苷酸分子包括这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子对应物、这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子非对应物、或其组合。[37]如段落[31]‑[36]中任一项所述的方法，其中该蛋白质污染物包括酶。[38]一种制备药物原料药的方法，该方法包括：a)提供环状多核糖核苷酸分子的制剂；b)评价该制剂中剩余的线性多核糖核苷酸分子的量；以及c)如果该环状多核糖核苷酸分子的制剂满足关于该制剂中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准，则将该制剂处理为药物原料药。[39]一种制备药物成品药的方法，该方法包括：a)提供环状多核糖核苷酸分子的制剂；b)测量该制剂中线性多核糖核苷酸分子的量；c)如果该环状多核糖核苷酸分子的制剂满足关于该制剂中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准，则将该制剂配制为药物成品药；以及d)如果该药物成品药满足关于该药物成品药中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的参考标准，则标记和运送该药物成品药。[40]如段落[38]‑[39]中任一项所述的方法，其中该配制该环状多核糖核苷酸分子的制剂包括将该环状多核糖核苷酸分子的制剂与药物赋形剂组合。[41]如段落[38]‑[40]中任一项所述的方法，其中关于该制剂中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的该参考标准是药物放行规格。[42]如段落[41]所述的方法，其中该药物制剂进一步满足关于这些环状多核糖核苷酸分子的序列的参考标准，例如序列与参考环状多核糖核苷酸序列具有至少80％(例如，85％、90％、95％、97％、99％、100％)序列同一性。[43]如段落[38]‑[42]中任一项所述的方法，其中关于该制剂中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的该参考标准是存在不超过1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200g/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、或2mg/ml的线性多核糖核苷酸分子。[44]如段落[38]‑[42]中任一项所述的方法，其中关于该制剂中存在的线性多核糖核苷酸分子的量的该参考标准是当通过显微镜法、分光光度法、荧光测定法、变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳成像、uv‑vis分光光度法、rna电泳、或rna酶h分析测量时存在不超过规定量(例如，测量时不可检测的水平或低于检测限的水平)的线性多核糖核苷酸分子。[45]如段落[38]‑[44]中任一项所述的方法，其中这些线性多核糖核苷酸分子包括这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子对应物。[46]如段落[38]‑[45]中任一项所述的方法，其中这些线性多核糖核苷酸分子包括这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子对应物、这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子非对应物、或其组合。[47]如段落[38]‑[46]中任一项所述的方法，其中该药物成品药或药物原料药包含浓度为至少0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、500μg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、或500mg/ml的环状多核糖核苷酸分子。[48]如段落[38]‑[47]中任一项所述的方法，其中该药物成品药或药物原料药包含相对于该药物制剂中的总核糖核苷酸分子至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、或99％(w/w)的环状多核糖核苷酸分子。[49]如段落[48]所述的方法，其中这些相对于该药物制剂中的总核糖核苷酸分子至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、或99％(w/w)的环状多核糖核苷酸分子通过以下项来测量：显微镜法、分光光度法、荧光测定法、变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳成像、uv‑vis分光光度法、rna电泳、rna酶h分析、uv光谱或荧光检测器、光散射技术、使用或不使用分离方法包括hplc的表面等离子体共振(spr)、hplc、使用或不使用分离前或分离后衍生化方法的基于芯片或凝胶的电泳、使用利用银或染料染色或放射性衰变用于检测线性多核糖核苷酸分子的检测方法、或利用显微镜、目测法或分光光度计的方法。[50]如段落[48]或[49]所述的方法，其中环状多核糖核苷酸相对于总核糖核苷酸的量使用实例3的方法确定。[51]如段落[38]‑[50]中任一项所述的方法，其中该药物成品药或药物原料药如通过鲎变形细胞裂解物测试所测量包含少于10eu/kg的内毒素或缺少内毒素。[52]如段落[38]‑[51]中任一项所述的方法，其中该药物成品药或药物原料药在灭菌之前包含少于100cfu/100ml或少于10cfu/100ml的生物负荷。[53]如段落[38]‑[52]中任一项所述的方法，其中该药物成品药或药物原料药是无菌成品药或无菌原料药。[54]如段落[53]所述的方法，其中该无菌成品药或无菌原料药如在无菌条件下所测试支持少于100个活微生物的生长。[55]如段落[38]‑[54]中任一项所述的方法，其中该药物成品药或药物原料药满足usp<71>的标准。[56]如段落[38]‑[55]中任一项所述的方法，其中该药物成品药或药物原料药满足usp<85>的标准。[57]如段落[38]‑[56]中任一项所述的方法，其中这些环状多核糖核苷酸分子包含一个或多个表达序列和在至少一个表达序列的3’端的交错元件。[58]如段落[38]‑[57]中任一项所述的方法，其中该制剂进一步满足关于该制剂中存在的脱氧核糖核苷酸的量的参考标准。[59]如段落[58]所述的方法，其中关于该制剂中存在的脱氧核糖核苷酸分子的量的该参考标准是存在不超过1pg/ml、10pg/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、或500ng/ml、1000μg/ml、5000μg/ml、10,000μg/ml、或100,000μg/ml的脱氧核糖核苷酸分子。[60]如段落[38]‑[59]中任一项所述的方法，其中该制剂进一步满足关于该制剂中存在的蛋白质污染物的量的参考标准。[61]如段落[60]所述的方法，其中关于该制剂中存在的蛋白质污染物的量的该参考标准是存在少于1pg、10pg、0.1ng、1ng、5ng、10ng、15ng、20ng、25ng、30ng、35ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、或500ng蛋白质污染物/毫克(mg)这些环状多核糖核苷酸分子的该蛋白质污染物。[62]如段落[38]‑[61]中任一项所述的方法，其中该药物成品药或药物原料药包含如通过分光光度计测量的从约1.6至2.3的a260/a280吸光度比。[63]一种将环状多核糖核苷酸递送至受试者或受试者的细胞或组织的方法，该方法包括将如段落[1]‑[27]中任一项所述的药物制剂、如段落[31]‑[37]中任一项所述的药物组合物、如段落[38]‑[62]中任一项所述的药物原料药、或如段落[39]‑[62]中任一项所述的药物成品药施用至该受试者的该细胞或组织，其中在该施用步骤之后至少3天在该细胞、组织、或受试者中检测到该环状多核糖核苷酸或从该环状多核糖核苷酸翻译的产物。[64]如段落[63]所述的方法，该方法进一步包括在该施用步骤之前评价该细胞、组织或受试者中该环状多核糖核苷酸或从该环状多核糖核苷酸翻译的产物的存在。[65]如段落[63]‑[64]中任一项所述的方法，该方法进一步包括在该施用步骤之后评价该细胞、组织或受试者中该环状多核糖核苷酸或从该环状多核糖核苷酸翻译的产物的存在。[66]一种肠胃外核酸递送系统，该肠胃外核酸递送系统包含(i)如段落[1]‑[27]中任一项所述的药物制剂、如段落[31]‑[37]中任一项所述的药物组合物、如段落[38]‑[62]中任一项所述的药物原料药、或如段落[39]‑[62]中任一项所述的药物成品药，和(ii)肠胃外可接受的稀释剂。[67]如段落[66]所述的肠胃外核酸递送系统，其中如段落[1]‑[27]中任一项所述的药物制剂、如段落[31]‑[37]中任一项所述的药物组合物、如段落[38]‑[62]中任一项所述的药物原料药、或如段落[39]‑[62]中任一项所述的药物成品药不含任何载体。[68]一种将环状多核糖核苷酸递送至受试者的方法，该方法包括向有需要的受试者肠胃外施用如段落[1]‑[27]中任一项所述的药物制剂、如段落[31]‑[37]中任一项所述的药物组合物、如段落[38]‑[62]中任一项所述的药物原料药、或如段落[39]‑[62]中任一项所述的药物成品药。[69]如段落[68]所述的方法，其中该环状多核糖核苷酸是处于有效引起该受试者中的生物学应答的量下。[70]如段落[68]所述的方法，其中该环状多核糖核苷酸是处于有效对该受试者中的细胞或组织具有生物学效应的量下。[71]一种将环状多核糖核苷酸递送至受试者的细胞或组织的方法，该方法包括向该细胞或组织肠胃外施用如段落[1]‑[27]中任一项所述的药物制剂、如段落[31]‑[37]中任一项所述的药物组合物、如段落[38]‑[62]中任一项所述的药物原料药、或如段落[39]‑[62]中任一项所述的药物成品药。[72]如段落[68]‑[71]中任一项所述的方法，其中如段落[1]‑[27]中任一项所述的药物制剂、如段落[31]‑[37]中任一项所述的药物组合物、如段落[38]‑[62]中任一项所述的药物原料药、或如段落[39]‑[62]中任一项所述的药物成品药包含载体。[73]如段落[68]‑[71]中任一项所述的方法，其中如段落[1]‑[27]中任一项所述的药物制剂、如段落[31]‑[37]中任一项所述的药物组合物、如段落[38]‑[62]中任一项所述的药物原料药、或如段落[39]‑[62]中任一项所述的药物成品药包含稀释剂并且不含任何载体。[74]如段落[68]‑[73]中任一项所述的方法，其中肠胃外施用是以静脉内、肌肉内、眼科、或局部方式。编号的实施例组#2[1]一种制备药物组合物的方法，该方法包括：a)提供多个线性多核糖核苷酸分子；b)使这些线性多核糖核苷酸环化以生成环状多核糖核苷酸的制剂；c)处理该环状多核糖核苷酸的制剂以基本上去除剩余的线性多核糖核苷酸分子；d)任选地评价在该处理步骤之后该制剂中线性多核糖核苷酸分子的量；以及e)进一步处理该制剂以产生用于药物用途的该药物组合物。[2]如段落[1]所述的方法，其中步骤e)的进一步处理包括以下项中的一种或多种：f)处理该制剂以基本上去除脱氧核糖核苷酸分子；g)评价该制剂中脱氧核糖核苷酸分子的量；h)将该制剂与药物赋形剂一起配制；i)浓缩该制剂；以及j)将该制剂中脱氧核糖核苷酸分子的量记录在印刷或数字媒介中。[3]如段落[1]‑[2]中任一项所述的方法，其中步骤e)的进一步处理包括以下项中的一种或多种：f)处理该制剂以基本上去除蛋白质污染物；g)评价该制剂中蛋白质污染物的量；h)将该制剂与药物赋形剂一起配制；以及i)浓缩该制剂。[4]如段落[1]‑[3]中任一项所述的方法，其中步骤e)的进一步处理包括以下项中的一种或多种：f)处理该制剂以基本上去除内毒素；g)评价该制剂中内毒素的量；h)将该制剂与药物赋形剂一起配制；以及i)浓缩该制剂。[5]如段落[1]‑[4]中任一项所述的方法，其中这些线性多核糖核苷酸分子包括这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子对应物或这些环状多核糖核苷酸分子的该线性多核糖核苷酸分子对应物的片段。[6]如段落[1]‑[5]中任一项所述的方法，其中这些线性多核糖核苷酸分子包括这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子对应物或其片段、这些环状多核糖核苷酸分子的线性多核糖核苷酸分子非对应物或其片段、或其组合。[7]如段落[1]‑[6]中任一项所述的方法，其中该药物组合物包含相对于该制剂中的总核糖核苷酸分子不超过20％、15％、10％、5％、2％、1％、或0.5％(w/w)的组合的线性和带切口多核糖核苷酸分子。[8]如段落[1]‑[7]中任一项所述的方法，其中该环化包括夹板连接。[9]如段落[1]‑[7]中任一项所述的方法，其中该蛋白质污染物包括酶。[10]如段落[1]‑[9]中任一项所述的方法，其中线性多核糖核苷酸分子相比于环状多核糖核苷酸分子的量使用实例2或实例3的方法确定。[11]如段落[1]‑[10]中任一项所述的方法，其中该制剂中线性多核糖核苷酸分子的量使用实例2的方法确定。[12]如段落[1]‑[11]中任一项所述的方法，其中该制剂中环状多核糖核苷酸分子的量使用实例3的方法确定。[13]如段落[1]‑[12]中任一项所述的方法，其中该药物组合物包含占该制剂中的总核糖核苷酸分子不超过30％、20％、15％、10％、5％、2％、1％、或0.5％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子。[14]一种环状多核糖核苷酸分子的药物制剂，该药物制剂包含环状多核糖核苷酸分子和占该药物制剂中的总核糖核苷酸分子不超过5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、或0.1％(w/w)的带切口多核糖核苷酸分子。[15]如段落[14]所述的药物制剂，该药物制剂在纯化之后与纯化之前相比具有降低水平的免疫或炎性应答的一种或多种标记物。[16]如段落[15]所述的药物制剂，其中该免疫或炎性应答的一种或多种标记物是细胞因子或免疫原性相关基因。[17]如段落[15]或[16]中任一项所述的药物制剂，其中该免疫或炎性应答的一种或多种标记物是选自由rig‑i、mda5、pkr、ifn‑β、oas、和oasl组成的组的基因的表达。[18]如段落[14]‑[17]中任一项所述的药物制剂，该药物制剂基本上不含选自以下项的工艺相关杂质：细胞蛋白质、细胞脱氧核糖核酸、酶、试剂组分、凝胶组分、或色谱材料。[19]如段落[14]‑[18]中任一项所述的药物制剂，其中这些带切口线性多核糖核苷酸分子是环化后的带切口线性多核糖核苷酸分子。[20]如段落[14]‑[19]中任一项所述的药物制剂，该药物制剂如通过鲎变形细胞裂解物测试所测量包含少于10eu/kg的内毒素或缺少内毒素。[21]如段落[14]‑[20]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂在灭菌之前包含少于100cfu/100ml或少于10cfu/100ml的生物负荷。[22]如段落[14]‑[21]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂是无菌药物制剂。[23]如段落[22]所述的药物制剂，其中该无菌药物制剂如在无菌条件下所测试支持少于100个活微生物的生长。[24]如段落[14]‑[23]中任一项所述的药物制剂，该药物制剂满足usp<71>的标准。[25]如段落[14]‑[24]中任一项所述的药物制剂，该药物制剂满足usp<85>的标准。[26]如段落[14]‑[25]中任一项所述的药物制剂，其中这些环状多核糖核苷酸分子包含一个或多个表达序列和在至少一个表达序列的3'端的交错元件。[27]如段落[14]‑[26]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂是最终成品药的中间体药物制剂。[28]如段落[14]‑[27]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂是用于施用至受试者的最终成品药。[29]如段落[14]‑[28]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂包含浓度为至少0.1ng/ml的这些环状多核糖核苷酸分子。[30]如段落[14]‑[29]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂包含不超过约9％(w/w)、8％(w/w)、7％(w/w)、6％(w/w)、5％(w/w)、4％(w/w)、3％(w/w)、2％(w/w)、1％(w/w)、或0.5％(w/w)的带切口多核糖核苷酸分子。[31]如段落[14]‑[30]中任一项所述的药物制剂，该药物制剂中总核糖核苷酸分子的至少80％(w/w)是环状多核糖核苷酸分子。[32]如段落[14]‑[31]中任一项所述的药物制剂，其中该药物制剂包含占该制剂中的总核糖核苷酸分子不超过20％(w/w)的线性多核糖核苷酸分子。