以生化方式生产的檀香油的制作方法

1.本发明涉及香料领域。更具体地，它涉及如本文所定义的以生化方式生产的檀香油。此外，本发明包括以生化方式生产的檀香油作为加香组合物或加香消费品的一部分的用途。本发明包括以生化方式生产的檀香油作为抗微生物剂和抗炎剂以及作为节肢动物防治组合物的用途。


背景技术：

2.从檀香树的心材和根部蒸馏而来的檀香油是最有价值的精油之一，因其木质香调而受到调香师的重视，为香料(日化香精)提供了浓郁的基调，并作为天然定香剂。除了作为生产精油的原料外，该木材还用于雕刻和家具制造。对木材和精油的需求不断增长且价格非常高，一棵生长缓慢的树需要30到60年才能收获，根部和心材的破坏性收获没有可持续的收获选择，该场景是不受控制和非法采伐和破坏自然资源。40年前，檀香油的售价低于100美元/公斤；今天它的市场价值超过2,000美元/公斤，反映了供应的限制。
3.檀香油来自一系列物种，虽然它们都有相似的用途，但不同物种的油的品质和特性各不相同。用于蒸馏精油的主要品种如下所列，其中东印度檀香油和澳大利亚檀香油在市场上占主导地位：东印度檀香油(santalum album)是最知名和最古老的檀香贸易类型，并且已经使用了数千年。栽培以印度为中心(原产于印度南部高地和马来亚(malayan)群岛)，生产中心在印度迈索尔(mysore)。它的自然分布一直延伸到印度尼西亚(尤其是帝汶)，并已被引入澳大利亚并在热带西北部地区建立种植园——估计有8,000公顷，每年增加约1,000公顷；最近它也被引入到一些南太平洋岛屿和种植园(斐济、汤加、瓦努阿图、新喀里多尼亚)；澳大利亚檀香油(santalum spicatum，又名eucarya spicata(也称为西澳大利亚檀香油)原产于澳大利亚西南部沙漠状地区，靠近珀斯。现在也建立了大量种植园——约15,000公顷，每年增加1～2,000公顷。第二个檀香树种大花澳洲檀香(s.lanceolatum)在澳大利亚也有发现，主要在昆士兰、新南威尔士州和西澳大利亚的西北部，但很少用于商业用途。夏威夷檀香(santalum paniculatum)仅在夏威夷发现。据报道，约7,000公顷土地处于可持续管理之下。商业油现在进入市场。斐济檀香(santalum yasi)发现于斐济、萨摩亚和汤加。传统上包括在混合种植农林种植系统中。该物种很容易与檀香(s.album)杂交，取决于来源树而导致质量参差不齐的油。
4.心材和根部在蒸馏前被切碎并粗磨研磨。出油量因植株部位、树龄和栽培环境而异。根部可以提供高至10％的油；心材高至4％。蒸馏需要48到72小时，当油的收率不再经济时，蒸馏有效地结束。高压蒸汽蒸馏会产生更高的收率并减少蒸馏时间，但会失去一些微妙的香调。
5.发展中经济体工作人口数量的增加导致压力水平增加，这使消费者倾向于去水疗中心放松。这最终对檀香油市场产生了积极影响，因为它是一种广泛用于芳香疗法的精油。与合成香料相比，对天然香料的需求增加是檀香油市场的主要推动力。随着人口可支配收入的增加，对香皂、洗发剂和乳液等个人护理产品的需求不断增加，从而推动了市场的增
长。然而，檀香油的高价预计将阻碍檀香油市场的增长。
6.不幸的是，由于檀香产品尤其是檀香油的价值很高，檀香树的开采历史悠久。对该树的有价值的油的高需求导致过度采伐，因此，檀香树是其范围内最受开发的植物群之一。今天，国际自然保护联盟iucn将许多檀香树种视为“易危”。
7.因此，需要制备可用于上述商业用途的檀香油的替代方法。


技术实现要素：

8.本发明提供了一种以生化方式生产的檀香油。
9.本发明的一个方面提供了一种以生化方式生产的檀香油，其包含至少85％的檀香醇(santalol)和香柠檬醇(bergamotol)以及1％或更少的顺式澳白檀醇(lanceol)，其中该油具有一个或多个以下特征：i)5％或更少的α
‑
檀香醛，ii)5％或更少的法呢醇；iii)0.5％或更少的螺檀香醇(spirosantalol)。
10.本发明该形态的一个实施方案是其中85％的檀香醇和香柠檬醇包含37～65％的α
‑
檀香醇、13～37％的β
‑
檀香醇和1～35％的香柠檬醇。
11.本发明该形态的一个实施方案是其中顺式α
‑
檀香醇与反式α
‑
檀香醇的比为90:1或更小。
12.本发明该形态的一个实施方案是其中α
‑
檀香醛是90％或更多的反式α
‑
檀香醛。
13.本发明该形态的一个实施方案是其中以生化方式生产的檀香油包含0～1％的顺式β
‑
甜橙醇(sinensol)。
14.本发明该形态的一个实施方案是其中以生化方式生产的檀香油包含：i)50～60％的α
‑
檀香醇，ii)20～35％的β
‑
檀香醇；iii)5％或更少的α
‑
檀香醛；iv)5％或更少的法呢醇；v)5％或更少的螺檀香醇；vi)4～10％的香柠檬醇；vii)0～5％的顺式β
‑
甜橙醇；viii)5％或更少的表
‑
β
‑
檀香醇。
15.本发明该形态的一个实施方案是其中以生化方式生产的檀香油包含：i)54％～59％的α
‑
檀香醇；ii)25.1％～30％的β
‑
檀香醇；iii)0.7％～3％的α
‑
檀香醛；iv)1％～2.3％的法呢醇；v)0.5％或更少的螺檀香醇；vi)6.3％～7.2％的香柠檬醇；vii)0.6％～1.4％的顺式β
‑
甜橙醇；viii)1％～2％的表
‑
β
‑
檀香醇。
16.本发明该形态的一个实施方案是其中以生化方式生产的檀香油是以微生物方式产生的。
17.本发明该形态的一个实施方案是其中以生化方式生产的檀香油被包封在基质材料内。
18.本发明的一个形态提供了一种制备本发明的以生化方式生产的檀香油的方法，包括(i)培养能够生产fpp并表达合适倍半萜合酶、细胞色素p450和cpr的基因工程改造的生物，和(ii)分离本发明的以生化方式生产的檀香油。
19.本发明的一个形态提供了一种加香组合物，其包含：i)本发明的檀香油；ii)至少一种从由香料载体和香料基料构成的群组中选出的成分；和iii)选地，至少一种香料佐剂。
20.本发明的一个形态提供了一种已加香消费品，其包含本发明的以生化方式生产的檀香油或加香组合物。
21.本发明该形态的一个实施方案是其中香料消费品是香水、织物护理产品、身体护
理产品、化妆品制剂、皮肤护理产品、空气护理产品或家庭护理产品，或其中香水消费品是精细香水、涂抹式香水或淡香精、古龙水、剃须水或须后水、液体或固体洗涤剂、织物柔软剂、织物清新剂、熨烫水、纸张、漂白剂、地毯清洁剂、窗帘护理产品、洗发剂、着色制剂、颜色护理产品、头发定型产品、牙齿护理产品、消毒剂、私处护理产品、头发喷雾剂、雪花膏、体香剂或止汗剂、脱毛剂、晒黑或防晒产品、美甲产品、皮肤清洁剂、化妆品、香皂、沐浴摩丝、浴油或沐浴露、或足部/手部护理产品、卫生用品、空气清新剂、“即用型”粉末空气清新剂、去霉剂、家具护理剂、擦拭巾、餐具洗涤剂或硬表面洗涤剂、皮革护理产品、汽车护理产品。
22.本发明的一个形态提供了本发明的檀香油，其用于治疗微生物感染、炎症和/或增加皮肤保湿，或用于治疗痤疮、湿疹、牛皮癣、脂溢性皮炎或特应性皮炎。
23.本发明的一个形态提供了包含本发明的檀香油的节肢动物防治组合物。
附图说明
24.图1：对大肠杆菌产生的分子进行gcms分析，这些分子经过工程改造以产生倍半萜并表达α
‑
檀香萜/β
‑
檀香萜合酶(sasas)、细胞色素p450还原酶(cprm)和细胞色素p450单加氧酶sacp816。a.培养基溶剂提取后获得的总倍半萜混合物。b.在额外的纯化步骤后获得的氧化倍半萜组分。1、α
‑
檀香萜(santalene)；2、α
‑
反式香柠檬烯(bergamotene)；3、表
‑
β
‑
檀香萜；4、β
‑
檀香萜；5、(z)
‑
α
‑
檀香醇；6、(z)
‑
α
‑
反式香柠檬醇；7、(z)
‑
表
‑
β
‑
檀香醇；8、(z)
‑
β
‑
檀香醇。
25.图2：测量由nhdf和nhek细胞在促炎挑战下释放的细胞因子的工作流程。
26.图3：nhdf(a)和nhek(b和c)细胞在用本发明的檀香油和檀香(s.album)精油处理26小时后在不同促炎挑战下的存活率。使用标准mts测定法测量细胞存活率。每种条件一式三份测量。在所有图面中——第4列和第5列是布洛芬；第6至10列为本发明的檀香油；第11至15列是檀香(s.album)精油。
27.图4：当暴露于本发明的檀香油24和72小时时，nhek细胞在基础培养条件下的存活率。使用标准mts测定法测量细胞存活率，每种条件进行一式三份。
28.图5：使用改编自t.等人(pesticide biochemistry and physiology.2013；107(2):160
–
168)的测试，本发明的檀香油对蜱驱避性(篦子硬蜱(ixodes ricinus))的剂量反应。
29.图6：使用t.等人(j.of the american mosquito control association(2010),26(4):381
‑
386)所述的暖体测定法测量的本发明的檀香油对蚊驱避性(埃及伊蚊(a.aegyptii))的剂量反应。
30.图7：在用10、20和40μg/ml的本发明檀香油处理的nheks细胞中对选定mrna转录的影响。
31.图8：在24和72小时时，20和40μg/ml的本发明檀香油对nheks细胞中蛋白质表达的影响(分别为图8a和图8b)。
32.图9：20和40μg/ml的本发明檀香油对重建人表皮中生物素扩散的影响。
33.图10：20和40μg/ml的本发明檀香油对模仿敏感皮肤的重建人表皮模型中的兜甲蛋白(loricrin)、内披蛋白(involucrin)和透明质酸合酶3的表达水平的影响。
具体实施方式
34.在本文提供的描述和所附权利要求的上下文中，除非另有说明，否则“或”的使用意味着“和/或”。
35.类似地，各种时态的“含”、“含有”、“包含”和“包括”是可互换的而不是限制性的。
36.术语“约”表示所述值的
±
25％的可能变化，特别是
±
15％、
±
10％、更特别是
±
5％、
±
2％或
±
1％。
37.术语“基本上”描述的值范围为约80至100％，例如85至99.9％，特别是90至99.9％，更特别是95至99.9％，或98至99.9％，尤其是99至99.9％。
[0038]“主要地”是指大于50％的范围内的比例，例如在51％至100％的范围内，特别是在75％至99.9％的范围内；尤其是85至98.5％，例如95至99％。
[0039]
本发明的以生化方式生产的檀香油可包含以下化合物。
[0040]
顺式α
‑
檀香醇，( )
‑
顺式α
‑
檀香醇(α(2z)
‑
檀香醇)，( )
‑
(2z)
‑5‑
[(1s,3r,4r)
‑
2,3
‑
二甲基三环[2.2.1.0～2,6～]庚
‑3‑
基]
‑2‑
甲基
‑2‑
戊烯
‑1‑
醇。
[0041]
反式α
‑
檀香醇，( )
‑
反式α
‑
檀香醇(α(2e)
‑
檀香醇)，(2e)
‑5‑
[(3s)
‑
2,3
‑
二甲基三环[2.2.1.0～2,6～]庚
‑3‑
基]
‑2‑
甲基
‑2‑
戊烯
‑1‑
醇。
[0042]
顺式β
‑
檀香醇，(
‑
)
‑
顺式β
‑
檀香醇(β(2z)
‑
檀香醇)，(
‑
)
‑
(2z)
‑2‑
甲基
‑5‑
[(1s,2r,4r)
‑2‑
甲基
‑3‑
甲亚基双环[2.2.1]庚
‑2‑
基]
‑2‑
戊烯
‑1‑
醇。
[0043]
反式β
‑
檀香醇，(
‑
)
‑
反式β
‑
檀香醇(β(2e)
‑
檀香醇)，(e)
‑2‑
甲基
‑5‑
((1rs,2sr,4sr)
‑2‑
甲基
‑3‑
甲亚基双环[2.2.1]庚
‑2‑
基)戊
‑2‑
烯
‑1‑
醇。
[0044]
顺式澳白檀醇，(
‑
)
‑
顺式澳白檀醇，2,6
‑
庚二烯
‑1‑
醇，2
‑
甲基
‑6‑
[(1s)
‑4‑
甲基
‑3‑
环己烯
‑1‑
基]
‑
,(2z)
‑
。
[0045]
顺式α
‑
檀香醛(α
‑
檀香醛(z)
‑
)，( )
‑
(2z)
‑5‑
[(3r)
‑
2,3
‑
二甲基三环[2.2.1.0～2,6～]庚
‑3‑
基]
‑2‑
甲基
‑2‑
戊烯醛。
[0046]
反式α
‑
檀香醛(α
‑
檀香醛,(e)
‑
)，( )
‑
(2e)
‑5‑
[(3r)
‑
2,3
‑
二甲基三环[2.2.1.0～2,6～]庚
‑3‑
基]
‑2‑
甲基
‑2‑
戊烯醛。
[0047]
螺檀香醇，螺[双环[2.2.1]庚烷
‑
2,1'
‑
环戊烷]
‑
3'
‑
乙醇,β,3
‑
双(甲亚基)
‑
。
[0048]
法呢醇，(2e,6e)
‑
法呢醇，(2e,6e)
‑
3,7,11
‑
三甲基
‑
2,6,10
‑
十二碳三烯
‑1‑
醇，cas编号106
‑
28
‑
5。
[0049]
反式β
‑
檀香醛，(2e)
‑2‑
甲基
‑5‑
[(1s,2r,4r)
‑2‑
甲基
‑3‑
甲亚基双环[2.2.1]庚
‑2‑
基]
‑2‑
戊烯醛。
[0050]
香柠檬醇，(
‑
)
‑
(z)
‑
α
‑
香柠檬醇，(
‑
)
‑
(z)
‑5‑
((1s,5s,6r)
‑
2,6
‑
二甲基双环[3.1.1]庚
‑2‑
烯
‑6‑
基)
‑2‑
甲基戊
‑2‑
烯
‑1‑
醇。
[0051]
本发明的以生化方式生产的檀香油中还可以存在以下组分。
[0052]
(1s,2r,4s,7r)
‑
1,7
‑
二甲基
‑7‑
(4
‑
甲基
‑3‑
戊烯
‑1‑
基)双环[2.2.1]庚
‑2‑
醇。
[0053]
表
‑
β
‑
檀香醇，(z)
‑
表
‑
β
‑
檀香醇，(2z)
‑2‑
甲基
‑5‑
[(1s,2r,4r)
‑2‑
甲基
‑3‑
甲亚基双环[2.2.1]庚
‑2‑
基]
‑2‑
戊烯醛。
[0054]
二氢
‑
α
‑
檀香醇，5
‑
[(3r)
‑
2,3
‑
二甲基三环[2.2.1.0～2,6～]庚
‑3‑
基]
‑2‑
甲基
‑1‑
戊醇。
[0055]
顺式β
‑
甜橙醇，(2z,6e)
‑
2,6
‑
甲基
‑
10
‑
甲亚基
‑
2,6,11
‑
十二碳三烯
‑1‑
醇，
[0056]5‑
(2,3
‑
二甲基三环[2.2.1.02,6]庚
‑3‑
基)戊
‑3‑
烯
‑2‑
酮。
[0057]
2,3
‑
二甲基
‑3‑
(4
‑
甲基
‑3‑
戊烯
‑1‑
基)双环[2.2.1]庚
‑2‑
醇。
[0058]
(e,z)
‑
β
‑
甜橙醇，2,6,11
‑
十二碳三烯
‑1‑
醇,2,6
‑
二甲基
‑
10
‑
甲亚基
‑
,(e,z)
‑
。
[0059]
(2e,6e)
‑
β
‑
甜橙醇2,6,11
‑
十二碳三烯
‑1‑
醇,2,6
‑
二甲基
‑
10
‑
甲亚基
‑
,(2e,6e)
‑
。
[0060]
α
‑
檀香萜，α
‑
檀香萜，(7r)
‑
1,7
‑
二甲基
‑7‑
(4
‑
甲基
‑3‑
戊烯
‑1‑
基)三环[2.2.1.0～2,6～]庚烷。
[0061]
α
‑
法呢烯，(z；z)
‑
α
‑
法呢烯，(3z,6z)
‑
3,7,11
‑
三甲基
‑
1,3,6,10
‑
十二碳四烯。
[0062]
(
‑
)
‑
β
‑
檀香萜异构体，(1s,2r,4r)
‑2‑
甲基
‑3‑
甲亚基
‑2‑
(4
‑
甲基
‑3‑
戊烯
‑1‑
基)双环[2.2.1]庚烷。
[0063]
β
‑
檀香萜，(1s,2r,4r)
‑2‑
甲基
‑3‑
甲亚基
‑2‑
(4
‑
甲基
‑3‑
戊烯
‑1‑
基)双环[2.2.1]庚烷。
[0064]
α
‑
姜黄烯，( /
‑
)
‑
α
‑
姜黄烯，4
‑
(1,5
‑
二甲基
‑4‑
己烯基)
‑1‑
甲基苯。
[0065]
β
‑
姜黄烯，(
‑
)
‑
β
‑
姜黄烯，1
‑
甲基
‑4‑
(6
‑
甲基
‑5‑
庚烯
‑2‑
基)
‑
1,4
‑
环己二烯。
[0066]
本发明提供了一种以生化方式生产的檀香油，其包含至少85％的檀香醇和香柠檬醇以及1％或更少的顺式澳白檀醇，其中该油具有以下一个或多个特征：i)5％或更少的α
‑
檀香醛，ii)5％或更少的法呢醇；iii)0.5％或更少的螺檀香醇。
[0067]
如本文所用，术语“以生化方式生产”是指本发明的檀香油不是从檀香树制备的。相反，檀香油是使用生物体以生化方式生产的，该生物体已被基因工程改造以产生导致生产本发明的檀香油的生化途径。本文提供了可以提供这种生化途径的基因的例子。然而，应当理解，本发明的范围还包括具有要求保护的化学成分并使用其他生化途径提供的檀香油，包括从其他物种中分离的合成途径基因，以及经过修饰以产生本发明檀香油化学成分的基因。
[0068]
本发明提供了许多优于现有已知檀香油的优点。
[0069]
如本发明背景中的随附声明所述，由于檀香油的高价值，檀香树的开采历史悠久。对该树的有价值的油的高需求导致过度采伐，因此，檀香树是其范围内最受开发的植物群之一。这导致檀香树物种被国际自然保护联盟iucn视为“易危”。
[0070]
此外，从树木中提取檀香油的现有方法需要在使用蒸馏过程提取油之前将木材研磨成细粉。这种方法对能量的要求很高，并且还可能使用对环境有害的溶剂。
[0071]
本发明克服了这些环境和保护问题，因为油是使用基因工程改造的生物制备的。事实上，本发明的以生化方式生产的檀香油是第一种使用这种技术制备成商业上可接受的品质的檀香油。
[0072]
除了这些明显重要的环境优势之外，本发明的檀香油还具有优于现有已知檀香油的许多令人惊讶的技术优势。
[0073]
一种这样令人惊讶的技术优势是本发明的檀香油具有比任何现有已知檀香油更高比例的檀香醇和香柠檬醇(至少85％)。檀香醇——包括α和β檀香醇——以及香柠檬醇，是檀香油的关键嗅觉成分。此外，本发明的檀香油中α和β檀香醇的比例与现有已知檀香油的比例一致，因此保留了油的特征气味。
[0074]
另一个上升的技术优势是本发明的檀香油具有1％或更少的顺式澳白檀醇。本领
域已知该化合物几乎无味(baldovini等人(2011)flavor and fragrance journal vol.26,7
‑
26)。因此，通过具有较少的无味化合物，本发明的檀香油不包含基本上对油的整体嗅觉品质没有任何价值的污染化合物。
[0075]
根据本发明的檀香油与现有已知檀香油相比具有环境优势和令人惊讶的技术优势。
[0076]
下面更详细地描述上述每个形态的实施方案。如技术人员将理解的，所描述的实施方案的比上述形态中的对应特征更宽泛的任何特征不适用于该形态。
[0077]
本发明的檀香油包含至少85％的檀香醇和香柠檬醇。
[0078]“至少85％的檀香醇和香柠檬醇”包括其中本发明的檀香油包含至少85％的檀香醇和香柠檬醇。在一些实施方案中，檀香油包含至少86％的檀香醇和香柠檬醇。在一些实施方案中，檀香油包含至少87％的檀香醇和香柠檬醇。在一些实施方案中，檀香油包含至少88％的檀香醇和香柠檬醇。在一些实施方案中，檀香油包含至少89％的檀香醇和香柠檬醇。在一些实施方案中，檀香油包含至少90％的檀香醇和香柠檬醇。在一些实施方案中，檀香油包含至少91％的檀香醇和香柠檬醇。在一些实施方案中，檀香油包含至少92％的檀香醇和香柠檬醇。在一些实施方案中，檀香油包含至少93％的檀香醇和香柠檬醇。在一些实施方案中，檀香油包含至少94％的檀香醇和香柠檬醇。在一些实施方案中，檀香油包含至少95％的檀香醇和香柠檬醇。
[0079]“檀香醇”包括α
‑
檀香醇、β
‑
檀香醇和表
‑
β
‑
檀香醇。本文提供了关于这些化合物的结构和特征的信息。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含37～65％的α
‑
檀香醇和13～37％的β
‑
檀香醇。檀香油还可包含5％或更少的表
‑
β
‑
檀香醇
[0080]
