一种化学-酶法制备螺内酯的方法与流程

一种化学
‑
酶法制备螺内酯的方法
【技术领域】
1.本发明涉及有机合成技术领域，具体涉及一种制备螺内酯的方法,尤其涉及一种化学和酶法相结合的制备螺内酯的方法。


背景技术：

2.螺内酯是一种弱的保钾利尿药，又名安体舒通、螺旋内酯，为白色或类白色细微结晶性粉末，微有苦味，无臭或有轻微硫醇臭。在氯仿中极易溶解，不溶于水，溶于乙醇，易溶于苯或醋酸乙酯。化学结构与醛固酮相似，可与醛固酮竞争远曲小管及集合管细胞浆内的醛固酮受体，影响醛固酮和受体结合，从而阻碍醛固酮诱导蛋白的合成，进而抑制k
‑
na 交换，钾的排出减少，起到保钾利尿作用。结构式如式i所示：
[0003][0004]
目前已有关于式(i)化合物螺内酯制备工艺的报道，主要有两种方法，一种是以去氢表雄酮为原料，经乙炔加成，格氏反应增碳、二氧化碳羧化、催化氢化、内酯化等反应得到五元螺环后，然后再经脱氢、加成等反应制得。该合成方法反应条件苛刻，对设备的要求高，不易操作，步骤多，试剂昂贵、总收率低，成本高。
[0005]
第二种是以雄烯二酮为起始原料，经烯醚化、环氧化、内酯化得到内酯化合物，再经溴化、脱溴化氢，然后加成反应制得；该合成方法在上溴、脱溴过程中使用了溴化剂，对环境不友好，脱溴采用高温脱溴，杂质大，收率低。也有文献报道在3位酮基还是烯醇醚化时使用四氯苯醌脱氢，但是四氯苯醌及副产物四氯氢醌难处理，造成大量污染。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供了一种对环境的污染小，反应选择性高，副产物少，收率高，工业化操作成熟，适合工业化大规模生产的化学
‑
酶法制备螺内酯的方法。
[0007]
本发明的目的是通过以下方式来实现的：
[0008]
本发明提供了一种化学
‑
酶法制备螺内酯的方法，该方法的合成路线如下：
[0009][0010]
具体包括如下步骤：
[0011]
1)将4
‑
雄烯
‑
3,17二酮投入无水乙醇中，加入原甲酸三乙酯和对甲苯磺酸，保温40～45℃反应，待反应完成后，过滤，烘干得到3
‑
乙氧基
‑
雄甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
17
‑
酮(1)；
[0012]
2)投入二甲亚砜、乙醇钠和三甲基溴化锍，0～50℃搅拌半小时，投入3
‑
乙氧基
‑
雄甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
17
‑
酮(1)，保温0～50℃反应，待反应完成后，加水，过滤，干燥得17β，20β
‑
环氧
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯(2)；
[0013]
3)在无水乙醇中投入乙醇钠和丙二酸二乙酯，保温30～80℃反应，投入17β，20β
‑
环氧
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯(2)，保温30～80℃反应完成后，加入氢氧化钠水溶液，回流反应，待反应完成后，加水，过滤，干燥得17β
‑
羟基
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
21
‑
羧酸
‑
γ
‑
内酯(3)；
[0014]
4)将17β
‑
羟基
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
21
‑
羧酸
‑
γ
‑
内酯(3)、二甲基四氢呋喃和碱性磷酸酶缓冲溶液构成酶反应体系，加入胆固醇氧化酶、辅酶i、辅酶再生系统和硫酸镁，在28
‑
37℃的温度条件下进行生物酶促反应，整个反应过程控制ph在7.0～7.5，通过hplc检测生物酶促反应进程，当转化率达到95～99％时，反应结束，经后续处理，得到17β
‑
羟基
‑
17α孕甾
‑
4,6
‑
二烯
‑3‑
酮
‑
21
‑
羧酸γ
‑
内酯(4)
[0015]
5)在17β
‑
羟基
‑
17α孕甾
‑
4,6
‑
二烯
‑3‑
酮
‑
21
‑
羧酸γ
‑
内酯(4)中依次投入甲醇和硫代醋酸，回流2
‑
5小时，降温至0℃，过滤，得到的固体使用甲醇结晶精制，干燥得到螺内酯；
[0016]
进一步，步骤1)中所述无水乙醇的体积用量为底物4
‑
雄烯
‑
3,17二酮重量的0.5～10倍；所述原甲酸三乙酯的体积用量为底物4
‑
雄烯
‑
3,17二酮重量的0.6～3倍；所述对甲苯磺酸的重量用量为底物4
‑
雄烯
‑
3,17二酮重量的0.01～0.1倍。
[0017]
进一步，步骤2)中所述二甲亚砜的体积用量为底物3
‑
乙氧基
‑
雄甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
17
‑
酮(1)重量的2～10倍；所述乙醇钠的重量用量为底物3
‑
乙氧基
‑
雄甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
17
‑
酮(1)重量的0.22～0.6倍；所述三甲基溴化锍的重量用量为底物3
‑
乙氧基
‑
雄甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
17
‑
酮(1)重量的0.5～1倍。
[0018]
进一步，步骤3)中所述无水乙醇的体积用量为底物17β，20β
‑
环氧
