32个大豆InDel标记在检测大豆遗传多样性中的应用的制作方法

32个大豆indel标记在检测大豆遗传多样性中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域中，32个大豆indel标记在检测大豆遗传多样性中的应用。


背景技术：

2.大豆(glycine max(l.)merrill)起源于中国，是野生品种栽培进化而来的双子叶草本植物，属于豆科(leguminsae)、蝴蝶花亚科(papiliontae)、大豆属(glycine)。大豆为人类提供了1/3的植物蛋白和植物油来源，是我国五大作物之一。大豆是关系到民生的基础性、经济性、战略性的作物，其产业具有巨大发展潜力，在农产品贸易中扮演举足轻重的作用。近年来，随着国家农业部供给侧改革的调整，大豆的种业体系得到了多元化发展。我国大豆种业市场十分活跃，已建立了比较完善的大豆育种体系，为大豆种业的发展奠定了基础；大豆种子企业初具规模，加快了新品种的培育及推广；育成品种(如黑河43、齐黄34等)等也已经实现高价转让品种权，进一步加快了大豆品种应用。然而我国大豆种业的发展存在一定的问题：种子检验体系不完善、种子纯度低；种业市场管理不规范，部分地区市场混乱，大豆种子“同名异种”、“同种异名”现象时有发生。在作物种质资源保存过程中，材料的同名问题是各个国家都面临的难题。解决这一问题不仅能为种质资源的研究提供便利，也有利于减少种质资源保存时的损耗。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是如何检测大豆遗传多样性。
4.为解决上述技术问题，本发明首先提供了32个大豆indel标记或检测所述32个大豆indel标记的物质在检测或辅助检测大豆遗传多样性中的应用；
5.所述32个大豆indel标记的名称为indel-10-5、indel-10-6、indel-12-4、indel-12-7、indel-13-1、indel-13-4、indel-14-1、indel-15-4、indel-16-3、indel-1-7、indel-17-1、indel-1-8、indel-18-3、indel-19-4、indel-19-8、indel-20-1、indel-2-1、indel-3-4、indel-3-6、indel-4-4、indel-4-6、indel-5-2、indel-5-5、indel-6-1、indel-7-3、indel-7-8、indel-8-1、indel-9-4、indel-9-8、indel-11-6、indel-2-8和indel-6-4；
6.所述indel-10-5为利用名称为indel-10-5-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-10-5-p由序列表中序列1和2所示的两条单链dna组成；
7.所述indel-10-6为利用名称为indel-10-6-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-10-6-p由序列表中序列3和4所示的两条单链dna组成；
8.所述indel-12-4为利用名称为indel-12-4-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-12-4-p由序列表中序列5和6所示的两条单链dna组成；
9.所述indel-12-7为利用名称为indel-12-7-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-12-7-p由序列表中序列7和8所示的两条单链dna组成；
10.所述indel-13-1为利用名称为indel-13-1-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr
扩增得到的dna分子；所述indel-13-1-p由序列表中序列9和10所示的两条单链dna组成；
11.所述indel-13-4为利用名称为indel-13-4-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-13-4-p由序列表中序列11和12所示的两条单链dna组成；
12.所述indel-14-1为利用名称为indel-14-1-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-14-1-p由序列表中序列13和14所示的两条单链dna组成；
13.所述indel-15-4为利用名称为indel-15-4-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-15-4-p由序列表中序列15和16所示的两条单链dna组成；
14.所述indel-16-3为利用名称为indel-16-3-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-16-3-p由序列表中序列17和18所示的两条单链dna组成；
15.所述indel-1-7为利用名称为indel-1-7-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-1-7-p由序列表中序列19和20所示的两条单链dna组成；
16.所述indel-17-1为利用名称为indel-17-1-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-17-1-p由序列表中序列21和22所示的两条单链dna组成；