在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含37～65％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含40～65％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含45～65％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含50～65％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含55～65％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含60～65％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含37～60％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含37～55％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含37～50％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含37～45％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含37～40％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含40～60％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含45～60％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含50～60％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含50～59％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含51～59％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含52～59％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含53～59％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含54～59％的α
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含20～37％的β
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含22～37％的β
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含24～37％的β
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含25～37％的β
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含20～35％的β
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含20～33％的β
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含20～31％的
β
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含20～30％的β
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含22～30％的β
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含24～30％的β
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含25～30％的β
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含25.1～30％的β
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含0.5～10％的表
‑
β
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含1～4％的表
‑
β
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含1～3％的表
‑
β
‑
檀香醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含1～2％的表
‑
β
‑
檀香醇。
[0081]
本发明的檀香油包含至少85％的檀香醇和香柠檬醇。
[0082]
本文提供了关于香柠檬醇的结构和特性的信息。
[0083]
在本发明的一个实施方案中，檀香油包含37～65％的α
‑
檀香醇和13～37％的β
‑
檀香醇和1至35％的香柠檬醇。
[0084]
在本发明的一个实施方案中，檀香油包含1至35％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含1至34％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含1至33％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含1至32％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含1至31％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含1至30％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含1至29％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含1至28％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含1至27％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含1至26％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含1至25％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含1至20％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含1至15％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含1至10％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方式中，檀香油包含2至8％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方式中，檀香油包含3至8％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方式中，檀香油包含4至8％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方式中，檀香油包含5至7.5％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方式中，檀香油包含5.5至7.5％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含6至7.4％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方式中，檀香油包含6.2至7.3％的香柠檬醇。在本发明的一个实施方式中，檀香油包含6.3至7.2％的香柠檬醇。
[0085]
本发明提供了一种以生化方式生产的檀香油，其包含至少85％的檀香醇和香柠檬醇以及1％或更少的顺式澳白檀醇。本文提供了关于顺式澳白檀醇的结构和特性的信息。
[0086]
在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.9％或更少的顺式澳白檀醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.8％或更少的顺式澳白檀醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.7％或更少的顺式澳白檀醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.6％或更少的顺式澳白檀醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.5％或更少的顺式澳白檀醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.4％或更少的顺式澳白檀醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.3％或更少的顺式澳白檀醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.2％或更少的顺式澳白檀醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.2％或更少的顺式澳白檀醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.1％或更少的顺式澳白檀醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.05％或更少的顺式澳白檀醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.01％或更少的顺式澳白檀醇。在本发明的一个实施
方案中，檀香油包含0％的顺式澳白檀醇。
[0087]
在一个实施方案中，本发明提供了一种以生化方式生产的檀香油，其包含5％或更少的α
‑
檀香醛。本文提供了关于α
‑
檀香醛的结构和特性的信息。
[0088]
在本发明的一个实施方案中，檀香油包含4％或更少的α
‑
檀香醛。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含3％或更少的α
‑
檀香醛。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含2％或更少的α
‑
檀香醛。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.2％至4％的α
‑
檀香醛。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.4％至4％的α
‑
檀香醛。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.6％至4％的α
‑
檀香醛。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.2％至3％的α
‑
檀香醛。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.4％至3％的α
‑
檀香醛。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.6％至3％的α
‑
檀香醛。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.7％至3％的α
‑
檀香醛。
[0089]
在一个实施方案中，本发明提供了一种以生化方式生产的檀香油，其包含5％或更少的法呢醇。本文提供了关于法呢醇的结构和特性的信息。
[0090]
在本发明的一个实施方案中，檀香油包含4％或更少的法呢醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含3％或更少的法呢醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含1％至3％的法呢醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含1％至2.5％的法呢醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含1％至2.4％的法呢醇。在本发明的另一个实施方案中，檀香油包含1％至2.3％的法呢醇。
[0091]
在一个实施方案中，本发明提供了一种以生化方式生产的檀香油，其包含0.5％或更少的螺檀香醇。本文提供了关于螺檀香醇的结构和特性的信息。
[0092]
在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.5％或更少的螺檀香醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.4％或更少的螺檀香醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.3％或更少的螺檀香醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.2％或更少的螺檀香醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.1％或更少的螺檀香醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.05％或更少的螺檀香醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.01％或更少的螺檀香醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0％螺檀香醇。
[0093]“α
‑
檀香醇”包括顺式α
‑
檀香醇和反式α
‑
檀香醇。本文提供了关于这些化合物的结构和特征的信息。
[0094]
本发明的一个实施方案是其中顺式α
‑
檀香醇与反式α
‑
檀香醇的比为90:1或更小。本发明的一个实施方案是其中顺式α
‑
檀香醇与反式α
‑
檀香醇的比为85:1或更小。在本发明的一个实施方案中，其中顺式α
‑
檀香醇与反式α
‑
檀香醇的比为80:1或更小。在本发明的一个实施方案中，其中顺式α
‑
檀香醇与反式α
‑
檀香醇的比为78:1或更小。在本发明的一个实施方案中，其中顺式α
‑
檀香醇与反式α
‑
檀香醇的比为75:1或更小。在本发明的一个实施方案中，其中顺式α
‑
檀香醇与反式α
‑
檀香醇的比为72:1或更小。在本发明的一个实施方案中，其中顺式α
‑
檀香醇与反式α
‑
檀香醇的比为70:1或更小。在本发明的一个实施方案中，其中顺式α
‑
檀香醇与反式α
‑
檀香醇的比为68:1或更小。在本发明的一个实施方案中，其中顺式α
‑
檀香醇与反式α
‑
檀香醇的比为66:1或更小。
[0095]“α
‑
檀香醛”包括顺式α
‑
檀香醛和反式α
‑
檀香醛。本文提供了关于这些化合物的结构和特征的信息。
[0096]
本发明的一个实施方案是其中α
‑
檀香醛为90％或更多的反式α
‑
檀香醛。本发明的一个实施方案是其中α
‑
檀香醛为92％或更多的反式α
‑
檀香醛。本发明的一个实施方案是其中α
‑
檀香醛为94％或更多的反式α
‑
檀香醛。本发明的一个实施方案是其中α
‑
檀香醛为96％或更多的反式α
‑
檀香醛。本发明的一个实施方案是其中α
‑
檀香醛为98％或更多的反式α
‑
檀香醛。本发明的一个实施方案是其中α
‑
檀香醛为99％或更多的反式α
‑
檀香醛。
[0097]
在一个实施方案中，本发明提供了一种以生化方式生产的檀香油，其包含2％或更少的顺式β
‑
甜橙醇。本文提供了关于顺式β
‑
甜橙醇的结构和特征的信息。
[0098]
在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.1～1.9％的顺式β
‑
甜橙醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.2～1.7％的顺式β
‑
甜橙醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.3～1.6％的顺式β
‑
甜橙醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.4～1.5％的顺式β
‑
甜橙醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.5～1.4％的顺式β
‑
甜橙醇。在本发明的一个实施方案中，檀香油包含0.6～1.4％的顺式β
‑
甜橙醇。
[0099]
在本发明的一个实施方案中，檀香油是其中至少85％的檀香醇和香柠檬醇包含37～65％的α
‑
檀香醇、13～37％的β
‑
檀香醇和1至35％的香柠檬醇。
[0100]
在本发明的一个实施方案中，檀香油包含：i)50～60％的α
‑
檀香醇，ii)20～35％的β
‑
檀香醇；iii)5％或更少的α
‑
檀香醛；iv)5％或更少的法呢醇；v)0.5％或更少的螺檀香醇；vi)4～10％的香柠檬醇；vii)0～5％顺式β
‑
甜橙醇；viii)5％或更少的表
‑
β
‑
檀香醇。
[0101]
在本发明的一个实施方案中，檀香油包含：i)54％～59％的α
‑
檀香醇；ii)25.1％～30％的β
‑
檀香醇；iii)0.7％～3％的α
‑
檀香醛；iv)1％～2.3％的法呢醇；v)0.5％或更少的螺檀香醇；vi)6.3％～7.2％的香柠檬醇；vii)0.6％～1.4％的顺式β
‑
甜橙醇；viii)1～2％的表
‑
β
‑
檀香醇。
[0102]
除了上面列出的化合物之外，以生化方式生产的檀香油可以包含另外的化合物。例如，(1s,2r,4s,7r)
‑
1,7
‑
二甲基
‑7‑
(4
‑
甲基
‑3‑
戊烯
‑1‑
基)双环[2.2.1]庚
‑2‑
醇、表
‑
β
‑
檀香醇、5
‑
[(3r)
‑
2,3
‑
二甲基三环[2.2.1.0～2,6～]庚
‑3‑
基]
‑2‑
甲基
‑1‑
戊醇、α
‑
檀香萜、α
‑
法呢烯、β
‑
檀香萜异构体，β
‑
檀香萜，α
‑
姜黄烯，β
‑
姜黄烯。还可以包括其他额外的化合物，尤其是在baldovini等人的(2011)flavor and fragrance journal vol.26,7
‑
26中讨论的那些化合物。
[0103]
顺式β
‑
甜橙醇、(2z,6e)
‑
2,6
‑
甲基
‑
10
‑
甲亚基
‑
2,6,11
‑
十二碳三烯
‑1‑
醇和2,3
‑
二甲基
‑3‑
(4
‑
甲基
‑3‑
戊烯
‑1‑
基)双环[2.2.1]庚
‑2‑
醇是新的。
[0104]
因此，本发明的另一形态提供顺式β
‑
甜橙醇((2z,6e)
‑
2,6
‑
二甲基
‑
10
‑
甲亚基
‑