实例[0393]提供以下实例以进一步说明本发明的一些实施例，但并非旨在限制本发明的范围；通过其示例性性质将理解，可以替代性地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。将如国际专利公开号wo2019118919a1的[0356]‑[0375]、[0393]‑[0405]和[0433]‑[0436]中所述的实施例1‑3、6、9、10和16及其相应图通过援引以其全文并入本文。[0394]下表2旨在提供以下描述的每个实例的内容的简单概述，该简单概述绝不是排他性的。实例的某些方面可能未反映在表2的说明中。表2.实例的简单概述实例1：通过评估rna酶h产生的核酸降解产物表征环状rna制剂[0395]此实例展示了对环状rna制剂的rna酶h产生的核酸降解产物的评估可以检测线性和连环化相比于环状产物。[0396]当与连接酶一起孵育时，rna不能反应或形成分子内或分子间键，分别生成环状(无游离端)或连环化rna(线性)。使用互补dna引物和rna酶h(一种识别dna/rna双链体的非特异性核酸内切酶)处理每种类型的rna，预期会根据起始rna物质产生独特数量的具有特定大小的降解产物。[0397]基于通过rna酶h降解产生的rna的数量和大小，连接的rna可以显示为没有连环化rna污染物的环状rna或具有连环化rna污染物的环状rna。当将引物和rna酶h添加至环状rna中时，单一引物与环状rna形成双链体，并且rna酶h降解dna/rna双链体区域，产生单一线性rna产物。当将引物和rna酶h添加至连环体中时，至少两个引物与连环化rna形成双链体，并且rna酶h降解dna/rna双链体，产生三种产物；一种产物是从5’端到第一引物结合区的rna，一种产物是第一引物结合区与下一引物结合区之间的rna(它可以包括多个rna，这取决于连接在一起的连环体的数量)，并且最终产物是从最后一个引物结合区到3’端的rna。当将引物和rna酶h添加至线性rna中时，单一引物与线性rna形成双链体，产生从5’端到引物结合区的一种rna产物和引物结合区到3’端的另一种产物。图1的左侧图片展示了此策略。[0398]在此实例中，如下生成环状rna。使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段合成未修饰的线性rna。将转录的rna用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，按照制造商的说明用rna5’‑焦磷酸水解酶(rpph，新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化系统纯化。环状rna被设计为包含随有编码纳米萤光素酶(nluc)的orf的ires和两个侧接ires‑orf的间隔子元件。[0399]为了测试rna的环化状态，将0.05pmol/μl线性rna或环状rna制剂与0.25u/μlrna酶h(消化dna/rna双链体的内切核糖核酸酶)和0.3pmol/μl与nlucrna(caccgctcaggacaatcctt)互补的寡聚体在37℃下一起孵育30min。孵育后，通过6％变性page分析反应混合物。将凝胶用sybr‑绿染色并且通过e‑凝胶成像仪可视化。通过imagej测量和分析可视化凝胶上的条带强度。[0400]图1的右侧显示出此实验中的实际裂解产物。与rna酶h核酸内切酶一起孵育的线性rna泳道中的条带数量产生了预期的两条条带，而在泳道a的情况下在环状rna泳道中检测到单条条带，这表明环状rna实际上是环状的而非连环化的。在泳道b和泳道c的情况下，来自线性和连环体污染物的条带在rna酶h处理之后是可见的，这是由于rna酶h泳道中显现的多个较小片段条带的存在。实例2：环状rna制剂中的线性rna(标准曲线)[0401]此实例展示了环状rna制剂中线性rna的计算。[0402]在此实例中，如下生成环状rna。使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段合成未修饰的线性rna。将转录的rna用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，按照制造商的说明用rna5’‑焦磷酸水解酶(rpph，新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化系统纯化。环状rna被设计为包含随有编码纳米萤光素酶(nluc)的orf的ires和两个侧接ires‑orf的间隔子元件。[0403]通过用t4dna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)处理转录的线性rna和dna夹板来生成夹板连接的环状rna。[0404]为了纯化环状rna，在4％变性page上解析连接混合物，并且切除对应于环状rna中的每一种的rna条带。压碎切除的rna凝胶片段，并且用凝胶洗脱缓冲液(0.5mnaoac，1mmedta和0.1％sds)在37℃下洗脱rna。收获上清液，并且通过将凝胶洗脱缓冲液添加至压碎凝胶中再洗脱一次rna，并孵育一小时。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且用乙醇沉淀rna。通过6％变性page分析洗脱的环状rna。将凝胶用sybr‑绿染色并且通过e‑凝胶成像仪可视化。[0405]通过比较已知量和相同大小的rna(标准rna)的条带强度来确定凝胶上rna的量。生成标准曲线以确定凝胶上未知样品的量(图2)。为了生成标准曲线，将1、0.5、0.2和0.05pmol的环状rna的线性对应物与环状rna制剂平行加载在6％变性page上。将变性凝胶用sybr‑绿染色并且通过e‑凝胶成像仪可视化。然后通过imagej测量和分析凝胶上的每条条带强度。通过分析加载在不同泳道中的每一个中的rna的条带强度，生成线性rna的标准曲线(在所有情况下r2>0.98)，并且基于线性rna标准曲线确定环状rna制剂中线性rna的量。[0406]不同样品中线性rna的量如下：对于环状rna制剂a：计算线性rna为大约0.31mol/mol、或115.99ng/395ng、或30.2％。对于环状rna制剂c：计算线性rna为大约0.45mol/mol、或260.52ng/488ng、或49.2％。实例3：环状rna制剂中的线性rna(凝胶切除和提取)[0407]此实例展示了对制剂中环状rna的纯化和定量。[0408]在此实例中，如下生成环状rna。使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段合成未修饰的线性rna。将转录的rna用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，按照制造商的说明用rna5’‑焦磷酸水解酶(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化系统纯化。环状rna被设计为包含随有编码纳米萤光素酶(nluc)的orf的ires和两个侧接ires‑orf的间隔子元件。[0409]通过用t4dna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)处理转录的线性rna和dna夹板来生成夹板连接的环状rna。[0410]为了纯化环状rna，在6％变性page上解析连接混合物，并且切除对应于环状rna中的每一种的rna条带。压碎切除的rna凝胶片段，并且用凝胶洗脱缓冲液(0.5mnaoac，1mmedta和0.1％sds)在37℃下洗脱rna。收获上清液，并且通过将凝胶洗脱缓冲液添加至压碎凝胶中再洗脱一次rna，并孵育一小时。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且在0.3m乙酸钠存在时用乙醇沉淀rna。通过6％变性page分析洗脱的环状rna。将凝胶用sybr‑绿染色并且通过e‑凝胶成像仪可视化(图3)。再次切除可见条带并且使用凝胶破碎机压碎。为了提取rna，将凝胶洗脱缓冲液(0.5mnaoac，1mmedta，0.1％sds)添加至压碎凝胶中并且在37℃下孵育1小时。收获上清液，并且通过将凝胶洗脱缓冲液添加至压碎凝胶中再洗脱一次rna，并孵育一小时。通过旋转x柱去除凝胶碎片，并且乙醇沉淀所提取的rna。通过qubit3荧光计测量来自单独条带的所提取rna。[0411]如下定量来自不同样品的所提取rna：(制剂a)大约1446ng环状rna和176ng线性rna(89.1％环状rna)；(制剂b)大约934ng环状rna和270ng线性rna(77.5％环状rna)；以及(制剂c)大约320ng环状rna和396ng线性rna(44.6％环状rna)。实例4：环状rna制剂中的线性rna[0412]此实例展示了产生相对于制剂中的总核糖核苷酸分子91％(w/w)纯的环状rna分子并且随后在小鼠中的给予以生成生物学效应。[0413]在此实例中，环状rna包括ires、编码高斯萤光素酶(gluc)的orf、和两个侧接ires‑orf的间隔子元件。[0414]在此实例中，在体外生成环状rna。从包含以上列出的所有基序以及用于驱动转录的t7rna聚合酶启动子的dna模板体外转录未修饰的线性rna。将转录的rna用rna净化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’‑磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化柱纯化。使用夹板dna5’‑tttttcggctattcccaatagccgttttg‑3’和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的线性rna环化。将环状rna进行尿素‑page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠，0.1％sds，1mmedta)中洗脱，乙醇沉淀并且重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific)，目录号am7000)中。[0415]线性多核糖核苷酸保留在最终的环状rna产品制剂中。通过以下方式对每个批次的最终产品制剂中环状rna的纯度和剩余线性rna的百分比进行定量：在6％tbe‑尿素凝胶上运行最终产品制剂并且使用imagej分析条带。通过计算环状rna相比于总rna强度的强度来评估纯度，并且将其以百分比表示。在此，相对于制剂中的总rna，环状具有91％(w/w)纯度。[0416]在施用前，添加pbs和10％transit载体以在100ul最终体积中实现0.25pmol的所期望最终环状rna浓度。使小鼠接受0.25pmol编码高斯萤光素酶orf的环状rna(100ul)的单次静脉内尾静脉注射。[0417]通过亚摩尔抽取从每只小鼠收集血液样品(约25ul)。在给予后0、6小时、1、2、3、7、14、21、28和35天，收集血液到edta管中。通过在4℃下以1300g离心30分钟分离血浆，并且使用高斯萤光素酶活性测定(赛默科技皮尔斯公司(thermoscientificpierce))测试高斯萤光素酶(一种分泌酶)的活性。简而言之，将50ul1xgluc底物添加至5ul血浆中，以进行gluc萤光素酶活性测定。在混合后立即在发光检测仪器(普洛麦格公司(promega))中读取板。[0418]在给予环状rna后6小时和1、2、3、7、14和21天，在血浆中检测到高斯萤光素酶活性。在注射后大约2天观察到环状rna的最高表达，并且高水平的表达在延长的时间段内得以维持且在21天仍是可检测的。在所有时间点，这些活性水平大于对于阴性对照(仅pbs媒介物)观察到的活性水平。[0419]此实例展示了，成功产生了相对于制剂中的总rna具有91％(w/w)纯度的环状rna，该环状rna经由静脉内注射成功递送，并且能够在延长的时间内表达在血液中可检测的蛋白质。实例5：对凝胶纯化的环状rna中带切口环状rna的定量[0420]此实例展示了通过凝胶提取纯化的环状rna含有相对于制剂中的总rna分子不超过1.1％(w/w)的带切口rna。[0421]在此实例中，rna包括ires、编码高斯萤光素酶(gluc)的orf、和两个侧接ires‑orf的间隔子元件。[0422]在此实例中，在体外生成环状rna。从包含以上列出的所有基序以及用于驱动转录的t7rna聚合酶启动子的dna模板体外转录未修饰的线性rna。将转录的rna用rna净化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’‑磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化柱纯化。使用夹板dna(5’‑tttttcggctattcccaatagccgttttg‑3’)和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的线性rna环化。此举导致rna在连接接合点处的环化以生成环状rna。将环状rna在4％page凝胶上进行尿素‑page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠，0.1％sds，1mmedta)中洗脱，乙醇沉淀并且重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。在此实例中，评价经纯化的环状rna相对于制剂中的总rna具有80％(w/w)的纯度。[0423]在此实例中，通过下一代测序来评估线性rna的序列。使用truseq小rna工作流程(依诺米那公司(illumina)，rs‑200‑0012)中描述的文库制备方法制备经纯化的环状rna制剂(80％纯度)用于ngs管线。此方法以高保真度保留了3’端身份。简而言之，将衔接子连接至溶液中具有可用3’或5’端的任何rna分子。完整的环状rna不会进行这种连接‑因此，此步骤仅选择非环状rna。然后将这些产物逆转录并且扩增以生成cdna文库，随后对其进行纯化、质量控制和多路复用。然后在依诺米那公司miniseq机器上对文库进行测序。[0424]以与上述类似的方式，对rpph处理之后的来自体外转录的线性rna产物进行处理以进行测序。[0425]通过以下方式来比较ivt的线性rna产物和凝胶纯化的环状rna制剂中的非环状rna两者的测序结果：将读数取映射回至用于生成环状rna的模板序列并且评价在连接接合点上映射的读取数量。[0426]在此分析中，假设剩余的非环状rna是带切口rna和来自ivt的残余线性rna产物的混合物。在此实例中，如果假设非环状rna仅包含带切口rna，则预计在连接接合点上映射的片段百分比为50％。如果假设非环状rna仅包含来自ivt的剩余线性rna产物，则预计在连接接合点上映射的片段百分比为0％。使用这些统计假设和对照实验，生成了使得能够定量带切口rna的标准曲线。这产生了5.4％的非环状rna为带切口rna的计算结果。[0427]此实例展示了经纯化的环状rna制剂的非环状rna级分的5.4％(w/w)(相当于总rna的1.1％(w/w))是带切口rna。实例6：环状rna制剂中存在的线性rna影响体外的表达水平和持续性[0428]此实例展示了环状rna制剂中线性rna的存在影响环状rna在细胞中的蛋白质表达水平和持续性。[0429]在此实例中，如下生成环状rna。使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段合成未修饰的线性rna。将转录的rna用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，按照制造商的说明用rna5’‑焦磷酸水解酶(rpph，新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化系统纯化。环状rna被设计为包含随有编码高斯萤光素酶(gluc)的orf的ires和两个侧接ires‑orf的间隔子元件。[0430]通过用t4dna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)处理转录的线性rna和dna夹板来生成夹板连接的环状rna。[0431]将连接混合物进行凝胶纯化以去除模板dna、蛋白质、和线性(非环化)rna。在4％变性page上解析rna制剂，并且切除对应于环状rna中的每一种的rna条带。压碎切除的rna凝胶片段，并且用凝胶洗脱缓冲液(0.5mnaoac，1mmedta和0.1％sds)在37℃下洗脱rna。收获上清液，并且通过将凝胶洗脱缓冲液添加至压碎凝胶中再洗脱一次rna，并孵育一小时。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且用乙醇沉淀rna。[0432]在bj成纤维细胞中监测凝胶纯化的环状rna制剂和未纯化的rna制剂在细胞分裂期间的持续性。使用基于脂质的转染试剂(赛默飞世尔科技公司(lmrna003))，将96孔板中的细胞用等量的凝胶纯化的环状rna制剂或未纯化的rna制剂悬浮(反向)转染。