17.所述indel-1-8为利用名称为indel-1-8-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-1-8-p由序列表中序列23和24所示的两条单链dna组成；
18.所述indel-18-3为利用名称为indel-18-3-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-18-3-p由序列表中序列25和26所示的两条单链dna组成；
19.所述indel-19-4为利用名称为indel-19-4-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-19-4-p由序列表中序列27和28所示的两条单链dna组成；
20.所述indel-19-8为利用名称为indel-19-8-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-19-8-p由序列表中序列29和30所示的两条单链dna组成；
21.所述indel-20-1为利用名称为indel-20-1-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-20-1-p由序列表中序列31和32所示的两条单链dna组成；
22.所述indel-2-1为利用名称为indel-2-1-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-2-1-p由序列表中序列33和34所示的两条单链dna组成；
23.所述indel-3-4为利用名称为indel-3-4-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-3-4-p由序列表中序列35和36所示的两条单链dna组成；
24.所述indel-3-6为利用名称为indel-3-6-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-3-6-p由序列表中序列37和38所示的两条单链dna组成；
25.所述indel-4-4为利用名称为indel-4-4-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-4-4-p由序列表中序列39和40所示的两条单链dna组成；
26.所述indel-4-6为利用名称为indel-4-6-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-4-6-p由序列表中序列41和42所示的两条单链dna组成；
27.所述indel-5-2为利用名称为indel-5-2-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-5-2-p由序列表中序列43和44所示的两条单链dna组成；
28.所述indel-5-5为利用名称为indel-5-5-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-5-5-p由序列表中序列45和46所示的两条单链dna组成；
29.所述indel-6-1为利用名称为indel-6-1-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-6-1-p由序列表中序列47和48所示的两条单链dna组成；
30.所述indel-7-3为利用名称为indel-7-3-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-7-3-p由序列表中序列49和50所示的两条单链dna组成；
31.所述indel-7-8为利用名称为indel-7-8-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-7-8-p由序列表中序列51和52所示的两条单链dna组成；
32.所述indel-8-1为利用名称为indel-8-1-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-8-1-p由序列表中序列53和54所示的两条单链dna组成；
33.所述indel-9-4为利用名称为indel-9-4-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-9-4-p由序列表中序列55和56所示的两条单链dna组成；
34.所述indel-9-8为利用名称为indel-9-8-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-9-8-p由序列表中序列57和58所示的两条单链dna组成；
35.所述indel-11-6为利用名称为indel-11-6-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-11-6-p由序列表中序列59和60所示的两条单链dna组成；
36.所述indel-2-8为利用名称为indel-2-8-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-2-8-p由序列表中序列61和62所示的两条单链dna组成；
37.所述indel-6-4为利用名称为indel-6-4-p的引物对对大豆基因组dna进行pcr扩增得到的dna分子；所述indel-6-4-p由序列表中序列63和64所示的两条单链dna组成。
