一种用于DNA样本跟踪检测的生物标志物、方法和应用与流程

一种用于dna样本跟踪检测的生物标志物、方法和应用
技术领域
1.本发明涉及基因检测跟踪领域，具体涉及一种用于dna样本跟踪检测的生物标志物、方法和应用。


背景技术：

2.目前，高通量测序技术(next generation sequencing，ngs)在临床诊断应用中逐渐崭露头角，广泛应用于癌症早筛、癌症伴随诊断、遗传病辅助诊断、无创产前诊断以及病原微生物检测等多个领域，日益发挥着强大的检测能力。但在该技术快速发展的同时，相应的实验室内部质量控制却发展得相对缓慢。ngs技术涉及核酸提取、文库构建，有些甚至还需要涉及复杂的探针杂交捕获环节，在最终上机测序前，要经历二十几个步骤。很难保证在这一过程中人工操作不出现任何错误造成样本混淆、相互混淆。如何建立、建立什么样本的样本防混淆跟踪体系，有效监测结果准确可靠，是目前ngs面向临床大规模开展最急需解决的问题之一。
3.在没有额外建立样本追踪系统针对ngs流程可能出现样本混淆的情况时，最为常见的用于监控是否存在样本混淆的方法，是在完成人全基因组测序(whole genome sequencing,wgs)或全外显子组测序(whole exome sequencing,wes)分析的同时，对样本进行性别分析。该方法的优势在于无需增加额外的实验即可得出实际分析结果与送检标本信息是否一致的结论；但由于性别分析过于简单，只能对男女性别不符的样本做出区分，相同性别的不同样本是否混淆依然不得而知。
4.美国promega公司开发基于毛细管电泳测序的str检测试剂盒对个体dna进行准确鉴定。str是指短串联重复序列(short tandem repeat)，它是以2～6个碱基作为核心单位重复串联形成的一类dna序列，人类基因组中平均每15kb就存在一个str，目前已发现的str超过7000个。由于str核心单位重复次数不同个体之间存在高度特异性，使其具有遗传多样性而能对个体dna亲缘关系、个体dna身份进行鉴定。该技术已作为dna鉴定的金标准广泛应用于刑侦、法医领域，同时根据图谱分析结果，也可对实验过程中可能出现的样本混淆进行判断。但该方法也有其局限性，虽然能对核心单位的重复次数准确分辨，但无法得知重复碱基的具体构成，对于重复次数相同而仅内部碱基差异的位点无法准确判断；同时图谱分析也会受到多种因素的影响而导致结果错误。
5.罗氏诊断在最新发布的全外显子测序产品中开发了一款包含有340个snp位点的seqcap ez primer exome panel，snp位点组成了源于dna内部的样本识别id，可以在整个检测过程中追踪样本并监测样本间的混淆情况。由于该panel无需手动添加标志物，可以有效规避人为操作失误造成的风险。但由于不同全外显子测序panel覆盖的区域不同，其他品牌的panel(panel指一组或一套检测)探针并不能覆盖以上340个snp，且采用怎样的检测方法对这340个位点进行对比验证也是需要解决的问题。另外，采用多个snp位点会使相应的数据增多，增加数据处理的复杂程度和检测成本。


技术实现要素：

6.本发明主要的目的是提供一种用于dna样本跟踪检测的方法和应用，通过筛选出包含26个snp位点的核酸作为dna样本跟踪检测的生物标志物，能够有效的跟踪生物样本dna，对怀疑存在混淆的待测样本进行验证，判断样本dna是否存在污染。
7.为了实现上述目的，本技术采用了以下技术方案：
8.根据第一方面，本技术提供一种用于dna样本跟踪检测的生物标志物，所述生物标志物为含有26个snp位点的核酸，所述26个snp位点具体为rs1344、rs3917981、rs857870、rs4478844、rs4621、rs1058900、rs1130598、rs4703、rs8481、rs4673、rs1132812、rs9930567、rs1045280、rs1135989、rs17626、rs354021、rs2304186、rs6554、rs2230267、rs11554159、rs5030878、rs3822585、rs9483504、rs11998387、rs11136343、rs1071583。