[0433]按照制造商的说明，使用萤光素酶测定(赛默科技皮尔斯公司，16158)在施用后6小时和1‑5天监测高斯萤光素酶活性以作为蛋白质表达测量值。简而言之，将1x腔肠素底物添加至来自转染孔的细胞上清液中。在添加底物后立即在发光检测仪(普洛麦格公司)上读取板。[0434]与用未纯化的rna转染的细胞相比，以更高水平并且在更长时间段内检测到来自用凝胶纯化的环状rna制剂转染的细胞的蛋白质表达(图4)。在5天的时程内，与未纯化的rna相比，在纯化的环状rna制剂的情况下检测到高约100倍的发光(rlu)。实例7：环状rna制剂中存在的线性rna以剂量依赖性方式影响在细胞中的表达[0435]此实例展示了环状rna制剂中的线性rna以剂量依赖性方式负面影响表达。[0436]在此实例中，如下生成环状rna和线性rna。使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段合成未修饰的线性rna。将转录的rna用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，按照制造商的说明用rna5’‑焦磷酸水解酶(rpph，新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化系统纯化。环状rna被设计为包含随有编码高斯萤光素酶(gluc)的orf的ires和两个侧接ires‑orf的间隔子元件。[0437]通过用t4dna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)处理转录的线性rna和dna夹板来生成夹板连接的环状rna。[0438]为了纯化环状rna，在4％变性page上解析连接混合物，并且切除对应于环状rna中的每一种的rna条带。使用相同的4％变性page凝胶纯化线性rna。压碎切除的rna凝胶片段(线性或环状)，并且用凝胶洗脱缓冲液(0.5mnaoac，1mmedta和0.1％sds)在37℃下洗脱rna。收获上清液，并且通过将凝胶洗脱缓冲液添加至压碎凝胶中再洗脱一次rna，并孵育一小时。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且用乙醇沉淀rna。[0439]通过监测bj成纤维细胞中的细胞分裂来确定在具有凝胶纯化的环状rna的制剂中不同水平的线性rna对应物的影响。使用基于脂质的转染试剂(赛默飞世尔科技公司(lmrna003))，用凝胶纯化的环状rna制剂或等量的但补充有不同水平的线性rna的凝胶纯化的环状rna制剂悬浮(反向)转染96孔板中的细胞。按照制造商的说明，使用萤光素酶测定(赛默科技皮尔斯公司，16158)在施用后6小时和1‑5天监测高斯萤光素酶活性以作为蛋白质表达的量度。简而言之，将1x腔肠素底物添加至来自转染孔的细胞上清液中。在添加底物后立即在发光检测仪(普洛麦格公司)上读取板。[0440]与用组合的环状rna和线性rna转染的细胞的相比，以剂量依赖性方式在更长的时间段内检测到用单独的凝胶纯化的环状rna制剂转染的细胞的蛋白质表达(图5)。单独的经纯化的环状rna的水平在120小时的时程内保持稳定，然而，具有环状rna和线性rna两者的rna制剂的水平随时间下降，并且下降速率与线性rna的水平成比例。令人惊讶的是，即使用等量的环状rna转染细胞并且一些样品含有两倍多的编码rna(环状与线性组合)，线性rna的渐增水平随时间反向影响蛋白质表达水平，甚至在环状rna量保持不变的时候也是如此。[0441]此实例展示了具有降低水平的线性rna的环状rna具有改善的表达，例如改善的表达寿命。实例8：环状rna制剂中的线性rna影响表达水平和时间(凝胶成像)[0442]此实例展示了环状rna制剂中线性rna的存在改变体内的蛋白质水平和持续性。[0443]在此实例中，如下生成环状rna。使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段合成未修饰的线性rna。将转录的rna用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，按照制造商的说明用rna5’‑焦磷酸水解酶(rpph，新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化系统纯化。环状rna被设计为包含随有编码纳米萤光素酶(nluc)的orf的ires和两个侧接ires‑orf的间隔子元件。[0444]通过用t4dna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)处理转录的线性rna和dna夹板来生成夹板连接的环状rna。[0445]为了纯化环状rna，在4％变性page上解析连接混合物，并且切除对应于环状rna中的每一种的rna条带。压碎切除的rna凝胶片段，并且用凝胶洗脱缓冲液(0.5mnaoac，1mmedta和0.1％sds)在37℃下洗脱rna。收获上清液，并且通过将凝胶洗脱缓冲液添加至压碎凝胶中再洗脱一次rna，并孵育一小时。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且用乙醇沉淀rna。通过6％变性page分析洗脱的环状rna。将凝胶用sybr‑绿染色并且通过e‑凝胶成像仪可视化。通过imagej测量和分析可视化凝胶上的条带强度(图6)。[0446]通过e‑凝胶成像比较单独制剂中显示环状和线性rna的rna条带。通过尿素page凝胶分析定量环状和线性rna含量。简而言之，针对单独制剂中线性和环状rna物种的相对量分析凝胶。如下计算环状rna含量的百分比：环状rna的量除以总rna量(环状 线性rna)。circrna的百分比在泳道a中是79.5％，并且在泳道b中是53.9％，并且在泳道c中是44.8％。[0447]经由静脉内(iv)尾静脉施用，向balb/c小鼠注射包含具有nlucorf的环状rna、或作为对照的线性rna的制剂。根据制造商的说明，使动物接受在基于脂质的转染试剂(麦鲁斯公司(mirus))中配制的单剂10pmol总rna。[0448]在rna施用后24小时，向小鼠ip注射40ugfurimazine(普洛麦格公司，n1120；20ul底物，80ulpbs/剂量)，并且在孵育10分钟后使用生物发光图像采集来采集图像。在给予后第14天，向动物腹膜内注射40ugfurimazine(普洛麦格公司，n1120，20ul底物，80ulpbs/剂量)，处死动物，并且然后收集肝脏。在收获后立即使用生物发光图像采集对肝脏成像2分钟。使用生物发光图像采集来测量由线性和环状rna表达的纳米荧光素酶的存在。使用livingimage4.3.1(珀金埃尔默公司(perkinelmer)，马萨诸塞州)软件分析图像。将全身固定体积的roi放置在每只单独动物的俯卧和仰卧图像上，并且根据动物标识进行标记。计算并导出所有roi的总通量(光子/秒)以有利于组间分析。[0449]与线性rna或具有大约44.8％或大约53.9％环状rna的制剂相比，具有79.5％环状rna的制剂在24小时显示出较高的体内表达。另外，当在施用后14天在肝脏中离体分析较高百分比环状rna制剂的荧光素酶表达时，大约79.5％环状rna制剂的表达得以保持，但大约44.8％或约53.9％环状rna制剂的表达未得以保持。[0450]因此，环状rna制剂中线性rna的存在影响体内的表达和持续性。实例9：经由使用生物素标记的腺苷对线性rna的聚腺苷酸化和随后的链霉亲和素介导的捕获，从制剂中富集环状rna[0451]此实例展示了从包含含有相同核苷酸序列的环状rna和线性rna对应物的混合池的制剂中富集环状rna。[0452]使用聚(a)聚合酶对rna进行聚腺苷酸化导致将3’聚腺嘌呤尾添加至rna。此过程需要rna的3’端可用于缀合。在rna被环化的情况下，不存在这种游离端。聚(a)聚合酶还可以掺入修饰的腺嘌呤，诸如生物素化n6‑atp类似物。这使得能够使用生物素‑链霉亲和素结合系统下拉生物素化、聚腺苷酸化的线性rna。因此，可以在下拉中使用此生物素‑链霉亲和素结合系统捕获生物素化、聚腺苷酸化线性rna对应物，包括其任何片段(诸如单核糖核苷酸)。[0453]在此实例中，从使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段产生的线性rna生成环状rna(长度为1.2kb)。将转录的rna用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，按照制造商的说明用rna5’‑焦磷酸水解酶(rpph，新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化系统纯化。使用夹板dna和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的线性rna环化。[0454]在连接之后，环状rna和线性rna的混合物存在于具有夹板dna的溶液中。使用具有所提供的反应缓冲液(40mmtris‑hcl，ph8.0，10mmmgso4，10mmcacl2)的dna酶i[普洛麦格公司，m610a]，使用dna酶i消化剩余的夹板。将此反应物在37℃下孵育30分钟。经由monarchrna净化试剂盒[新英格兰生物学实验室公司，#t2040l]从反应混合物分离rna。[0455]对于聚腺苷酸化反应，将2.5ug连接后、dna酶i处理后的rna与酵母聚(a)聚合酶[赛默飞世尔科技公司，74225z25ku]在丰富生物素化n6‑atp类似物[耶纳生物科学公司(jenabioscience)，nu‑805‑bio]以及所提供的反应缓冲液(100mmtris‑hcl，ph7.0，3.0mmmncl2，0.1mmedta，1mmdtt，500μg/ml乙酰化bsa，50％甘油)存在时一起孵育。将反应物在37℃下孵育30分钟。经由monarchrna净化试剂盒[新英格兰生物学实验室公司，#t2030l]从反应混合物分离rna。[0456]为了去除聚腺苷酸化线性rna，将来自聚腺苷酸化反应的0.5ugrna通过用2x结合/洗涤缓冲液(10mmtris‑hcl，ph7.5，1mmedta，2mnacl)一对一稀释进行平衡，并且与5ul预平衡的myone链霉亲和素dynabeadsc1[赛默飞世尔科技公司，65001]珠浆液一起孵育。经由两分钟暴露于磁性支架从上清液中分离珠。通过a260吸光度(nanodrop)分析上清液的rna含量，并且通过6％尿素page分析上清液的rna连接产物提高。使用伯乐公司(biorad)imagelab手动定量所有分析样品的相对条带强度。[0457]在此实例中，通过测量6％尿素page凝胶中的条带强度计算环状rna与线性rna的比率。对条带的定量示出于图7中：在纯化之前，42.6％的rna产物是环状rna，并且57.4％的rna产物是线性rna(未纯化的rna)；在纯化之后，50.4％的rna产物是环状rna，并且49.6％的rna产物是线性rna(经纯化的circrna)。此实例展示了在利用使用生物素化腺嘌呤类似物对线性rna进行聚腺苷酸化之后对线性rna进行链霉亲和素介导的下拉的情况下，含有相同核苷酸序列的环状rna和线性rna对应物的混合池中的环状rna增加8％。实例10：环状rna制剂中存在的线性rna的减少增加编码蛋白质的表达[0458]此实例展示了减少主要为环状rna的组合物中存在的线性rna增加编码蛋白质在细胞中的表达。[0459]对于此实例，环状rna包括ires、编码高斯萤光素酶(gluc)的orf、和两个侧接ires‑orf的间隔子元件。[0460]生成两个批次环状rna。在每种情况下，在体外生成环状rna。从包含以上列出的所有基序以及用于驱动转录的t7rna聚合酶启动子的dna模板体外转录未修饰的线性rna。将转录的rna用rna净化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’‑磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化柱纯化。使用夹板dna5’‑ggctattcccaatagccgtt‑3’和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的线性rna环化。将环状rna进行尿素‑page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠，0.1％sds，1mmedta)中洗脱，乙醇沉淀，并且重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。[0461]线性rna保留在最终的环状rna产品中。通过以下方式对每个批次的最终产品中环状rna的纯度和剩余线性rna的百分比进行定量：在6％tbe‑尿素凝胶上运行最终产品并且使用imagej分析条带。通过计算circrna相比于总rna强度的强度来评估circrna纯度，并且将其以百分比表示。在此，批次具有71％纯度和84％纯度。[0462]将0.2pmol每个rna批次用于细胞转染。根据制造商的建议，将rna与optimem和messengermax合并。类似地制备仅媒介物对照但不含任何rna。在时间＝0时，将每种制剂添加至bj成纤维细胞中。[0463]使用高斯萤光素酶活性测定(赛默科技皮尔斯公司)测试高斯萤光素酶的活性。将20μl细胞上清液的样品添加至96孔板(康宁公司(corning)3990)中。在转染后6、24、48、72、96和120小时获取样品。简而言之，将1x腔肠素底物添加至每个孔中。在添加底物并混合后立即在发光检测仪器(普洛麦格公司)中读取板。[0464]在转染后6、24、48、72、96和120小时，在使用具有84％纯度的环状rna的实验中在细胞中检测到高斯萤光素酶活性(图8)，并且高于仅媒介物对照所提供的表达。衍生自具有84％纯度的环状rna的表达显著高于衍生自具有71％纯度的环状rna的表达。在转染后24小时，与转染具有71％纯度的环状rna时相比，转染具有84％纯度的环状rna时的gluc活性高397倍。在转染后6、24、48和72小时，在使用具有71％纯度的环状rna的实验中在细胞中检测到gluc活性(图8)，并且高于仅媒介物对照所提供的表达。[0465]此实例展示了具有更高纯度(具有减少的线性rna)的环状rna增加并且延长编码蛋白质的表达。实例11：环状rna制剂中存在的线性rna以剂量依赖性方式影响在细胞中的环状rna稳定性[0466]此实例展示了环状rna制剂中的线性rna存在以剂量依赖性方式负面影响环状rna稳定性。[0467]在此实例中，如下生成环状rna和线性rna。使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段合成未修饰的线性rna。将转录的rna用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，按照制造商的说明用rna5'‑焦磷酸水解酶(rpph，新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化系统纯化。环状rna被设计为包含随有编码高斯萤光素酶(gluc)的orf的ires和两个侧接ires‑orf的间隔子元件。[0468]通过用t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)处理转录的线性rna和dna夹板来生成夹板连接的环状rna。[0469]为了纯化环状rna，在4％变性page上解析连接混合物，并且切除对应于环状和线性rna中的每一种的rna条带。压碎切除的rna凝胶片段(线性或环状)，并且用凝胶洗脱缓冲液(0.5mnaoac，1mmedta和0.1％sds)在37℃下洗脱rna。收获上清液，并且通过将凝胶洗脱缓冲液添加至压碎凝胶中再洗脱一次rna，并孵育一小时。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且用乙醇沉淀rna。[0470]通过监测bj成纤维细胞中的环状rna水平来确定在凝胶纯化的环状rna的制剂中不同水平的线性rna对应物的影响。使用基于脂质的转染试剂(赛默飞世尔科技公司(lmrna003))，用凝胶纯化的环状rna制剂或等量的补充有不同水平的凝胶纯化线性rna的凝胶纯化的环状rna制剂转染96孔板中的细胞。在转染后6小时和1‑5天通过circrna特异性q‑pcr分析环状rna水平。简而言之，使用powersybr绿细胞至ct试剂盒(赛默飞世尔科技公司，目录号4402953)并且按照制造商的说明，通过随机引发从细胞裂解物中生成cdna。使用外向引物设计进行q‑pcr，以仅扩增circrna而不扩增其线性对应物，并且使用pfaffl方法、使用β‑肌动蛋白作为管家基因计算倍数变化。[0471]与用组合的环状rna和线性rna转染的细胞相比，以剂量依赖性方式在用单独的凝胶纯化的环状rna制剂转染的细胞中以更高的量在更长的时间段内检测到环状rna(图9)。单独的经纯化的环状rna的水平在120小时的时程内保持稳定；然而，在用环状rna和线性rna两者的组合转染的细胞中检测到的环状rna水平随时间而下降，并且下降速率与线性rna的水平成比例。令人惊讶的是，即使用等量的环状rna转染细胞，线性rna的存在也会随时间反向影响环状rna水平。