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯(2)重量的2～10倍；所述乙醇钠的重量用量为底物17β，20β
‑
环氧
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯(2)重量的0.21～1倍；所述丙二酸二乙酯的体积用量为底物17β，20
β
‑
环氧
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯(2)重量的0.5～2.3倍；所述氢氧化钠水溶液的质量浓度为10～20％，其体积用量为底物17β，20β
‑
环氧
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯(2)重量的1～3倍。
[0019]
进一步，步骤4)中所述生物酶为胆固醇氧化酶，所述辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，所述辅酶再生系统由葡萄糖和葡萄糖脱氢酶的混合物组成；
[0020]
进一步，步骤4)中的各物料投料质量比为：
[0021]
17β
‑
羟基
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
21
‑
羧酸
‑
γ
‑
内酯：生物酶＝1：0.006～0.01，
[0022]
17β
‑
羟基
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
21
‑
羧酸
‑
γ
‑
内酯：辅酶i＝1：0.003～0.005，
[0023]
17β
‑
羟基
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
21
‑
羧酸
‑
γ
‑
内酯：葡萄糖：葡萄糖脱氢酶＝1：0.5～1：0.003～0.005；
[0024]
进一步，所述碱性磷酸酶缓冲溶液ph为7.5；
[0025]
进一步，所述胆固醇氧化酶包括如seq id no.1～12中的任一所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；
[0026]
更进一步，所述胆固醇氧化酶是在非致病性微生物中的表达产物；
[0027]
更进一步，所述非致病性微生物为大肠杆菌；
[0028]
进一步，所述后续处理具体为：加入盐酸调节ph值<3，加入乙酸乙酯和活性炭搅拌，过滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，合并滤液和淋洗液，旋蒸浓缩去除有机相，水相中加入乙酸乙酯萃取，萃取液合并旋蒸浓缩至大量晶体析出，过滤，干燥，得到17β
‑
羟基
‑
17α孕甾
‑
4,6
‑
二烯
‑3‑
酮
‑
21
‑
羧酸γ
‑
内酯(4)
[0029]
进一步，步骤5)中所述甲醇的体积用量为底物17β
‑
羟基
‑
17α孕甾
‑
4,6
‑
二烯
‑3‑
酮
‑
21
‑
羧酸γ
‑
内酯(4)重量的5～10倍；所述硫代醋酸的体积用量为底物17β
‑
羟基
‑
17α孕甾
‑
4,6
‑
二烯
‑3‑
酮
‑
21
‑
羧酸γ
‑
内酯(4)重量的0.5～1倍。
[0030]
所述葡萄糖脱氢酶通过市购获得。
[0031]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0032]
1、本发明螺内酯合成工艺路线采用胆固醇氧化酶脱氢的方法，此法专一性好，相对于传统的使用上脱溴的方法需要100℃的高温，本发明反应只需要30℃左右，条件温和，不需要特殊设备，催化速率高，脱氢工序质量收率最高达到88.7％。
[0033]
2、本发明合成路线步骤3)中脱酯基使用乙醇做溶剂，碱性环境下回流的方法，避免了传统的缩合反应后需先醋酸中和，浓缩去除溶剂，再水析，过滤拿出固体，固体加入dmf和溴化锂高温回流反应，通过本发明改进后，缩短了步骤，反应温度由约150℃降低至78℃，免除了dmf回流导致的安全风险。
[0034]
3、本发明方法所涉及各步反应产物纯化容易，最终产物总质量收率高于92％，hplc纯度大于99.8％。
[0035]
4、本发明方法总体生产成本低，可操作性强，有极高的商业竞争力，适合工业化大规模生产，具有良好的经济效益。
【附图说明】
[0036]
图1为本发明实施例13中产物螺内酯的hplc谱图。
[0037]
图2为本发明实施例14中产物螺内酯的hplc谱图。
[0038]
图3为本发明实施例15中产物螺内酯的hplc谱图。
【具体实施方式】
[0039]
结合以下实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0040]
实施例中未说明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的公开文本所描述的常规实验方法的操作即可进行，所用试剂或设备未注明厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0041]
实例1 3
‑
乙氧基
‑
雄甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
17
‑
酮的制备1
[0042]
将4
‑
雄烯
‑
3,17二酮(4ad)30g投入至15ml无水乙醇中，加入18ml原甲酸三乙酯，0.3g对甲苯磺酸，保温40℃反应，待反应完成后，过滤，烘干得到3
‑