9.需要说明的是，snp是指单核苷酸多态性(snp，single nucleotide polymorphism的缩写)。根据单核苷酸多态性分析结果判断待测核酸样本是否存在不同个体来源的污染，其理论依据是，除了同卵双生子外，每个人的单核苷酸多态性都会有所不同，因此，单核苷酸多态性分析可以作为每个个体的特异性标记，如果单核苷酸多态性分析结果与待测样本自身的snp位点情况不同，则判断待测样本可能存在污染或者在整个试验过程中存在不同待测样本反应体系的交叉污染。在本技术中，通过筛选出特定的26个snp位点，可以对怀疑混淆的dna样本进行验证，以进一步判断是否存在样本污染的情况。
10.检测的snp位点越多其准确性越高，相应的数据量也越大。但数据量大一方面增加检测成本，另一方面也会对检测本身的数据造成影响和干扰；因此，综合考虑样本snp位点检测的准确性和snp数据量，本技术优选的snp位点为26个从在443个已取得外显子panel结果的家系样本中进行遗传距离分析而筛选出的。
11.本技术针对的是经过现有其他方法检测后判断可能存在混淆(污染)的样本进行验证。通过对本技术生物标志物中所包含的26个snp位点进行检测，能够有效的跟踪生物样本dna，验证样本dna是否存在污染。与现有的通过340个snp位点进行样本追踪和污染判断方法相比，本技术的生物标志物仅仅需要检测26个snp位点，可操作性更强、性价比更高；并且，本技术的生物标志物可以对wes、wgs实验过程中的样本污染进行快速鉴定，无需重复实验，且结果准确。采用本技术的生物标志物进行样本跟踪和污染检测，极大的缩短了实验查因的周期，既能对临床样本进行流程监控，又能充分利用ngs测序平台，无需增加其他设备，还能满足临床样本对检测周期的严格要求。可以理解，本技术生物标志物的关键在于其中含有26个指定的snp位点，通过这26个指定的snp位点即可准确有效的实现样本追踪和污染检测；出于其他功能需求，本技术的生物标志物中还可以含有其他snp位点或其他序列，在此不作具体限定。
12.在本技术中，26个snp位点的具体筛选方法为：筛选人群频率为0.4
‑
0.6的snp位点，且所筛选的snp位点位于外显子panel能深度覆盖的区域，并将所筛选的snp位点在443个已取得外显子panel结果的家系样本中进行遗传距离分析，最后筛选出如上所述26个符合要求的snp位点。
13.需要说明的是，“人群频率”可以理解为在一个特定群体中(如中国人群)一个位点的碱基差异的比例。例如对于人群频率为0.5的snp位点，是指有50％的人为a，50％的人为c/t/g。在本技术中，符合要求的snp位点首先应满足人群频率约为0.5，如0.4
‑
0.6范围均
可。其次要求所筛的位点位于外显子panel能深度覆盖的区域，即不会因为位点深度覆盖不够造成外显子panel结果错误，在本技术中，外显子panel采用的是integrated dna technologies(以下简称idt)公司生产的外显子panel。再根据所筛选的位点在443个已取得外显子panel结果的家系样本中进行遗传距离分析，遗传距离分析属于本领域常用技术手段，在此不再赘述。
14.需要说明的是，本技术的关键在于通过对本技术生物标志物中的26个指定snp位点进行检测，为了简单有效的实现样本追踪和污染检测，可以设计特异性的引物，对26个snp位点的生物标志物进行多重pcr扩增和高通量测序。至于具体的引物序列，可以根据现有的引物设计原则进行确定，在此不作具体限定。
15.根据第二方面，本技术提供一种用于dna样本跟踪检测的试剂盒，该试剂盒包括pcr扩增引物，pcr扩增引物用于检测第一方面所述生物标志物的26个snp位点。优选的，pcr扩增引物依序为seq id no.1至seq id no.52所示序列。
16.seq id no.1至seq id no.52的序列如下表所示：
17.18.[0019][0020]