[0472]此实例展示了从线性rna中纯化环状rna影响环状rna稳定性。实例12：环状rna制剂中存在的线性rna以剂量依赖性方式影响在细胞中的先天性免疫应答[0473]此实例展示了环状rna制剂中存在的线性rna以剂量依赖性方式负面影响先天性免疫应答。[0474]在此实例中，如下生成环状rna和线性rna。使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段合成未修饰的线性rna。将转录的rna用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，按照制造商的说明用rna5'‑焦磷酸水解酶(rpph，新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化系统纯化。环状rna被设计为包含随有编码高斯萤光素酶(gluc)的orf的ires和两个侧接ires‑orf的间隔子元件。[0475]通过用t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)处理转录的线性rna和dna夹板来生成夹板连接的环状rna。[0476]为了纯化环状rna，在4％变性page上解析连接混合物，并且切除对应于环状和线性rna中的每一种的rna条带。使用相同的4％变性page凝胶纯化线性rna。压碎切除的rna凝胶片段(线性或环状)，并且用凝胶洗脱缓冲液(0.5mnaoac，1mmedta和0.1％sds)在37℃下洗脱rna。收获上清液，并且通过将凝胶洗脱缓冲液添加至压碎凝胶中再洗脱一次rna，并孵育一小时。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且用乙醇沉淀rna。[0477]通过监测bj成纤维细胞中的环状rna水平来确定在凝胶纯化的环状rna的制剂中不同水平的线性rna对应物的影响。使用基于脂质的转染试剂(赛默飞世尔科技公司(lmrna003))，用凝胶纯化的环状rna制剂、或等量的但补充有不同水平的凝胶纯化线性rna的凝胶纯化的环状rna制剂悬浮(反向)转染96孔板中的细胞。在转染后6小时和1‑5天通过q‑pcr分析免疫基因水平。简而言之，使用powersybr绿细胞至ct试剂盒(赛默飞世尔科技公司，目录号4402953)并且按照制造商的说明，通过随机引发从细胞裂解物中生成cdna。使用免疫基因特异性引物进行q‑pcr，并且使用pfaffl方法和使用β‑肌动蛋白作为管家基因计算相对rna水平。[0478]用单独的凝胶纯化的环状rna制剂转染的细胞中的环状rna显示出有限增加的先天性免疫基因表达。相反地，用组合的环状和线性rna转染的细胞以剂量依赖性方式展示出对先天性免疫基因的上调(图10)。实例13：细胞培养物中的非免疫原性[0479]此实例展示了对细胞转染后环状rna的免疫原性的体内评估。[0480]在此实例中，环状rna被设计为包含加密原(例如，zkscan1内含子)和gfporf。另外，对照环状rna被设计为包含具有和不具有内含子的gfporf，参见图11。在体外或细胞中生成环状rna，如实例1和2中所述。用500ng环状rna转染hela细胞。[0481]环状rna的转染包括以下条件：(1)细胞培养基中的裸环状rna(lingor等人2004)；(2)电穿孔(muller等人2015)；(3)阳离子脂质(snalp、vaxfectin)(chesnoy和huang,2000)；(3)阳离子聚合物(pei、聚凝胺、deae‑右旋糖酐)(turbofect)；(4)病毒样颗粒(hpv的l1、多瘤病毒的vp1)(tonges等人2006)；(5)外来体(sbi的exo‑fect)；(6)纳米结构化磷酸钙(nanocap)(olton等人2006)；(6)肽转导结构域(tat、polyr、sp、pvec、synb1等)(zhang等人2009)；(7)囊泡(vsv‑g、tamel)(liu等人2017)；(8)细胞挤压；(sqz生物技术公司(sqzbiotechnologies))；(9)纳米颗粒(neuhaus等人2016)；和/或(10)磁转染(mair等人2009)。在细胞培养基(dmem10％fbs)中进行转染方法，并且随后将细胞培养24‑48小时。[0482]转染后2‑48小时后，去除培养基，并且通过qrt‑pcr测量指示rna和转染rna的相对表达。[0483]对于qrt‑pcr分析，按照制造商的说明，使用酚基rna分离溶液(trizol)和rna分离试剂盒(凯杰公司(qiagen))从细胞中分离总rna。使用pcr主混合物(brilliantiisybr绿qrt‑pcr主混合物)和pcr循环仪(lightcycler480)一式三份进行qrt‑pcr分析。对熟知的先天性免疫调控剂(诸如rig‑i、mda5、oas、oasl和pkr)的mrna水平进行定量，并且相对于肌动蛋白、gapdh或hprt值进行归一化。通过转染rna的水平归一化用于环状rna转染的指示rna基因的相对表达，并且与不包含一种或多种加密原的环状rna转染细胞的表达水平进行比较。[0484]如以上实例6中所述，除了qrt‑pcr分析之外，还使用蛋白质印迹分析和免疫组织化学法来评估gfp表达效率。[0485]预期含有一种或多种加密原的gfp阳性细胞将显示出减弱的免疫原性应答。[0486]另外，将(1)原代鼠树突细胞；(2)稳定表达tlr‑7、8或9的人胚肾293细胞(因韦基因公司(invivogen))；(3)单核细胞衍生的树突细胞(澳赛尔斯公司(allcells))或(4)未加工的264.7细胞用包含zkscan1或td内含子的dna质粒转染，从而产生如上所述的编码gfp的环状rna。转染后6‑48小时后，收集细胞培养物上清液，并且使用elisa测量细胞因子表达。当收集细胞培养物上清液时，收集细胞用于rna印迹、基因表达阵列和facs分析。[0487]对于elisa，使用了针对干扰素‑β(ifn‑β)、趋化因子(c‑c基序)配体5(ccl5)、il‑12(bd生物科学公司(bdbiosciences))、ifn‑α、tnf‑α和il‑8(博知源国际公司(biosourceinternational))的elisa试剂盒。根据制造商的建议进行elisa。将环状rna转染细胞的指示细胞因子的表达与对照rna转染细胞的水平进行比较。预期与对照转染细胞相比，用具有加密原的环状rna转染的细胞将具有降低的细胞因子表达。[0488]关于rna印迹分析。如先前所述对样品进行处理和分析。探针衍生自质粒，并且对人ifn‑α13、ifn‑β(开放生物系统公司(openbiosystems))、tnf‑α、或gapdh(atcc)的编码区具有特异性。预期与对照转染细胞相比，用具有加密原的环状rna转染的细胞将具有降低的细胞因子表达。[0489]对于基因表达阵列，使用酚基溶液(trizol)和/或rna分离试剂盒(rneasy凯杰公司)分离rna。扩增并分析rna(例如依诺米那公司beadstation500gx中的依诺米那公司人ht12v4芯片)。将模拟对照处理的细胞中的水平用作计算倍数增加的基线。预期与对照转染细胞相比，用具有加密原的环状rna转染的细胞将具有降低的细胞因子表达。[0490]对于facs分析，将细胞用针对cd83(研究诊断公司(researchdiagnosticsinc))、hla‑dr、cd80或cd86的直接缀合抗体染色，并且在流式细胞仪上进行分析。预期与对照转染细胞相比，用具有加密原的环状rna转染的细胞将显示出这些标记物的降低表达。实例14：用于选择性表达的核糖开关[0491]此实例展示了控制环状rna的体内蛋白质表达的能力。[0492]对于此实例，环状rna被设计为包含一种或多种加密原(seqidno:4)、调控编码gfp的orf(seqidno:2)的表达的合成核糖开关(seqidno:9)，具有侧接gfporf的交错元件(2a序列)(seqidno:3)，参见图12。在体外或细胞中生成环状rna，如国际专利公开号wo2019118919a1的[0356]‑[0365]中所述的实例1和2及其相应图中所述，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。[0493]茶碱诱导核糖开关的激活，从而导致基因表达的开关关闭(如auslander等人2010年所述)。预期核糖开关控制环状rna的gfp表达。在茶碱存在时，预期不会观察到gfp表达。[0494]在茶碱依赖性合成核糖开关(seqidno:9)的控制下，用500ng所述的编码gfp的环状rna转染hela细胞，以评估选择性表达。转染方法在实例7中描述。[0495]在37℃和5％co2下培养24小时后，用和不用浓度范围为1nm‑3mm的茶碱处理细胞。连续培养24小时后，将细胞在4％多聚甲醛中在室温下固定15分钟，并且用在含0.2％洗涤剂的pbs中的10％fbs封闭并透化45分钟。然后将样品与针对gfp的一抗(英杰公司)和与alexa488和dapi缀合的二抗(英杰公司)在含10％fbs和0.1％洗涤剂的pbs中在室温下孵育2小时，或在4℃下孵育过夜。然后用pbs洗涤细胞，并且随后使用荧光显微镜分析gfp表达。实例15：体内非免疫原性[0496]此实例展示了对细胞转染后环状rna的免疫原性的体内评估。[0497]此实例描述了在施用具有加密原(在此情况下为内含子)的环状rna后免疫应答的定量和比较，参见图13。在一个实施例中，与对照相比，在一次或多次施用环状rna后，具有加密原的环状rna中的任一种将具有降低的(例如，与施用对照rna相比降低的)免疫原性应答。[0498]环状rna的免疫原性的量度是血清中的细胞因子水平。[0499]在此实例中，在一次或多次施用环状rna之后检查细胞因子血清水平。将来自前述实例中任一个的环状rna经由皮内(id)、肌肉内(im)、口服(po)、腹膜内(ip)、或静脉内(iv)施用至6‑8周龄的balb/c小鼠。从不同的群组抽取血清：对小鼠进行全身和/或局部注射，一次或多次注射具有加密原的环状rna和不带有加密原的环状rna。[0500]将收集的血清样品在pbs中稀释1‑10倍，并且通过酶联免疫吸附测定(pbl生物化学实验室(pblbiomedicallabs)，新泽西州皮斯卡塔韦市(piscataway,nj))和tnf‑α(安迪生物公司(r&d)，明尼苏达州明尼阿波利斯市(minneapolis,mn))分析小鼠的ifn‑α。[0501]除血清中的细胞因子水平之外，炎性标记物的表达是免疫原性的另一种量度。在此实例中，在施用后1、4和24小时，将收获来自用媒介物(无环状rna)、线性rna或环状rna处理的小鼠的脾组织。将使用以下技术对样品进行分析：qrt‑pcr分析、rna印迹或facs分析。[0502]对于qrt‑pcr分析，如先前所述定量rig‑i、mda5、oas、oasl、tnf‑α和pkr的mrna水平。[0503]关于rna印迹分析。如上所述，对样品进行处理并分析ifn‑α13、ifn‑β(开放生物系统公司)、tnf‑α或gapdh(atcc)。[0504]对于facs分析，将细胞用针对cd83(研究诊断公司)、hla‑dr、cd80或cd86的直接缀合抗体染色，并且在流式细胞仪上进行分析。[0505]在一个实施例中，与对照rna相比，在一次或多次施用后，具有加密原的环状rna将具有降低的细胞因子水平(如通过elisa、rna印迹、facs和/或qrt‑pcr测量的)。实例16：环状rna包含至少一个双链rna区段[0506]此实例展示了环状rna包含至少一个双链rna区段。[0507]在此实例中，通过先前所述方法之一合成环状rna，以包括gfporf和ires，参见图14。将利用j2和k1单克隆抗体的斑点印迹测定来测量长度为至少40bp的双链rna结构。将环状rna(200ng)印迹到尼龙膜(超负荷nytran)上，干燥，用在tbs‑t缓冲液(50mmtris‑hcl，150mmnacl，0.05％tween‑20，ph7.4)中的5％脱脂干乳粉封闭，并且与dsrna特异性mabj2或k1(英语和科学咨询公司(english&scientificconsulting))一起孵育60min。将膜用tbs‑t洗涤六次，然后用hrp缀合驴抗小鼠ig(杰克森免疫公司(jacksonimmunology))处理，然后洗涤六次，并且使用增强的化学发光蛋白质印迹检测试剂(安玛西亚公司(amersham))可视化斑点。[0508]预期环状rna产生内部准双链rna区段。实例17：环状rna包含准双链结构[0509]此实例展示了环状rna包含准双链结构。7.0)、25mmkcl、10mmnacl、0.1g/l牛血清白蛋白(新英格兰生物学实验室公司)、5％甘油、0.5mmdtt、0.2u/lrna酶抑制剂(应用生物系统公司)和1mm苯基甲基磺酰氟溶液的25ul中进行结合反应。将环状rna与浓度范围为从0‑110nm的hdag蛋白(如通过defenbaugh等人2009所述获得)一起孵育。将反应混合物在冰上组合，在37℃下孵育1h，并且在240v下在0.5tris‑硼酸酯‑edta中的6％天然聚丙烯酰胺凝胶上电泳2.5h。使用核酸染色(例如，gelred)测定游离和结合rna的水平。结合将计算为相对于整个泳道强度减去背景的未结合rna强度。[0519]预期环状rna将具有功能性准螺旋结构。实例19：自转录/复制[0520]在此实例中，通过先前所述方法之一合成环状rna，其中添加一个或多个hdv复制结构域的表达(如通过beeharry等人2014所述)、有反基因组复制能力的核酶和核定位信号。这些rna序列使环状rna位于其中宿主rna聚合酶将结合并转录rna的核中。然后，使用核酶使此rna自裂解。然后将rna连接并再次自复制，参见图17。[0521]使用上述技术将环状rna(1‑5微克)转染至hela细胞中。将hela细胞在37℃和5％co2下，在补充有青霉素‑链霉素和10％胎牛血清、含高葡萄糖的杜尔贝科氏改良伊格培养基(dmem)(生命技术公司(lifetechnologies))中生长。在转染后，将hela细胞再培养4‑72小时，然后在转染后1小时至20天，按照制造商的说明，使用酚基rna分离试剂(生命技术公司)从转染细胞中分离总rna，并且将使用如本文所述的qpcr确定编码hdv结构域的环状rna的总量并与对照环状rna进行比较。实例20：子细胞中的环状rna保留[0522]在此实例中，通过先前所述方法之一合成环状rna。环状rna被设计为包含加密原(seqidno:4)和编码gfp的orf(seqidno:2)，具有侧接gfporf的交错元件(seqidno:3)，参见图18。[0523]在37℃下、在5％co2下，在组织培养处理板上，使人成纤维细胞(例如imr‑90)在补充10％胎牛血清(fbs；英杰公司)的杜尔贝科氏改良伊格培养基(dmem；英杰公司)中生长。将细胞定期传代以维持指数生长。将脂质转染试剂(2μl；英杰公司)添加至12孔组织培养处理板的一个孔中的1μg环状rna或线性rna(如上所述)和145μl还原血清培养基(opti‑memi溶液)的混合物中。在室温下孵育15min后，将悬浮在含10％fbs的dmem中的约1×10^5个hela细胞添加至环状rna溶液中(如上所述)。在37℃和5％co2下孵育24h后，用brdu(例如西格玛奥德里奇公司(sigma‑aldrich))脉冲处理细胞。根据每种细胞的特定群体倍增时间优化其brdu标记时间，例如，如elabd等人2013年所述，imr‑90人成纤维细胞的倍增时间为27小时，并且脉冲8‑9小时。[0524]将在brdu脉冲后的第1、2、3、4、5和10天收集细胞。将分离这些细胞的一个亚群用于q‑rt‑pcr，并且另一个亚群用于facs分析。为了测量gfp环状rna和mrna水平，使用随机六聚体进行qpcr逆转录，如国际专利公开号wo2019118919a1的[0360]‑[0365]中所述的实例2及其相应图中所述，将该国际专利公开通过援引以其全文并入本文。如本文所述，将使用brdu和gfp抗体通过facs分析细胞。[0525]预期环状rna将在子细胞中持续存在，并且子细胞将表达gfp蛋白。实例21：环状rna环化[0526]此实例展示了使用夹板连接体外产生环状rna。[0527]可以将非天然存在的环状rna工程化以包含一种或多种所期望的特性，并且可以使用重组dna技术来产生。如以下实例中所示，夹板连接环化线性rna。[0528]circrna1被设计为编码没有终止密码子的三联flag标签化egf(264nt)。它在用于翻译起始的起始密码子处具有科扎克序列(seqidno:11)。cirrna2具有与环状rna1相同的序列，除了它具有终止元件(三联终止密码子)(273nt，seqidno:12)。环状rna3被设计为编码如下的三联flag标签化egf，其侧接交错元件(2a序列，seqidno:13)、无终止元件(终止密码子)(330nt)。circrna4具有与环状rna3相同的序列，除了它具有终止元件(三联终止密码子)(339nt)。[0529]在此实例中，如下生成环状rna。从gblocks基因片段中扩增出用于体外转录的dna模板，该基因片段具有有着带有t7启动子的正向引物的相应序列(idt)和有着反向引物的2‑o‑甲基化核苷酸。用dna凝胶纯化试剂盒(凯杰公司)对扩增的dna模板进行凝胶纯化。将250‑500ng经纯化的dna模板进行体外转录。