2,6,11
‑
十二碳三烯
‑1‑
醇)。
[0105]
本发明的另一形态提供2,3
‑
二甲基
‑3‑
(4
‑
甲基
‑3‑
戊烯
‑1‑
基)双环[2.2.1]庚
‑2‑
醇。
[0106]
本发明的以生化方式生产的檀香油的制备
[0107]
本发明提供了一种以生化方式生产的檀香油。檀香油是由基因工程改造的生物制成的。如上所述，本发明的以生化方式生产的檀香油是第一种使用这种技术制备成商业上可接受的品质的檀香油。
[0108]
檀香油包含不同的倍半萜醇化合物，它们有助于油的嗅觉特性。倍半萜醇在多步酶促过程中衍生自萜烃。倍半萜醇化合物的酶促合成是本领域已知的。简而言之，法呢基二
磷酸(fpp)通过倍半萜合酶转化为α
‑
和β
‑
檀香萜等化合物。它们随后通过细胞色素p450转化为倍半萜醇化合物。
[0109]
可以理解，为了制备本发明的以生化方式生产的檀香油，可以使用表达合适倍半萜合酶和细胞色素p450的基因工程改造的生物。这种酶的例子是本领域已知的。例如，wo2010067309和wo2015040197提供了适用于制备本发明的以生化方式生产的檀香油的酶的细节。其他倍半萜合酶和细胞色素p450s可以包括本领域提供的那些。例如，jones等人的journal of biochemistry(2011),286(20),17445
‑
54和srivastava等人的scientific reports(2015),5,10095提供了倍半萜合酶的详细信息，而celedon等人的plant journal(2016),86(4),289
‑
29提供了细胞色素p450的详细信息
[0110]
此外，本领域还已知细胞色素p450还原酶(cpr)的存在有益于重建细胞色素p450酶的活性。这种cpr的例子也是本领域已知的。例如，wo2015040197提供了适用于该方法的cpr的详细信息。
[0111]
如上所述，fpp通过倍半萜合酶转化为倍半萜。本发明的以生化方式生产的檀香油可以使用将fpp外源提供给合适的基因工程改造的生物的方法来制备。然而，优选该生物体能够产生fpp。这样的生物体可以自然地产生fpp，或者它不自然地产生fpp而是经转化以产生fpp。转化生物体例如微生物以使其产生fpp的方法是本领域已知的。此类方法可以在例如文献中找到，例如在以下出版物中：martin,v.j.,pitera,d.j.,withers,s.t.,newman,j.d.,and keasling,j.d.nat biotechnol,2003,21(7),796
‑
802(大肠杆菌的转化)；wu,s.,schalk,m.,clark,a.,miles,r.b.,coates,r.,and chappell,j.,nat biotechnol,2006,24(11),1441
‑
1447(植物的转化)；takahashi,s.,yeo,y.,greenhagen,b.t.,mcmullin,t.,song,l.,maurina
‑
brunker,j.,rosson,r.,noel,j.,chappell,j,biotechnology and bioengineering,2007,97(1),170
‑
181(酵母的转化)。例如，wo2013064411或schalk等人的(2013)j.am.chem.soc.134,18900
‑
18903中提供了可用于在基因工程改造的生物中产生fpp的酶的例子。
[0112]
为了制备本发明的以生化方式生产的檀香油，制备了能够产生fpp并且表达合适的倍半萜烯合酶、细胞色素p450和cpr的基因工程改造的生物。我们在本文的实施例中提供了此类基因工程改造的生物的制备的详细信息，其决不限制本发明的范围。
[0113]
因此，本发明的一个形态提供了一种制备本发明的以生化方式生产的檀香油的方法，包括：(i)培养能够产生fpp并表达合适的倍半萜烯合酶、细胞色素p450和cpr的基因工程改造的生物，和(ii)分离本发明的以生化方式生产的檀香油。
[0114]
根据一个优选的实施方案，能够产生fpp并表达合适的倍半萜烯合酶、细胞色素p450和cpr的基因工程改造的生物包含具有α和β
‑
檀香萜合酶活性的多肽，其与seq id no:6有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，甚至更优选至少98％相同。优选地，基因工程改造的生物体还包含具有细胞色素p450活性的多肽，其与seq id no:2有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，甚至更优选至少98％相同。优选地，基因工程改造的生物体还包含具有cpr活性的多肽，其与seq id no:4有至少55％，优选至少60％，优选至少65％，优选至少70％，优选至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，甚
至更优选至少98％相同。
[0115]
如本文所用，多肽旨在作为包含本文鉴定的氨基酸序列的多肽或肽片段，以及截短的或变体多肽，条件是它们保持如上所定义的α和β
‑
檀香萜合酶、细胞色素p450或cpr活性，并且它们与适当的seq id no:6、2或4的相应片段具有至少确定的同一性百分比。
[0116]
变体多肽的例子是由选择性mrna剪接或由本文所述多肽的蛋白酶剪切而得到的天然存在的蛋白质。可归因于蛋白水解的变体包括，例如，当在不同类型的宿主细胞中表达时，由于从本发明多肽上蛋白水解去移除一个或多个末端氨基酸而导致在n
‑
或c
‑
末端的差异。本发明还包含用如后所描述的由本发明核酸的天然或人工突变而获得的核酸编码的多肽。
[0117]
由在氨基和羧基末端融合额外的肽序列产生的多肽变体也可以用在本阀门的方法中。特别地，此种融合能够增强多肽的表达，有用于蛋白的纯化或改善多肽在期望环境或表达系统中的酶活性。此种额外的肽序列可以是信号肽。因此，本发明包括使用变体多肽(诸如通过与其他寡肽或多肽融合所获得的那些和/或连接到信号肽的那些)的方法。由与另一种功能性蛋白质(诸如来自萜生物合成路径的另一种蛋白)融合产生的多肽也可以有利地用于本发明的方法中。
[0118]
优选地，能够产生fpp的基因工程改造的生物体包含具有如seq id no:6所示氨基酸序列的具有α和β
‑
檀香萜合酶活性的多肽，具有如seq id no:2所示氨基酸序列的具有细胞色素p450活性的多肽和具有如seq id no:4所示氨基酸序列的具有cpr活性的多肽。
[0119]
生物体或细胞意在“表达”多肽，条件是该生物体或细胞经转化以携带(harbor)编码所述多肽的核酸，该核酸被转录为mrna并且该多肽存在于宿主生物体或细胞中。术语“表达”包括“异源表达”和“过表达”，后者是指mrna、多肽和/或酶活性的水平超过在未经转化的生物体或细胞中测量的水平。转化非人宿主生物体或细胞的合适方法的更详细描述将在后面的说明书部分(该部分专用于将此类经转化的非人宿主生物体或细胞作为本发明的特定对象)中以及在实施例中描述。
[0120]
术语“经转化”是指宿主经过基因工程改造以便使其含有上述任何实施方案中所需的每种核酸的一个、两个或更多个拷贝的事实。优选地，术语“经转化”涉及异源表达由该核酸编码的多肽(该多肽使用所述核酸转化)以及过表达所述多肽的宿主。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种经转化的生物体，其中该多肽的表达量高于未经如此转化的同一生物体的表达量。本领域已知有几种方法用于产生转基因宿主生物体或细胞，例如植物、真菌、原核生物或高等真核细胞的培养物。适用于细菌、真菌、酵母、植物和哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体描述于例如pouwels等人的cloning vectors:a laboratory manual,1985,elsevier,new york和sambrook等人的molecular cloning:a laboratory manual,2
nd edition,1989,cold spring harbor laboratory press。特别是高等植物和/或植物细胞的克隆和表达载体对于技术人员是可获得的。参见例如schardl等人的gene,1987,61:1
‑
11。
[0121]
用于将宿主生物体或细胞转化为携带转基因核酸的方法是本领域技术人员熟悉的。例如，对于转基因植物的产生，目前的方法包括：植物原生质体的电穿孔，脂质体介导的转化，农杆菌介导的转化，聚乙二醇介导的转化，粒子轰击，植物细胞的显微注射和使用病毒的转化。
[0122]
在一个实施方案中，将经转化的dna整合到非人宿主生物体和/或细胞的染色体中，从而产生稳定的重组系统。本领域已知的任何染色体整合方法可用于本发明的实践，包括但不限于重组酶介导的盒交换(rmce)，病毒位点特异性染色体插入，腺病毒和原核注射。
[0123]
优选地，能够产生fpp的基因工程改造的生物体包含seq id no:5的核酸序列、seq id no:1的核酸序列和seq id no:3所示的核酸序列。
[0124]
为了在体内实施本发明，宿主生物体或细胞在有助于产生本发明的檀香油的条件下培养。因此，如果宿主是转基因植物，则提供最佳生长条件，例如最佳光、水和营养条件。如果宿主是单细胞生物，有利于产生本发明的以生化方式生产的檀香油的条件可以包括向宿主的培养基中添加合适的辅因子。此外，可以选择培养基，以使β
‑
檀香萜合成最大化。在以下实施例中以更详细的方式描述了最佳培养条件。
[0125]
适合于在体内进行本发明方法的非人宿主生物体可以是任何非人的多细胞或单细胞生物体。在一个优选的实施方案中，用于在体内进行本发明的非人宿主生物体是植物、原核生物或真菌。可以使用任何植物、原核生物或真菌。特别有用的植物是天然产生大量萜的植物。在更优选的实施方案中，该植物选自茄科(solanaceae)、禾本科(poaceae)、十字花科(brassicaceae)、碟形花科(fabaceae)、锦葵科(malvaceae)、菊科(asteraceae)或唇形科(lamiaceae)。例如，该植物选自烟草属(nicotiana)、茄属(solanum)、高粱属(sorghum)、拟南芥属(arabidopsis)、芸苔属(brassica(油菜))、苜蓿属(medicago(紫花苜蓿))、棉属(gossypium(棉花))、蒿属(artemisia)、鼠尾草属(salvia)和薄荷属(mentha)。优选，该植物属于烟草(nicotiana tabacum)种。
[0126]
在更优选的实施方案中，用于在体内进行本发明方法的非人宿主生物体是微生物。可以使用任何微生物，但是根据甚至更优选的实施方案，所述微生物是细菌或酵母。最优选，所述细菌是大肠杆菌(e.coli)，而所述酵母是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。
[0127]
也可以使用分离的高等真核细胞代替完整的生物体作为宿主在体内进行本发明的方法。合适的真核细胞可以是任何非人细胞，但优选植物或真菌细胞。
[0128]
本发明形态的方法包括分离本发明的以生化方式生产的檀香油的步骤。
[0129]
分离本发明的以生化方式生产的檀香油的方法包括使用快速色谱法或蒸馏，如本领域技术人员已知的那样。可以使用的分离方法的更多信息在所附实施例中提供。
[0130]
香料用途
[0131]
如上所述，本发明涉及本发明的檀香油作为加香成分的用途。换句话说，它涉及给予、增强、改善或改变加香组合物或已加香制品或表面的气味特性的方法或过程，该方法包括向所述组合物或制品中加入有效量的本发明的檀香油，以例如赋予其典型的香调。应理解最终享乐效应可能取决于本发明的檀香油的精确剂量和感官特性，但是无论如何，添加本发明的檀香油将根据剂量以香调、触感(touch)或细微特征(aspect)的形式赋予最终产品以典型触感。
[0132]
通过“本发明的檀香油的用途”，在此还必须理解为包含本发明的檀香油、并且可以有利地用于香料业工业的任何组合物的用途。
[0133]
实际上可以有利地用作加香成分的所述组合物也是本发明的目的。
[0134]
因此，本发明的另一个目的是一种加香组合物，其包含：
[0135]
i)至少一种如上定义的本发明的檀香油作为加香成分；
[0136]
ii)至少一种从由香料载体和香料基料构成的群组中选出的成分；和
[0137]
iii)可选地，至少一种香料佐剂。
[0138]
通过“香料载体”，这里是指从香料的观点来看实际上是中性的材料；即不会显著改变加香成分的感官特性。所述载体可以是液体或固体。
[0139]
作为液体载体，可以列举作为非限制性例子的乳化体系，即溶剂和表面活性剂体系，或通常用于香料中的溶剂。香料中通常使用的溶剂的性质和类型的详细描述是无法穷尽的。然而，可以列举作为非限制性例子的溶剂，如丁二醇或丙二醇、甘油、二丙二醇及其单醚、三乙酸1,2,3
‑
丙三酯、戊二酸二甲酯、己二酸二甲酯、乙酸1,3
‑
二乙酰氧基丙
‑2‑
基酯、邻苯二甲酸二乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、苯甲酸苄酯、苄醇、2
‑
(2
‑
乙氧基乙氧基)
‑1‑
乙醇、柠檬酸三乙酯或它们的混合物，它们是最常用的。对于同时包含香料载体和香料基料的组合物，除之前详细说明的，其他合适的香料载体也可以是乙醇，水/乙醇混合物，柠檬烯或其他萜烯，异链烷烃，如以商标公知的那些(来源：exxon chemical)，或二醇醚和二醇醚酯，如以商标公知的那些(来源：dow chemical company)，或氢化蓖麻油，如以商标rh 40公知的那些(来源：basf)。
[0140]
固体载体是指这样一种材料，加香组合物或加香组合物的某些成分可以化学地或物理地与其结合。通常，使用这样的固体载体来稳定组合物，或控制组合物或某些成分的蒸发速率。固体载体是目前在本领域中使用的，并且本领域技术人员知道如何达到期望的效果。然而，作为固体载体的非限定性例子，可以列举吸收胶或聚合物或无机材料，例如多孔聚合物、环糊精、木基材料、有机或无机凝胶、粘土、石膏、滑石或沸石。
[0141]
作为固体载体的其他非限制性例子，可以列举包封材料。这种材料的例子可包括成壁材料和增塑材料，例如单糖、二糖或三糖，天然或改性淀粉，水胶体，纤维素衍生物，聚乙酸乙烯酯，聚乙烯醇，蛋白质或果胶，或在参考文献例如h.scherz,hydrokolloide:stabilisatoren,dickungs
‑
und geliermittel in lebensmitteln,band 2der schriftenreihe lebensmittelchemie,behr's verlag gmbh&co.,hamburg,1996中列举的材料。包封是本领域技术人员熟知的方法，并且可以通过例如使用诸如喷雾干燥、附聚或挤出的技术进行；或由包括凝聚和复合凝聚技术的涂层包封组成。
[0142]
作为固体载体的非限制性例子，可以特别列举核
‑
壳胶囊，其使用氨基塑料、聚酰胺、聚酯、聚脲或聚氨酯类型的树脂或它们的混合物(所有所述树脂都是本领域技术人员公知的)，通过使用聚合、界面聚合、凝聚等技术或这些技术一起(所有所述技术已经在现有技术中描述)引发的相分离方法，并且可选地在聚合物稳定剂或阳离子共聚物的存在下进行。
[0143]
树脂可以通过醛(例如甲醛、2,2
‑
二甲氧基乙醛、乙二醛、乙醛酸或羟乙醛及它们的混合物)与胺例如脲、苯并胍胺、甘脲基、三聚氰胺、羟甲基三聚氰胺、甲基化羟甲基三聚氰胺、胍唑等以及它们的混合物缩聚产生。或者，可以使用预先形成的树脂烷基化(alkylolated)多胺，例如以商标(来源：cytec technology corp.)、(来源：cytec technology corp.)、或(来源：basf)可商购的那些。
[0144]
其他树脂是通过多元醇如甘油与多异氰酸酯如六亚甲基二异氰酸酯的三聚体、异
佛尔酮二异氰酸酯或苯二甲基二异氰酸酯的三聚体或六亚甲基二异氰酸酯的缩二脲、或苯二甲基二异氰酸酯与三羟甲基丙烷的三聚体(以商品名已知，来源：mitsui chemicals)的缩聚产生的那些，其中优选苯二甲基二异氰酸酯与三羟甲基丙烷的三聚体和六亚甲基二异氰酸酯的缩二脲。
[0145]
与通过氨基树脂即三聚氰胺基树脂与醛类缩聚而包封香料有关的一些研究文献包括诸如k.dietrich等人发表的文章acta polymerica,1989,vol.40,pages 243,325和683以及1990,vol.41,page 91。这些文章已经描述了影响根据现有技术方法制备这种核
‑
壳微胶囊的各种参数，这些方法在专利文献中也被进一步详述和示例。wiggins teape group limited的us 4'396'670是后者的相关早期例子。此后，许多其他作者已经丰富了这一领域的文献，这里并不可能涵盖所有发表的进展，但是包封技术的一般知识是非常重要的。更为近期的针对性的出版物也涉及这种微胶囊的合适用途，代表文章例如k.bruyninckx and m.dusselier,acs sustainable chemistry&engineering,2019,vol.7,pages 8041
‑
8054。
[0146]
通过“香料基料”，这里是指包含至少一种加香助成分的组合物。
[0147]
所述加香助成分不是本发明的檀香油。此外，通过“加香助成分”，这里是指这样一种化合物，其用于加香制剂或组合物中以赋予享乐效果。换句话说，要被认为是加香助成分的此种助成分必须被本领域技术人员公认为能够以主动或令人愉快的方式赋予或改变组合物的气味，而不仅仅是具有气味。
[0148]
基料中存在的加香助成分的性质和类型在这里不保证更详细的描述，其无论如何都是无法穷尽的，技术人员能够根据其常识并根据预期的用途或应用和所需的感官效果对它们进行选择。一般而言，这些加香助成分属于不同的化学分类，如醇类、内酯类、醛类、酮类、酯类、醚类、乙酸酯类、腈类、萜类化合物、含氮或含硫杂环化合物和精油，并且所述加香助成分可以是天然来源的或合成来源的。
[0149]
特别是可以列举通常用于香料制剂中的加香助成分，例如：
[0150]
‑
醛香成分：癸醛、十二醛、2
‑
甲基十一醛、10
‑
十一烯醛、辛醛和/或壬烯醛；
[0151]
‑
芳香草本成分：桉树油、樟脑、桉叶油醇、薄荷醇和/或α
‑
蒎烯；
[0152]
‑
香脂成分：香豆素、乙基香草醛和/或香草醛；
[0153]
‑
柑橘香成分：二氢月桂烯醇、柠檬醛、橙油、乙酸芳樟酯、香茅腈、橙萜烯、柠檬烯、乙酸1
‑
对薄荷烯
‑8‑
基酯和/或1,4(8)
‑
对薄荷二烯；
[0154]
‑
花香成分：二氢茉莉酮酸甲酯、芳樟醇、香茅醇、苯乙醇、3
‑
(4
‑
叔丁基苯基)
‑2‑
甲基丙醛、己基肉桂醛、乙酸苄酯、水杨酸苄酯、四氢
‑2‑
异丁基
‑4‑
甲基
‑
4(2h)
‑
吡喃醇、β
‑
紫罗兰酮、2
‑
(甲基氨基)苯甲酸甲酯、(e)
‑3‑
甲基
‑4‑
(2,6,6
‑
三甲基
‑2‑
环己烯
‑1‑
基)
‑3‑
丁烯
‑2‑
酮、(1e)
‑1‑
(2,6,6
‑
三甲基
‑2‑
环己烯
‑1‑
基)
‑1‑
戊烯
‑3‑
酮、1
‑
(2,6,6
‑
三甲基
‑
1,3
‑
环己二烯
‑1‑
基)
‑2‑
丁烯
‑1‑
酮、(2e)
‑1‑
(2,6,6
‑
三甲基
‑2‑
环己烯
‑1‑
基)
‑2‑
丁烯
‑1‑
酮、(2e)
‑1‑
[2,6,6
‑
三甲基
‑3‑
环己烯
‑1‑
基]
‑2‑
丁烯
‑1‑
