一种紫花苜蓿MsWRKY19基因及其在铬胁迫环境中的应用的制作方法

一种紫花苜蓿mswrky19基因及其在铬胁迫环境中的应用
技术领域
1.本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及紫花苜蓿抗逆基因mswrky19及其在提高植物抗逆性和改善土壤环境中的应用。


背景技术：

2.全球经济化的迅速发展，采矿、冶金和制造等工业向环境中排放的有毒重金属逐渐增多，造成土壤污染日益加重。据农业部调查结果显示，目前我国污水灌溉面积约1.40
×
106hm2，其中遭受重金属污染的土地面积占污水灌溉总面积的64.8％。在土壤重金属污染中，重金属铬是主要成分之一。铬(cr)是广泛存在于环境中的“五毒”元素之一，也是一种致畸形剂。cr作为重要的战略性资源，被广泛应用于各种行业中。尤其化工、轻工、冶金等行业产生大量铬渣及含铬废气。cr进入土壤后，严重的破坏了生态环境，使人类的生存、健康受到严重威胁。因此，如何有效控制cr元素、修复土壤重金属污染，成为一项极其重要且紧迫的工作。修复土壤重金属污染主要有物理化学联用法和植物修复法。植物修复是一种理想的环境友好型修复方法，其修复过程对土壤影响小、修复效果永久、修复成本低等优点正逐步成为土壤重金属污染修复领域研究的热点。
3.紫花苜蓿(medicago sativa l.)对多种重金属具有较高的富集作用，是一种很有应用前景的土壤重金属修复植物。研究显示，在重金属污染浓度为我国二级标准时，紫花苜蓿的生长不受到重金属影响。peralta
‑
videa等发现紫花苜蓿生长在重金属污染环境中20天后，90％都可以正常生长。同样，还有学者认为重金属对紫花苜蓿的萌发率、根长和株高生长产生促进作用。wang等认为低浓度cdcl2可以促进紫花苜蓿种子的萌发。在关于吸附重金属cr的研究中，有报道通过定量方式测定了紫花苜蓿吸附cr的能力，在20mg
·
kg
‑1k2cr2o7离子处理下的紫花苜蓿根、茎、叶k2cr2o7离子含量分别是对照组的64、34、5倍；经过k2cr2o7离子处理紫花苜蓿20天后，其对cr的吸附达到1088.5mg/kg。但由于土壤修复的紧迫性，紫花苜蓿富集重金属的能力还不够理想，所以对于获得重金属超富集的紫花苜蓿植株显得尤为重要。wrky基因是一类参与生物和非生物胁迫的植物转录因子。1994年ishiguro和nakamura从甘薯(ipomoea batatas l.)基因组中分离出wrky基因的cdna序列。研究者们发现wrky基因广泛参与生物和非生物胁迫下植物的应激反应。当植物受到如盐害、干旱、高温及病原菌入侵等胁迫时，wrky基因的表达量都会上调。wrky19是wrky基因家族的一员，是在紫花苜蓿中发现的参与紫花苜蓿的生物与非生物胁迫应激反应的转录因子。wrky基因参与植物的非生物胁迫反应越来越受到关注。其中重金属胁迫方向是研究的热点，然而目前国内外尚无紫花苜蓿中wrky家族基因有关功能的报道。深入的探究wrky基因调控紫花苜蓿对于重金属的耐受及富集的分子机制对研究wrky家族的生物学功能具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种紫花苜蓿抗铬胁迫基因mswrky19及其应用。更为具体的，所述紫花苜蓿抗铬胁迫基因mswrky19的核苷酸序列如seq id no.1所示。
5.本发明的另一方面提供了含有上述基因mswrky19的过表达载体。在本发明的一个实施例中，所述过表达载体的结构如图1所示。该过表达载体的构建方法为：
6.(1)在保持mswrky19转录因子氨基酸序列不发生改变的前提下，将编码基因的所有密码子采用紫花苜蓿密码子最适编码方式进行密码子替换，对经修饰后的基因序列再通过dnaman7.0和vector nti 10.0软件分析其中的酶切位点信息，根据酶切位点信息设计合成mswrky19基因序列和mswrky19rnai基因序列，并送于公司合成；
7.(2)构建过表达表达载体pcambia3301
‑
mswrky19，将合成后的mswrky19基因连入克隆载体puc19载体中，命名为puc19
‑
mswrky19。利用限制性内切酶nco i和bste ii在37℃将mswrky19基因从该载体上切下，并用同样的方式处理pcambia3301，经凝胶电泳纯化回收puc19的小片段和pcambia3301释放出的大片段，并用t4连接酶在16℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌，在kan 抗性的lb固体培养基上37℃过夜培养。待培养基上长出菌落，挑取4
‑
6个抗性菌落，并送于公司测序，将测序正确的载体命名为pcambia3301
‑
mswrky19。
8.(3)构建过基因沉默载体pcambia3301
‑
mswrky19 rnai：将合成后的mswrky19rnai基因连入克隆载体puc19载体中，命名为puc19
‑