需要说明的是，本技术试剂盒的关键在于通过pcr扩增，结合后续的高通量测序，实现对生物标志物的26个snp位点的检测；至于具体的pcr扩增引物序列，可以参考现有的引物设计原则。这些包含26对多重pcr扩增引物的试剂盒，在组装时可以是每条引物独立包装，然后根据需求选择添加，也可以是每组引物对作为整体均匀混合在一起，又或者26个snp位点所涉及的26对共52条引物全部均匀混合在一起，使用时添加引物混合液即可。另外，试剂盒内所采用的pcr酶预混液、酶免水、末端修复反应缓冲液、文库接头、连接反应液、高保真pcr酶、标签引物以及纯化磁珠(简称磁珠)等物质可以采购于市面。
[0021]
本技术的一种实现方式中，设计与26个snp位点相关的pcr多重引物，可以全部应用于全基因组(wgs)或全外显子组(wes)检测的样本混淆验证，并且不会对wgs或wes检测本身造成不利影响，即对26个snp位点进行分析，可以实现对任意混淆样本进行检测。
[0022]
需要说明的是，采用本技术的生物标志物对怀疑被污染的dna样本进行跟踪检测，整个过程可以在外显子组测序或基因组测序中进行，即在外显子组测序或基因组测序的同时，分析检测本技术生物标志物中的26个snp位点，从而实现样本追踪和污染检测；也可以直接利用外显子组测序或基因组测序的panel即可，例如本技术的一种实现方式中，具体采用的是idt的全外显子panel。
[0023]
更进一步的，该试剂盒还包括：pcr酶预混液、酶免水、末端修复反应缓冲液、文库接头、连接反应液、高保真pcr酶、标签引物以及纯化磁珠。酶免水是指不含dna酶、rna酶的水，可以用于对反应物进行洗脱；pcr酶预混液采用takara公司生产的taq酶预混液。其它没有特别说明的，所使用的反应物均可选用现有技术中通常所采用的组分和接头。构建文库的方法可以采用现有技术中的常规方法，例如，包括多重pcr引物混合、多重pcr扩增、磁珠纯化、末端修复加a尾、接头连接、磁珠纯化、文库pcr扩增、磁珠纯化以及文库质检等步骤。
[0024]
一种实施例中，依据上述26个snp位点设计并合成pcr扩增引物(简称引物)后，将单条引物稀释至浓度100μm的引物母液，等体积混合各条引物使得工作液的单引物浓度为1μm；采用takara公司的taq酶预混液(premix taq)进行一轮多重pcr扩增，获得片段大小在190bp～320bp之间的pcr产物；将pcr产物纯化，去除引物二聚体和taq酶预混液；随后对纯化的pcr产物进行末端修复和接头连接，加上通用接头；再对连接产物进行磁珠纯化，去除接头二聚体和连接反应液；使用高保真pcr酶和用于区分样本的标签引物对纯化后的连接产物进行扩增，获得符合上机浓度要求的文库，文库片段大小经安捷伦2100质控，文库片段大小应集中在270～400bp之间，方可进行下游测序。
[0025]
需要说明的是，本技术的关键在于筛选出26个snp位点，并设计成26对多重pcr引物，而对于其它后续构建文库、测序步骤等均可参考现有的文库构建、高通量测序的相关步骤，而后续对于测序结果进行snp分析可以采用ngs测序平台进行分析等，在此不再赘述。
[0026]
基于目前市场上并没有操作简便、性价比高的的高通量检测产品对样本是否存在污染做出准确判断，本技术公开一种利用dna内部snps追踪样本的方法，其适用于追踪全基因组或全外显子组测序检测，尤其适用于追踪采用integrated dna technologies(以下简称idt)公司xgen exome research panel进行的全外显子组测序检测。通过该dna样本跟踪
检测的方法，可以快速判断待测样本的snp位点与实际应该存在的位点突变情况进行比对，从而判断出是否存在样本污染(或混淆)。
[0027]
因此，根据第三方面，本技术还提供一种用于dna样本跟踪检测的方法，包括采用第二方面所述的试剂盒中的pcr扩增引物，对待测样本dna进行pcr扩增，并对pcr扩增产物进行高通量测序，根据高通量测序结果分析生物标志物的26个snp位点的突变情况，由此判断待测样本dna是否有被污染。判断待测样本dna是否有被污染的步骤，具体包括：通过将检测获得的snp位点的突变情况与实际已知的待测dna样本应该存在的snp位点突变情况进行对比，判断该待测dna样本是否存在污染。
[0028]