酮、(2e)
‑1‑
(2,6,6
‑
三甲基
‑1‑
环己烯
‑1‑
基)
‑2‑
丁烯
‑1‑
酮、2,5
‑
二甲基
‑2‑
茚满甲醇、2,6,6
‑
三甲基
‑3‑
环己烯
‑1‑
甲酸酯、3
‑
(4,4
‑
二甲基
‑1‑
环己烯
‑1‑
基丙醛、水杨酸己酯、3,7
‑
二甲基
‑
1,6
‑
壬二烯
‑3‑
醇、3
‑
(4
‑
异丙基苯基)
‑2‑
甲基丙醛、乙酸三环癸烯酯、香叶醇、对薄荷
‑1‑
烯
‑8‑
醇、乙酸4
‑
(1,1
‑
二甲基乙基)
‑1‑
环己酯、乙酸1,1
‑
二甲基
‑2‑
苯基乙酯、4
‑
环己基
‑2‑
甲基
‑2‑
丁醇、水杨酸戊酯、高顺
式二氢茉莉酮酸甲酯、3
‑
甲基
‑5‑
苯基
‑1‑
戊醇、丙酸三环癸烯酯、乙酸香叶酯、四氢芳樟醇、顺
‑7‑
对薄荷醇、(s)
‑2‑
(1,1
‑
二甲基丙氧基)丙酸丙酯、2
‑
甲氧基萘、乙酸2,2,2
‑
三氯
‑1‑
苯基乙酯、4/3
‑
(4
‑
羟基
‑4‑
甲基戊基)
‑3‑
环己烯
‑1‑
甲醛、戊基肉桂醛、8
‑
癸烯
‑5‑
内酯、4
‑
苯基
‑2‑
丁酮、乙酸异壬酯、乙酸4
‑
(1,1
‑
二甲基乙基)
‑1‑
环己酯、异丁酸三环癸烯酯、和/或甲基紫罗兰酮异构体的混合物；
[0155]
‑
果香成分：γ
‑
十一内酯、2,2,5
‑
三甲基
‑5‑
戊基环戊酮、2
‑
甲基
‑4‑
丙基
‑
1,3
‑
氧硫杂环己烷、4
‑
癸内酯、2
‑
甲基
‑
戊酸乙酯、乙酸己酯、2
‑
甲基丁酸乙酯、γ
‑
壬内酯、庚酸烯丙酯、异丁酸2
‑
苯氧基乙酯、2
‑
甲基
‑
1,3
‑
二氧戊环
‑2‑
乙酸乙酯、3
‑
(3,3/1,1
‑
二甲基
‑5‑
茚满基)丙醛、1,4
‑
环己烷二甲酸二乙酯、乙酸3
‑
甲基
‑2‑
己烯
‑1‑
基酯、[3
‑
乙基
‑2‑
环氧乙烷基]乙酸1
‑
[3,3
‑
二甲基环己基]乙酯和/或1,4
‑
环己烷二甲酸二乙酯；
[0156]
‑
青香成分：2
‑
甲基
‑3‑
己酮(e)
‑
肟、2,4
‑
二甲基
‑3‑
环己烯
‑1‑
甲醛、乙酸2
‑
叔丁基
‑1‑
环己酯、乙酸苏合香酯、(2
‑
甲基丁氧基)乙酸烯丙酯、4
‑
甲基
‑3‑
癸烯
‑5‑
醇、二苯醚、(z)
‑3‑
己烯
‑1‑
醇和/或1
‑
(5,5
‑
二甲基
‑1‑
环己烯
‑1‑
基)
‑4‑
戊烯
‑1‑
酮；
[0157]
‑
麝香成分：1,4
‑
二氧杂
‑
5,17
‑
环十七烷二酮、(z)
‑4‑
环十五碳烯
‑1‑
酮、3
‑
甲基环十五碳酮、1
‑
氧杂
‑
12
‑
环十六碳烯
‑2‑
酮、1
‑
氧杂
‑
13
‑
环十六碳烯
‑2‑
酮、(9z)
‑9‑
环十七碳烯
‑1‑
酮、丙酸2
‑
{1s)
‑1‑
[(1r)
‑
3,3
‑
二甲基环己基]乙氧基}
‑2‑
氧乙基酯、3
‑
甲基
‑5‑
环十五碳烯
‑1‑
酮、1,3,4,6,7,8
‑
六氢
‑
4,6,6,7,8,8
‑
六甲基环戊并[g]
‑2‑
苯并吡喃、丙酸(1s,1'r)
‑2‑
[1
‑
(3',3'
‑
二甲基
‑
1'
‑
环己基)乙氧基]
‑2‑
甲基丙酯、氧杂环十六烷
‑2‑
酮和/或丙酸(1s,1'r)
‑
[1
‑
(3',3'
‑
二甲基
‑
1'
‑
环己基)乙氧基羰基]甲酯；
[0158]
‑
木香成分：1
‑
[(1rs,6sr)
‑
2,2,6
‑
三甲基环己基]
‑3‑
己醇、3,3
‑
二甲基
‑5‑
[(1r)
‑
2,2,3
‑
三甲基
‑3‑
环戊烯
‑1‑
基]
‑4‑
戊烯
‑2‑
醇、3,4'
‑
二甲基螺[环氧乙烷
‑
2,9'
‑
三环[6.2.1.0
2,7
]十一碳[4]烯、(1
‑
乙氧基乙氧基)环十二烷、乙酸2,2,9,11
‑
四甲基螺[5.5]十一碳
‑8‑
烯
‑1‑
基酯，1
‑
(八氢
‑
2,3,8,8
‑
四甲基
‑2‑
萘基)
‑1‑
乙酮、广藿香油、广藿香油的萜烯馏分、(1'r,e)
‑2‑
乙基
‑4‑
(2',2',3'
‑
三甲基
‑
3'
‑
环戊烯
‑
1'
‑
基)
‑2‑
丁烯
‑1‑
醇、2
‑
乙基
‑4‑
(2,2,3
‑
三甲基
‑3‑
环戊烯
‑1‑
基)
‑2‑
丁烯
‑1‑
醇、甲基柏木酮、5
‑
(2,2,3
‑
三甲基
‑3‑
环戊烯基)
‑3‑
甲基戊
‑2‑
醇、1
‑
(2,3,8,8
‑
四甲基
‑
1,2,3,4,6,7,8,8a
‑
八氢萘
‑2‑
基)乙
‑1‑
酮和/或乙酸异冰片酯；
[0159]
‑
其他成分(例如琥珀香、粉香、辣或水样)：十二氢
‑
3a,6,6,9a
‑
四甲基萘并[2,1
‑
b]呋喃及其任何立体异构体、胡椒醛、茴香醛、丁子香酚、肉桂醛、丁香油、3
‑
(1,3
‑
苯并间二氧杂环戊烯
‑5‑
基)
‑2‑
甲基丙醛、7
‑
甲基
‑
2h
‑
1,5
‑
苯并二氧杂环庚
‑
3(4h)
‑
酮、2,5,5
‑
三甲基
‑
1,2,3,4,4a,5,6,7
‑
八氢
‑2‑
萘酚，乙酸1
‑
苯基乙烯基酯、6
‑
甲基
‑7‑
氧杂
‑1‑
硫杂
‑4‑
氮杂螺[4.4]壬烷和/或3
‑
(3
‑
异丙基
‑1‑
苯基)丁醛。
[0160]
根据本发明的香料基料可以不限于上述加香助成分，并且许多其他的这些助成分无论如何都在参考文献中列出，例如s.arctander,perfume and flavor chemicals,1969,montclair,new jersey,usa或其更新的版本，或其他相似性质的著作，以及香料业领域大量的专利文献。还应当理解，所述助成分也可以是已知以受控方式释放各种类型的加香化合物的化合物，也被称为香料前体(properfume)或芳香剂前体(profragrance)。合适的香料前体的非限制性例子可包括4
‑
(十二烷基硫代)
‑4‑
(2,6,6
‑
三甲基
‑2‑
环己烯
‑1‑
基)
‑2‑
丁酮、4
‑
(十二烷基硫代)
‑4‑
(2,6,6
‑
三甲基
‑1‑
环己烯
‑1‑
基)
‑2‑
丁酮、反式
‑3‑
(十二烷基
硫代)
‑1‑
(2,6,6
‑
三甲基
‑3‑
环己烯
‑1‑
基)
‑1‑
丁酮、氧代(苯基)乙酸2
‑
苯基乙酯或它们的混合物。
[0161]
通过“香料佐剂”，这里我们指能够赋予附加的额外益处如颜色、特定的耐光性、化学稳定性等的成分。在加香组合物中通常使用的佐剂的性质和类型的详细描述是无法穷尽的，但是必须提及的是所述成分是本领域技术人员熟知的。作为具体的非限制性例子可以列举如下：粘性剂(例如表面活性剂、增稠剂、胶凝和/或流变改性剂)，稳定剂(例如防腐剂、抗氧化剂、热/光或缓冲剂或螯合剂，例如bht)，着色剂(例如染料和/或颜料)，防腐剂(例如抗菌剂或抗微生物剂或抗真菌剂或抗刺激剂)，研磨剂，皮肤清凉剂，定香剂，驱虫剂，软膏，维生素及它们的混合物。
[0162]
可以理解的是，本领域技术人员仅通过应用本领域的标准知识以及通过试错法来混合加香组合物的上述组分，完全能够设计用于期望效果的最佳配方。
[0163]
除了包含至少本发明的檀香油、至少一种香料载体、至少一种香料基料和可选的至少一种香料佐剂的加香组合物之外，由至少一种本发明的檀香油和至少一种香料载体组成的加香组合物也构成本发明的一种特定实施方案。
[0164]
根据一个特定实施方案，上述组合物包含多于一种的本发明的檀香油，并且能够使调香师制备具有本发明檀香油气味调子的调和物或香料，从而为创造目的创造新的结构单元。
[0165]
本发明的檀香油也可以有利地用于现代香料(即精细香料或功能性香料)的所有领域中，以主动地赋予或改变添加有本发明檀香油的消费品的气味。因此，本发明的另一个目的在于一种已加香消费品，该消费品包含如上定义的本发明的檀香油作为加香成分。
[0166]
本发明的檀香油可以原样加入或作为本发明加香组合物的一部分加入。
[0167]
为了清楚起见，“已加香消费品”是指一种消费品，其向施覆它的表面或空间(例如皮肤、头发、织物或家庭表面)递送至少一种令人愉快的加香效果。换句话说，根据本发明的已加香消费品是这样一种已加香消费品，其包含功能性配方以及对应于期望的消费品的可选的附加益处剂，以及嗅觉有效量的至少一种本发明化合物。为了清楚起见，所述已加香消费品是不可食用的产品。
[0168]
已加香消费品的成分的性质和类型不保证在这里更详细的描述，其无论如何都是无法穷尽的，技术人员能够基于其常识并根据所述产品的特性及期望的效果对它们进行选择。
[0169]
合适的已加香消费品的非限制性例子包括香水，例如精细香水、涂抹式香水(splash)或淡香精(eau de perfume)、古龙水或剃须水或须后水；织物护理产品，例如液体或固体洗涤剂、织物柔软剂、液体或固体香味增强剂、织物清新剂、熨烫水、纸张、漂白剂、地毯清洁剂、窗帘护理产品；身体护理产品，例如头发护理产品(例如洗发剂、着色剂或头发喷雾剂、颜色护理产品、头发定型产品、牙齿护理产品)，消毒剂，私处护理产品；化妆品制剂(例如护肤霜或护肤液、雪花膏、体香剂(除臭剂)或止汗剂(例如喷雾或走珠)，脱毛剂，晒黑剂、防晒或晒后产品，美甲产品，皮肤清洁产品，化妆品)；或皮肤护理产品(例如香皂、沐浴摩丝、浴油或沐浴露，或卫生用品或足部/手部护理产品)；空气护理产品，例如空气清新剂或“即用型”粉末空气清新剂，其可用于家庭空间(房间、冰箱、橱柜、鞋或车)和/或公共空间(大厅、旅馆、商场等)；或家庭护理产品，例如去霉剂、家具护理产品、擦拭巾、餐具洗涤剂或
硬表面(例如地板、浴室、洁具或窗户清洁)洗涤剂；皮革护理产品；汽车护理产品，如抛光剂、蜡或塑料清洁剂。
[0170]
上述已加香消费品中的一些可能代表本发明檀香油的侵蚀性介质，因此可能需要保护其免于过早分解，例如通过包封。
[0171]
本发明的檀香油可以掺入到各种上述产品或组合物中的比例在很宽的数值范围内变化。当根据本发明的檀香油与本领域通常使用的加香助成分、溶剂或添加剂混合时，这些值取决于待加香制品的性质和所需感官效果以及给定基料中的助成分的性质。
[0172]
例如，在加香组合物的情况下，基于其所掺入到的组合物的重量，本发明檀香油的典型浓度为0.001重量％至10重量％，或甚至更多。在已加香消费品的情况下，基于其所掺入到的消费品的总重量，本发明檀香油的典型浓度为约0.0001重量％至2重量％，优选为约0.0001重量％至1重量％，或甚至更多。
[0173]
本发明的一个优选实施方案提供一种加香组合物，其包含本发明的檀香油和合成檀香成分。合成檀香成分可以是例如以下化合物中的至少一种：(
‑
)
‑
(2e)
‑2‑
乙基
‑4‑
[(1r)
‑
2,2,3
‑
三甲基
‑3‑
环戊烯
‑1‑
基]
‑2‑
丁烯
‑1‑
醇；(
‑
)
‑2‑
乙基
‑4‑
(2,2,3
‑
三甲基
‑3‑
环戊烯
‑1‑
基)
‑2‑
丁烯
‑1‑
醇；3
‑
(双环[2.2.1]庚
‑2‑
基)
‑1‑
环己醇；(
‑
)
‑
(2r,4e)
‑
3,3
‑
二甲基
‑5‑
[(1r)
‑
2,2,3
‑
三甲基
‑3‑
环戊烯
‑1‑
基]
‑4‑
戊烯
‑2‑
醇(a) (
‑
)
‑
(2s,4e)
‑
3,3
‑
二甲基
‑5‑
[(1r)
‑
2,2,3
‑
三甲基
‑3‑
环戊烯
‑1‑
基]
‑4‑
戊烯
‑2‑
醇(b)；3
‑
[(2',2',3'
‑
三甲基
‑
3'
‑
环戊烯
‑
1'
‑
基)甲氧基]
‑2‑
丁醇；( )
‑
(2s,4e)
‑
3,3
‑
二甲基
‑5‑
[(1s)
‑
2,2,3
‑
三甲基
‑3‑
环戊烯
‑1‑
基]
‑4‑
戊烯
‑2‑
醇(a) ( )
‑
(2r,4e)
‑
3,3
‑
二甲基
‑5‑
[(1s)
‑
2,2,3
‑
三甲基
‑3‑
环戊烯
‑1‑
基]
‑4‑
戊烯
‑2‑
醇(b)；(
‑
)
‑7‑
甲氧基
‑
3,7
‑
二甲氧基
‑2‑
辛醇；(2s)
‑2‑
甲基
‑4‑
[(1r)
‑
2,2,3
‑
三甲基
‑3‑
环戊烯
‑1‑
基]
‑4‑
戊烯
‑1‑
醇(a) (2r)
‑2‑
甲基
‑4‑
[(1r)
‑
2,2,3
‑
三甲基
‑3‑
环戊烯
‑1‑
基]
‑4‑
戊烯
‑1‑
醇(b)；(2r)
‑2‑
甲基
‑4‑
[(1r)
‑
2,2,3
‑
三甲基
‑3‑
环戊烯
‑1‑
基]
‑4‑
戊烯醛(a) (2s)
‑2‑
甲基
‑4‑
[(1r)
‑
2,2,3
‑
三甲基
‑3‑
环戊烯
‑1‑
基]
‑4‑
戊烯醛(b)；(1's,3'r)
‑
{1
‑
甲基
‑2‑
[(1',2',2'
‑
三甲基环[3.1.0]己
‑
3'
‑
基)甲基]环丙基}甲醇。可以理解的是，本发明的檀香油会给檀香细微香调(facet)带来自然感、乳脂感和更持久性(tenacity)。
[0174]
本发明的一个优选实施方案提供一种加香组合物，其包含本发明的檀香油和麝香成分。麝香成分可以是例如以下化合物中的至少一种：1
‑
氧杂
‑
12
‑
环十六碳烯
‑2‑
酮(a) 1
‑
氧杂
‑
13
‑
环十六碳烯
‑2‑
酮(b)；(
‑
)
‑
4,6,6,7,8,8
‑
六甲基
‑
1,3,4,6,7,8
‑
六氢环戊基并[g]异色烯；1,4
‑
二氧杂环十七碳
‑
5,17
‑
二酮；氧杂环十七碳
‑2‑
酮；丙酸( )
‑
(1s,1'r)
‑2‑
[1
‑
(3',3'
‑
二甲基
‑
1'
‑
环己基)乙氧基]
‑2‑
甲基丙酯；丙酸2
‑
{(1rs)
‑1‑
[(1sr)
‑
3,3
‑
二甲基环己基]乙氧基}
‑2‑
氧代乙酯(a) 丙酸2
‑
{(1rs)
‑1‑
[(1rs)
‑
3,3
‑
二甲基环己基]乙氧基}
‑2‑
氧代乙酯(b) 丙酸2
‑
氧代
‑2‑
{[(1rs,2rs)
‑
2,6,6
‑
三甲基环庚基]氧基}乙酯(c) 丙酸2
‑
氧代
‑2‑
{[(1rs,2sr)
‑
2,6,6
‑
三甲基环庚基]氧基}乙酯(d)；(
‑
)
‑
(4e)
‑3‑
甲基
‑4‑
环十五碳烯
‑1‑
酮(a) (
‑
)
‑
(5e)
‑3‑
甲基
‑5‑
环十五碳烯
‑1‑
酮(b) (
‑
)
‑
(5z)
‑3‑
甲基
‑5‑
环十五碳烯
‑1‑
酮(c)；1,2,3,5,6,7
‑
六氢
‑
1,1,2,3,3
‑
五甲基
‑4‑
茚酮；(
‑
)
‑1‑
(3,5,5,6,8,8
‑
六甲基
‑
5,6,7,8
‑
四氢
‑2‑
萘基)乙酮；(10e)
‑
氧杂环十七碳
‑
10
‑
烯
‑2‑
酮；(
‑
)
‑3‑
甲基环十五酮；1
‑
(4
‑
叔丁基
‑
3,5
‑
二硝基
‑
2,6
‑
二甲基苯基)
‑1‑
乙酮。可以理解的是，本发明的檀香油将为加香组合物增强麝香感并带来更持久性。
[0175]
本发明的一个优选实施方案提供了一种加香组合物，其包含本发明的檀香油和花香成分。花香成分可以是例如以下化合物中的至少一种：2
‑
((1rs,2rs)
‑3‑
氧代
‑2‑
戊基环戊基)乙酸甲酯；(2e)
‑2‑
亚苄基辛醛；(e)
‑2‑
戊基
‑3‑
苯基
‑2‑
丙烯醛；(
‑
)
‑
(3r)
‑
3,7
‑
二甲基
‑
1,6
‑
辛二烯
‑3‑
醇；(
‑
)
‑2‑
甲基
‑3‑
[4
‑
(2
‑
甲基
‑2‑
丙基)苯基]丙醛；2
‑
苯基乙醇；2
‑
羟基苯甲酸苄酯；乙酸顺
‑4‑
(2
‑
甲基
‑2‑
丙基)环己酯(a) 乙酸反
‑4‑
(2
‑
甲基
‑2‑
丙基)环己酯(b)；2
‑
羟基苯甲酸己酯；水杨酸(3z)
‑3‑
己烯
‑1‑
基酯；2
‑
羟基苯甲酸戊酯；(
‑
)
‑
3,7
‑
二甲基
‑6‑
辛烯
‑1‑
醇；(
‑
)
‑
(3e)
‑3‑
甲基
‑4‑
(2,6,6
‑
三甲基
‑2‑
环己烯
‑1‑
基)
‑3‑
丁烯
‑2‑
酮(a) (
‑
)
‑
(1e)
‑1‑
(2,6,6
‑
三甲基
‑2‑
环己烯
‑1‑
基)
‑1‑
戊烯
‑3‑
酮(b)；(
‑
)
‑3‑
甲基
‑5‑
苯基
‑1‑
戊醇；(
‑
)
‑
(3e)
‑4‑
(2,6,6
‑
三甲基
‑2‑
环己烯
‑1‑
基)
‑3‑
丁烯
‑2‑
酮；(3e)
‑4‑
(2,6,6
‑
三甲基
‑1‑
环己烯
‑1‑
基)
‑3‑
丁烯
‑2‑
酮；(
‑
)
‑
四氢
‑2‑
异丁基
‑4‑
甲基
‑
4(2h)
‑
吡喃醇。可以理解的是，本发明的檀香油会给加香组合物的花香核心部分带来更多的量感(volume)和持久性。
[0176]
本发明的一个优选实施方案提供一种加香组合物，其包含本发明的檀香油和木香成分。木香成分可以是例如以下化合物中的至少一种：(
‑
)
‑1‑
(八氢
‑
2,3,8,8
‑
四甲基
‑2‑
萘基)
‑1‑
乙酮(双键：4a,5(a) 4,4a(b) 4a,8a(c)；广藿香油；甲基柏木烯酮(vertofix coeur)；乙氧基甲氧基环十二烷(boisambrene forte)；雪松油；柏木甲醚(cedramber)；1
‑
[(1rs,6sr)
‑
2,2,6
‑
三甲基环己基]
‑3‑
己醇；(
‑
)
‑
(1
‑
乙氧基乙氧基)环十二烷。可以理解，本发明的檀香油会给木香细微香调和加香组合物带来更多的自然、温暖和持久性。
[0177]
包封的香料
[0178]
在一些形态中，以生化方式生产的檀香油被包封在基质材料中。
[0179]
无意受限于任何特定理论，基质材料形成壳，包封并保留以生化方式生产的檀香油。基质材料对于加香调和物可以是可渗透的，因此，在一些形态中，基质材料可以通过例如扩散的机制随着时间缓慢地释放所保留的以生化方式生产的檀香油。
[0180]
或者，基质材料可以是本发明的以生化方式生产的檀香油不可渗透的。因此，在一些形态中，当包封用基质材料破裂时，基质材料可以释放以生化方式生产的檀香油。
[0181]
基质材料可以是任何能够保留芳香剂的材料。例子包括：核壳型胶囊，其由聚合物可破裂外壁组成，该外壁包裹着香料调和物；喷雾干燥基质型，其中该基质包含水溶性材料；挤压造粒型；以及，包括分散在喷雾干燥载体中的多个核壳微胶囊的复合型。
[0182]
核
‑
壳胶囊的例子包括但不限于m，mg，和polybloom
tm
。
[0183]
喷雾干燥的胶囊的例子包括但不限于
[0184]
挤出造粒胶囊的例子包括但不限于和。
[0185]
复合胶囊的例子包括但不限于m
‑
dry，p
‑
dry和m
‑
dry plus。
[0186]
适用于本公开的胶囊的另一个例子是美国专利5,135,747中公开的胶囊。
[0187]
适用于本公开的胶囊的另一个例子是美国专利5,508,259a中公开的胶囊。
[0188]
适用于本公开的胶囊的另一个例子是美国专利6,200,949b1中公开的胶囊。
[0189]
适用于本公开的胶囊的另一个例子是美国专利7,208,463b2中公开的胶囊。
[0190]
适用于本公开的胶囊的另一个例子是美国专利申请公开no.2003/0194416 a1中公开的胶囊。
[0191]
本发明檀香油的应用
[0192]
本领域已知檀香油具有多种抗炎、抗微生物、抗增殖、免疫调节和抗癌特性。因此，本发明的檀香油可用作抗炎剂、抗微生物剂、抗增殖剂、免疫调节剂和抗癌剂。
[0193]
本发明的檀香油的进一步用途包括抗高血糖、抗氧化剂、抗肿瘤、抗晒黑、抗衰老和皮肤软化。
[0194]
因此，本发明的另一形态提供了配制用于局部(外部)应用的本发明的檀香油。下面提供本发明该形态的进一步实施方案。
[0195]
本发明人进一步研究了下文讨论的本发明檀香油的抗微生物和抗炎作用。
[0196]
抗微生物
[0197]
如下面的实施例所示，本文提出的本发明的檀香油表现出抗微生物作用。
[0198]