在7.5mmgmp、1.5mmgtp、7.5mmutp、7.5mmctp和7.5mmatp存在时，使用来自具有相应序列的每个dna模板的t7rna聚合酶生成线性5'‑单磷酸化的体外转录物。每个反应中生成约40μg线性rna。孵育后，将每个反应用dna酶处理以去除dna模板。在2.5m乙酸铵存在时，用乙醇沉淀体外转录的rna，以去除未掺入的单体。[0530]使用t4rna连接酶2，在作为模板的20nt夹板dna寡聚体(seqidno:14)上环化转录的线性rna。夹板dna被设计为使线性rna的每个5’或3’端退火10nt。用夹板dna(3μm)退火之后，将1μm线性rna与0.5u/μlt4rna连接酶2在37c下孵育4小时。将无t4rna连接酶2的混合物用作阴性对照。[0531]通过在6％变性page上分离rna来监测线性rna的环化。在变性聚丙烯酰胺凝胶上，较慢迁移的rna条带(由于其环状结构)对应于环状rna，而不是线性rna。如图19中可见，向rna混合物中添加连接酶( 泳道)生成新的条带，这些条带出现在存在于缺少连接酶(‑泳道)的混合物中的线性rna条带之上。在所有rna混合物中均出现较慢迁移的条带，这表明与阴性对照相比，多种构建体成功发生了夹板连接(例如，环化)。实例22：rna环化效率[0532]此实例展示了rna夹板连接的环化效率。[0533]工程化以包含一种或多种所期望特性的非天然存在环状rna可以使用夹板介导的环化产生。如以下实例中所示，夹板连接环化的线性rna的效率高于对照。[0534]也在此处使用如实例21中所述的circrna1、circrna2、circrna3、和circrna4。circrna5被设计为编码如下的flag标签化egf，其侧接2a序列且后接flag标签化纳米萤光素酶(873nt，seqidno:17)。circrna6具有与环状rna5相同的序列，除了它在egf与纳米萤光素酶基因之间包括终止元件(三联终止密码子)和在纳米萤光素酶序列端部包括终止元件(三联终止密码子)(762nt，seqidno:18)。[0535]在此实例中，为了测量rna的环化效率，如实例1中所述生成6种不同大小的线性rna(264nt、273nt、330nt、339nt、873nt和762nt)并环化。通过6％变性page解析环状rna，并且切除凝胶上线性rna或环状rna的相应rna条带用于纯化。压碎切除的rna凝胶条带，并且用800μl300mmnacl过夜洗脱rna。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且在0.3m乙酸钠存在时用乙醇沉淀rna。[0536]如下计算环化效率。将洗脱的环状rna的量除以总洗脱rna量(环状 线性rna)，并且结果如图20中的图所描绘。[0537]使用t4rna酶连接酶2连接线性rna产生环状rna的效率高于对照。趋势数据表明，较大的构建体以较高的速率环化，例如，具有约800nt的线性rna显示出具有约80％的环化效率，而具有约200‑400nt的线性rna显示出具有在50％至80％范围内的环化效率。实例23：缺少降解易感性的环状rna[0538]此实例展示了与线性rna相比，环状rna对rna酶r降解的易感性。[0539]由于缺少5’和3’端，环状rna比线性rna对核酸外切酶降解更具抗性。如以下实例中所示，环状rna比其线性rna对应物更不易降解。[0540]如实例22中所述生成circrna5并环化以用于本文所述的测定中。[0541]为了测试circrna5的环化，将20ng/μl线性或circrna5与2u/μlrna酶r(一种消化线性rna但不消化套索或环状rna结构的3'至5'外切核糖核酸酶)一起在37℃下孵育30min。孵育后，通过6％变性page分析反应混合物。[0542]circrna5泳道中不存在缺少核酸外切酶的泳道中存在的线性rna条带(参见图21)，这表明circrna5与线性rna对照相比显示出对核酸外切酶处理的更高抗性。实例24：环状rna的分离和纯化[0543]此实例展示了使用尿素凝胶分离的环状rna纯化。[0544]如本文所述分离如实例19和20中所述的circrna1、circrna2、circrna3、circrna4、circrna5、和circrna6。[0545]在此实例中，如所述生成线性和环状rna。为了纯化环状rna，在6％变性page上解析连接混合物，并且切除对应于环状rna中的每一种的rna条带。压碎切除的rna凝胶片段，并且用800μl300mmnacl过夜洗脱rna。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且在0.3m乙酸钠存在时用乙醇沉淀rna。通过6％变性page分析洗脱的环状rna，参见图22。[0546]通过page可视化具有可变大小的环状rna的单条条带。实例25：蛋白质表达的检测[0547]此实例展示了环状rna的体外蛋白质表达。[0548]蛋白质表达是由mrna生成特定蛋白质的过程。此过程包括将dna转录成信使rna(mrna)，随后将mrna翻译成多肽链，这些多肽链最终被折叠成功能性蛋白，并且可以靶向至特定的亚细胞或细胞外位置。[0549]如以下实例中所示，由环状rna序列体外表达蛋白质。[0550]环状rna被设计为编码如下的三联flag标签化egf，其侧接2a序列、无终止元件(终止密码子)(330nt，seqidno:19)。[0551]将线性rna或环状rna在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成含有70％兔网织红细胞裂解物、20μm氨基酸、0.8u/μlrna酶抑制剂和1μg线性rna或环状rna。孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物溶解于30°l的2xsds样品缓冲液中，并且在70℃下孵育15min。以1400xg离心5min后，在10％‑20％梯度聚丙烯酰胺/sds凝胶上分析上清液。[0552]使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗flag抗体和抗小鼠igg过氧化物酶一起孵育。用ecl试剂盒可视化印迹(参见图23)并且通过imagej测量蛋白质印迹条带强度。[0553]检测到荧光，这表明存在表达产物。因此，显示了环状rna驱动蛋白质的表达。实例26：非ires依赖性表达[0554]此实例展示了在不存在ires时环状rna驱动表达。[0555]ires或内部核糖体进入位点是允许以非帽依赖性方式进行翻译起始的rna元件。显示了在不存在ires时环状rna驱动flag蛋白的表达。[0556]环状rna被设计为编码如下的三联flag标签化egf，其侧接2a序列、无终止元件(终止密码子)(330nt，seqidno:19)。[0557]将线性rna或环状rna在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、20μm氨基酸、0.8u/μlrna酶抑制剂和1μg线性rna或环状rna。孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物溶解于30°l的2xsds样品缓冲液中，并且在70℃下孵育15min。以1400xg离心5min后，在10％‑20％梯度聚丙烯酰胺/sds凝胶上分析上清液。[0558]使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗flag抗体和抗小鼠igg过氧化物酶一起孵育。用增强化学发光(ecl)试剂盒可视化印迹(参见图23)并且通过imagej测量蛋白质印迹条带强度。[0559]即使在不存在ires时，在环状rna反应混合物中也检测到表达产物。实例27：非帽依赖性表达[0560]此实例展示了在不存在帽时环状rna能够驱动表达。[0561]帽是mrna的5’端上经过特别改变的核苷酸。5’帽对于线性mrna的稳定性和翻译起始很有用。环状rna在不存在帽时驱动产物的表达。[0562]环状rna被设计为编码如下的三联flag标签化egf，其侧接2a序列、无终止元件(终止密码子)(330nt，seqidno:19)。[0563]将线性rna或环状rna在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、20μm氨基酸、0.8u/μlrna酶抑制剂和1μg线性rna或环状rna。孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物在70℃下溶解于30μl2xsds样品缓冲液中15min。以1400xg离心5min后，在10％‑20％梯度聚丙烯酰胺/sds凝胶上分析上清液。[0564]使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗flag抗体和抗小鼠igg过氧化物酶一起孵育。用ecl试剂盒可视化印迹(参见图23)并且通过imagej测量蛋白质印迹条带强度。[0565]即使在不存在帽时，在环状rna反应混合物中也检测到表达产物。实例28：无5’‑utr的表达[0566]此实例展示了缺少5’非翻译区的环状rna的体外蛋白质表达。[0567]5′非翻译区(5′utr)是起始密码子直接上游的区域，该区域有助于rna转录物的下游蛋白质翻译。[0568]如以下实例中所示，环状rna序列中的5’‑非翻译区对于体外蛋白表达不是必需的。[0569]环状rna被设计为编码如下的三联flag标签化egf，其侧接2a序列、无终止元件(终止密码子)(330nt，seqidno:19)。[0570]将线性rna或环状rna在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、20μm氨基酸、0.8u/μlrna酶抑制剂和1μg线性rna或环状rna。孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物溶解于30°l的2xsds样品缓冲液中，并且在70℃下孵育15min。以1400xg离心5min后，在10％‑20％梯度聚丙烯酰胺/sds凝胶上分析上清液。[0571]使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗flag抗体和抗小鼠igg过氧化物酶一起孵育。用ecl试剂盒可视化印迹(参见图23)并且通过imagej测量蛋白质印迹条带强度。[0572]即使在不存在5’utr时，在环状rna反应混合物中也检测到表达产物。实例29：无3’‑utr的表达[0573]此实例展示了缺少3’‑utr的环状rna的体外蛋白表达。[0574]3’非翻译区(3'‑utr)是翻译终止密码子直接下游的区域，并且包括可在转录后影响基因表达的调控区。3'‑非翻译区还可以通过影响mrna的定位、稳定性、输出和翻译效率在基因表达中发挥作用。另外，3'‑utr的结构特征及其替代的聚腺苷酸化的用途可以在基因表达中起作用。[0575]如以下实例中所示，环状rna序列中的3’‑utr对于体外蛋白表达不是必需的。[0576]环状rna被设计为编码如下的三联flag标签化egf，其侧接2a序列、无终止元件(终止密码子)(330nt，seqidno:19)。[0577]将线性rna或环状rna在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、20μm氨基酸、0.8u/μlrna酶抑制剂和1μg线性rna或环状rna。孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物溶解于30°l的2xsds样品缓冲液中，并且在70℃下孵育15min。以1400xg离心5min后，在10％‑20％梯度聚丙烯酰胺/sds凝胶上分析上清液。[0578]使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗flag抗体和抗小鼠igg过氧化物酶一起孵育。用ecl试剂盒可视化印迹(参见图23)并且通过imagej测量蛋白质印迹条带强度。[0579]即使在不存在3’utr时，在环状rna反应混合物中也检测到表达产物。实例30：无终止元件(终止密码子)的表达[0580]此实例展示了缺少终止元件(终止密码子)的环状rna在滚环翻译后多肽产物的生成。[0581]蛋白质基于多肽，这些多肽由独特的氨基酸序列组成。每个氨基酸均由称为密码子的核苷酸三联体在mrna中编码。蛋白质翻译期间，mrna中的每个密码子都对应于正在增长的多肽链中氨基酸的添加。终止元件或终止密码子通过结合释放因子来指示此过程的终止，该终止导致核糖体亚基解离，释放氨基酸链。[0582]如以下实例中所示，缺少终止密码子的环状rna经由滚环翻译生成了由重复的多肽序列构成的大型多肽产物。[0583]环状rna被设计为编码无终止元件(终止密码子)的三联flag标签化egf(264nt，seqidno:20)，并且在起始密码子处包括科扎克序列以促进翻译起始。[0584]将线性rna或环状rna在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、20μm氨基酸、0.8u/μlrna酶抑制剂和1μg线性rna或环状rna。孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物溶解于30°l的2xsds样品缓冲液中，并且在70℃下孵育15min。以1400xg离心5min后，在10％‑20％梯度聚丙烯酰胺/sds凝胶上分析上清液。[0585]使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗flag抗体和抗小鼠igg过氧化物酶一起孵育。用ecl试剂盒可视化印迹(参见图24)并且通过imagej测量蛋白质印迹条带强度。[0586]即使在不存在终止元件(终止密码子)时，在环状rna反应混合物中也检测到表达产物。实例31：无终止元件(终止密码子)的离散蛋白质表达[0587]此实例展示了从缺少终止元件(终止密码子)的环状rna翻译的离散蛋白质产物的生成。[0588]交错元件(诸如2a肽)可以包括约20aa的短氨基酸序列，该短氨基酸序列允许单一mrna产生等摩尔水平的多个基因。交错元件可以通过使核糖体跳过2a元件c末端的肽键合成来起作用，导致2a序列端部与下一个下游肽之间的隔开。隔开发生在c末端上发现的甘氨酸与脯氨酸残基之间，并且上游的顺反子在端部添加了一些额外的残基，而下游的顺反子则以脯氨酸开始。[0589]如以下实例中所示，缺少末端元件(终止密码子)的环状rna生成大型多肽聚合物(图16左图：无交错‑环状rna泳道)，并且在编码区的3'端包含2a序列导致产生的离散蛋白质的大小与当量线性rna构建体生成的大小相当(图16右图：交错‑环状rna泳道)。[0590]环状rna被设计为编码如下的三联flag标签化egf，其无终止元件(终止密码子)(264nt，seqidno:20)并且无交错元件。第二环状rna被设计为编码如下的三联flag标签化egf，其侧接2a序列、无终止元件(终止密码子)(330nt，seqidno:19)。[0591]将线性rna或环状rna在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、20μm氨基酸、0.8u/μlrna酶抑制剂和1μg线性rna或环状rna。孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物溶解于30°l的2xsds样品缓冲液中，并且在70℃下孵育15min。以1400xg离心5min后，在10％‑20％梯度聚丙烯酰胺/sds凝胶上分析上清液。[0592]使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗flag抗体和抗小鼠igg过氧化物酶一起孵育。用ecl试剂盒可视化印迹(图25)并且通过imagej测量蛋白质印迹条带强度。[0593]检测到离散的表达产物，这表明即使在不存在终止元件(终止密码子)时，包含交错元件的环状rna也驱动了单独蛋白质的表达。实例32：滚环翻译[0594]此实例展示了使用交错元件提高环状rna的体外蛋白质生物合成。[0595]将非天然存在的环状rna工程化以包含交错元件，以将蛋白质表达与缺少交错元件的环状rna进行比较。如以下实例中所示，与缺少交错元件的其他相同环状rna相比，包含这种序列的circrna过表达了蛋白质。[0596]环状rna被设计为编码具有终止元件(例如，串联的三个终止密码子)的三联flag标签化egf(273nt，seqidno:21)。第二环状rna被设计为编码如下的三联flag标签化egf，其侧接2a序列、无终止元件(终止密码子)(330nt，seqidno:19)。[0597]将线性rna或环状rna在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成含有70％兔网织红细胞裂解物、20μm氨基酸、0.8u/μlrna酶抑制剂和1μg线性rna或环状rna。孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物溶解于30°l的2xsds样品缓冲液中，并且在70℃下孵育15min。