乙氧基
‑
雄甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
17
‑
酮31.5g。
[0043]
实例2 3
‑
乙氧基
‑
雄甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
17
‑
酮的制备2
[0044]
将4
‑
雄烯
‑
3,17二酮(4ad)30g投入至150ml无水乙醇中，加入60ml原甲酸三乙酯，0.15g对甲苯磺酸，保温42℃反应，待反应完成后，过滤，烘干得到3
‑
乙氧基
‑
雄甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
17
‑
酮31.3g。
[0045]
实例3 3
‑
乙氧基
‑
雄甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
17
‑
酮的制备3
[0046]
将4
‑
雄烯
‑
3,17二酮(4ad)30g投入至300ml无水乙醇中，加入90ml原甲酸三乙酯，0.3g对甲苯磺酸，保温45℃反应，待反应完成后，过滤，烘干得到3
‑
乙氧基
‑
雄甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
17
‑
酮31.2g。
[0047]
实例4 17β，20β
‑
环氧
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯的制备1
[0048]
投入60ml二甲亚砜、6.6g乙醇钠和15g三甲基溴化锍，0℃搅拌半小时，投入3
‑
乙氧基
‑
雄甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
17
‑
酮30g，保温0℃反应，待反应完成后，加水，过滤，干燥得17β，20β
‑
环氧
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯30.5g。
[0049]
实例5 17β，20β
‑
环氧
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯的制备2
[0050]
投入150ml二甲亚砜、9g乙醇钠和22g三甲基溴化锍，30℃搅拌半小时，投入3
‑
乙氧基
‑
雄甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
17
‑
酮30g，保温30℃反应，待反应完成后，加水，过滤，干燥得17β，20β
‑
环氧
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯30.4g。
[0051]
实例6 17β，20β
‑
环氧
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯的制备3
[0052]
投入300ml二甲亚砜、18g乙醇钠和30g三甲基溴化锍，50℃搅拌半小时，投入3
‑
乙氧基
‑
雄甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
17
‑
酮30g，保温50℃反应，待反应完成后，加水，过滤，干燥得17β，20β
‑
环氧
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯30.3g。
[0053]
实例7 17β
‑
羟基
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
21
‑
羧酸
‑
γ
‑
内酯的制备1
[0054]
在60ml无水乙醇中投入6.3g乙醇钠和15ml丙二酸二乙酯，保温80℃反应，投入30g 17β，20β
‑
环氧
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯，保温80℃反应完成后，加入30ml 20％氢氧化钠水溶液，回流反应，待反应完成后，加水，过滤，干燥得17β
‑
羟基
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
21
‑
羧酸
‑
γ
‑
内酯31.3g。
[0055]
实例8 17β
‑
羟基
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
21
‑
羧酸
‑
γ
‑
内酯的制备2
[0056]
在150ml无水乙醇中投入15g乙醇钠和35ml丙二酸二乙酯，保温50℃反应，投入30g 17β，20β
‑
环氧
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯，保温50℃反应完成后，加入60ml 13％氢氧化钠水溶液，回流反应，待反应完成后，加水，过滤，干燥得17β
‑
羟基
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
21
‑
羧酸
‑
γ
‑
内酯31.2g。
[0057]
实例9 17β
‑
羟基
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
21
‑
羧酸
‑
γ
‑
内酯的制备3
[0058]
在300ml无水乙醇中投入30g乙醇钠和69ml丙二酸二乙酯，保温30℃反应，投入30g 17β，20β
‑