在一个形态中，本发明提供包含本发明的檀香油的组合物，其中檀香油以足以提供抗微生物作用的量存在。优选地，该组合物是局部应用的。
[0199]
在另一形态中，本发明提供了一种包含本发明的檀香油用作抗微生物剂的组合物。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了用于治疗微生物感染的本发明的檀香油。
[0200]
在另一形态中，本发明提供治疗微生物感染的方法，包括将有效量的本发明的檀香油组合物给予有需要的接受者。
[0201]
通过“抗微生物”，包括本发明的檀香油可用作抗菌、抗病毒和抗真菌组合物。在此上下文中，术语“治疗”旨在包括本发明的檀香油组合物通过例如杀死微生物细胞和/或防止微生物细胞的扩散和/或抑制细胞的生长和繁殖来减轻或缓和微生物感染的情况。
[0202]
例如，本发明的檀香油可用于治疗由真菌皮肤癣菌和酵母菌，包括毛癣菌属(trichophyton)、小孢子菌属(microsporum)和假丝酵母菌属(candida)引起的感染。
[0203]
本发明的檀香油可用于治疗由包括单纯疱疹病毒
‑
1和
‑
2以及流感病毒、人乳头瘤病毒(hpv)疣和传染性软疣病毒(mulluscipox)在内的病毒剂引起的感染。
[0204]
在一个形态中，该组合物通过抑制细菌的生长来提供抗微生物作用。
[0205]
细菌可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。
[0206]
例如，本发明的檀香油对其有效的细菌可以包括厚壁菌门(firmicutes)，其可以是杆菌纲(bacilli)或梭菌纲(clostridia)，例如肉毒杆菌(clostridium botulinum)。
[0207]
在优选的实施方案中，本发明的檀香油对其有效的细菌可包括芽孢杆菌目(bacillales)，优选葡萄球菌属(staphylococcus)，例如金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)。本发明的檀香油对其有效的其他芽孢杆菌目包括链球菌属(streptococci)，例如化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)或肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)。
[0208]
本发明的檀香油对其有效的细菌的其他例子可包括假单胞菌目(pseudomonadales)，优选铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)。本发明的檀香油对其有效的细菌的其他例子可包括γ
‑
变形菌纲(gammaproteobacteria)，其可独立地选自肠杆菌目(enterobacteriales)、变形杆菌属(proteus)、沙雷氏菌属(serratia)、巴斯德氏菌目(pasteurellales)和弧菌目(vibrionales)。优选的肠杆菌目包括埃希氏菌属
(escherichia)。优选的变形杆菌属包括奇异变形杆菌(proteus mirabilis)。优选的沙雷氏菌属包括粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)。优选的巴斯德氏菌目包括流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)。优选的弧菌目包括霍乱弧菌(vibrio cholerae)。
[0209]
本发明的檀香油对其有效的细菌的其他例子可包括β
‑
变形菌纲(betaproteobacteria)，包括奈瑟菌目(neisseriales)，例如淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)。本发明的檀香油对其有效的细菌的其他例子可包括δ/ε细分的变形菌门(proteobacteria)，包括弯曲菌目(campylobacterales)，例如幽门螺杆菌(helicobacter pylori)。本发明的檀香油对其有效的细菌的其他例子可包括放线菌门(actinobacteria)，例如结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)和星状诺卡氏菌(nocardia asteroides)。
[0210]
革兰氏阳性细菌的其他例子包括黄微球菌(micrococcus flavus)、产谷氨酸小球菌(micrococcus glutamicus)、痤疮丙酸杆菌(cuticubacterium acnes)((propionibacterium acnes))和丙酸杆菌科(propionibacteriaceae)成员、藤黄八叠球菌(sarcina lutea)、白色葡萄球菌(staphylococcus albus)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidemidis)、类马链球菌(staphylococcus equisimili)。
[0211]
革兰氏阴性菌的其他例子包括鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)、乙酸钙不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus)、产气克雷伯菌(klebsiella aerogenes)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumonia)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、荧光假单胞菌(pseudomonas florescens)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)。
[0212]
酵母和真菌的其他例子包括白色念珠菌(candida albicans)、克鲁斯氏念珠菌(candida krusei)、絮状表皮癣菌(epidermophyton fluccosum)、腹股沟皮癣菌(epidemophyton inguinale)、犬小孢子菌(microsporum canis)、石膏样小孢子菌(microsporum gypseum)、星形毛癣菌(trichophyton asteroids)、指间毛癣菌(trichophyton interdigital)、须发毛癣菌(trichophyton mentaprophytes)、紫色毛癣菌(trichophyton purpureum)。
[0213]
在一个形态中，本发明提供了一种方法，包括用包含本发明檀香油的组合物以有效提供抗微生物作用的量处理包含微生物的基材。
[0214]
在一些形态中，本公开提供了包含本发明檀香油的组合物的用途或使用方法，其中本发明檀香油以足以提供抗微生物作用的量存在。
[0215]
通过术语“抗微生物作用”，是指本领域的正常含义；即杀死微生物或抑制其生长的药剂。
[0216]
在一些形态中，本公开中使用的组合物包含高于25ppm的量、或者25ppm至10000ppm的量、或者40ppm至5000ppm的量的本发明檀香油。或者，该组合物包含40ppm至500ppm的量；或者40ppm至300ppm的量的本发明檀香油。或者，该组合物包含40ppm至200ppm的量，或者40ppm至100ppm的量的本发明檀香油。或者，该组合物包含40ppm、50ppm、300ppm或7000ppm的本发明檀香油。
[0217]
使用本文定义的组合物特别有利于限制或控制微生物包括细菌、真菌和酵母的生长。抗菌作用是卫生用品如身体护理或家庭护理产品的主要要求之一。
[0218]
如上所述，本公开涉及包含如上定义的本发明檀香油的组合物作为抗微生物剂的
用途。
[0219]
在一些形态中，本公开提供了影响微生物活性的非治疗性方法，该方法包括用包含本发明檀香油的组合物处理包含微生物的基材，其中用足以提供抗微生物作用的量的组合物来处理该基材。
[0220]
在一些形态中，本公开提供了影响微生物活性的非治疗性方法，该方法包括用包含本发明檀香油的组合物处理包含微生物的基材，其中用足以提供抗微生物作用的量的组合物来处理该基材。
[0221]
抗炎和保湿
[0222]
如下面的实施例所示，本文提出的本发明的檀香油证明了对众所周知与皮肤生理学相关的细胞类型的抗炎作用。本发明的檀香油还具有皮肤保湿益处。
[0223]
数据表明，本发明的檀香油通过其减少促炎负担和增强表皮屏障完整性的倾向以及通过建立针对外部威胁的功能性保护，代表了预防皮肤炎症和修复表皮屏障功能障碍的治疗策略，例如在各种皮肤炎症和特应性皮炎中观察到的。
[0224]
此外，由于本发明的檀香油增强了表皮屏障的完整性，因此本发明的组合物还具有皮肤保湿益处。
[0225]
因此，本发明的另一形态提供了包含本发明的檀香油的组合物，其中檀香油以足以提供抗炎作用和/或保湿作用的量存在。优选地，待治疗的炎症是皮肤炎症，并且该组合物是局部应用的。
[0226]
在另一形态中，本发明提供了一种包含本发明檀香油的组合物，用作抗炎剂和/或保湿剂。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了用于治疗炎症和/或增加皮肤保湿的本发明檀香油。
[0227]
在另一形态中，本发明提供治疗炎性病症和/或增加皮肤保湿的方法，包括向有需要的接受者施用有效量的本发明的檀香油组合物。
[0228]
通过“抗炎和/或保湿作用”，包括本发明的檀香油可用于治疗(包括缓解)湿疹、牛皮癣、脂溢性皮炎和特应性皮炎以及其他此类皮肤病的情况。
[0229]
在一些形态中，本公开中使用的组合物包含高于1μg/ml的量，或者高于5μg/ml的量的本发明檀香油。或者，该组合物包含高于10μg/ml或高于15μg/ml的量的本发明檀香油。或者，该组合物包含高于20μg/ml的量的本发明檀香油。
[0230]
使用本文定义的组合物特别有利于限制或控制受试者的炎症。
[0231]
如上所述，本公开内容涉及包含如上定义的本发明檀香油的组合物作为抗炎剂的用途。
[0232]
包含本发明檀香油的组合物可以在本发明的此形态中与一种或多种其他抗炎或镇痛化合物组合，包括非甾体抗炎药、环氧合酶
‑
2选择性抑制剂、水杨酸盐、甾体、阿片类药物、麻醉剂，以及具有抗炎特性的天然和合成舒缓剂。包含本发明檀香油的组合物还可与清凉剂组合。例如，至少一种具有镇痛特性的成分可以选自布洛芬、萘普生、酮洛芬、吡罗昔康、消炎痛、双氯芬酸、尼美舒利、塞来昔布、伐地考昔、乙酰水杨酸、可的松、泼尼松、吗啡、芬太尼、利多卡、丙胺卡因、布比卡因、苯佐卡因、丁卡因、地布卡因、扑热息痛、对乙酰氨基酚、月见草油、琉璃苣籽油、黑醋栗籽油、大麻素、联苯乙酸、烟酸酯、辣椒素、阿米替林、三硝酸甘油酯、薄荷醇、樟脑碱、吡美莫司、苯妥英、苯甲醇、乙基氯己基间苯二酚、曲拉宁、普拉
莫辛、丙对卡因、杏仁油、芦荟、蓖麻油、桉树油、葡萄籽油、薄荷油、茶树油或姜黄。
[0233]
抗痤疮
[0234]
在本发明的一个实施方案中，本发明的檀香油用于治疗痤疮。
[0235]
可以理解，本发明的檀香油的抗微生物和抗炎作用的组合因此提供了其治疗痤疮的有效性的证据。事实上，本发明的檀香油可以起到防止新损伤的作用。它还可以与现有的抗痤疮活性疗法产生协同作用。此外，本发明的檀香油可以减轻副作用(连同润肤和保湿特性)。
[0236]
在本发明的另一个实施方案中，组合物可包含一种或多种抗痤疮剂。优选地，另外的抗粉刺剂选自脱屑剂、角质层分离剂、粉刺剂、去角质剂和润肤剂，例如角鲨烷等。脱屑剂、角质层分离剂、粉刺剂和去角质剂有助于活性物质渗透到皮肤中，并且能够发挥这些功能中的一种或多种功能的化合物是本领域公知的。化合物可具有这些特性中的一种或多种，例如脱屑剂也可用作角质层分离剂。
[0237]
另外的抗粉刺剂优选选自以下中的一种或多种：过氧化苯甲酰、异戊二烯半胱氨酸及其衍生物、烟酰胺、α
‑
oh酸、脂质
‑
oh酸、基于视黄醇的产品、亚油酸、月桂酸、锌、epa(二十碳五烯酸)、α
‑
亚麻酸、dha(二十二碳六烯)酸、间苯二酚、间苯二酚单乙酸酯、硫、水杨酸、在芳环上具有一个或多个(c1至c
12
)烷基和/或(c1至c
12
)烷氧基的水杨酸衍生物(例如，5
‑
正辛基水杨酸、5
‑
正辛酰基水杨酸和2
‑
羟基
‑3‑
甲氧基苯甲酸)、苯酚、甲酚、乙酸间甲酚酯、乳酸、乙醇酸、丙酮酸、苹果酸、尿素、n
‑
乙酰半胱氨酸、视黄酸、视黄醇、视黄酯以及视黄醇和视黄酯与类视黄醇增强剂的组合。类视黄醇增强剂是通过增强视黄醇或视黄酯向视黄酸的转化来模拟视黄酸对皮肤作用的化合物。类视黄醇增强剂可单独使用或作为两种或更多种化合物的组合使用。类视黄醇增强剂描述于wo 02/02074，其内容通过引用并入本文。具体的类视黄醇增强剂包括例如神经酰胺、磷脂酰胆碱、亚油酸、12
‑
羟基硬脂酸和克洛姆唑。
[0238]
当用于局部应用时，包含本发明的檀香油的组合物可以与加香组分一起使用。这种组分的例子包括天然和合成芳香物质的混合物。天然芳香物质可能包括花(百合，薰衣草，玫瑰，茉莉，橙花，依兰)，茎，和叶(天竺葵，广藿香，苦橙叶(petitgrain))，果实(大茴香，香菜籽(coriander)，藏茴香，杜松)，果皮(佛手柑，柠檬，橙)，根(小茴香，当归，芹菜，小豆蔻，闭鞘姜(costus)，鸢尾，菖蒲)，树木(松木，白檀，愈创木，雪松，花梨木(rosewood))，草本和禾本(龙蒿，柠檬草，鼠尾草，百里香)，针叶和树枝(云杉，松树)，树脂和香脂(阿魏脂，榄香脂，安息香，没药，乳香脂(olibanum)，愈伤草脂(opoponax))。也可以使用动物来源的原材料，例如灵猫香和海狸香。典型的合成芳族化合物是酯类、醚类、醛类、酮类、醇类和烃类类型的产物。酯类型的芳族化合物包括例如乙酸苄酯，异丁酸苯氧基乙酯，乙酸对叔丁基环己基酯，乙酸芳樟酯，乙酸二甲基苄基原酯，乙酸苯乙酯，苯甲酸芳樟酯，甲酸苄酯，乙基甲基苯基甘氨酸酯，丙酸烯丙基环己基酯，丙酸苏合香酯和水杨酸苄酯。醚包括例如苄基乙基醚，醛包括例如具有8至18个碳原子的直链烷醛，柠檬醛，香茅醛，香茅基氧基乙醛，仙客来醛，羟基香茅醛，铃兰醛和波洁红醛，酮包括例如α
‑
异甲基紫罗兰酮和甲基柏木酮，醇包括例如茴香脑，香茅醇，丁子香酚，异丁子香酚，香叶醇，芳樟醇，苯乙醇和松油醇，并且烃主要包括萜烯和香脂。在一个形态中，香料是各种芳香物质的混合物，它们一起产生吸引人的香味。挥发性较低的醚油主要用作芳香成分，适合用作香料油，例如鼠尾草油，甘菊油，丁香油，香脂油，薄荷油，肉桂叶油，椴树花(lime blossom)油，杜松子油，香根草油，乳香脂
油，阿魏脂油，岩玫瑰(labdanum)油和杂薰衣草(lavandin)油，佛手柑油，二氢月桂烯醇，铃兰醛，新铃兰醛，香茅醇，苯乙醇，α
‑
己基肉桂醛，香叶醇，苄基丙酮，仙客来醛，乙氧基甲氧基环十二烷(boisambrene forte)，降龙涎香醚(ambroxan)，吲哚，二氢茉莉酮酸甲酯(hedione)，2
‑
甲基
‑4‑
(2,2,3
‑
三甲基
‑3‑
环戊烯
‑1‑
基)
‑2‑
丁烯
‑1‑
醇(sandelice)，柠檬油，桔子(mandarin)油，橙油，格蓬酯，3,6
‑
二甲基
‑
环己
‑3‑
烯
‑1‑
甲醛(cyclovertal)，杂薰衣草油，香紫苏油(muscatel sage oil)，13
‑
大马酮，波旁天竺葵油，水杨酸环己酯，甲基柏木烯酮(vertofix coeur)，龙涎酮(iso
‑
e
‑
super)，吐纳麝香(fixolide np)，合成橡苔(evernyl)，γ
‑
甲基紫罗兰酮(iraldein gamma)，苯乙酸，乙酸香叶酯，乙酸苄酯，玫瑰醚，romilate，2
‑
乙基
‑
己酸乙酯(irotyl)和2
‑
叔丁基环己基乙基碳酸酯(floramate)，可单独或以混合物形式使用。
[0239]
如本文所用，术语“皮肤病学上可接受的”是指如此描述的组分适用于与人类皮肤接触而没有过度的毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等。remington's pharmaceutical sciences ed.by gennaro,mack publishing,easton,pa.,1995公开了用于配制药物组合物的各种载体和制备此类剂型的已知技术。
[0240]
所使用的皮肤病学上可接受的载体可以是水或水溶液；油，例如癸酸或辛酸的甘油三酯，或蓖麻油；脂肪、蜡和其他天然和合成脂肪材料，优选脂肪酸与低c数醇，例如与异丙醇、丙二醇或甘油所形成的酯，或脂肪醇与低c数链烷酸或与脂肪酸所形成的酯；低c数的醇，以及它们的醚，优选乙醇、异丙醇、甘油、乙二醇，乙二醇单乙基或单丁基醚，丙二醇单甲基、单乙基或单丁基醚，二甘醇单甲基或单乙基醚和类似产品。在某些情况下，使用上述溶剂的混合物。在醇溶剂的情况下，水可以是另外的成分。
[0241]
适用于本发明的皮肤病学上可接受载体的一些具体例子包括水、橄榄油、花生(peanut)油、芝麻油、葵花油、红花油、花生(arachis)油、椰子油、液体石蜡、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯、聚乙烯醇、部分水解的聚乙酸乙烯酯。本领域普通技术人员将理解其他合适的载体。
[0242]
载体组分可包含油，在一个实施方案中，其存在于乳液的油相中，该油选自烃油，例如石蜡烃或矿物油；b)蜡，如蜂蜡或石蜡；c)天然油，如葵花油、杏仁油、乳木果油或荷荷巴油；d)硅油，如二甲基硅油、环甲基硅油或十六烷基二甲基硅油等；e)脂肪酸酯，如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯、马来酸二辛酯、油酸甘油酯和异壬酸十六十八酯；f)脂肪醇，如鲸蜡醇或硬脂醇及其混合物(例如鲸蜡硬脂醇)；g)聚丙二醇或聚乙二醇醚，例如ppg
‑
14丁醚；或h)它们的混合物，例如以商品名cutina(cognis)商购的蜡的混合物。
[0243]
载体可以是水醇体系(例如液体和凝胶)、无水油或基于有机硅的体系或乳液体系的形式，包括但不限于水包油、油包水、水包油包水型和有机硅包水包油型乳液。乳液可以覆盖广泛的稠度，包括稀乳液(也可以适用于喷雾或气雾剂递送)、乳状乳液、轻乳膏、重乳膏等。乳液还可包括微乳液系统。其他合适的局部载体包括无水固体和半固体(例如凝胶和棒)；和水性摩丝系统。可用于本发明的局部载体系统的非限制性例子在以下四篇参考文献中进行了描述，所有这些参考文献通过引用整体并入本文：“sun products formulary”,cosmetics&toiletries,vol.105,pp。
[0244]
本发明组合物的各种实施方案可包括稳定剂。稳定剂可以是选自如下的抗氧化剂：氨基酸(例如甘氨酸、组氨酸、酪氨酸、色氨酸)及其衍生物、咪唑(例如尿烷酸)及其衍生
物、肽例如d,l
‑
肌肽、d
‑
肌肽、l
‑
肌肽及其衍生物(例如鹅肌肽)、类胡萝卜素、胡萝卜素(例如α
‑
胡萝卜素、β
‑
胡萝卜素、番茄红素)及其衍生物、硫辛酸及其衍生物(例如二氢硫辛酸)、金硫葡萄糖、丙硫氧嘧啶和其他硫醇(例如硫氧还蛋白、谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸、胱胺及它们的糖基、n
‑
乙酰基、甲基、乙基、丙基、戊基、丁基和月桂基、棕榈酰基、油基、γ
‑