38.本发明还提供了所述32个大豆indel标记或检测所述32个大豆indel标记的物质在鉴定或辅助鉴定大豆品种或品系中的应用。
39.本发明还提供了所述32个大豆indel标记或检测所述32个大豆indel标记的物质在开发鉴定或辅助鉴定大豆品种或品系的分子标记中的应用。
40.本发明还提供了所述32个大豆indel标记或检测所述32个大豆indel标记的物质在制备大豆遗传图谱中的应用。
41.制备大豆遗传图谱的方法可包括：检测待测大豆中所述32个大豆indel标记，根据所述32个大豆indel标记制备得到待测大豆的遗传图谱。
42.本发明还提供了所述32个大豆indel标记或检测所述32个大豆indel标记的物质在大豆育种中的应用。
43.上文中，所述检测所述32个大豆indel标记的物质包括成套引物，所述成套引物由序列表中序列1-64所示的64条单链dna组成。
44.所述检测所述32个大豆indel标记的物质还可包括进行pcr扩增所需的除引物外的其他试剂。
45.所述检测所述32个大豆indel标记的物质可由所述成套引物组成，还可以由所述成套引物与进行pcr扩增所需的除引物外的其他试剂组成。
46.所述成套引物可为具有如下任一用途的成套引物：
47.x1、检测或辅助检测大豆遗传多样性；
48.x2、鉴定或辅助鉴定大豆品种或品系；
49.x3、开发鉴定或辅助鉴定大豆品种或品系的分子标记；
50.x4、制备大豆遗传图谱；
51.x5、大豆育种。
52.所述检测所述32个大豆indel标记的物质，也属于本发明的保护范围。
53.所述32个大豆indel标记，也属于本发明的保护范围。
54.本发明中，所述待测大豆品种或品系可为冀豆12、中黄42、徐豆16、齐黄34、吉育101、hobbit、hj117、郑196、zyd2738、冀豆17、中黄13和/或绥农14和/或来源于表5中的任意大豆品种或品系。
55.利用所述成套引物中的引物对进行pcr扩增的体系中引物的浓度均可为0.5μmol/l。具体的利用所述成套引物中的引物对进行pcr扩增的体系均可为：
56.基因组dna(20ng/μl-1
)1μl2
×
es taq mastermix10μl上游引物(10μmol/l)1μl下游引物(10μmol/l)1μlddh2o7μl
57.其中，序列2n-1所示的单链dna(上游引物)和序列2n所示的单链dna(下游引物)组成一个引物对，n为1-32间的自然数。2
×
es taq mastermix为北京康为世纪生物科技有限公司产品。
58.利用所述成套引物中的引物对进行pcr扩增的退火温度可为55℃。具体的，利用所述成套引物中的引物对进行pcr扩增的反应条件可为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃终延伸10min。
59.本发明获得了32个大豆indel标记，利用这32个大豆indel标记可以检测大豆遗传多样性，可以鉴定大豆品种或品系或开发鉴定大豆品种或品系的分子标记，还可以制备大豆遗传图谱，也可以还可以用于分析大豆的遗传结构，进一步还可以用于大豆育种。本发明的32个大豆indel标记以及检测这32个大豆indel标记的成套引物具有广阔的研究前景。
附图说明
60.图1为部分pcr产物的琼脂糖凝胶电泳检结果。m:marker，1-12分别是冀豆17，冀豆12，绥农14，中黄13，hj117，hobbit，吉育101，齐黄34，徐豆16，zyd2738，郑196，中黄42；a-j分别是indel-4-6，indel-5-5，indel-6-1，indel-8-1，indel-8-2，indel-10-5，indel-13-4，indel-16-3，indel-19-8，indel-20-8的引物的pcr产物。
61.图2为部分pcr产物的琼脂糖凝胶电泳检结果。泳道m:dna marker，泳道1-12分别是冀豆17，冀豆12，绥农14，中黄13，hj117，hobbit，吉育101，齐黄34，徐豆16，zyd2738，郑196，中黄42；图(1)-(16)分别是：indel-1-7,indel-1-8,indel-4-6,indel-2-1,indel-5-2,indel-2-8,indel-6-4,indel-3-4,indel-6-7,indel-3-6,indel-7-3,indel-4-4,indel-8-1,indel-5-5,indel-6-1,indel-7-4。
62.图3为部分pcr产物的琼脂糖凝胶电泳检结果。泳道m:dna marker，泳道1-12分别是冀豆17，冀豆12，绥农14，中黄13，hj117，hobbit，吉育101，齐黄34，徐豆16，zyd2738，郑196，中黄42；图(17)-(32)分别是：indel-10-5,indel-7-8,indel-11-7,indel-8-2,indel-12-7,indel-9-4,indel-13-1,indel-9-8,indel-13-2,indel-10-6,indel-14-1,indel-11-4,indel-14-3,indel-11-6,indel-16-2,indel-12-4。
63.图4为部分pcr产物的琼脂糖凝胶电泳检结果。泳道m:dna marker，泳道1-12分别是冀豆17，冀豆12，绥农14，中黄13，hj117，hobbit，吉育101，齐黄34，徐豆16，zyd2738，郑
196，中黄42；图(33)-(43)分别是：indel-16-3,indel-13-4,indel-16-5,indel-15-4,indel-16-7,indel-19-4,indel-17-1,indel-19-8,indel-18-3,indel-18-5,indel-20-1。