以1400xg离心5min后，在10％‑20％梯度聚丙烯酰胺/sds凝胶上分析上清液。[0598]使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗flag抗体和抗小鼠igg过氧化物酶一起孵育。用ecl试剂盒可视化印迹(参见图26)并且通过imagej测量蛋白质印迹条带强度。图27示出了汇总来自从图26中所示的两种示例性环状rna翻译的蛋白质产物的蛋白质印迹分析的信号强度的图，该图展示在滚环翻译期间，与包含终止密码子的circrna相比，包含交错元件且不含终止密码子的circrna的蛋白质表达增加。[0599]检测到离散的表达产物，这表明即使在不存在终止元件(终止密码子)时，包含交错元件的环状rna也驱动了单独蛋白质的表达。实例33：生物活性蛋白质的体外表达[0600]此实例展示了由环状rna体外生物合成生物活性蛋白质。[0601]将非天然存在的环状rna工程化，以表达具有生物活性的治疗性蛋白质。如以下实例中所示，由网织红细胞裂解物中的环状rna表达了生物活性蛋白质。[0602]环状rna被设计为编码如下的flag标签化egf，其侧接2a序列且后接flag标签化纳米萤光素酶(873nt，seqidno:17)。[0603]将线性rna或环状rna在25μl体积中的兔网织红细胞裂解物中在30℃下孵育5小时。反应混合物的最终组成含有70％兔网织红细胞裂解物、20μm氨基酸、0.8u/μlrna酶抑制剂。根据制造商的方案(普洛麦格公司)，使用萤光素酶测定系统监测翻译混合物中的萤光素酶活性。[0604]如图28中所示，在环状rna和线性rna情况下检测到的荧光均远高于对照媒介物rna，这表明存在表达产物。因此，显示了环状rna表达生物活性蛋白质。实例34：具有比线性rna对应物更长半衰期的环状rna[0605]此实例展示了工程化以与线性rna相比具有更长的半衰期的环状rna。[0606]编码治疗性蛋白质的环状rna为受体细胞提供了产生更高水平的编码蛋白质的能力，这起源于例如与线性rna相比延长的生物学半衰期。如以下实例中所示，环状rna在网织红细胞裂解物中具有长于其线性rna对应物的半衰期。[0607]环状rna被设计为编码如下的flag标签化egf，其侧接2a序列且后接flag标签化纳米萤光素酶(873nt，seqidno:17)。[0608]在此实例中，进行了时程实验以监测rna的稳定性。将100ng线性rna或环状rna与兔网织红细胞裂解物一起孵育，并且在1小时、5小时、18小时和30小时收集样品。使用酚基试剂(英杰公司)从裂解物中分离总rna，并且通过逆转录生成cdna。使用基于染料的定量pcr反应混合物(伯乐公司)进行qrt‑pcr分析。[0609]如图29中所示，在较晚的时间点检测到的环状rna浓度大于线性rna，并且环状rna浓度随时间的降低百分比低于线性rna的降低百分比。因此，环状rna与其线性对应物相比更稳定或具有增加的半衰期。实例35：环状rna在细胞中展示了比线性rna更长的半衰期[0610]此实例展示了环状rna被递送至细胞中并且在细胞中具有与线性rna相比增加的半衰期。[0611]将非天然存在的环状rna工程化，以表达具有生物活性的治疗性蛋白质。如以下实例中所示，环状rna与其线性rna对应物相比以更高的水平存在，这展示环状rna的半衰期更长。[0612]在此实例中，环状rna和线性rna被设计为编码科扎克egf，其侧接2a、终止序列或无终止序列(seqidno:11、19、20、21)。为了监测rna在细胞中的半衰期，将0.1x106个细胞铺板至12孔板的每个孔中。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将1μg线性rna或环状rna转染至每个孔中。转染后二十四小时，使用酚基提取试剂(英杰公司)从细胞中分离出总rna。将总rna(500ng)进行逆转录以生成cdna。使用基于染料的定量pcr混合物(伯乐公司)进行qrt‑pcr分析。引物序列如下：用于线性rna或环状rna的引物，f：acgacggtgtgtgcatgtat，r：ttcccaccacttcaggtctc；用于环状rna的引物，f：tacgcctgcaactgtgttgt，r：tcgatgatcttgtcgtcgtc。[0613]环状rna及其线性对应物成功转染至293t细胞中。24小时后，使用qpcr测量剩余的环状rna和线性rna。显示环状rna在转染后24小时在细胞中具有与线性rna相比更高的浓度，这表明环状rna在细胞中具有长于线性rna的半衰期的半衰期(图30a和图30b)。实例36：在细胞中翻译了合成环状rna，并且经由滚环翻译翻译了合成环状rna[0614]此实例展示了在细胞中合成环状rna的翻译。[0615]如以下实例中所示，环状rna和线性rna被设计为编码无终止元件的科扎克3xflag‑egf序列(seqidno:11)。环状rna被翻译成聚合物egf，而线性rna没有，这展示细胞对合成环状rna进行了滚环翻译。[0616]在此实例中，将0.1x106个细胞铺板至12孔板的每个孔中以监测细胞中线性rna或环状rna的翻译效率。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将1μg线性rna或环状rna转染至每个孔中。转染后二十四小时，通过在每个孔中添加200μlripa缓冲液来收获细胞。接下来，在10％‑20％梯度聚丙烯酰胺/sds凝胶上分析10μg细胞裂解物蛋白质。使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗flag抗体和抗小鼠igg过氧化物酶一起孵育。作为上样对照，使用了抗β微管蛋白抗体。用增强的化学发光(ecl)试剂盒可视化印迹。通过imagej测量蛋白质印迹条带强度。[0617]环状rna及其线性对应物成功转染至293t细胞中。然而，图31显示转染后24小时，在环状rna转染细胞中检测到egf蛋白质，而在线性rna转染细胞中未检测到。因此，与线性rna相比，环状rna经由滚环翻译在细胞中翻译。实例37：合成环状rna在细胞中展示出降低的免疫原性基因表达[0618]此实例展示了工程化以与线性rna相比具有降低的免疫原性的环状rna。[0619]编码治疗性蛋白质的环状rna在受体细胞中提供与线性rna相比减少的免疫相关基因(rig‑i、mda5、pkr和ifn‑β)诱导。rig‑i可以识别短的5'三磷酸酯无帽双链或单链rna，而mda5可以识别更长的dsrna。rig‑i和mda5均可参与激活mavs并且触发抗病毒应答。pkr可以被dsrna激活，并且被干扰素(诸如ifn‑β)诱导。如以下实例中所示，如通过q‑pcr通过rig‑i、mda5、pkr和ifn‑β的表达评估的，显示了环状rna在293t细胞中具有与类似线性rna相比减少的免疫相关基因激活。[0620]环状rna和线性rna被设计为编码(1)科扎克3xflag‑egf序列，无终止元件(seqidno:11)；(2)科扎克3xflag‑egf，其侧接终止元件(终止密码子)(seqidno:21)；(3)科扎克3xflag‑egf，其侧接2a序列(seqidno:19)；或(4)科扎克3xflag‑egf序列，其侧接2a序列、后接终止元件(终止密码子)(seqidno:20)。[0621]在此实例中，通过将0.1x106个细胞铺板至12孔板的每个孔中来监测细胞中先天性免疫应答基因的水平。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将1μg线性rna或环状rna转染至每个孔中。转染后二十四小时，使用酚基提取试剂(英杰公司)从细胞中分离出总rna。将总rna(500ng)进行逆转录以生成cdna。使用基于染料的定量pcr混合物(伯乐公司)进行qrt‑pcr分析。[0622]使用的引物序列：用于gapdh的引物，f：agggctgcttttaactctggt，r：ccccacttgattttggaggga；rig‑i，f：tgtgggcaatgtcatcaaaa，r：gaagcacttgctacctcttgc；mda5，f：ggcaccatgggaagtgatt，r：atttggtaaggcctgagctg；pkr，f：tcgctggtatcactcgtctg，r：gattctgaagaccgccagag；ifn‑β，f：ctctcctgttgtgcttctcc，r：gtcaaagttcatcctgtccttg。[0623]如图32中所示，与线性rna转染细胞相比，用环状rna转染的293t细胞的免疫相关基因的qrt‑pcr水平显示出rig‑i、mda5、pkr和ifn‑β的降低。因此，与线性rna转染细胞相比，在环状rna转染的细胞中受体细胞中免疫原性相关基因的诱导减少。实例38：在细胞中合成环状rna经由滚环翻译的表达增加[0624]此实例展示了在细胞中合成环状rna经由滚环翻译的表达增加。[0625]环状rna被设计为包含随有纳米萤光素酶基因或egf阴性对照基因的ires，无终止元件(终止密码子)。用以下转染细胞：egf阴性对照(seqidno:22)；nluc终止(seqidno:23)：emcvires、交错序列(2a序列)、3xflag标签化nluc序列、交错序列(2a序列)、和终止密码子；或nluc交错(seqidno:24)：emcvires、交错序列(2a序列)、3xflag标签化nluc序列、和交错序列(2a序列)。如图33中所示，两种环状rna均产生具有功能性萤光素酶活性的翻译产物。[0626]在此实例中，在细胞中监测环状rna的翻译。具体而言，将0.1x106个细胞铺板至12孔板的每个孔中。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将300ng环状rna转染至每个孔中。24小时后，通过添加100μlripa缓冲液收获细胞。根据制造商的方案(普洛麦格公flag标签化nluc序列、交错序列(2a序列)和终止密码子。如图36中所示，与具有科扎克序列的环状rna相比，具有ires的环状rna展示了较高水平的萤光素酶活性，这对应于较高的蛋白质水平。[0638]在此实例中，在细胞中监测环状rna的翻译。具体而言，将0.1x106个细胞铺板至12孔板的每个孔中。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将300ng环状rna转染至每个孔中。24小时后，通过添加100μlripa缓冲液收获细胞。根据制造商的方案(普洛麦格公司)，使用萤光素酶测定系统测量裂解物中的纳米萤光素酶活性。[0639]如图36中所示，与具有科扎克起始蛋白质表达的环状rna相比，环状rna用ires起始了蛋白质表达并且产生了更高水平的具有功能性萤光素酶活性的蛋白质产物。实例42：在细胞中合成环状rna的滚环翻译[0640]此实例展示了在细胞中合成环状rna经由滚环翻译的更高蛋白质产生，该合成环状rna用ires起始蛋白质产生。[0641]环状rna被设计为包含随有纳米萤光素酶基因或egf阴性对照的科扎克序列或ires，具有或无终止元件(终止密码子)。用以下转染细胞：egf阴性对照(seqidno:22)；nlucires终止(seqidno:23)：emcvires、交错序列(2a序列)、3xflag标签化nluc序列、交错序列(2a序列)和终止密码子；或nlucires交错(seqidno:24)：emcvires、交错序列(2a序列)、3xflag标签化nluc序列、和交错序列(2a序列)。如图37中所示，两种环状rna产生的表达产物都展示了滚环翻译，并且与具有终止元件、无ires(例如，具有科扎克序列)的环状rna相比，无终止元件、具有ires(例如，无科扎克序列)的环状rna起始并产生了更高水平的具有功能性萤光素酶活性的蛋白质产物，这展示了滚环翻译。[0642]在此实例中，在细胞中监测环状rna的翻译。具体而言，将0.1x106个细胞铺板至12孔板的每个孔中。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将300ng环状rna转染至每个孔中。24小时后，通过添加100μlripa缓冲液收获细胞。根据制造商的方案(普洛麦格公司)，使用萤光素酶测定系统测量裂解物中的纳米萤光素酶活性。[0643]如图37中所示，经由从两种环状rna得出的滚环方法在细胞中将环状rna翻译成蛋白质。然而，与具有终止元件科扎克翻译起始的环状rna相比，环状rna的滚环翻译使用ires起始了更高的蛋白质产生，并且产生了更多的具有功能性萤光素酶活性的蛋白质产物。实例43：由环状rna表达的蛋白质增加[0644]此实例展示了在细胞中的合成环状rna翻译。另外，此实例显示，环状rna比其线性对应物产生更多具有正确分子量的表达产物。[0645]线性rna和环状rna被设计为包含具有终止元件(终止密码子)的纳米萤光素酶基因。用以下转染细胞：媒介物：仅转染试剂；线性nluc(seqidno:23)：emcvires、交错元件(2a序列)、3xflag标签化nluc序列、交错元件(2a序列)、和终止元件(终止密码子)；或环状nluc(seqidno:23)：emcvires、交错元件(2a序列)、3xflag标签化nluc序列、交错元件(2a序列)、和终止元件(终止密码子)。如图28中所示，与线性rna相比，环状rna产生更高水平的具有正确分子量的蛋白质。[0646]24小时后，通过添加100μlripa缓冲液收获细胞。以1400xg离心5min后，在10％‑20％梯度聚丙烯酰胺/sds凝胶上分析上清液。[0647]使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗flag抗体和抗小鼠igg过氧化物酶一起孵育。用ecl试剂盒可视化印迹并且通过imagej测量蛋白质印迹条带强度。[0648]如图38中所示，环状rna在细胞中被翻译成蛋白质。特别地，环状rna与其线性rna对应物相比产生更高水平的具有正确分子量的蛋白质。实例44：在细胞中合成环状rna的滚环翻译产生离散蛋白质产物[0649]此实例展示了在细胞中由缺少终止元件(终止密码子)，例如具有交错元件代替终止元件(终止密码子)的合成环状rna经由滚环翻译翻译了离散蛋白质产物。另外，此实例显示，具有交错元件的环状rna比其线性对应物表达更多具有正确分子量的蛋白质产物。[0650]环状rna被设计为包含具有交错元件代替终止元件(终止密码子)的纳米萤光素酶基因。用以下转染细胞：媒介物：仅转染试剂；线性nluc(seqidno:24)：emcvires、交错元件(2a序列)、3xflag标签化nluc序列、和交错元件(2a序列)；或环状nluc(seqidno:24)：emcvires、交错元件(2a序列)、3xflag标签化nluc序列、和交错元件(2a序列)。如图39中所示，与线性rna相比，环状rna产生更高水平的具有正确分子量的蛋白质。[0651]24小时后，通过添加100μlripa缓冲液收获细胞。以1400xg离心5min后，在10％‑20％梯度聚丙烯酰胺/sds凝胶上分析上清液。[0652]使用干转移法电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗flag抗体和抗小鼠igg过氧化物酶一起孵育。用ecl试剂盒可视化印迹并且通过imagej测量蛋白质印迹条带强度。[0653]如图39中所示，在细胞中检测到环状rna翻译产物。特别地，无终止元件(终止密码子)的环状rna比其线性rna对应物产生更高水平的具有正确分子量的离散蛋白质产物。实例45：具有准双链螺旋结构的环状rna的制备[0654]此实例展示了具有准双链和螺旋两种结构的环状rna。[0655]将非天然存在的环状rna工程化为采用准双链螺旋结构。显示了相似的结构参与天然存在的环状rna的缩合，该环状rna具有独特的长体内半衰期(griffin等人2014,jvirol.[病毒学杂志]2014年7月；88(13):7402‑11.doi:10.1128/jvi.00443‑14；guedj等人,hepatology[肝脏学].2014年12月；60(6):1902‑10.doi:10.1002/hep.27357)。[0656]在此实例中，环状rna被设计为编码emcvires、作为orf的用3xflag标签化的nluc和交错序列(emcv2a3xflagnluc2a无终止)。为了评价rna二级结构，使用了热力学rna结构预测工具(rnafold)(viennarna)。另外，使用rna建模算法分析rna三级结构。[0657]如图40和图41中所示，将环状rna建模为采用准双链螺旋结构。实例46：具有与重复序列连接的准螺旋结构的环状rna的制备[0658]此实例展示了可以将环状rna设计为具有与重复序列连接的准螺旋结构。[0659]将非天然存在的环状rna工程化以采用与重复序列连接的准螺旋结构。显示了相似的结构参与天然存在的环状rna的缩合，该环状rna具有独特的长体内半衰期(griffin等人2014，guedj等人2014)。[0660]在此实例中，环状rna被设计为编码emcvires、nluc和包括重复序列(seqidno:26)的间隔子。为了评价rna三级结构，使用了rna建模算法。[0661]如图42中所示，将环状rna建模为采用准螺旋结构。