亚油基、胆固醇和甘油的酯)及其盐，硫代二丙酸二月桂酯，硫代二丙酸二硬脂酯、硫代二丙酸及其衍生物(酯、醚、肽、脂类、核苷酸、核苷和盐)和亚砜亚胺化合物(例如丁硫氨酸亚砜亚胺、高半胱氨酸亚砜亚胺、丁硫氨酸砜、五
‑
、六
‑
或七硫代亚砜)以非常低的耐受剂量(例如pmol至.mu.mol/kg)、进一步的(金属)螯合剂(例如α
‑
羟基脂肪酸、棕榈酸、植酸、乳铁蛋白)、α
‑
羟基酸(例如柠檬酸、乳酸、苹果酸)、腐殖酸、胆汁酸、胆汁提取物、胆红素、胆绿素、edta、egta及其衍生物、不饱和脂肪酸及其衍生物(如γ
‑
亚麻酸、亚油酸、油酸)、叶酸及其衍生物、泛醌和泛醇及其衍生物，维生素c和衍生物(例如棕榈酸抗坏血酸酯、磷酸抗坏血酸镁、乙酸抗坏血酸酯)、生育酚和衍生物(例如维生素e乙酸酯)、维生素a和衍生物(维生素a棕榈酸酯)以及来自安息香、芸香酸和其衍生物、阿魏酸及其衍生物、丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、去甲二氢愈创木酸、三羟基丁苯酮、尿酸及其衍生物、甘露糖及其衍生物、锌及其衍生物(例如zno、znso4)、硒及其衍生物(例如硒代甲硫氨酸)、芪及其衍生物(例如芪氧化物、反式芪氧化物)，以及这些活性化合物的根据本发明的合适的衍生物(盐、酯、醚、糖、核苷酸、核苷、肽和脂质)。稳定剂可以0.2～3.0％的浓度存在。
[0245]
根据本发明的组合物可包含一种或多种保湿剂，即旨在增加皮肤表层的水含量的成分。这些成分的例子是润肤剂，例如角鲨烷、甘油、1,3
‑
丁二醇、丙二醇、尿素、泛醇、α
‑
羟基酸例如乳酸、水解蛋白质、透明质酸、吡咯烷酮碳酸，以及天然材料，如库拉索芦荟。其他合适的成分包括甘油季铵盐、甘油和羟乙基脲并且包括由联合利华公司出售的stratys
‑
3系统或以名称sheer infusion出售的那些。保湿剂通常是水溶性保湿剂。
[0246]
本发明的组合物还可包含增稠剂。合适的增稠剂包括纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素羟乙基纤维素、乙酸丙酸羧酸纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、微晶纤维素、纤维素硫酸钠及其混合物。其他合适的增稠剂包括烷基取代的纤维素。在这些聚合物中，纤维素聚合物的一部分羟基被羟烷基化(优选羟乙基化或羟丙基化)以形成羟烷基化纤维素，然后通过醚键用c
10
‑
c
30
直链或支链烷基进一步改性。通常，这些聚合物是c
10
‑
c
30
直链或支链醇与羟烷基纤维素形成的醚。可用于改性羟烷基纤维素的烷基的例子包括选自以下的那些：硬脂基、异硬脂基、月桂基、肉豆蔻基、鲸蜡基、异十六烷基、椰油基(即衍生自椰子油醇的烷基)、棕榈基、油基、亚油基、亚麻基、蓖麻油基、山嵛基及其混合物。
[0247]
适用于本发明组合物的其他增稠剂包括阿拉伯胶、琼脂、藻胶、藻酸、藻酸铵、支链淀粉、藻酸钙、角叉菜胶钙、肉碱、角叉菜胶、糊精、明胶、结冷胶、瓜尔胶、瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵、锂蒙脱石、透明质酸、水合二氧化硅、羟丙基壳聚糖、羟丙基瓜尔胶、刺梧桐胶、海带、刺槐豆胶、纳豆胶、海藻酸钾、角叉菜胶钾、海藻酸丙二醇酯、菌核胶、羧甲基葡聚糖钠、角叉菜胶钠、黄原胶及其混合物。
[0248]
根据本发明提供的凝胶可以是水性的或非水性的。优选水性凝胶。凝胶将含有胶凝剂以赋予凝胶足够的粘度。特别合适的胶凝剂是丙烯酰二甲基牛磺酸(或其盐)的共聚物，尤其是该单体与另一种乙烯基单体的共聚物。盐可以是第i族碱金属的盐，但更优选铵
盐。合适的共聚物胶凝剂的例子是丙烯酰二甲基牛磺酸铵/乙烯基吡咯烷酮共聚物、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/山嵛醇聚醚
‑
25甲基丙烯酸酯共聚物、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/乙烯基甲酰胺共聚物。这些材料可从clariant gmbh以商品名aristoflex的产品范围获得。
[0249]
优选的水性体系包含至少40％w/w，更优选至少50％w/wt，最优选至少60％w/w的量的水。一些组合物可包含至少70％或甚至至少75％w/w。水的上限将取决于掺入到组合物中的其他成分的量，使得水可以形成组合物的剩余部分，直至组合物的100％w/w。典型的最大值小于90％w/w，例如小于85％或80％w/w。
[0250]
根据本发明的组合物还可包括防腐剂。合适的防腐剂包括但不限于c1‑
c3烷基对羟基苯甲酸酯和苯氧乙醇、丙酸钙、硝酸钠、亚硝酸钠、亚硫酸盐(二氧化硫、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾等)和edta二钠。基于总组合物，防腐剂通常以约0.5％至约2.0重量％的量存在。
[0251]
在本发明的一个实施方案中，组合物可包括抗炎剂。抗炎剂的例子包括但不限于非甾体和甾体抗炎剂例如皮质类固醇例如氢化可的松、羟曲安西龙、α
‑
甲基地塞米松、地塞米松
‑
磷酸酯、二丙酸倍氯米松、戊酸氯倍他索、地奈德、去氧米松、醋酸去氧皮质酮、地塞米松、二氯松、二醋酸双氟拉松、戊酸双氟可龙、氟肾上腺素、氟拉龙丙酮、氟氢可的松、氟米松新戊酸酯、氟西米松、氟轻松、氟可汀丁酯、氟可龙、氟可龙、氟泼尼定、醋酸氟泼尼定、氟氢缩松、氯氟舒松、醋酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、甲泼尼龙、曲安奈德、可的松、可多酮、氟西酮、氟氢可的松、醋酸双氟拉松、氟肾上腺素丙酮、甲羟松、安舒菲、安西奈德、倍他米松、氯泼尼松、醋酸氯泼尼松、氯可特龙、克西诺龙、二氯松、二氟泼尼酯、氟氯奈德、氟尼缩松、氟米龙、氟哌隆、氟泼尼松龙、戊酸氢化可的松、环戊丙酸氢化可的松、氢可他酯、甲泼尼松、帕拉米松、泼尼松龙、泼尼松、二丙酸倍氯米松、二丙酸倍他米松、曲安缩松、以及它们的组合。非甾体抗炎剂的例子包括但不限于cox抑制剂、lox抑制剂和p38激酶抑制剂、免疫抑制剂如环孢菌素和细胞因子合成抑制剂。其他天然抗炎药包括但不限于小白菊提取物、大豆提取物或燕麦提取物、β
‑
葡聚糖和桃柁酚(totarol)。
[0252]
在本发明的另一个实施方案中，组合物可包含一种或多种抗痤疮剂。优选地，另外的抗痤疮剂选自脱屑剂、角质层分离剂、粉刺剂、非粉刺剂和去角质剂。脱屑剂、角质层分离剂、粉刺剂和去角质剂有助于活性物质渗透到皮肤中，并且能够发挥这些功能中的一种或多种功能的化合物是本领域公知的。化合物可具有这些特性中的一种或多种，例如脱屑剂也可用作角质层分离剂。
[0253]
节肢动物防治
[0254]
本发明人研究了本发明的檀香油作为节肢动物驱避剂的潜力。如所附实施例所示，该组合物可用作驱蚊剂或驱蜱剂。
[0255]
因此，本发明的另一形态提供了包含本发明檀香油的节肢动物防治组合物。
[0256]
本发明理解的节肢动物涉及不想要的节肢动物，意思是它们存在于空气中、物品表面、植物表面或动物表面。动物可以是鸟(例如鸡，节肢动物是蜱)、鱼(例如鲑鱼，节肢动物是虱子)、脊椎动物例如人类受试者或其他哺乳动物优选人类受试者。优选的不想要的节肢动物是影响植物和动物的害虫(pest)节肢动物，例如蓟马、蜱、蚜虫、甲虫、蛾、粉蚧、蚧壳虫(scale)等，更优选影响动物的害虫节肢动物，例如蚂蚁、白蚁、蟑螂、苍蝇等，甚至更优选影响脊椎动物的吸血节肢动物，例如咬蝇、臭虫、猎蝽(kissing bug)、跳蚤、虱子、蚊子和蜱虫，更优选蚊子和蜱虫。
[0257]
不希望节肢动物存在的原因可能是节肢动物在空气中的存在使受试者不愉快，节肢动物接触物品会传播疾病和/或细菌，或者节肢动物咬伤生物体并引起瘙痒、疾病和/或细菌的传播，或者节肢动物的摄食可能是其他疾病和/或状况的原因。
[0258]
在一个特定的实施方案中，节肢动物是昆虫或蛛形纲动物，优选昆虫。
[0259]
术语“昆虫”具有技术领域技术人员的通常理解。昆虫被描述为明确的头部、胸部和腹部，只有三对腿，通常有一对或两对翅膀。
[0260]
在一个特定的实施方案中，昆虫是蚊子、咬蝇、臭虫、猎蝽、跳蚤、虱子、蚂蚁、白蚁、蟑螂、苍蝇、蚜虫、甲虫、蓟马、蜱、蛾、粉蚧或蚧壳虫害虫，更优选蚊子.
[0261]
术语“蛛形纲动物”具有技术领域技术人员的通常理解。蛛形纲动物被描述为具有分成两个区域的分段身体，其中前部有四对腿但没有触角。
[0262]
在一个特定的实施方案中，蛛形纲动物是蜱、螨、恙螨或蜘蛛，更优选蜱。
[0263]
表述“防治”、“节肢动物防治”、“昆虫防治”或“蛛形纲动物防治”等对于本技术领域的技术人员具有通常的含义。
[0264]
本发明上下文中的“防治”定义了根据本发明的节肢动物防治组合物吸引、阻止、灭活、限制发育和/或繁殖或驱避节肢动物的能力，优选阻止或驱避节肢动物，甚至更优选地驱避节肢动物
[0265]
根据本发明的“吸引”定义了根据本发明的节肢动物引诱剂组合物增加或促进节肢动物在节肢动物引诱剂源处接触或存在节肢动物的能力，例如在空气中、制品表面上或脊椎动物，例如人类受试者或其他哺乳动物，优选物品例如诱捕装置的表面上，节肢动物引诱剂化合物或组合物已应用于其上。
[0266]
根据本发明的“阻止”定义了根据本发明的节肢动物阻止组合物最小化、减少、遏制或防止节肢动物在节肢动物阻止源处、制品表面上或脊椎动物，例如人类受试者或其他哺乳动物，优选人类受试者表面上(节肢动物阻止化合物或组合物已应用于其上)的接触或存在的能力。通常，在最初品尝节肢动物阻止化合物或组合物后，当用作摄食阻止物时显示阻止作用，阻碍了害虫随后的食物摄入或产卵。
[0267]
根据本发明的“驱避性”定义了根据本发明的节肢动物驱避组合物最小化、减少、遏制或防止节肢动物接近或存在于节肢动物驱避剂源处，例如在空气中，物品的表面或脊椎动物，例如人类受试者或其他哺乳动物，优选人类受试者的表面上(节肢动物驱避化合物或组合物已应用于其上)的能力。
[0268]
在一个特定的实施方案中，节肢动物防治组合物是节肢动物驱避组合物，优选昆虫驱避开合物，更优选驱蚊组合物。
[0269]
在一个特定的实施方案中，节肢动物防治源是物品附近的表面和/或空气，优选蜡烛、线圈、电扩散器、腕带、贴片、项圈、耳贴、衣物、织物、纸、生物炭、硬纸板、纤维素垫、蚊帐、屏风、窗帘、家具、墙壁、地面或油漆，或受试者的表面，优选脊椎动物的表面，例如人类受试者或其他哺乳动物，优选人类受试者，即皮肤用喷雾剂、气雾剂、乳霜、走珠、腕带、乳液、肥皂、洗发水、防晒霜或贴剂等产品处理过的人类受试者，或用洗衣粉、增香剂、柔软剂、液体洗涤剂、喷雾、乳液、粉末、液体洗涤剂、喷雾、乳液、粉末等产品处理过的衣物。
[0270]
在一个特定的实施方案中，节肢动物防治组合物包含本发明的檀香油，当存在于组合物中时，其量为0.1mg/ml至50mg/ml，优选其量为0.2mg/ml至40mg/ml，其量为0.3mg/ml
至30mg/ml，其量为0.4mg/ml至20mg/ml，其量为0.4mg/ml至10mg/ml。
[0271]
在一个实施方案中，节肢动物防治组合物还可包含节肢动物防治辅助成分。“节肢动物防治辅助成分”被理解为能够赋予本文所述组合物的节肢动物防治作用额外的节肢动物防治益处的成分。
[0272]
在一种实施方式中，节肢动物防治组合物还可包含香料成分。香料成分被理解为有助于、改良、增强或改善组合物的嗅觉特性，但不有助于、增强或改善组合物的节肢动物防治效果。
[0273]
节肢动物防治组合物还可包含载体。“载体”被理解为一种材料，活性化合物与该材料混合或配制以促进其在待处理场所或其他受试者的应用，或其储存、运输和/或处理。所述载体可以是无机的或有机的或合成的天然来源。所述载体可以是液体或固体。
[0274]
以下实施例仅是说明性的，并不意味着限制说明书中所述的本发明的范围。
[0275]
实施例
[0276]
实施例1：在工程改造的大肠杆菌细胞中制备本发明的檀香木组合物。
[0277]
编码檀香(santalum album)细胞色素p450 sacp816(wo2015040197)、薄荷细胞色素p450还原酶(cprm)和α
‑
檀香萜/β
‑
檀香萜合酶(sasas)(wo2010067309)的n末端变体的密码子优化的cdna被设计并合成以在大肠杆菌中最佳表达。
[0278]
首先将优化的细胞色素p450和细胞色素p450还原酶cdna结合以制备双顺反子构建体，该构建体依次包含p450 cdna和包括核糖体结合位点(rbs)和cprm cdna的接头序列。该构建体是通过pcr扩增具有5'和3'突出端的两种cdna来制备的，这些cdna适合使用程序(clontech)在pcwori 表达载体的ndei
‑
hindiii位点克隆(barnes hj(1996)method enzymol.272,3
‑
14)提供质粒pcwori
‑
sacp816
‑
cprm。然后将密码子优化的α
‑
檀香萜/β
‑
檀香萜合酶cdna扩增并使用dry
‑
down pcr cloning kit在pcwori
‑
sacp816
‑
cprm的hindiii酶识别位点连接，提供载体pcwori
‑
sacp816
‑
cprm
‑
sasas。
[0279]
构建第二个表达载体用于异源甲羟戊酸途径的表达和增加量的法呢基二磷酸(fpp)的产生，如先前在专利wo2013064411或schalk等人(2012)j.am.chem.soc.134,18900
‑
18903中所述。简而言之，制备包含两个操纵子的表达质粒，该操纵子由编码完整甲羟戊酸途径的酶的基因组成。由大肠杆菌乙酰乙酰辅酶a硫解酶(atob)、金黄色葡萄球菌hmg
‑
辅酶a合酶(mvas)、金黄色葡萄球菌hmg
‑
辅酶a还原酶(mvaa)和酿酒酵母fpp合酶(erg20)基因组成的第一个合成操纵子是体外合成(dna2.0，menlo park，ca，usa)并连接到ncoi
‑
bamhi消化的pacycduet
‑
1载体(invitrogen)中，产生pacyc
‑
29258。从肺炎链球菌(atcc baa
‑
334)的基因组dna扩增含有甲羟戊酸激酶(mvak1)、磷酸甲羟戊酸激酶(mvak2)、甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(mvad)和异戊烯二磷酸异构酶(idi)的第二个操纵子并连接进入pacyc
‑
29258的第二个多克隆位点，提供质粒pacyc
‑
29258
‑
4506。因此，该质粒包含编码从乙酰辅酶a到fpp的生物合成途径的所有酶的基因。
[0280]
大肠杆菌krx细胞(promega)与pcwori
‑
sacp816
‑
cprm
‑
sasas和pacyc
‑
29258
‑
4506共转化。在羧苄青霉素(50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)lb琼脂平板上选择经转化的细胞。使用单菌落接种5ml补充有适当抗生素的lb培养基。培养物在37℃和250rpm下孵育过夜。第二天，在含有100μg/l羧苄青霉素和17μg/l氯霉素的玻璃培养管中的2ml tb培养基中接种200
μl的lb预培养物，并在37℃和250rpm下孵育。培养6小时后(或当培养物600nm处的光密度达到3的值时，将培养物冷却至20℃，并用0.1mm的iptg(异丙基β
‑
d
‑1‑
硫代吡喃半乳糖苷)和0.1％鼠李糖引发蛋白表达，然后添加75μg/lδ
‑
氨基乙酰丙酸(σ)和5％(v/v)癸烷。250rpm振荡孵育48小时后，用1体积的mtbe(甲基叔丁基醚，sigma)提取全部的培养液，并在连接到agilent 5975质量检测器的agilent 6890系列gc系统上通过gcms进行分析。gc配备有0.25mm内径和30m db
‑
5ms的毛细管柱(agilent j&w)。载气为he，流速为1ml/min。初始烘箱温度为80℃(保持1分钟)，然后以20℃/分钟的梯度升至260℃并以40℃/分钟的速度升至300℃。产品的鉴定基于质谱和保留指数与真实标准和内部数据库的比较。
[0281]
在这些条件下，产生了几种倍半萜烃、α
‑
檀香萜、β
‑
檀香萜、反式α
‑
香柠檬烯和表
‑
β
‑
檀香萜以及相应的倍半萜醇(e)
‑
α
‑
檀香萜醇、(e)
‑
β
‑
檀香萜醇、(e)
‑
α
‑
香柠檬醇和(e)
‑
表
‑
β
‑
檀香醇(图1a)。除了倍半萜醇之外，倍半萜烃的存在表明在这些条件下细胞色素p450单加氧酶的转化是不完全的。倍半萜烃可以使用例如快速色谱法去除。这种技术可以在不同的规模上实施。可以使用一次性巴斯德移液器进行微量分离。将玻璃棉楔入移液管的窄端，然后将硅胶从宽端倒入移液管中。在硅胶顶部加入一层薄砂，然后用庚烷平衡色谱柱。使用转化的大肠杆菌细胞产生的倍半萜混合物被干燥，悬浮在庚烷中并加载到柱上。柱子用两体积的庚烷洗涤，倍半萜醇用一体积的40:60(v:v)mtbe:庚烷混合物洗脱。所得样品含有(e)
‑
α
‑
檀香醇、(e)
‑
β
‑
檀香醇、(e)
‑
α
‑
香柠檬醇和(e)
‑
表
‑
β
‑
檀香醇(图1b)的混合物。
[0282]
除了上面概述的快速色谱方案之外，可以理解的是，技术人员还可以使用分馏方法从发酵过程产生的粗溶液中去除倍半萜烃并提供本发明的檀香油。
[0283]
实施例2：本发明檀香油的分析
[0284]
下面提供一种分析本发明檀香油成分的方法
[0285]
将样品在二氯甲烷中稀释为3％，并在gc/ms
‑
fid上进样。gc/ms
‑
fid分析在配备两根色谱柱的agilent系统上进行，该色谱柱与两个检测器、一个质谱仪和一个fid检测器相连。它配备了两根agilent db
‑
1ms色谱柱(60m x 0.25mm x 0.25μm)。0.2μl样品在250℃下以分流模式(1:50)进样。初始烘箱温度在50℃保持5分钟，以3℃/分钟的速度升至120℃，以5℃/分钟的速度升至250℃，保持5分钟，然后以15℃/分钟升至310℃，然后在该温度下保持20分钟。
[0286]
质谱在70ev下产生，扫描范围为0到20分钟m/z：29
‑
250，20分钟为29
‑
450。在类似条件下注入一系列正烷烃(c5
‑
c31)后测定线性保留指数(lri)。使用带有search review插件和ms库的mass hunter软件对gc
‑
ms峰进行识别和积分。使用辛酸甲酯作为内标，通过gc
‑
fid进行定量分析，并对每种化合物应用相对响应因子。
[0287]
实施例3：本发明的檀香组合物的皮肤病学作用
[0288]
介绍
[0289]
本发明人研究了本发明檀香油的皮肤病学效果。特别地，他们研究了本发明组合物的(i)抗微生物特性和(ii)抗炎特性。
[0290]
对于这两种类型的分析，第一项研究确定了将在各自适应的体外模型中使用的组合物的非细胞毒性浓度。
[0291]
材料与方法
[0292]
本发明的檀香油
[0293]
本发明的檀香油样品使用上述实施例1中概述的方法制备。
[0294]
细胞毒性试验
[0295]
进行初步研究以确定本发明檀香油和参比檀香油的非细胞毒性有效浓度。在用测试成分处理(160
–
80
–
40
–
20
–
10μg/ml，一式三份测试)之后，使用标准mts测定法(3
‑
(4,5
‑
二甲基噻唑
‑2‑
基)
‑5‑
(3
‑
羧基
‑
甲氧基苯基)
‑2‑
(4
‑
磺基苯基)
‑
2h
‑
四唑鎓)评估细胞存活率。
[0296]
该测试分别在基础条件(即没有促炎挑战)和促炎刺激下进行24至72小时或26小时。在处理前24小时，将细胞接种在具有完全培养基的24孔板中。