mswrky19rnai。利用限制性内切酶nco i和bste ii在37℃将mswrky19rnai基因从该载体上切下，并用同样的方式处理pcambia3301，经凝胶电泳纯化回收puc19的小片段和pcambia3301释放出的大片段，并用t4连接酶在16℃过夜连接，在kan 抗性的lb固体培养基上37℃过夜培养。待培养基上长出菌落，挑取4
‑
6个抗性菌落，并送于公司测序，将测序正确的过载体命名为pcambia3301
‑
mswrky19rnai。
9.本发明另一方面还提供了mswrky19基因在制备转基因植物中的应用。优选地，所述的植物为紫花苜蓿。
10.本发明另一方面还提供了mswrky19基因在提高植物抗逆性方面的应用。所述的抗逆性是指抗金属铬胁迫。
11.本发明另一方面还提供了克隆紫花苜蓿mswrky19基因的方法，所述包括以下步骤：
12.采用trizol法提取紫花苜蓿根系的rna，利用genbank上登录的紫花苜蓿mswrky19基因保守序列设计引物进行rt
‑
pcr获取mswrky19基因的3’端序列信息，然后用race法获得mswrky19基因的5’端序列信息，根据获得的序列信息设计引物以经反转录克隆完整的mswrky19基因cds序列。
13.本发明具有下列优点及有益效果：
14.本发明提供了紫花苜蓿mswrky19基因及其在环境污染和作物育种中的应用。具体为，通过将该基因在紫花苜蓿中过表达，显著提高紫花苜蓿对于土壤中铬离子的富集能力，从而达到改善和修复该处土壤重金属铬污染的状况。
附图说明
15.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
16.图1不同胁迫时间和不同胁迫条件下mswrky19基因的转录水平差异分析；
17.图2 mswrky19蛋白质与苜蓿中其他wrky家族成员氨基酸结构域序列比对结果；
18.图3 mswrky19蛋白质的系统进化树分析；
19.图4高频再生无性系不同外植体的再生；
20.图5 mswrky19基因的超表达和沉默转基因紫花苜蓿载体构建示意图；
21.图6 mswrky19基因的超表达和沉默转基因紫花苜蓿株系的获得；
22.图7在80mg
·
l
‑1的k2cr2o7溶液处理培养24hr的过表达和沉默转基因紫花苜蓿生理生化指标(包括：mda、脯氨酸含量、sod、pod)的变化。
具体实施方式
23.以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
24.实施例1 mswrky19基因的获得
25.利用在线生物信息学软件nnpsl(http://predict.sanger.ac.uk/nnpsl)、targetp(http://www.cbs.dtu.dk/services/targetp/)、psort(http://psort.nibb.ac.jp)、predotar(http://www.inra.fr/internet/produits/predotar/)、以及subloc(http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/subloc/)分析mswrky19蛋白n端前导肽序列，通过算法比较查询序列中所包含的特征参数与各类相应的location的相似度，推测其可能的细胞定位。
26.采用trizol法提取紫花苜蓿根系的rna，利用genbank上登录的紫花苜蓿mswrky19基因保守序列设计引物进行rt
‑
pcr获取mswrky19基因的3’端序列信息，然后用race法获得mswrky19基因的5’端序列信息，根据获得的序列信息设计引物以经反转录克隆mswrky19基因编码的前导肽的核酸序列。
27.通过in
‑
fusion法构建以35s启动子驱动mswrky19基因前导肽和绿色荧光蛋白gfp基因融合的植物表达载体pcambia3300
‑
35s::mswrky19
‑
gfp。经peg介导转化紫花苜蓿原生质体，置于lsm510型激光共聚焦显微镜下观察，进行亚细胞定位研究。
28.采用trizol法提取紫花苜蓿根系的rna，利用genbank上登录的紫花苜蓿mswrky19基因保守序列设计引物进行rt
‑
pcr获取mswrky19基因的3’端序列信息，然后用race法获得mswrky19基因的5’端序列信息，根据获得的序列信息设计引物以经反转录克隆完整的mswrky19基因序列(seq id no.:1)。
29.分别提取在含有0、20、100mm k2cr2o7的1/3ms培养基中胁迫处理0h、5h的紫花苜蓿幼苗根部总rna，反转录的cdna为模板，进行荧光定量pcr检测，结果表明：在高浓度(100mm)k2cr2o7条件下胁迫5h，mswrky19基因转录水平显著上调；低浓度(20mm)k2cr2o7条件下胁迫5h，mswrky19基因转录水平均略微下调(图1)。
30.实施例2 mswrky19基因的生物信息学分析