实例47：环化rna是环状的而非连环化的[0662]此实例展示了通过rna酶h的环状rna降解产生与环状rna(而非连环化rna)一致的核酸降解产物。[0663]当与连接酶一起孵育时，rna不能反应或形成分子内或分子间键，分别生成环状(无游离端)或连环化rna。使用互补dna引物和rna酶h(一种识别dna/rna双链体的非特异性核酸内切酶)处理每种类型的rna，预期会根据起始rna物质产生独特数量的具有特定大小的降解产物。[0664]如以下实例中所示，基于rna酶h降解产生的rna的数量和大小，显示了连接的rna是环状的而非连环化的。[0665]生成了含有emcvt2a3xflag‑nlucp2a的环状rna和线性rna。[0666]为了测试rna(1299nt)的环化状态，将0.05pmol/μl线性rna或环状rna与0.25u/μlrna酶h(消化dna/rna双链体的内切核糖核酸酶)和0.3pmol/μl针对1037‑1046ntrna(caccgctcaggacaatcctt，seqidno:55)的寡聚体在37℃下孵育20min。孵育后，通过6％变性page分析反应混合物。[0667]对于上述使用的线性rna，预期在dna引物结合并随后被rna酶h裂解后，获得1041nt和258nt的两种裂解产物。预期连环体产生258nt、1041nt和1299nt的三种裂解产物。预期环状产生单一1299nt裂解产物。[0668]与rna酶核酸内切酶一起孵育的线性rna泳道中的条带数量产生了预期的两条1041nt和258nt条带，而在环状rna泳道中产生了1299nt的单条条带(参见图43)，这表明环状rna实际上是环状的而非连环化的。实例48：大型circrna的制备[0669]此实例展示了约20个碱基至约6.2kb的范围内的环状多核糖核苷酸的生成。[0670]根据所期望功能，在一定大小范围内产生了工程化以包含一种或多种所期望特性的非天然存在的环状rna。如以下实例中所示，将高达6200nt的线性rna环化。[0671]在此使用了质粒pcdna3.1/cat(6.2kb)。将引物设计为以规则的间隔退火至pcdna3.1/cat，以生成对应于500nt、1000nt、2000nt、4000nt、5000nt和6200nt的dna寡核苷酸。对指示dna寡核苷酸进行体外转录以生成相应大小的线性rna。使用夹板dna从这些rna寡核苷酸生成环状rna。[0672]为了测量rna的环化效率，生成了6种不同大小的线性rna(500nt、1000nt、2000nt、4000nt、5000nt和6200nt)。使用dna夹板和t4dna连接酶2将它们环化。作为对照，在没有t4rna连接酶的情况下进行一个反应。将一半的环化样品用rna酶r处理以去除线性rna。[0673]为了监测环化效率，使用qpcr分析每个样品。如图44中所示，环状rna由多种不同长度的dna生成。如图45中所示，使用rna酶r处理和针对环状接合点的qpcr分析证实了rna的环化。此实例展示了各种长度的环状rna的产生。实例49：经工程化具有蛋白质结合位点的环状rna[0674]此实例展示了具有蛋白质结合位点的环状rna的生成。[0675]在此实例中，一种环状rna被设计为包含cvb3ires(seqidno:56)和编码高斯萤光素酶(gluc)的orf(seqidno:57)，后接至少一个蛋白质结合位点。对于一个具体实例，使用辛德毕斯病毒(sindbisvirus)3'utr的hur结合序列(seqidno:52)来测试蛋白质结合对环状rna免疫原性的影响。hur结合序列包含两个元件，即ure(富u元件；seqidno:50)和cse(保守序列元件；seqidno:51)。将无hur结合序列或有ure的环状rna用作对照。鱼腥藻属(anabaena)自催化内含子和外显子序列的一部分位于cvb3ires(seqidno:56)之前。如所述在体外生成环状rna。如图46中所示，生成了含有hur结合位点的环状rna。[0676]为了监测rna结合蛋白对环状rna免疫原性的影响，将细胞铺板至96孔板的每个孔中。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将500ng环状rna转染至每个孔中。每天监测翻译效率/rna稳定性/免疫原性，长达72小时。收获培养基以监测gluc活性。用试剂盒制备用于测量rna水平的细胞裂解物，该试剂盒允许通过实时rt‑pcr(英杰公司)测量相对基因表达。[0677]根据制造商的说明(皮尔斯公司(pierce))，用高斯萤光素酶快速测定试剂盒测量gluc活性来监测翻译效率。[0678]对于qrt‑pcr分析，使用细胞裂解物制备试剂盒根据制造商的说明(英杰公司)生成cdna。使用pcr主混合物(brilliantiisybr绿qrt‑pcr主混合物)和pcr循环仪(lightcycler480)一式三份进行qrt‑pcr分析。通过针对nluc的引物测量环状rna的稳定性。对熟知的先天性免疫调控剂(诸如rig‑i、mda5、oas、oasl和pkr)的mrna水平进行定量，并且相对于肌动蛋白值进行归一化。实例50：具有调控核酸位点的环状rna的制备[0679]此实例展示了具有调控rna结合位点的环状rna的体外产生。[0680]不同的细胞类型具有独特的核酸调控机制来靶向特定的rna序列。在环状rna中编码这些特定序列可以在不同细胞类型中赋予独特的特性。如以下实例中所示，将环状rna工程化以编码微rna结合位点。[0681]在此实例中，环状rna包含编码wtemcvires的序列、mir692微rna结合位点(gaggugcucaaagagau)、和两个侧接ires‑orf的间隔子元件。[0682]在体外生成环状rna。从除了用于驱动转录的t7rna聚合酶启动子之外还包含以上列出的所有基序的dna模板体外转录未修饰的线性rna。将转录的rna用rna净化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’‑磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化柱纯化。使用夹板dna(ggctattcccaatagccgtt)和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的rna环化。将环状rna进行尿素‑page纯化(图47)，在缓冲液(0.5m乙酸钠，0.1％sds，1mmedta)中洗脱，乙醇沉淀并且重悬于无rna酶的水中。[0683]如图47中所示，生成了具有mirna结合位点的环状rna。实例51：环状rna的自剪接[0684]此实例展示了通过自剪接产生环状rna的能力。[0685]对于此实例，环状rna包含cvb3ires、编码高斯萤光素酶(gluc)的orf、和两个侧接ires‑orf的间隔子元件。[0686]在体外生成环状rna。从包括以上列出的所有基序的dna模板体外转录未修饰的线性rna。体外转录反应包含1μg模板dnat7rna聚合酶启动子、10xt7反应缓冲液、7.5mmatp、7.5mmctp、7.5mmgtp、7.5mmutp、10mmdtt、40urna酶抑制剂、和t7酶。在37℃下进行转录4h。将转录的rna用1u的dna酶i在37℃下dna酶处理15min。为了有利于通过自剪接进行的环化，添加额外的gtp至终浓度2mm，在55℃下孵育15min。然后将rna进行柱纯化，并且通过尿素‑page可视化。[0687]图48示出了通过自剪接生成的环状rna。实例52：具有包含加密原的剪接元件的环状rna[0688]对于此实例，环状rna包含cvb3ires、编码高斯萤光素酶(gluc)的orf、和两个侧接ires‑orf的间隔子元件，这两个间隔子元件包含为鱼腥藻属自催化内含子和外显子序列(seqidno:59)的一部分的剪接元件。[0689]在体外生成环状rna。[0690]在此实例中，通过将细胞铺板至12孔板的每个孔中来监测细胞中先天性免疫应答基因的水平。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将1μg线性rna或环状rna转染至每个孔中。转染后二十四小时，使用酚基提取试剂(英杰公司)从细胞中分离出总rna。将总rna(500ng)进行逆转录以生成cdna。使用基于染料的定量pcr混合物(伯乐公司)进行qrt‑pcr分析。[0691]针对与线性rna转染细胞相比rig‑i、mda5、pkr和ifn‑β的降低评价用包含剪接元件的环状rna转染的bj细胞的免疫相关基因的qrt‑pcr水平。实例53：细胞分裂期间环状rna的持续性[0692]此实例展示了环状多核糖核苷酸在细胞分裂期间的持续性。工程化以包含一种或多种所期望特性的非天然存在的环状rna可以通过细胞分裂在细胞中持续存在而不会被降解。如以下实例中所示，在hela细胞中在72h内监测表达环状高斯萤光素酶(gluc)的环状rna。[0693]在此实例中，1307nt环状rna包含cvb3ires、编码高斯萤光素酶(gluc)的orf、和两个侧接ires‑orf的间隔子元件。[0694]在hela细胞中监测环状rna在细胞分裂中的持续性。将96孔板中5000个细胞/孔用环状rna悬浮转染。在avos成像仪(赛默飞世尔公司)中进行亮细胞成像，并且在0h、24h、48h、72h和96h使用发光细胞活力测定(普洛麦格公司)进行细胞计数。通过使用高斯萤光素酶活性测定(赛默科技皮尔斯公司)，每天监测高斯萤光素酶活性以作为蛋白质表达的量度，并且在每24h从孔中移取的上清液中每天监测gluc表达。将50μl1xgluc底物添加至5μl血浆中，以进行gluc萤光素酶活性测定。在混合后立即在发光检测仪器(普洛麦格公司)上读取板。[0695]在正进行分裂的细胞中，检测到的环状rna的蛋白质表达水平(在转染后48小时约10rlu)高于线性rna(在转染后48小时约7rlu)(图49)。在所有测量时间点，与线性rna相比，具有环状rna的细胞具有更高的细胞分裂率。此实例展示了在细胞分裂期间环状rna的检测与其线性rna对应物相比增加。实例54：滚环翻译产生多个表达序列[0696]此实例展示了环状rna从单一构建体表达多种蛋白质的能力。另外，此实例展示了编码多个orf的环状rna的滚环翻译。此实例进一步展示了两种蛋白质从单一构建体的表达。[0697]一种环状rna(mtemcvt2a3xflag‑gfpf2a3xflag‑nlucp2ais间隔子)被设计为用于滚环翻译，以包含emcvires(seqidno:58)、和编码具有3xflag标签的gfp的orf和编码具有3xflag标签的纳米萤光素酶(nluc)的orf。交错元件(2a)侧接gfp和nlucorf。类似地设计了另一种环状rna，但是在nlucorf与间隔子之间包含三联终止密码子。鱼腥藻属自催化内含子和外显子序列的一部分包含在emcvires之前。如所述在体外生成环状rna。[0698]在体外或在细胞中监测环状rna的蛋白质表达。对于体外分析，将环状rna在兔网织红细胞裂解物(普洛麦格公司，美国威斯康星州菲奇堡(fitchburg,wi,usa))中在30℃下孵育3h。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、20μm完整氨基酸和0.8u/μlrna酶抑制剂(东洋纺公司(toyobo)，日本大阪(osaka,japan))。[0699]孵育后，通过向反应混合物(16μl)中添加乙酸(0.32μl)和水(300μl)并且在15℃下以20,817xg离心10min来去除血红蛋白。去除上清液，并且将沉淀物溶解于2xsds样品缓冲液中，并且在70℃下孵育15min。以1400xg离心5min后，在10％‑20％梯度聚丙烯酰胺/sds凝胶上分析上清液。[0700]对于细胞中的分析，将细胞铺板至12孔板的每个孔中，以监测细胞中环状rna的翻译效率。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将500ng环状rna转染至每个孔中。转染后48小时，通过向每个孔中添加200μlripa缓冲液收获细胞。接下来，在10％‑20％梯度聚丙烯酰胺/sds凝胶上分析10μg细胞裂解物蛋白质。[0701]使用干转移法将样品从网织红细胞裂解物和细胞电转移到硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗flag抗体和抗小鼠igg过氧化物酶一起孵育。作为上样对照，使用了抗β微管蛋白抗体。用增强的化学发光(ecl)试剂盒可视化印迹。通过imagej测量蛋白质印迹条带强度。[0702]如图50中所示，编码gfp和nluc的环状rna产生2种蛋白质产物。与有三联终止密码子的环状rna相比，无三联终止密码子的环状rna的翻译生成的两种蛋白质产物更多。最后，有和无三联终止密码子的环状rna分别以1/3.24和1/3.37的比率表达蛋白质。实例55：环状rna显示出相比于线性rna更低的毒性[0703]此实例展示了环状rna的毒性比线性rna低。[0704]对于此实例，环状rna包含emcvires、编码具有3xflag标签的nanoluc且两侧侧接交错元件(2a)的orf和终止元件(终止密码子)。如本文所述在体外生成环状rna并纯化。在此实例中使用的线性rna是具有球蛋白utr、编码nluc的经帽修饰的聚a尾rna或未经帽修饰的聚a尾rna。[0705]为了监测rna在细胞中的毒性，将bj人成纤维细胞铺板至96孔板的每个孔。在零、四十八和七十二小时后，按照制造商的建议使用基于脂质的转染试剂(赛默飞世尔公司)转染50ng环状或帽修饰的聚a尾线性rna。在96h在avos成像仪(赛默飞世尔公司)中进行亮细胞成像。使用imagej分析每种条件下的总细胞。[0706]如图51中所示，在用环状rna转染的培养物中有约90‑100个细胞/图像，而在用线性帽‑nluc‑聚(a)rna转染的培养物中仅有约40个细胞/图像，这表明与线性rna相比，环状rna的转染展示了降低的毒性。实例56：应激条件下的表达[0707]此实例展示了环状rna在应激条件下的表达优于线性rna。[0708]对于此实例，环状rna包含emcvires、编码具有3xflag标签的nanoluc且侧接交错元件的orf。如所述在体外生成环状rna并纯化。在此实例中使用的线性rna是具有球蛋白utr、编码nluc的加帽聚a尾rna。[0709]为了监测来自细胞的高斯萤光素酶表达，将bj人成纤维细胞铺板至96孔板的每个孔中。在零、四十八和七十二小时后，按照制造商的建议使用基于脂质的转染试剂转染50ng环状或帽‑聚a尾线性rna。通过使用高斯萤光素酶活性测定(赛默科技皮尔斯公司)，每天监测高斯萤光素酶活性以作为蛋白质表达的量度，并且在每24h从孔中移取的上清液中每天监测gluc表达。将50μl1xgluc底物添加至5μl血浆中，以进行gluc萤光素酶活性测定。在混合后立即在发光检测仪器(普洛麦格公司)上读取板。[0710]如图52中所示，在应激条件下，与线性rna(在转染后3天约2000rlu并且在转染后4天降低至不可检测)相比，环状rna以更高的水平翻译(在转染后3天约1000rlu并且在转染后6天高于2000rlu)。实例57：用于选择性表达的核糖开关[0711]此实例展示了控制环状rna的蛋白质表达的能力。[0712]对于此实例，环状rna被设计为包含调控编码nanoluc的orf的表达的合成核糖开关(seqidno:60)，参见图43。在体外生成环状rna。从除了用于驱动转录的t7rna聚合酶启动子之外还包含以上列出的所有基序的dna模板体外转录未修饰的线性rna。将转录的rna用rna净化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’‑磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化柱纯化。使用夹板dna(ccgttgtggtctcccagataaacagtattttgtcc)和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的rna环化。将环状rna进行尿素‑page纯化(图53)。[0713]茶碱或四环素诱导其特异性核糖开关的激活，导致基因表达的开关关闭(如auslander等人molbiosyst[分子生物系统].2010年5月；6(5):807‑14和ogawa等人,rna.2011年3月；17(3):478‑88.doi:10.1261/rna.2433111.电子版2011年1月11日所述)。预期核糖开关控制环状rna的gfp或nluc表达。因此，在添加茶碱或四环素后，预期没有gfp或nluc表达。[0714]在无细胞翻译系统和hela细胞中测试了核糖开关的效率。按照制造商的建议，使用无细胞翻译试剂盒(普洛麦格公司，l4140)进行无细胞翻译，并且使用针对nlucorf的发光检测仪器(普洛麦格公司)和针对gfporf的细胞成像多模式阅读器(伯腾公司(biotek))测量发光强度。