64.图5为大豆材料遗传距离聚类分析图。注：pop1为北组材料，pop2为中组材料，pop3为南组材料。
65.图6为利用δk推测96份大豆种质的最优组群划分。
66.图7为96份大豆种质的遗传结构。横坐标表示大豆序号，各序号表示的大豆名称见表5。
具体实施方式
67.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5
′
末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3
′
末端核苷酸。
68.下述实施例中的大豆以及所记载的文献如下，公众均可从申请人处获得这些生物材料，这些生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用：
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[0071]
徐豆16：王幸,王宗标,徐泽俊.大豆新品种徐豆16的选育和栽培技术[j].大豆科技,2011(06):64-65。
[0072]
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[0073]
吉育101：杨光宇,王洋,马晓萍,纪锋,杨春明,胡金海,许明,高淑琴,王英男.高蛋白大豆新品种吉育101号的选育与栽培技术[j].大豆通报,2008(02):45-46。
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[0087]
商豆1310：何鑫,闫向前,孙华军,大豆新品种商豆1310的丰产性、稳定性及适应性分析[j].大豆科技,2017(05):41-49。
[0088]
潍豆12：练云,李海朝,李金英,王金社,魏荷,雷晨芳,武永康,卢为国.大豆胞囊线虫抗性位点rhg1和rhg4优异等位变异在黄淮育成品种中的分布[j].中国农业科学,2019,52(15):2559-2567。
[0089]
沧豆09y1：沧州市农林科学院(石7631
×
石豆4号)。
[0090]
(1)expected heterozygous number：期望杂合度，即基因多样性，简称he。
[0091]
he＝1-∑pi2，其中pi为第i个等位基因在大豆群体中的频率，计算每个位点的期望杂合度，取平均值代表该群体的期望杂合度。
[0092]
(2)nei diversity index：nei多样性指数。
[0093]
nei多样性指数＝nhe/(n-1),n为样品数，he为群体的期望杂合度。
[0094]
(3)shnnon wiener index：香农指数，简称shi。
[0095]
shi＝-∑(pi
×
lnpi)，pi为第i个等位基因在大豆群体中的频率，分别计算获得各位点的shi，取平均值代表该群体的shi。
[0096]
(4)polymorphysm information content：多态性信息含量，简称pic。
[0097]
[0098]
pi和pj分别为第i个和第j个等位基因在大豆群体中频率，n为等位基因数。
[0099]
实施例1、大豆标记组合在检测大豆遗传多样性中的应用
[0100]
本实施例提供了一组由32个插入/缺失标记(indel标记)组成的大豆indel标记组合，该大豆indel标记组合在96份大豆材料中能反映出其遗传多样性。
[0101]
一、大豆indel标记的发现
[0102]
本发明的发明人利用illumia hiseqtm2500对12份大豆材料进行全基因组重测序：提取植物材料dna利用超声波将质检合格的植物材料dna片段化，然后将片段化的dna进行片段纯化、末端修复、3'端加a、链接测序接头，用琼脂糖凝胶电泳选择片段长度大小，pcr扩增建立测序文库，用illumina hiseqtm 2500对质检合格的文库进行测序。对测序得到的原始reads进行质量评估，过滤得到clean reads，用于后续的基因组序列拼装。
[0103]
测序数据中，正确识别率大于q20(99.9％)的碱基占比平均值为97.50％，正确识别率大于q30(99.9％)的碱基占比平均值为93.48％，基因组gc含量平均值为36.23％，样品平均重测序覆盖率为98.70％，平均测序深度18.73x。测序结果中，gc含量分布正常，样品测序覆盖率高，测序质量合格，可用于后续分析。
[0104]
这12份大豆材料为：冀豆12、中黄42、徐豆16、齐黄34、吉育101、hobbit、hj117、郑196、zyd2738、冀豆17、中黄13和绥农14。
[0105]
根据12份大豆材料的clean reads在大豆参考基因组glyma.wm82.a2v1的定位结果进行变异检测，检测到snp、indel两种主要变异类型。12份材料中检测到snp数量的平均值为1488416，检测到indel数量的平均值为294560。
[0106]
通过与大豆参考基因组glyma.wm82.a2v1比对，共检测到插入/缺失片段长度大于20bp(包括20bp)的indel标记的数量为66561，平均每条染色体的indel标记的数量为3262，其中第18号染色体分布的indel标记最多，数量为4521，第12号染色体分布的indel标记最少，数量为2019。
[0107]