31.用orf finder分析表明，该基因全长为2174bp，包含1个1554bp的完整开放阅读框序列(orf)，起始密码子为atg，终止密码子为taa，包括208bp的5'非翻译区和412bp的3'非翻译区，共编码517个氨基酸。核苷酸序列分析发现该cdna序列含有两个wrky保守结构域和2个c2h2不同的锌指基序，一个是c
‑
x4
‑
c
‑
x22
‑
h
‑
x1
‑
h，另一个是c
‑
x4
‑
c
‑
x23
‑
h
‑
x1
‑
h，表明其属于第ⅰ类wrky家族成员。protparam软件分析显示其分子量为128.14kda，等电点为4.96，不稳定系数为47.02，属于不稳定蛋白。亲水性平均数为0.908，预测该蛋白为疏水性蛋白。
32.通过protscale软件对蛋白质整体分析显示，疏水性氨基酸均匀分布在整个多肽链中，推测该编码蛋白是一个疏水性蛋白，与protparam软件预测结果一致。
33.利用clustalx 8和mega 4软件对mswrky19蛋白质进行多重序列比对(图2)，并绘制系统进化树(图3)。结果表明，其与苜蓿中wrky家族的mtwrky20和mtwrky21具有较高的同源性。
34.实施例3转基因紫花苜蓿的获得
35.1.过表达载体和基因沉默载体的构建
36.在保持mswrky19转录因子氨基酸序列不发生改变的前提下，利用gene designer将编码基因的所有密码子采用紫花苜蓿密码子最适编码方式进行密码子替换，对经修饰后的基因序列再通过dnaman7.0和vector nti 10.0软件分析其中的酶切位点信息，设计合成了mswrky19基因以及mswrky19rnai基因序列，mswrky19基因序列如seq id no.:1所示，并送于公司合成。
37.(1)构建过表达表达载体pcambia3301
‑
mswrky19：合成后的mswrky19基因连入克隆载体puc19载体中，命名为puc19
‑
mswrky19。利用限制性内切酶nco i和bste ii在37℃将mswrky19基因从该载体上切下，并用同样的方式处理pcambia3301，经凝胶电泳纯化回收puc19的小片段和pcambia3301释放出的大片段，并用t4连接酶在16℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌，在kan 抗性的lb固体培养基上37℃过夜培养。待培养基上长出菌落，挑取4
‑
6个抗性菌落，并送于公司测序，将测序正确的载体命名为pcambia3301
‑
mswrky19。
38.(2)构建过基因沉默载体pcambia3301
‑
mswrky19 rnai：合成后的mswrky19rnai基因连入克隆载体puc19载体中，命名为puc19
‑
mswrky19rnai。利用限制性内切酶nco i和bste ii在37℃将mswrky19rnai基因从该载体上切下，并用同样的方式处理pcambia3301，经凝胶电泳纯化回收puc19的小片段和pcambia3301释放出的大片段，并用t4连接酶在16℃过夜连接，在kan 抗性的lb固体培养基上37℃过夜培养。待培养基上长出菌落，挑取4
‑
6个抗性菌落，并送于公司测序，将测序正确的载体命名为pcambia3301
‑
mswrky19rnai。
39.2.利用农杆菌介导的叶盘转化法转化紫花苜蓿，获得紫花苜蓿mswrky19基因超表达和沉默转基因植株(图4
‑
6)。
40.实施例4 mswrky19基因在紫花苜蓿中的抗逆功能验证
41.1.以非转基因紫花苜蓿作为对照，测定80mg
·
l
‑1的k2cr2o7溶液处理培养24hr的过表达和沉默转基因紫花苜蓿生理生化指标(包括：mda、脯氨酸含量、sod、pod)的变化水平，分析mswrky19基因在植物中的功能。具体方法如下：
42.丙二醛(mda)：硫代巴比妥酸法。
43.脯氨酸(pro)：用80％乙醇提取，茚三酮显色后用分光光度计法测定。
44.超氧化物歧化酶(sod)：氮蓝四唑(nbt)法测定。
45.过氧化物酶(pod)：愈创木酚法测定。
46.2.选取温州龙湾区铬污染超标的工业园区，土壤中铬含量达到139.712mg
·
kg
‑1(土壤中背景值约为50mg
·
kg
‑1)，取土放在60
×
30cm的种植盒中，种上转基因紫花苜蓿，采用硝酸
‑
高氯酸法消解样品，日立180
‑
80原子吸收分析仪检测紫花苜蓿中铬积累量，以及种植前后土壤中铬含量的变化。
47.结果如图7和表1所示，过表达mswrky19基因的紫花苜蓿植株中，茎叶和根系的铬
积累量分别达到41.848
±
5.890mg
·
kg
‑1和36.733
±
2.791mg
·
kg
‑1，种植过表达mswrky19基因的紫花苜蓿后，土壤中的铬含量显著下降，接近土壤背景值。由此可见过表达mswrky19基因的紫花苜蓿能够显著提高紫花苜蓿对于土壤中铬离子的富集能力，从而达到改善和修复该处土壤重金属铬污染的状况。
48.表1紫花苜蓿的铬积累量和土壤中铬含量变化(mg
·
kg
‑1)
[0049][0050]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。