[0715]对于细胞测定，在茶碱或四环素依赖性合成核糖开关的控制下，用1nm所述编码gfp或nluc的环状rna转染hela细胞/孔(theon5的第一次pcr的正向引物，ataccagccgaaaggcccttggcagagaggtctgaaaagacctctgctgactatgtgatcttattaaaattagg，theon5的第二次pcr的正向引物，gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctcctctataccagccgaaaggcccttggcag；tc‑n5的第一次pcr的正向引物，acataccagatttcgatctggagaggtgaagaatacgaccacctagaggtctgaaaagacctctgctgactatgtgatc，tc‑n5的第二次pcr的正向引物，gaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctcctctaaaacataccagatttcgatc)，以评估选择性表达。根据制造商的建议使用基于脂质的转染试剂。[0716]在37℃和5％co2下培养24小时后，根据环状rna中编码的核糖开关，用或不用浓度范围为从1nm‑3mm的茶碱或四环素处理细胞。连续培养24小时后，评价荧光性或发光性。对于gfp，将活细胞在含5％fbs和青霉素/链霉素以及核染色剂的荧光中性dmem培养基中成像。对于nluc，根据制造商的说明，使用发光检测仪器(普洛麦格公司)使用萤光素酶系统评估发光性。nluc的dna模板(蓝色：小珀椿象(plautiastali)肠病毒ires，橙色：nlucorf)egfp的dna模板(蓝色：小珀椿象肠病毒ires，橙色：egfporf)引物序列2的正向引物(加下划线：t7启动子)theon5第1次pcr中的正向引物(橙色：适体；红色：aires；紫色：aaires)theon5第2次pcrtc‑n5第1次pcr中的正向引物tc‑n5第2次pcr中的正向引物所有pcr中的反向引物agataaacagtattttgtccagtcgtcgaac接合点ggacaaaatactgtttatctgggagaccacaacgg夹板5'‑ccgttgtggtctcccagataaacagtattttgtcc‑3'实例58：生成、翻译具有经修饰的核苷酸的环状rna且环状rna的免疫原性降低[0717]此实例展示了产生蛋白质产物的经修饰的环状多核糖核苷酸的生成。另外，此实例展示了与线性rna相比，用核苷酸修饰工程化的环状rna具有降低的免疫效应。[0718]产生了非天然存在的环状rna，该环状rna被工程化以包含一种或多种所期望特性，并且具有全部或部分掺入的经修饰的核苷酸。如以下实例中所示，将全长经修饰的线性rna或者经修饰的和未修饰的线性rna的杂交体环化，并且评估nluc的表达。另外，与未修饰的环状rna相比，经修饰的环状rna在bj细胞中显示出降低的免疫相关基因激活(mda5、oas和ifn‑β表达的q‑pcr)。[0719]生成了具有wtemcvnluc终止间隔子的环状rna。对于完全的修饰取代，在体外转录反应期间，分别添加了经修饰的核苷酸、假尿苷和甲基胞嘧啶或m6a代替标准的未修饰的核苷酸、尿苷和胞嘧啶或腺苷。对于杂交构建体，wtemcvires与nlucorf分开合成。使用经修饰的或未修饰的核苷酸合成wtemcvires。相比之下，在体外转录反应期间中，分别使用经修饰的核苷酸、假尿苷和甲基胞嘧啶或m6a代替标准的未修饰的核苷酸、尿苷和胞嘧啶或腺苷合成了nlucorf序列。在合成经修饰的或未修饰的ires和经修饰的orf之后，使用t4dna连接酶将这两个寡核苷酸连接在一起。如图54a中所示，生成了经修饰的环状rna。[0720]为了测量完全修饰或杂交修饰的构建体中nluc的表达效率，将0.1pmol线性rna和环状rna转染至bj成纤维细胞中持续6h。在转染后6h、24h、48h和72h测量nluc表达。[0721]使用酚基提取试剂(英杰公司)，在细胞中监测从细胞中分离的总rna中的先天性免疫应答基因的水平。将总rna(500ng)进行逆转录以生成cdna。使用基于染料的定量pcr混合物(伯乐公司)进行qrt‑pcr分析。[0722]如图54b和图54c中所示，如通过萤光素酶活性所测量翻译了经修饰的环状rna。如图55a、图55b和图55c中所示，与未修饰的环状rna转染细胞相比，用环状rna转染的bj细胞的免疫相关基因的qrt‑pcr水平显示出mda5、oas和ifn‑β表达的降低。因此，与未修饰的环状rna转染细胞相比，在用经修饰的环状rna转染的细胞中受体细胞中免疫原性相关基因的诱导减少。实例59：与线性rna相比，体内施用的环状rna显示出更长半衰期/增加的稳定性[0723]此实例展示了在体内，与线性rna相比，递送环状rna的能力和环状rna的增加稳定性。[0724]对于此实例，环状rna被设计为包含随有编码纳米萤光素酶(nluc)的orf和交错序列的emcvires(emcv2a3xflagnluc2a无终止和emcv2a3xflagnluc2a终止)。在体外生成环状rna。[0725]经由静脉内(iv)尾静脉施用，向balb/c小鼠注射具有nlucorf的环状rna或作为对照的线性rna。根据制造商的说明，使动物接受在基于脂质的转染试剂(麦鲁斯公司)中配制的单剂5μgrna。[0726]处死小鼠，并且在给予后3、4和7天收集肝脏(n＝2只小鼠/时间点)。收集肝脏并将其储存在rna稳定试剂(英杰公司)中。使用微管匀浆器(赛默飞世尔科技公司)在ripa缓冲液中匀质化组织，并且使用酚基rna提取试剂提取rna用于cdna合成。使用qpcr来测量肝脏中线性rna和环状rna两者的存在。[0727]通过qpcr在组织中进行rna检测。为了检测扩增的线性和环状rna引物，使用了nlucorf。(f：agatttcgttggggactggc，r：caccgctcaggacaatcctt)。为了仅检测环状rna，扩增5’‑3’接合点的引物允许检测环状而非线性rna构建体(f：ctggagacgtggaggagaac，r：ccaaaagacggcaatatggt)。[0728]在注射后3、4和7天，在小鼠肝脏中检测到的环状rna水平高于线性rna(图56)。因此，施用环状rna并且在施用后至少7天可在体内检测到。实例60：环状rna的体内表达、半衰期和非免疫原性[0729]此实例展示了环状rna体内驱动表达的能力。它展示了与线性rna相比，环状rna的半衰期增加。最终，它展示了环状rna具有降低的体内免疫效应。[0730]对于此实例，环状rna包含cvb3ires、编码高斯萤光素酶(gluc)的orf、和两个侧接ires‑orf的间隔子元件。[0731]在体外生成环状rna。未修饰的线性rna从包含以上列出的所有基序以及用于驱动转录的t7rna聚合酶启动子的dna模板体外转录。将转录的rna用rna净化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’‑磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化柱纯化。使用夹板dna(gtcaacggattttcccaagtccgtagcgtctc)和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rpph处理的rna环化。将环状rna进行尿素‑page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠，0.1％sds，1mmedta)中洗脱，乙醇沉淀并且重悬于无rna酶的水中。[0732]使小鼠接受2.5μg具有高斯萤光素酶orf的环状rna、或作为对照的线性rna(两者均在作为载体的基于脂质的转染试剂(麦鲁斯公司)中配制)的单剂尾静脉注射。[0733]在给予后1、2、7、11、16和23天，收集每只小鼠的尾静脉血液样品(50μl)到edta管中。通过在4℃下以1300g离心25min分离血浆，并且使用高斯萤光素酶活性测定(赛默科技皮尔斯公司)测试了高斯萤光素酶(一种分泌酶)的活性。将50μl1xgluc底物添加至5μl血浆中，以进行gluc萤光素酶活性测定。在混合后立即在发光检测仪器(普洛麦格公司)中读取板。[0734]在给予环状rna后1、2、7、11、16和23天，在血浆中检测到高斯萤光素酶活性(图57a和图57b)。[0735]相比之下，高斯萤光素酶活性仅在给与经修饰的线性rna后1、2天在血浆中检测到。在第6天或以后，未检测到高于背景水平的线性rna衍生蛋白的酶活性(图57a和图57b)。[0736]在第16天，切开三只动物的肝脏，并且使用酚基提取试剂(英杰公司)从细胞中分离总rna。将总rna(500ng)进行逆转录以生成cdna。使用基于染料的定量pcr混合物(伯乐公司)进行qrt‑pcr分析。[0737]如图58中所示，在第16天，在肝脏和脾脏两者中均检测到环状rna而非线性rna的qrt‑pcr水平。如图59中所示，在第16天与载体转染的动物相比，用线性rna转染的肝脏的免疫相关基因显示出rig‑i、mda5、ifn‑b和oas的增加表达，而用环状rna转染的肝脏未显示出这些标记物的rig‑i、mda5、pkr、和ifn‑β的增加表达。因此，在来自转染肝脏的环状rna中不存在受体细胞中免疫原性相关基因的诱导。[0738]此实例展示了环状rna在更长时间段内体内表达蛋白质，在注射后数天时在血浆中具有蛋白质活性水平。鉴于高斯萤光素酶在小鼠血浆中的半衰期是约20min(参见tannous,natprotoc.[自然实验手册],2009,4(4):582‑591)，相似的活性水平指示环状rna的连续表达。此外，环状rna显示出比其经修饰的线性rna对应物更长的表达谱，而不诱导免疫相关基因。序列表seqidno:1(起始密码子)augseqidno:2(gfp)egfpseqidno:3(交错元件)p2a：gctactaacttcagcctgctgaagcaggctggcgacgtggaggagaaccctggacctt2a：gagggcaggggaagtctactaacatgcggggacgtggaggaaaatcccggcccae2a：cagtgtactaattatgctctcttgaaattggctggagatgttgagagcaacccaggtccc其他：f2a、bmcpv2a、bmifv2aseqidno:4zkscan内含子或seqidno:5(ires)ires(emcv)：seqidno:6(addgenep3.1漆酶)pcdna3.1( )漆酶2mcs外显子载体序列6926bpseqidno:8(rfp)mcherry：seqidno:9(核糖开关)适体酶(茶碱依赖性，参见auslander2010molbiosys[分子生物系统])：seqidno:10(萤光素酶)nluc：seqidno:11科扎克3xflag‑egf无终止(264bp)5‑13：科扎克序列14‑262：3xflag‑egfseqidno:12科扎克3xflag‑egf终止(273bp)5‑13：科扎克序列14‑262：3xflag‑egf263‑271：三联终止密码子seqidno:13科扎克3xflag‑egfp2a无终止(330bp)5‑13：科扎克序列14‑262：3xflag‑egf263‑328：p2aseqidno:14构建体科扎克3xflag‑egf无终止(264bp)夹板ggtggctcccaggcgcagttseqidno:15构建体科扎克3xflag‑egf终止(273bp)夹板ggtggctcccagttactatcseqidno:16构建体科扎克3xflag‑egfp2a无终止(330bp)夹板ggtggctcccagaggtccagseqidno:17科扎克1xflag‑egft2a1xflag‑nlucp2a无终止(873bp)5‑13：科扎克序列14‑202：1xflag‑egf203‑265：t2a266‑805：1xflag‑nluc806‑871：p2aseqidno:18科扎克1xflag‑egf终止1xflag‑nluc终止(762bp)5‑13：科扎克序列14‑202：1xflag‑egf203‑211：三联终止密码子212‑751：1xflag‑nluc752‑760：三联终止密码子seqidno:19科扎克3xflag‑egfp2a无终止(330bp)5‑13：科扎克序列14‑262：3xflag‑egf263‑328：p2aseqidno:20科扎克3xflag‑egf无终止(264bp)5‑13：科扎克序列14‑262：3xflag‑egfseqidno:21科扎克3xflag‑egf终止(273bp)5‑13：科扎克序列14‑262：3xflag‑egf263‑271：三联终止密码子seqidno:22emcvirest2a3xflag‑egfp2a无终止(954bp)5‑574:emcvires575‑637:t2a638‑886:3xfalg‑egf887‑952:p2aseqidno:23emcvt2a3xflagnlucp2a终止(1314nt)5‑574:emcvires575‑637:t2a638‑1237:3xflagnluc1238‑1303:p2a1304‑1312：三联终止密码子seqidno:24emcvt2a3xflagnlucp2a无终止(1305nt)5‑574:emcvires575‑637:t2a638‑1237:3xflagnluc1238‑1303:p2aseqidno:25科扎克1xflag‑egft2a1xflag‑nlucp2a终止(882bp)5‑13：科扎克序列14‑202：1xflag‑egf266‑805：1xflag‑nluc806‑871：p2a872‑880：三联终止密码子seqidno:26示例性重复间隔子序列seqidno:27实例55中使用的用于扩增pcdna3.1/cat的模板的正向引物cgcggatcctaatacgactcactatagggagacccaagctggcseqidno:28实例55中使用的用于扩增pcdna3.1/cat的0.5kb模板的反向引物seqidno:29实例55中使用的用于扩增pcdna3.1/cat的1kb模板的反向引物seqidno:30实例55中使用的用于扩增pcdna3.1/cat的2kb模板的反向引物seqidno:31实例55中使用的用于扩增pcdna3.1/cat的4kb模板的反向引物seqidno:32实例55中使用的用于扩增pcdna3.1/cat的5kb模板的反向引物seqidno:33实例55中使用的用于扩增pcdna3.1/cat的6.2kb模板的反向引物seqidno:34实例55中使用的用于检测pcdna3.1/cat的线性转录物的正向qpcr引物attcttgcccgcctgatgaaseqidno:35实例55中使用的用于检测pcdna3.1/cat的线性转录物的反向qpcr引物ttgctcatggaaaacggtgtseqidno:36实例55中使用的用于检测pcdna3.1/cat的环状转录物的正向qpcr引物tgatcctgcactatggcacaseqidno:37实例55中使用的用于检测pcdna3.1/cat的环状转录物的反向qpcr引物ctggactagtggatccgagcseqidno:38实例56中使用的用于检测肌动蛋白(actin)的正向引物序列gacgaggcccagagcaagagaggseqidno:39实例56中使用的用于检测肌动蛋白的反向引物序列ggtgttgaaggtctcaaacatgseqidno:40实例56中使用的用于检测rig‑i的正向引物序列tgtgggcaatgtcatcaaaaseqidno:42实例56中使用的用于检测rig‑i的反向引物序列gaagcacttgctacctcttgcseqidno:42实例56中使用的用于检测mda5的正向引物序列ggcaccatgggaagtgattseqidno:43实例56中使用的用于检测mda5的反向引物序列atttggtaaggcctgagctgseqidno:44实例56中使用的用于检测pkr的正向引物序列tcgctggtatcactcgtctgseqidno:45实例56中使用的用于检测pkr的反向引物序列gattctgaagaccgccagagseqidno:46实例56中使用的用于检测ifn‑β的正向引物序列ctctcctgttgtgcttctccseqidno:47实例56中使用的用于检测ifn‑β的反向引物序列gtcaaagttcatcctgtccttgseqidno:48emcvt2a3xflag‑gfpf2a3xfalg‑nlucp2aisseqidno:49emcvt2a3xflag‑gfpf2a3xfalg‑nlucp2aisseqidno:50ureucauaaucaauuuauuauuuucuuuuauuuuauucacauaauuuuguuuuuseqidno:51cseauuuuguuuuuaacauuucseqidno:52ure/cseseqidno:53cvb3‑gluc‑终止‑ureseqidno:54cvb3‑gluc‑终止‑ure/cseseqidno:55用于实例54的互补引物caccgctcaggacaatccttseqidno:56cvb3iresseqidno:57glucseqidno:58具有终止突变的emcviresseqidno:59间隔子1间隔子2seqid:60实例5中使用的高斯萤光素酶dna模板实例5中使用的emcvires实例4中使用的高斯萤光素酶orf实例4中使用的emcvires当前第1页12当前第1页12