[0297]
将测试成分溶解在溶剂(dmso或乙醇)中，并在促炎挑战(需要时)前2小时施加到细胞培养基中。0.008％或0.08％的sds用作细胞毒性阳性对照，以分别验证nheks角质形成细胞或nhdfs成纤维细胞的实验。
[0298]
最低抑菌浓度
[0299]
该测试确定可以抑制特定细菌菌株生长的最低成分浓度。使用的方法根据rey等人的comb chem high throughput screen.2014；17(7):614
‑
2进行。
[0300]
细胞培养
[0301]
正常人包皮衍生的真皮成纤维细胞(nhdf；atcc，crl
‑
2522)的单层培养物用于抗炎研究。细胞在补充有10％胎牛血清(fbs，gibco/life technologies,10270)和抗生素(青霉素/链霉素，gibco/life technologies,15140)的dulbecco改良eagle培养基(dmem，gibco/life technologies,31885)中生长。正常人表皮角质形成细胞(nheks；lonza,00192906)的单层培养物用于抗炎研究。细胞在含有庆大霉素和hkgs(人类角质形成细胞生长补充剂)的epilife培养基中生长。
[0302]
在进行代谢、细胞因子和基因表达分析之前，将细胞在37℃和5％co2气氛的加湿培养箱中维持指定的处理期。
[0303]
抗炎试验
[0304]
nhek和nhdf细胞类型均在24孔板中在完全培养基中培养24小时，然后再接触测试和参考项目。在用促炎剂挑战24小时前2小时将测试组合物施加到细胞上(见下表)。将每个样品与溶剂对照条件进行比较。在治疗结束时，收集所有上清液并储存在
‑
20℃直到进一步用于特定的elisa测定，以量化il
‑
8、il
‑
6、tnf
‑
α、mcp
‑
1和cxcl5的细胞外释放，该测定基于标准曲线，根据试剂盒供应商的规格进行。
[0305]
所用材料列于表1。实验过程示意图如图2所示。
[0306]
表1
[0307][0308]
结果
[0309]
细胞毒性
[0310]
为了确保使用无细胞毒性的测试组合物浓度进行实验，在处理26小时后(单独2小时和在用lps对nhdf成纤维细胞以及用pma/钙离子载体或tnf
‑
α对nheks进行炎症挑战下24小时)对nhek和nhdf进行细胞毒性研究。
[0311]
使用0.08％和0.008％的sds作为细胞毒性阳性对照以验证实验，与未处理的对照相比，细胞毒性阈值任意固定为80％的存活率。
[0312]
获得的结果(图3)以相对于炎症条件下相关对照的存活率百分比表示(对于nhdfs成纤维细胞的lps和对于nheks角质形成细胞的pma/a23187或tnf
‑
α)。
[0313]
正如预期的那样，在nhdfs成纤维细胞和nheks角质形成细胞上应用26小时后，阳性参考sds(0.08％和0.008％)诱导细胞存活率的强烈下降。应用或两个测试项目(参比檀香油和本发明檀香油)在其最低测试剂量下似乎与超过20％的细胞存活率的改变无关，结果与发炎的细胞对照相似。
[0314]
与这些结果一致，选择参比檀香油和本发明组合物的20μg/ml浓度以进行抗炎分析。
[0315]
为了确定在基础条件下(即没有炎症挑战)本发明组合物对nheks的非细胞毒性浓度，测量了5种浓度的测试材料在处理24小时和72小时后对nheks角质形成细胞存活率的影响。
[0316]
数据以相对于溶剂对照条件(乙醇0.02％和0.16％)的存活率百分比表示，任意设置为100％。按照惯例，细胞毒性阈值固定为80％的存活率。sds 0.008％用作细胞毒性的阳性参考并验证实验。
[0317]
结果(图4)表明，10、20和40μg/ml的生化来源檀香木剂量不会显著改变在基础条件下培养的nhek细胞的存活率，后者浓度至少在72小时时间点。
[0318]
本发明组合物的抗炎作用
[0319]
本发明的檀香油以20μg/ml在角质形成细胞和成纤维细胞上进行测试，与檀香(s.album)精油进行比较。在刺激炎症发作的条件下培养角质形成细胞和成纤维细胞。在诱导炎症状态和应用测试化合物后，收集细胞培养物上清液用于进一步的elisa定量。然后通过elisa(酶联免疫吸附试验)测量成分减少选定炎症标志物(mcp
‑
1、cxcl5、il
‑
6、il
‑
8和
tnfalpha)产生的能力，elisa(enzyme
‑
linked immunosorbent assay)是一种常见的用于量化物质生化试验。
[0320]
从随附的表2中可以看出，数据表明用pma(与钙离子载体a23187组合)或用tnf
‑
α处理nhek细胞诱导所有测试炎症介质的显著释放。在这些情况下，已知的抗炎药地塞米松(cxcl
‑
5除外)和布洛芬显著降低了炎症介质的分泌水平。
[0321]
表2：本发明檀香油的抗炎特性。本发明的檀香油减少细胞因子(mcp
‑
1、cxcl
‑
5、il
‑
6、il
‑
8和tnfalpha)释放的能力在用促炎刺激物挑战的人成纤维细胞和角质形成细胞中进行测量。抗炎药(地塞米松和布洛芬)用作对照。将本发明檀香油的功效与从檀香(s.album)中提取的传统精油的功效进行比较。报告的数据代表3次重复的平均值
[0322][0323]
本发明的以生化方式产生的檀香油和参比檀香油均显著降低了所有炎症标志物
的产生。
[0324]
本文呈现的结果证明，本发明的以生化方式产生的檀香油显著降低了由角质形成细胞产生的炎症标志物的量。这种减少与使用檀香(s.album)精油时观察到的减少相当。
[0325]
与在角质形成细胞、成纤维细胞上观察到的相似，本发明的檀香油减少了所有炎症标志物。
[0326]
因此，上述数据表明，本发明的檀香油在体外减少了人角质形成细胞中炎症介质的产生，因此支持该组合物作为抗炎剂的应用。
[0327]
测量炎症标志物的生物学意义
[0328]
白细胞介素6(il
‑
6)：在感染和组织损伤时迅速而短暂地产生，通过刺激急性期反应、造血和免疫反应来促进宿主防御。
[0329]
白细胞介素8(il
‑
8)是先天免疫系统反应的重要介质。il
‑
8，也称为嗜中性粒细胞趋化因子，有两个主要功能。它在靶细胞(主要是中性粒细胞，但也有其他粒细胞)中诱导趋化性，导致它们向感染部位迁移。il
‑
8到达后也会刺激吞噬作用。
[0330]
单核细胞趋化蛋白
‑
1(mcp
‑
1)是调节单核细胞/巨噬细胞迁移和浸润的关键趋化因子之一。单核细胞从血流穿过血管内皮迁移是组织的常规免疫监测以及对炎症的反应所必需的。
[0331]
cxcl5众所周知对中性粒细胞具有趋化和激活功能，主要是在急性炎症反应期间。也已知cxcl5水平在某些慢性炎症(例如动脉粥样硬化)中升高，但不具有中性粒细胞浸润作用
[0332]
肿瘤坏死因子α(tnf
‑
α)是负责启动炎症急性期反应以响应感染或疾病的细胞因子之一。
[0333]
本发明组合物的抗菌活性
[0334]
本发明人研究了本发明檀香油的抗微生物特性。如上文材料部分所述，确定的组合物的mic值是针对多种细菌物种确定的。mic(最低抑菌浓度)衡量可以防止细菌生长的物质的最低浓度。mic越低，抗微生物活性最强。测试协议由rey,s等人的“high throughput screening of perfumery raw materials for antimicrobial properties”comb.chem.high throughput screen.2014；17(7):614
‑
622描述。
[0335]
测试的细菌种类与不同的特性/益处相关：
[0336]
金黄色葡萄球菌(s.aureus)是一种通常存在于皮肤上的机会性病原体。这种细菌通常没有问题，但如果个体有潜在疾病，它可能会致病。这种细菌最近也与皮肤病如特应性皮炎有关。本发明的檀香油对这种细菌非常有活性。
[0337]
干燥棒状杆菌(c.xerosis)、纹带棒状杆菌(c.striatum)、杰氏棒状杆菌(c.jeikeium)、结核硬脂酸棒状杆菌(c.tuberculostearicum)和溶血葡萄球菌(s.haemolyticus)是与汗液体臭产生相关的细菌。
[0338]
痤疮丙酸杆菌(c.acnes)(以前归类为p.acnes)是痤疮的病原体。本发明的檀香油对这种细菌非常有活性。
[0339]
下表3中提供的数据显示了对革兰氏阳性菌种的抗菌活性。
[0340][0341]
对痤疮丙酸杆菌(c.acnes)的抗微生物活性，连同以上报道的抗炎作用，表明本发明的檀香油具有缓解痤疮症状的潜力。
[0342]
从实验得出的结论
[0343]
本发明的檀香油具有许多对皮肤病学有益的明确特性。
[0344]
当以至少20μg/ml施用26小时时，用本发明的檀香油进行细胞处理减轻了炎症负
担。这反映了它对皮肤生物学的潜在益处，促进其维持体内平衡并防止环境压力和病原体。
[0345]
因此，本发明的檀香油通过其减少促炎负担的倾向，代表了一种预防皮肤炎症的治疗策略，例如在各种皮肤炎症病理和特应性皮炎中观察到的。
[0346]
此外，本发明的檀香油具有明显的抗微生物活性。测试的细菌种类之一痤疮丙酸杆菌(c.acnes)是痤疮的病原体。因此，本发明的檀香油显示出明显的治疗痤疮的潜在应用。
[0347]
实施例4：本发明檀香油的昆虫和节肢动物驱避作用
[0348]
发明人研究了本发明的檀香油作为昆虫和节肢动物驱避剂的潜力。
[0349]
使用t,bourquin m,guerin pm的a standardised in vivo and in vitro test method for evaluating tick repellents.pesticide biochemistry and physiology.2013；107(2):160
–
168中定义的暖板试验的改编，确定对蜱(蓖子硬蜱(ixodes ricinus))的驱避效果，其改编为减小活动场所的大小，并在设置中添加受控温度和潮湿的气流。
[0350]
节肢动物驱避性的数据显示在图5和下面的表4中。
[0351]
表4
[0352][0353]
本文提供的数据显示，在与一种已知的节肢动物驱虫剂ir3535相当的功效下，本发明檀香油的浓度增加(分别为29％和47％，0.4mg/ml和10mg/ml)，影响的蜱数量增加。
[0354]
因此，本文提供的数据表明本发明的檀香油可用作节肢动物驱避剂。
[0355]
在称为“暖体测定”的实验室设置中获得的数据
[0356]
该实验测试使用热量作为诱饵和二氧化碳作为蚊子宿主寻找行为的激活剂，测量组合物驱避嗜血雌性蚊子的功效。该测定描述于t、kessler s、frei j、bourquin m、guerin pm的2010.an in vitro assay for testing mosquito repellents employing a warm body and carbon dioxide as a behavioral activator.j.of the american mosquito control association；26(4):381
‑
386。
[0357]
图6中显示的数据表明，当该成分分别以0.4mg/ml和10mg/ml进行测试时，蚊子降落次数减少了33％和50％。
[0358]
因此，本发明的檀香油显示出驱蚊性。
[0359]
实施例5：本发明的檀香油对正常人表皮角质形成细胞(nheks)中基因表达和蛋白质丰度的影响
[0360]
方法
[0361]
细胞培养条件
[0362]
正常人包皮来源的表皮角质形成细胞(nheks；lonza，00192906)在添加了人角质形成细胞生长补充剂(hkgs；fisher scientific，s
‑
001
‑
5)和抗生素(庆大霉素，fisher scientific，15710
‑
049)的epilife培养基(fisher scientific，m
‑
epi
‑
500
‑
a)中生长。
[0363]
基因表达分析
[0364]
将nheks接种到烧瓶(25cm2)中，并在37℃和5％co2气氛下保持在加湿培养箱中。24小时后，以3种浓度(10
‑
20和40μg/ml)施用本发明的檀香油24小时。细胞用冷pbs冲洗并在特别的(ad hoc)缓冲液中裂解。按照供应商的说明，使用qiagen rneasy试剂盒(qiagen，74106)提取总rna。收集到的rna保存在
‑
80℃。rna浓度通过分光光度法测量(qiaxpert,qiagen)确定，并通过毛细管电泳对完整核糖体rna条带的可视化进行分析(对于18s
‑
rna为1.9kb，对于28s
‑
rna为4.7kb)。
[0365]
通过taqman测定法测量响应于处理的11个靶基因表达的修饰。根据制造商的说明，使用高容量rna
‑
to
‑
cdna试剂盒(applied biosystems，438706)从总rna进行逆转录。然后将cdna储存在
‑
20℃直到用于聚合酶链反应(pcr)。
[0366]
使用quantstudio7实时pcr系统(applied biosystems)执行pcr。简而言之，将4μl cdna(4ng)与10μl taqman fast advanced master mix(applied biosystems)、1μl taqman gene expression assay和5μl无rnase的水混合。热循环编程为在95℃下进行第一个变性步骤20秒。扩增方案遵循40个循环(95℃下1秒，60℃下20秒)。
[0367]
为了使结果标准化，从相同的cdna样品中扩增了一个管家基因(b2m；β2
‑
微球蛋白)。平行进行不含cdna的对照作为扩增的阴性对照。这允许验证不存在污染物的情况。
[0368]
通过比较ct(δδct)方法(pfaffl,m.w.a new mathematical model for relative quantification in real
‑
time rt
‑
pcr.nucleic acids res.29,e45(2001)；livak,k.j.&schmittgen,t.d.analysis of relative gene expression data using real
‑
time quantitative pcr and the 2(
‑
delta delta c(t))method.methods san diego calif 25,402
–
408(2001))计算相对表达水平。所有测量均从一式三份培养物进行(n＝3)。
[0369]
0.01<p<0.05的值被认为是显著的(*)，0.001<p<0.01被认为是非常显著的(**)，而p<0.001被认为是极其非常显著的(***)(学生检验)。
[0370]
nheks角质形成细胞的蛋白质免疫染色和定量
[0371]
在处理前24小时，将nhek角质形成细胞接种在完全培养基中的0.7cm2载玻片(millipore，pezgs0816)上。然后用20和40μg/ml的本发明檀香油将它们处理0小时、24小时或72小时。为每个目标分析制作了三份培养物(n＝3)。
[0372]
nhek被固定并暴露于对感兴趣的蛋白质具有特异性的一抗。然后使用荧光素偶联的二抗检测一抗。dapi或4',6'
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚，一种能够与dna的腺嘌呤和胸腺嘧啶碱基结合的荧光分子，用于检测角质形成细胞的细胞核。使用mowiol(sigma,32.459
‑
0)或prolong diamond antifade封固剂(thermo fisher,p36962)封固载玻片。
[0373]
下面的表5给出了用于每个蛋白质靶标的一抗和二抗的参考。
[0374]
表5
[0375][0376]
结果
[0377]
为了探测本发明的檀香油在体外调节对皮肤功能很重要的基因和分子通路的潜力，在用本发明的檀香油以10、20和40μg/ml处理24小时后通过taqman低密度阵列(tlda)对nheks细胞进行基因组表达的同步分析。该分析侧重于已知在表皮益处中起关键作用的96个基因，例如表皮生物学、角质化、细胞连接、脂质合成、黑色素合成、神经源性炎症、抗菌和抗氧化防御等。
[0378]
本发明的檀香油对角质形成细胞的作用似乎主要影响与负责表皮屏障功能和保水、皮肤防御威胁和表皮内聚力的细胞机制有关的基因。
[0379]
因此，通过rt
‑
qpcr再次确认了本发明的檀香油对此类基因的有限子集的影响。本发明的檀香油显著上调水通道蛋白3(aqp 3)、半胱天冬酶14(casp 14)、透明质酸合酶2和3(has 2和has 3)、密封蛋白(claudin)1、4和7(cld 1、cld 4和cld 7)、闭锁蛋白(occludin)(ocl)、角膜锁链蛋白(corneodesmosin)(cds)、atp结合盒亚家族a成员12(abca 12)和导管素抗菌肽ll
‑
37(camp)。本发明的檀香油的作用也是剂量依赖性的。
[0380]
根据上述观察，我们想知道增加的基因表达是否也转化为更高丰度的相应蛋白质
标记。nheks细胞用本发明的檀香油以20和40μg/ml处理72小时。在3个时间点(处理开始后0、24和72小时)通过免疫染色(aqp3、casp14、cldn1、cldn4、cldn7、ocln、cdsn、abca12和camp/ll37)对9种蛋白质进行蛋白质检测和定量。然而，用现有抗体检测abca12存在问题，只有在高钙条件下(一种已知会刺激角质形成细胞分化的条件)在用维生素d3刺激后才能检测到camp。因此无法研究该化合物对这些目标的影响。
[0381]
与对基因表达的观察一致，我们发现在暴露于本发明的檀香油24小时后水通道蛋白、半胱天冬酶、密封蛋白4、密封蛋白1、密封蛋白7和闭锁蛋白的丰度增加，前3个标志物在统计学上显著。
[0382]
接触该成分72小时后，角膜锁链蛋白和密封蛋白7也以统计学上显著的方式增加。
[0383]
这证明在mrna水平检测到的上调转化为相同标志物的增加的蛋白质丰度，从而表明本发明的檀香油的功能作用。
[0384]
上述实验中产生的数据显示在表6和表7以及图7和图8中。
[0385]
[0386][0387]
实施例6：本发明的檀香油对重建的人表皮(rhe)渗透性的影响
[0388]
方法
[0389]
用nhek角质形成细胞(rhe，straticell，批次：aw0320/4和aw0520/7)在体外重建人表皮。在含有补充剂和抗生素(庆大霉素，fisher scientific，15710
‑
049)的epilife培养基(fisher scientific，m
‑
epi
‑
500
‑
a)中，在聚碳酸酯过滤器上的气液界面处培养组织。它们保持在37℃和5％co2的潮湿气氛中。14天后，经组织学证实，rhe呈多层并完全分化。rhe重建后，将测试化合物在培养基中施用48小时(从第14天到第16天)。rhe组织用本发明的檀香油以20μg/ml和40μg/ml处理。同时，应用参考条件(sds为0.005％)来改变rhe屏障功能并验证该方法。在处理结束时(n＝6)，rhe在pbs/cacl2溶液中冲洗两次。然后，将细胞膜不可渗透标记分子ez
‑
link sulfo
‑
nhs
‑
lc
‑