一种实施例中，通过验证待测样本的加样顺序是否与预设的加样顺序一致，可以判断样本是否存在混淆。例如对于怀疑混淆的待测样本，通过对dna片段进行多重pcr扩增、按照预设的加样顺序构建文库，并进行高通量测序。在验证时，通过将待测样本按照预设加样顺序进行建库过程中，加入根据26个snp位点所设计的pcr扩增引物，与待测样本一起进行pcr扩增、建库；对构建的混合文库进行测序，分析待测样本的单核苷酸多态性；根据单核苷酸多态性分析结果可以判断待测样本是否存在不同个体来源的样本污染。其中，所述dna片段初始包含26个snp位点、或扩增后包含26个snp位点。
[0029]
当验证测序结果与预设加样结果相同时，则说明dna样本存在混淆状态。由于初始测序结果与预设加样结果不相同，因此判断待测样本存在混淆情况，其加样顺序与预设的加样顺序不一致，猜测有可能是dna样本添加顺序颠倒所造成的，对该猜测结果进行验证，按照原先预设的加样顺序对待测样本进行pcr扩增、建库、测序，当所得的验证测序结果与预设的加样结果相同时，则说明待测样本存在混淆，且其正确的加样顺序为预设的加样顺序。
[0030]
根据第四方面，本技术还提供如上述第一方面所述生物标志物，或者第二方面所述的试剂盒，在外显子组测序或基因组测序中，对怀疑被污染的dna样本进行跟踪检测的应用。
[0031]
由于采用以上技术方案，本技术的有益效果在于：
[0032]
本技术只需通过检测26个snp位点即可实现对样本的追踪和污染检测，尤其适用于对待测样本加样顺序混淆的验证，同时可以有效减少样本及试剂消耗，可操作性更强、性价比更高。
[0033]
并且，本技术的生物标志物可以对wes、wgs实验过程中的样本污染进行快速鉴定，无需重复实验，且结果准确。采用本技术所述的dna样本跟踪检测方法对怀疑混淆的待测样本进行追踪验证，极大的缩短了实验查因的周期，既能对临床样本进行流程监控，又能充分利用ngs测序平台，无需增加其他设备，还能满足临床样本对检测周期的严格要求。
附图说明
[0034]
图1为实施例1中文库质检时的文库峰图。
具体实施方式
[0035]
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0036]
在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本技术能被更好的理解。然而，本
领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本技术相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本技术的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
[0037]
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
[0038]
现有技术中对于dna污染的判断并没有一种很好的验证方法，由于不同全外显子测序panel覆盖的区域不同，因此如果所选择的snp位点过多，无法被其它品牌的panel所覆盖，其应用范围受限制、普适性差，并且snp位点过多时，也难以对其准确性进行验证。本技术基于现有技术的缺陷，创造性地提出一种dna样本污染的追踪方法，对样本是否存在污染(或混淆)做出准确判断。该追踪方法所依据的26个snp位点能被大部分品牌的panel所覆盖，可用于人全基因组测序或全外显子组测序。具体地，所述snp位点包括如下26个位点：rs1344、rs3917981、rs857870、rs4478844、rs4621、rs1058900、rs1130598、rs4703、rs8481、rs4673、rs1132812、rs9930567、rs1045280、rs1135989、rs17626、rs354021、rs2304186、rs6554、rs2230267、rs11554159、rs5030878、rs3822585、rs9483504、rs11998387、rs11136343、rs1071583。依据该26个snp位点所设计出的26对(52条)pcr引物如下表所示：
[0039]
[0040]