检测到的66561个indel标记中，位于内含子的indel标记数量为8222个(12.35％)，位于基因上游序列和下游序列的indel标记数量分别为17190个(25.83％)和13602个(20.44％)，位于基因间隔区的indel标记数量为22893个(34.39％)，位于基因间的indel标记数量为125个(0.19％)，位于3'-utr和5'-utr的indel标记数量分别为1004个(1.51％)和617个(0.93％)。
[0108]
检测到的66561个indel标记插入/缺失片段长度平均值为41bp，片段长度大小介于20-40bp的indel标记数量为42453，介于41-60bp的indel标记数量为13044，介于61-80bp的indel标记数量为5034，介于81-100bp的indel标记数量为2285，大于100bp的indel标记数量为2413。
[0109]
利用popgene软件分析66561个indel标记的在这12个大豆材料中的pic、nei多样性指数、香农指数，pic的范围为0.067-0.375，nei多样性指数的范围为0.710-0.667，香农指数范围为0.154-0.693。pic集中分布范围是0.100-0.200和0.300-0.400，所占比例分别为35.58％和33.01％；nei多样性指数集中分布范围是0.100-0.200，所占比例为33.56％；香农指数集中分布的范围是0.200-0.300和0.600-0.700，所占比例分别为29.30％和24.09％。
[0110]
将clean reads与参考基因组序列(glyma.wm82.a2v1)进行对比，使用gatk软件对
indel标记进行检测，检测标准为：
[0111]
(1)选择插入/缺失片段大于20bp的位点；
[0112]
(2)每个位点最多有2个等位变异。
[0113]
挑选160个长片段插入/缺失位点，这160满足如下条件：
[0114]
(1)在大豆每条染色体选择8对均匀分布的位点；
[0115]
(2)插入/缺失片段长度大于40bp(包括40bp)；
[0116]
(3)每个位点有且只有两个等位变异；
[0117]
(4)选择多态性信息含量大于0.25的位点。
[0118]
在这160个indel标记位点上下游设计引物，共得到160对引物。
[0119]
在这160对引物中，在55℃的退火温度下，有51对引物不能使12份大豆材料中的每个材料都扩增出条带，有109对引物能使12份大豆材料均稳定扩增出条带。在稳定扩增出条带的109对引物中，43对引物的扩增条带清晰，肉眼可分辨片段插入/缺失类型，66对引物扩增条带不易分辨片段插入/缺失类型，43对引物所扩增的43个indel标记的详细信息见表1，引物信息见表2。部分indel标记引物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。
[0120]
表1、大豆indel标记组合信息
[0121]
indel名称染色体位置indel名称染色体位置indel-1-7138601796indel-11-41124374193indel-1-8150513481indel-11-61115581830indel-2-1222242181indel-12-41217649495indel-2-822237743indel-12-71211949731indel-3-4330874756indel-13-11331358622indel-3-6321939196indel-13-21316930542indel-4-4448358162indel-13-41337748838indel-4-6445230392indel-14-1144424007indel-5-2534356071indel-14-31443544210indel-5-5539857792indel-15-41515360421indel-6-1620039692indel-16-21625311303indel-6-4610896943indel-16-316156095indel-6-7648773671indel-16-51631016663indel-7-3717704210indel-16-71629753588indel-7-477458176indel-17-11739593964indel-7-8737866069indel-18-31851025175indel-8-1847711883indel-18-5188476744indel-8-289409779indel-19-41941727589indel-9-4949917537indel-19-8198157745indel-9-8929913558indel-20-12036027621indel-10-51049646363indel-20-82037390649indel-10-61011287611
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[0122]
表2、用于扩增43个大豆indel标记的引物信息
[0123]
[0124][0125]
利用这43对引物分别对12份大豆材料的基因组dna进行pcr扩增的体系如下：
[0126]
[0127][0128]
其中，2
×
es taq mastermix为北京康为世纪生物科技有限公司产品。
[0129]
pcr扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃终延伸10min。
[0130]
对所得这43对引物的pcr产物利用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，50bp ladder作为pcr扩增产物的质量标准，120v电泳35min，凝胶成像仪下观察。结果显示，每种引物均可以获得条带清晰的pcr产物，43对稳定扩增的引物的电泳检测图如图2-4。