环氧
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯，保温30℃反应完成后，加入90ml 10％氢氧化钠水溶液，回流反应，待反应完成后，加水，过滤，干燥得17β
‑
羟基
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
21
‑
羧酸
‑
γ
‑
内酯31.4g。
[0059]
实例10 17β
‑
羟基
‑
17α孕甾
‑
4,6
‑
二烯
‑3‑
酮
‑
21
‑
羧酸γ
‑
内酯的制备1
[0060]
将17β
‑
羟基
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
21
‑
羧酸
‑
γ
‑
内酯30g溶于180ml二甲基四氢呋喃中，加入180ml 100mm ph7.5的碱性磷酸酶缓冲溶液，开始搅拌，依次加入180mg由seq id no.3在大肠杆菌中表达得到的胆固醇氧化酶，15g葡萄糖，480mg硫酸镁，90mg葡萄糖脱氢酶，90mg辅酶i，28℃温度条件下进行生物酶促反应，并用40％氢氧化钠溶液控制ph值7.0。5小时后取样检测，转化率为98.2％，加入37％盐酸调节ph值<3，加入180ml乙酸乙酯和15g活性炭搅拌1小时，过滤，滤饼用120ml乙酸乙酯淋洗三遍，合并滤液和淋洗液，旋蒸浓缩去除有机相，水相中加入180ml乙酸乙酯萃取三遍，萃取液合并旋蒸浓缩至大量晶体析出，室温析晶12小时，过滤，干燥，得到17β
‑
羟基
‑
17α孕甾
‑
4,6
‑
二烯
‑3‑
酮
‑
21
‑
羧酸γ
‑
内酯26.1g，hplc纯度99％。
[0061]
实例11 17β
‑
羟基
‑
17α孕甾
‑
4,6
‑
二烯
‑3‑
酮
‑
21
‑
羧酸γ
‑
内酯的制备2
[0062]
将17β
‑
羟基
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
21
‑
羧酸
‑
γ
‑
内酯30g溶于180ml二甲基四氢呋喃中，加入180ml 100mm ph7.5的碱性磷酸酶缓冲溶液，开始搅拌，依次加入240mg由seq id no.8在大肠杆菌中表达得到的胆固醇氧化酶，24g葡萄糖，480mg硫酸镁，120mg葡萄糖脱氢酶，120mg辅酶i，32℃温度条件下进行生物酶促反应，并用40％氢氧化钠溶液控制ph值7.2。5小时后取样检测，转化率为97.9％，加入37％盐酸调节ph值<3，加入180ml乙酸乙酯和15g活性炭搅拌1小时，过滤，滤饼用120ml乙酸乙酯淋洗三遍，合并滤液和淋洗液，旋蒸浓缩去除有机相，水相中加入180ml乙酸乙酯萃取三遍，萃取液合并旋蒸浓缩至大量晶体析出，室温析晶12小时，过滤，干燥，得到17β
‑
羟基
‑
17α孕甾
‑
4,6
‑
二烯
‑3‑
酮
‑
21
‑
羧酸γ
‑
内酯25.8g，hplc纯度99％。
[0063]
实例12 17β
‑
羟基
‑
17α孕甾
‑
4,6
‑
二烯
‑3‑
酮
‑
21
‑
羧酸γ
‑
内酯的制备3
[0064]
将17β
‑
羟基
‑3‑
乙氧基
‑
17α
‑
孕甾
‑
3,5
‑
二烯
‑
21
‑
羧酸
‑
γ
‑
内酯30g溶于180ml二甲基四氢呋喃中，加入180ml 100mm ph7.5的碱性磷酸酶缓冲溶液，开始搅拌，依次加入300mg由seq id no.11在大肠杆菌中表达得到的胆固醇氧化酶，30g葡萄糖，480mg硫酸镁，150mg葡萄糖脱氢酶，150mg辅酶i，37℃温度条件下进行生物酶促反应，并用40％氢氧化钠溶液控制ph值7.5。5小时后取样检测，转化率为98.5％，加入37％盐酸调节ph值<3，加入180ml乙酸乙酯和15g活性炭搅拌1小时，过滤，滤饼用120ml乙酸乙酯淋洗三遍，合并滤液和淋洗液，旋蒸浓缩去除有机相，水相中加入180ml乙酸乙酯萃取三遍，萃取液合并旋蒸浓缩至大量晶体
析出，室温析晶12小时，过滤，干燥，得到17β
‑
羟基
‑
17α孕甾
‑
4,6
‑
二烯
‑3‑
酮
‑
21
‑
羧酸γ
‑
内酯26.6g，hplc纯度99％。
[0065]
实例13螺内酯的制备1
[0066]
在20g17β
‑
羟基
‑
17α孕甾
‑
4,6
‑
二烯
‑3‑
酮
‑
21
‑
羧酸γ
‑
内酯中依次投入100ml甲醇和10ml硫代醋酸，回流5小时，降温至0℃，过滤，固体使用甲醇结晶精制，干燥得到螺内酯20.1g，质量收率：100.5％，hplc纯度99.823％，如图1所示。
[0067]
实例14螺内酯的制备2
[0068]
在20g17β
‑
羟基
‑
17α孕甾
‑
4,6
‑
二烯
‑3‑
酮
‑
21
‑
羧酸γ
‑
内酯中依次投入150ml甲醇和15ml硫代醋酸，回流4小时，降温至0℃，过滤，固体使用甲醇结晶精制，干燥得到螺内酯19.8g，质量收率：99.0％，hplc纯度99.848％，如图2所示。
[0069]
实例15螺内酯的制备3
[0070]
在20g17β
‑
羟基
‑
17α孕甾
‑
4,6
‑
二烯
‑3‑
酮
‑
21
‑
羧酸γ
‑
内酯中依次投入200ml甲醇和20ml硫代醋酸，回流2小时，降温至0℃，过滤，固体使用甲醇结晶精制，干燥得到螺内酯19.7g，质量收率：98.5％，hplc纯度99.842％，如图3所示。
[0071]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。