生物素(thermo fisher scientific，21335)以2mg/ml的pbs溶液应用于rhe的基底侧。在37℃下孵育30分钟后，将组织在pbs/cacl2/甘氨酸溶液中冲洗两次，然后固定在4％的甲醛中，脱水并包埋在石蜡中。使用leica切片机rm2245生成6μm厚的切片并放置在显微载玻片上。对每个样品的一部分进行脱蜡和再水化。然后将载玻片在与alexa488(thermo fisher scientific,s32354)缀合的链霉亲和素存在下进行温育，这允许检测已扩散到表皮层中的生物素。然后使用特定的封固溶液(slowfade diamond antifade mountant with dapi；thermo fisher scientific,s36964)封固载玻片。该溶液包含dapi，一种能够与dna的腺嘌呤和胸腺嘧啶碱基结合的荧光分子，因此可以突出表皮角质形成细胞的细胞核。
[0390]
使用leica显微镜(dm 2000，镜头40x)与leica相机(dfc420c)相结合，将载玻片储存在4℃和黑暗中，直到每次重复捕获图像。使用qwin 3分析软件(leica)进行图像量化。每种处理应用于6个rhe，对每个rhe拍摄9张图像并进行量化，每种条件总共提供54个测量值。用20μg/ml和40μg/ml的本发明檀香油处理的rhe与用溶剂(乙醇0.04％)处理的rhe进行比较。完整的皮肤屏障功能会减慢生物素的扩散，而受损的屏障功能将允许染料扩散。0.01<p<0.05的值被认为是显著的(*)，0.001<p<0.01被认为是非常显著的(**)，而p<0.001是极其非常显著的(***)(学生检验)。
[0391]
结果
[0392]
与未处理的对照相比，参考处理sds降低了表皮的屏障功能，从而增加了染料通过细胞层的扩散。这验证了分析方法。
[0393]
与对照条件(乙醇0.04％)相比，用20μg/ml的本发明檀香油处理没有显著效果。然而，在40μg/ml的浓度下，本发明的檀香油显著增强了rhe的阻隔性，与乙醇0.04％(对照条件)相比，生物素扩散降低了30％。这种差异具有统计学意义(p＝0.015)
[0394]
本实施例中讨论的实验中生成的数据显示在表8和图9中
[0395]
表8
real
‑
time rt
‑
pcr.nucleic acids res.29,e45(2001)；livak,k.j.&schmittgen,t.d.analysis of relative gene expression data using real
‑
time quantitative pcr and the 2(
‑
delta delta c(t))method.methods san diego calif 25,402
–
408(2001))进行基因表达的相对量化。将ct值标准化为阵列上存在的管家基因(b2m)的ct。最大ct截止值固定为36个循环。所有测量均从一式三份进行(n＝3)。
[0405]
蛋白质表达分析
[0406]
在处理结束时通过免疫荧光定量兜甲蛋白(loricrin)、内披蛋白(involucrin)和has3的蛋白质水平。对每个样品的一部分进行脱蜡和再水化，并将载玻片在对3种目标蛋白中的每一种具有特异性的一抗存在下孵育。然后使用荧光素偶联的二抗检测一抗。dapi slowfade diamond用于检测细胞核。所用抗体列于下表9中
[0407]
表9
[0408][0409]
结果
[0410]
我们想要评估本发明的檀香油保护和/或恢复rhe的潜力，该rhe已经受到白介素的挑战，以诱导模仿敏感皮肤的修饰。该模型在hubaux,r.等人的研究论文exp.dermatol.27,1403
–
1407(2018)中有所描述，并允许在体外重现在具有特应性倾向的敏感皮肤中发现的破坏。这种破坏包括皮肤屏障改变和与皮肤屏障、瘙痒、炎症和脂质稳态相关的一组基因的修饰。在培养过程和处理结束时，从处理过的和对照rhe制备rna样品。通过分析93种表皮标记的基因调控，研究了用本发明的檀香油处理的保护作用，这些标记之前显示在敏感和/或特应性皮肤的背景下发生改变。
[0411]
与单独的溶剂(乙醇0.04％)相比，用20和40μg/ml的本发明檀香油处理诱导了几种基因表达的显著变化，总结在下表中。为清楚起见，基因表达的定量以相对方式(rq＝相对定量)表示，要么与未经处理的rhe相比，要么与用细胞因子混合物挑战的rhe相比，要么与用细胞因子混合物和溶剂挑战的rhe相比。基因表达的下调由值<1表示，而过表达由值>1表示。使用专门的软件(dataassist)进行统计分析，统计显著性以浅灰色突出显示。
[0412]
与未经处理的对照组相比，细胞因子处理改变了基因表达——主要是通过下调与脂质稳态、炎症、皮肤屏障功能和瘙痒/瘙痒症有关的关键基因。编码骨膜蛋白的基因反而被上调(postn)。用本发明的檀香油以20和40μg/ml处理显示出重新平衡这些不平衡(即增加下调基因的表达和减少上调基因的表达)的趋势，类似于未经处理的对照。
[0413]
与对基因表达的调节所做的类似，我们还使用免疫染色研究了本发明的檀香油对3个特定蛋白质靶标的潜在再平衡效应。内披蛋白(ivl)、兜甲蛋白(lor)和透明质酸合酶3
(has3)的水平被量化并与未经处理的rhe、或与用细胞因子混合物激发的rhe、或与用细胞因子混合物和溶剂激发的rhe进行比较。gw3965是一种lxr受体激动剂，已知可逆转细胞因子刺激对内披蛋白和透明质酸合酶3的影响。因此，该分子用作实验的阳性对照。
[0414]
作为角质化包膜的前体，内披蛋白和兜甲蛋白对皮肤的屏障功能起着至关重要的作用，这是众所周知的。在表皮发育过程中，角化的包膜前体发生共价交联，形成与细胞膜相邻的成熟包膜。角质细胞的完整性取决于这个外部角质化的包膜，对于维持屏障功能至关重要。
[0415]
透明质酸合酶3(has 3)是表皮中透明质酸的主要生产者，并且已知在特应性皮肤中被上调。透明质酸存在于表皮分层角质形成细胞之间的细胞外间隙中，参与角质形成细胞的增殖、分化和迁移，以及表皮屏障的建立。
[0416]
在用细胞因子混合物挑战的rhe中，兜甲蛋白和内披蛋白的丰度都减少了，这些细胞因子用于诱导类似于敏感皮肤的反应。在存在溶剂的情况下，本发明的檀香油将两种蛋白质增加到统计学上优于挑战的rhe的水平。正如预期的那样，透明质酸合酶3在用细胞因子混合物挑战的rhe中增加，这些细胞因子用于诱导类似于敏感皮肤的反应。本发明的檀香油将这种蛋白质的丰度降低至与未经处理对照相当的水平，并且当以40μg/ml测试时，在溶剂存在下，降低至与受挑战的rhe相比具有统计学意义的水平。
[0417]
敏感性皮肤的特征是皮肤屏障和脂质稳态的改变、瘙痒和炎症。本发明的檀香可用于缓解敏感皮肤状况，因为这里显示它重新平衡在rhe敏感皮肤模型中改变的基因和蛋白质的表达，特别是解决受损的皮肤屏障功能。
[0418]
本实施例中讨论的实验中生成的数据显示在表10和表11以及图10中。
[0419]
[0420]
[0421][0422]
序列表
[0423]
seq id no:1:密码子优化的cdna，编码sacp816 n
‑
末端变体
[0424]
atggcactgttgttggcggttttctggagcgctttgattattctggttagcatcttattgcgtcgtcgtcaaaaacgcaacaatttgccaccgggcccaccggccctgccgatcatcggtaacattcacattctgggcaccctgcc
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[0425]
seq id no:2:sacp816 n
‑
末端变体，氨基酸序列
[0426]
malllavfwsaliilvsillrrrqkrnnlppgppalpiignihilgtlphqslynlakkygpimsmrlglvpavvisspeaaelvlkthdivfasrprlqvadyfhygtkgvilteygtywrnmrrlctvkllntvkidsfagtrkkevasfvqslkeasvahkmvnlsarvanvienmvclmvigrssderfklkeviqeaaqlagafnigdyvpflmpldlqgltrriksgskafddileviidehvqdikdhddeqhgdfidvllammnkpmdsreglsiidrtnikailvdmigaamdtstsgvewaiselikhprvmkklqdevktvigmnrmveeadlpklpyldmvvketmrlhppgpllvpresmeditingyyipkksriivnawaigrdtnawsnnaheffperfmssnvdlqgqdfqlipfgsgrrgcpgmrlglttvrlvlaqlihcfdlelpkgtvatdldmsekfglampraqhllafptyrles
[0427]
seq id no:3:密码子优化的cdna，编码cprm
[0428]
atggaacctagctctcagaaactgtctccgttggaatttgttgctgctatcctgaagggcgactacagcagcggtcaggttgaaggtggtccaccgccaggtctggcagctatgttgatggaaaataaggatttggtgatggttctgacgacgtccgtggcagtcctgatcggctgtgtcgtggtcctggcatggcgtcgtgcggcaggtagcggtaagtacaagcaacctgaactgcctaaactggtggtcccgaaagcagccgaaccggaggaggcagaggatgataaaaccaagatcagcgtgtttttcggcacccaaaccggtacggcagaaggtttcgcgaaggcttttgttgaagaggccaaggcgcgttatcagcaggcccgtttcaaagttatcgacctggacgactatgcggcagacgatgacgagtacgaagagaaactgaagaaggaaaacttggcattcttcttcttggcgtcctacggtgacggcgagccgacggacaacgcggcacgcttttacaaatggtttacggagggtaaggaccgtggtgaatggctgaacaatctgcagtacggcgtttttggtctgggtaaccgtcaatatgagcatttcaataagatcgccattgtcgtcgatgatctgatcttcgagcaaggtggcaagaagctggttccggtgggtctgggtgacgatgaccagtgcattgaggatgattttgcggcgtggcgtgaactggtctggccggaactggataaactgctgcgtaacgaagacgacgctaccgtggcaaccccgtacagcgccgctgtgctgcaataccgcgtggttttccacgatcacattgacggcctgattagcgaaaacggtagcccgaacggtcatgctaatggcaataccgtgtacgatg
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[0429]
seq id no:4:cprm氨基酸序列
[0430]
mepssqklsplefvaailkgdyssgqveggpppglaamlmenkdlvmvlttsvavligcvvvlawrraagsgkykqpelpklvvpkaaepeeaeddktkisvffgtqtgtaegfakafveeakaryqqarfkvidlddyaadddeyeeklkkenlaffflasygdgeptdnaarfykwftegkdrgewlnnlqygvfglgnrqyehfnkiaivvddlifeqggkklvpvglgdddqcieddfaawrelvwpeldkllrneddatvatpysaavlqyrvvfhdhidglisengspnghangntvydaqhpcrsnvavkkelhtpasdrscthlefnisgtglmyetgdhvgvycenlletveeaekllnlspqtyfsvhtdnedgtplsgsslpppfppctlrtaltkyadltsapkksvlvalaeyasdqgeadrlrflaspsgkeeyaqyilasqrtllevmaefpsakpplgvffagvaprlqprfysissspkiapfrihvtcalvydksptgrvhkgicstwmknavpleesndcswapifvrnsnfklptdpkvpiimigpgtglapfrgflqerlalkesgaelgpailffgcrnrkmdfiyedelndfvkagvvselivafsregpmkeyvqhkmsqrasdvwniisdggyvyvcgdakgmardvhrtlhtiaqeqgsmssseaegmvknlqttgrylrdvw
[0431]
seq id no:5:密码子优化的cdna，编码satps8201
[0432]
atggacagcagcaccgccaccgcaatgaccgcaccattcatcgacccgacggatcatgtgaatctgaaaaccgacacggatgcgagcgaaaatcgtcgtatgggtaactacaagccgagcatttggaactacgattttctgcagtccctggcgacgcaccacaacattgttgaagagcgtcacctgaagctggcagagaaactgaaaggtcaagtgaaattcatgttcggtgcgccgatggagccattggctaagttggagctggttgatgtggtgcaacgcttgggtctgaaccacctgttcgagactgaaatcaaagaagctctgttcagcatctacaaagatggcagcaatggctggtggtttggccatctgcatgctacctctttgcgcttccgtctgttgcgccaatgtggcctgtttatcccgcaggacgttttcaaaacctttcaaaacaagaccggtgagtttgacatgaagctgtgggacaacgttaagggcctgctgagcctgtacgaggcgagctacctgggctggaagggcgagaacatcttggatgaagcaaaggcgttcacgaccaagtgcctgaagagcgcatgggagaacattagcgagaagtggctggcgaagcgtgttaaacatgcgttggcgctgccgctgcactggcgtgttccgcgtattgaagcacgctggtttatcgaggtgtacgaacaagaggccaatatgaatccgacgctgctgaaactggcgaaactggacttcaacatggtccaaagcattcaccagaaagaaatcggtgaactggcccgctggtgggttactaccggcctggacaagct
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[0433]
seq id no:6:satps8201氨基酸序列.
[0434]
mdsstatamtapfidptdhvnlktdtdasenrrmgnykpsiwnydflqslathhniveerhlklaeklkgqvkfmfgapmeplaklelvdvvqrlglnhlfeteikealfsiykdgsngwwfghlhatslrfrllrqcglfipqdvfktfqnktgefdmklwdnvkgllslyeasylgwkgenildeakafttkclksawenisekwlakrvkhalalplhwrvpriearwfievyeqeanmnptllklakldfnmvqsihqkeigelarwwvttgldkldfarnnllqsymwscaiasdpkfklaretiveigsvltvvddgydvygsmdeldlytssverwscvkidklpntlklifmsmfnktnevglrvqhergynsiptfikawveqcksyqkearwfhgghtppleeyslnglvsigfplllitgyvaiaeneaaldkvhplpdllhyssllsrlindigtspdemargdnlksihcymnetgaseevarehikgvieenwkilnqccfdqsqfqepfitfnlnsvrgshffyefgdgfgvtdswtkvdmksvlidpiplgee
[0435]
seq id no:7:合成操纵子，编码sacp816、cprm和sasas
[0436]
catatggcactgttgttggcggttttctggagcgctttgattattctggttagcatcttattgcgtcgtcgtcaaaaacgcaacaatttgccaccgggcccaccggccctgccgatcatcggtaacattcacattctgggcaccctgccgcaccagagcctgtacaatctggcgaagaagtacggtccgatcatgtccatgcgtttgggcttggttccggcggtggtcatcagcagcccggaagcggccgagctggtcctgaaaacccacgacatcgtttttgcttctcgccctcgtctgcaagttgcagattactttcactatggcaccaaaggcgtgattctgaccgaatatggtacctactggcgtaacatgcgtcgcctgtgcacggtcaaactgctgaacaccgttaagattgatagctttgcaggcacccgcaagaaagaagtcgctagcttcgttcagagcctgaaagaagcaagcgtggcgcacaaaatggttaacctgtccgcacgcgtcgctaatgttattgagaatatggtttgtctgatggttattggtagatcgtctgacgagcgtttcaagctgaaagaagtgatccaagaagcggcacagctggcgggtgccttcaatattggtgactatgtcccgtttctgatgccgctggatctgcagggcctgactcgccgtatcaagagcggtagcaaggcattcgatgacatcctcgaggtcattatcgacgagcatgtgcaagacattaaagatcatgacgatgagcagcatggtgacttcatcgacgtgctgctggcgatgatgaataagccgatggattctcgtgagggtctgtccatcattgatcgcacgaacattaaagcgatcctggtggatatgatcggtgccgcgatggacacgagcaccagcggtgtggagtgggcgatttcggagctgattaagcatcctcgtgtcatgaagaaactgcaagacgaagtgaaaaccgtaatcggtatgaaccgcatggtggaagaagcggatctgccgaaactgccgtacctggacatggttgtcaaggaaacgatgcgtctgcatccgccaggcccgctgctggtgccgcgtgaaagcatggaagatattacgatcaacggttactatatcccgaagaaatcccgcattattgtgaatgcatgggcgatcggccgtgacaccaacgcctggagcaataatgcgcacgagtttttccctgagcgttttatgagctctaacgttgatctgcaaggccaggacttc
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