[0131]
利用popgene32软件对这43个indel标记在12份供试材料的扩增结果进行分析，将每个indel标记的不同大小的pcr产物均作为等位基因计算每对引物反映的遗传多样性指数，各indel标记的pic见表3。
[0132]
表3、43个indel标记的pic
[0133]
indel名称picindel名称picindel名称picindel名称picindel-1-70.3538indel-6-40.3411indel-11-40.3538indel-16-30.3538indel-1-80.3047indel-6-70.3249indel-11-60.2149indel-16-50.3538indel-2-10.3249indel-7-30.3633indel-12-40.3750indel-16-70.3249indel-2-80.3698indel-7-40.3750indel-12-70.3249indel-17-10.2149indel-3-40.2800indel-7-80.3633indel-13-10.3249indel-18-30.3538indel-3-60.3698indel-8-10.2149indel-13-20.2800indel-18-50.3047indel-4-40.2800indel-8-20.3750indel-13-40.3538indel-19-40.2149indel-4-60.3411indel-9-40.2800indel-14-10.3750indel-19-80.2503indel-5-20.3698indel-9-80.2800indel-14-30.3249indel-20-10.3047indel-5-50.3698indel-10-50.3698indel-15-40.3698indel-20-80.2149indel-6-10.3538indel-10-60.3538indel-16-20.3538
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[0134]
二、32个indel标记分析遗传多样性
[0135]
在步骤一的43个indel标记中选出32个(indel-1-7、indel-1-8、indel-2-1、indel-2-8、indel-3-4、indel-3-6、indel-4-4、indel-4-6、indel-5-2、indel-5-5、indel-6-1、indel-6-4、indel-7-3、indel-7-8、indel-8-1、indel-9-4、indel-9-8、indel-10-5、indel-10-6、indel-11-6、indel-12-4、indel-12-7、indel-13-1、indel-13-4、indel-14-1、indel-15-4、indel-17-1、indel-16-3、indel-18-3、indel-19-4、indel-19-8、indel-20-1)，组成32个indel标记组成的大豆indel标记组合，利用这32对引物分别对另外96份大豆材料的基因组dna进行pcr扩增，pcr扩增体系如下：
[0136]
表4、
[0137]
成分用量基因组dna(20ng/μl-1
)1μl2
×
es taq mastermix10μl上游引物(10μmol/l)1μl下游引物(10μmol/l)1μlddh2o7μl
[0138]
其中，2
×
es taq mastermix为北京康为世纪生物科技有限公司产品。
[0139]
pcr扩增条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃终延伸10min。
[0140]
所用96份大豆材料按地理来源分成北、中、南三组，详情见表5。
[0141]
表5、96份大豆材料信息
[0142]
序号材料名称组别序号材料名称组别序号材料名称组别1洛1408北组33石11893北组65周12102-4中组2洛1407北组34圣豆102北组66商豆1310中组3陕豆1号北组35圣豆103北组67商豆161中组4中品16067北组36华豆30北组68秦豆2017中组5中品1184北组37道秋37北组69秦豆220中组6廊轮选4号北组38漯豆4904中组70中黄320中组7廊轮选2号北组39漯豆7901中组71菏豆44中组8hn2018北组40华豆21中组72濮豆5136中组9中作j161087北组41圣育5号中组73科豆18中组10科豆26北组42圣育6号中组74中作11-518中组11中作12-1251北组43华育2号中组75中作11-719中组12沧豆1123北组44道秋6号中组76郑1677中组13沧豆1312北组45泛豆13中组77郑16175中组14冀1708北组46泛豆19中组78济j14187中组15冀豆12北组47鲁lh284中组79汾豆104中组16冀1702北组48陕豆2号中组80济g15073中组17冀1701北组49洛1337中组81汾豆103中组18邯16-139北组50洛1330中组82永育1号中组19邯15-324北组51中黄104中组83鲁0540-4中组20濉科56北组52中黄105中组84hn1030中组21濉科55北组53中作11-11中组85晋科3号中组22安豆6223北组54中作11-54中组86晋黄11号中组23安豆331北组55潍豆1897中组87晋黄12号中组24晋遗59北组56石16s379中组88安豆109中组25晋遗57北组57安豆6023中组89皖豆920南组26科豆31北组58濉科57中组90濉科58南组27中黄103北组59邯15-685中组91商豆18南组28中作08-08北组60邯豆5号中组92陕豆3号南组29中作11-58北组61邯13-109中组93鲁0126南组30潍豆1897北组62冀1707中组94邯617南组31潍豆12北组63沧豆11中组95安豆115南组32石12503北组64沧豆09y1中组96安豆5451南组
[0143]
对所得的pcr产物利用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，50bp ladder作为pcr扩增产物的质量标准，120v电泳35min，凝胶成像仪下观察。结果显示，每种引物均可以获得条带清晰
的pcr产物。
[0144]
将每个indel标记的不同大小的pcr产物均作为等位基因，利用popgene32软件分析32个标记在96个大豆材料群体的nei多样性指数、香农指数以及pic，结果见表6。结果显示，每个indel标记的nei多样性指数分布在0.1486-0.4999，均值为0.3935；shi分布在0.2807-0.6931，均值为0.5779；pic分布在0.1528-0.5953，均值为0.3963。nei多样性指数、shi、pic变幅较大，表明这32个indel标记在96份大豆材料中能较好地反映出其丰富的遗传多样性信息。
[0145]
表6、32个indel标记的nei多样性指数、shi、pic
[0146]
indel标记名称等位变异数nei多样性指数shipicindel-1-73.00000.34570.52970.2963indel-1-83.00000.35920.54490.3904indel-2-12.00000.32250.50330.3277indel-2-82.00000.27100.44230.2778indel-3-43.00000.30470.48260.2863indel-3-62.00000.45310.69130.5099indel-4-42.00000.48310.64550.4707indel-4-62.00000.25710.42530.2188indel-5-23.00000.48310.65810.4946indel-5-52.00000.48080.67620.4674indel-6-12.00000.31500.49460.2963indel-6-42.00000.37750.56520.3852indel-7-32.00000.48850.67160.4824indel-7-82.00000.45100.64330.4373indel-8-12.00000.23420.39660.1919indel-9-42.00000.45120.64350.4370indel-9-82.00000.43490.62660.4387indel-10-52.00000.49990.69310.5000indel-10-62.00000.41670.60740.3670indel-11-63.00000.26150.43070.2389indel-12-42.00000.43460.62620.4420indel-12-73.00000.48240.67550.4900indel-13-12.00000.38520.57350.3931indel-13-42.00000.49870.69180.5000indel-14-12.00000.49640.68960.5953indel-15-42.00000.28910.46410.2963indel-17-12.00000.43750.62930.4373indel-16-32.00000.49380.68700.4965indel-18-32.00000.41670.60740.5623indel-19-42.00000.14860.28070.1528
indel-19-82.00000.35670.54210.3299indel-20-13.00000.46130.65390.4714平均值2.21880.39350.57790.3963
[0147]
利用popgene32软件分析这32个indel标记在37份北组材料中的nei多样性指数、香农指数以及pic，结果见表7。每个indel标记的nei多样性指数分布在0.1184-0.5000，均值为0.3990；shi分布在0.3365-0.6931，均值为0.5680；pic分布在0.1928-0.4938，均值为0.3859。
[0148]
表7、北组材料indel标记的nei多样性指数、shi、pic
[0149]
indel标记名称nei多样性指数shipicindel-1-70.38780.57630.3682indel-1-80.43210.62370.4383indel-2-10.31330.49260.3200indel-2-80.38780.57630.3944indel-3-40.33240.51470.3067indel-3-60.45120.43070.4918indel-4-40.41780.60860.4244indel-4-60.26590.43620.2337indel-5-20.46540.65810.4704indel-5-50.39440.58350.375indel-6-10.30680.48500.2778indel-6-40.30060.47770.3068indel-7-30.47780.67080.4821indel-7-80.43210.62370.4178indel-8-10.27780.45060.2841indel-9-40.48610.67920.4800indel-9-80.36150.54740.3389indel-10-50.50000.69310.4753indel-10-60.48210.67510.3225indel-11-60.31330.49260.4753indel-12-40.49960.69280.4762indel-12-70.47040.66330.2801indel-13-10.27780.45060.4938indel-13-40.49090.68400.4938indel-14-10.49670.68990.4938indel-15-40.19280.34250.1975indel-16-30.49630.68950.4795indel-17-10.45010.64240.4558indel-18-30.30680.4850.3133indel-19-40.18840.33650.1928
indel-19-80.41140.60170.3944indel-20-10.41140.60170.3944平均值0.39900.56800.3859
[0150]
利用popgene32软件分析这32个indel标记在51份中组材料中的nei多样性指数、香农指数以及pic，结果见表8。每个indel标记的nei多样性指数分布在0.1420-0.4983，均值为0.3798；shi分布在0.2712-0.6914，均值为0.5548；pic分布在0.1446-0.4992，平均值为0.3711。
[0151]
表8、中组材料indel标记的nei多样性指数、shi、pic
[0152][0153][0154]
数据表明，不同组别之间材料遗传多样性存在较大差别，说明这32个indel标记可
以用于鉴别不同材料间的遗传多样性。大豆材料的遗传多样性指数按大小排序为北组>中组。
[0155]
由表6可以进一步看出，indel10-5的nei多样性指数和shi最高，且pic也高于大部分标记，说明该标记对试验材料有很强的区分能力。分别计算不同组别各个indel标记的遗传多样性指数，不同组别表现出较大差异，如北组材料中indel 10-5的nei多样性指数和shi最高，区分材料的能力强；中组材料中indel 13-4的nei多样性指数和shi最高，区分材料的能力强。
[0156]
三、基于upgma的聚类分析
[0157]
根据步骤二的96份大豆材料的32对引物的pcr产物大小，利用utsys-pc 2.0软件的upgma对96份大豆材料进行聚类分析，步骤如下：
[0158]
(1)与大豆参考基因组glyma.wm82.a2v1相比，将变异类型为插入的位点记为1，变异类型为缺失的为0，未检测到变异类型的位点记为999，将数据转换为upgma支持的格式。
[0159]
(2)将数据导入upgma中，设置参数，运行程序，进行遗传距离分析。
[0160]
(3)得出聚类分析结果。
[0161]
三组大豆材料的遗传距离如图5所示，北组材料和中组材料被聚为第一类，两个组别的遗传距离为0.95，南组材料单独为一类，和北组、中组材料遗传距离较远，在遗传相似系数0.57处大豆材料可被分成3大类(表9)。
[0162]
表9、96份大豆材料的聚类分析结果
[0163][0164]
四、基于贝叶斯方法的structure群体遗传结构分析
[0165]
根据步骤二的96份大豆材料的32对引物的pcr产物大小，利用基于贝叶斯法的structure2.3.4软件对96份材料进行遗传结构分析。步骤如下：
[0166]
(1)与大豆参考基因组glyma.wm82.a2v1相比，将变异类型为插入的位点记为1，变异类型为缺失的为0，未检测到变异类型的位点记为-9，将数据转换为structure支持的格
式。
[0167]
(2)确定最佳群体组群k值。软件k值范围设置在2-7，重复次数设置为2。采用admixture model计算δk以作为衡量最佳k值得标准。
[0168]
结果见图6。当k＝5时，δk达到最大值。当k＝5时simulation result中的bar plot绘制大豆各品种所占比例(图7)。从图7可以看出，structure软件将96份大豆材料分成了五大类群，分别用5种颜色表示，柱状图描述的是不同品种被分到五个类群所占比例。
[0169]
根据所有大豆品种的q值(第i份材料基因组变异源自k组的概率)分布，当某品种q值大于等于0.6时，则认为该品种学院相对单一；若小于0.6时，则认为该品种拥有混合来源。为了更清楚阐述各材料遗传背景，对96份大豆材料q值进行了分析，其中有69个品种(71.88％)血缘较单一，被划分到5个聚类群中。不同地里来源(北组、中组、南组的)的大豆种质在5个聚类群的分布见表10。除了南组以外，北组和中组材料在5个聚类群体中均有分布，表明北组和中组材料具有丰富的遗传变异类型。
[0170]
表10、不同来源大豆种质在5个聚类群的分布
[0171][0172]
五、指纹图谱的构建
[0173]
根据步骤二的96份大豆材料的32对引物的pcr产物大小，与大豆参考基因组glyma.wm82.a2v1相比，将在相同迁移速率下，电泳检测结果为片段插入变异的条带记为1，检测结果为片段缺失的记为0，未检测到条带或检测到多于两个等位变异的记为999，获得由96分大豆材料组成的遗传图谱。
[0174]
经验证，参试的大豆材料纯度为96.84％，没有“同物异名”现象发生，因此证明基于32个indel标记构建的遗传图谱可以用于大豆品种的鉴定。