[0041][0042]
下面通过具体实施例和附图对本技术作进一步详细说明。以下实施例仅对本技术进行进一步说明，不应理解为对本技术的限制。
[0043]
实施例1
[0044]
采用idt的全外显子panel对4个家系及非家系的先证者共计16例样本进行检测，a1～a3为家系1，a4～a6为家系2，a7～a8为家系3，b6～b8为家系4，其余样本为独立的先证者；预设加样顺序为下图所示：
[0045][0046]
而实际加样顺序如下图所示：
[0047][0048]
检测结果发现a1与a2、a3不符合家系关系；a4、a5、a6均不符合家系关系；a7、a8与b1不符合家系关系；b6与b7、b8不符合家系关系；怀疑此批次样本混淆严重，采用本技术的
追踪方法对此批次16例dna样本按照预设加样顺序构建文库。步骤如下：
[0049]
1.多重引物混合
[0050]
将52条浓度为100μm的单引物母液按3μl/条加入到1.5ml离心管中，补充144μl te缓冲液使得终体积为300μl，充分涡旋混匀，瞬时离心，单条引物的工作液浓度为1μm。
[0051]
2.多重pcr扩增
[0052]
将premix taq置于冰上融解，涡旋混匀后短暂离心，按下表配制反应体系：
[0053][0054]
涡旋混匀各组分，瞬时离心，按下表反应程序进行多重pcr扩增：
[0055][0056][0057]
3.磁珠纯化
[0058]
反应结束后使用xp磁珠进行纯化。向25μl样本中加入35μl xp磁珠，充分混匀，室温静置5分钟；瞬时离心，磁力架上静置3分钟；彻底吸弃上清，加入150μl新鲜配制的80％乙醇，漂洗2次；彻底吸弃80％乙醇，加入45μl酶免水进行洗脱，取1μl上清检测浓度，取3μl上清进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，要求电泳条带在190～320bp之间；取40μl上清进行下游实验。
[0059]
4.末端修复加a尾
[0060]
取出末端修复加a缓冲液室温融解，涡旋混匀瞬时离心，置于冰上备用；取出末端修复加a反应酶，瞬时离心，置于冰上；按下表配制末端修复反应体系：
[0061]
试剂名称体积(μl)
末端修复缓冲液6末端修复加a反应酶4pcr纯化产物40总量50
[0062]
涡旋混匀各组分，瞬时离心，按下表程序进行反应：
[0063]
温度(℃)时间(min)2030653010保持
[0064]
5.接头连接
[0065]
取出连接缓冲液，室温融解，涡旋混匀瞬时离心，置于冰上备用；取出连接酶，瞬时离心置于冰上备用；取出通用接头，冰上融解，涡旋混匀瞬时离心，置于冰上备用。
[0066]
先向末端修复加a产物中加入2μl通用接头，涡旋混合瞬时离心，样本管置于冰上，再按下表配制连接反应体系：
[0067]
试剂名称体积(μl)连接缓冲液26连接酶2总量28
[0068]
向样本管中加入上述连接酶反应混合液28μl，涡旋混合瞬时离心，先置于冰上；
[0069]
按下表设置连接反应程序：
[0070]
温度(℃)时间(min)201510保持
[0071]
待pcr仪达到20℃后再将反应管置于仪器中。
[0072]
6.磁珠纯化
[0073]
反应结束后使用xp磁珠进行纯化。向80μl样本中加入40μl xp磁珠，充分混匀，室温静置5分钟；瞬时离心，磁力架上静置3分钟；彻底吸弃上清，加入150μl新鲜配制的80％乙醇，漂洗2次；彻底吸弃80％乙醇，加入23μl酶免水进行洗脱，取20μl上清进行下游实验。
[0074]
7.文库pcr扩增
[0075]
取出高保真pcr酶和标签引物置于冰上融解，涡旋混匀瞬时离心，按下表配制pcr反应体系：
[0076]
试剂名称体积(μl)高保真pcr酶mix25index primer mix5纯化连接产物20总量50
[0077]
涡旋混匀上述混合液，瞬时离心。按下表设置文库扩增程序：
[0078][0079]
8.磁珠纯化
[0080]
反应结束后使用xp磁珠进行纯化。向50μl样本中加入50μl xp磁珠，充分混匀，室温静置5分钟；瞬时离心，磁力架上静置3分钟；彻底吸弃上清，加入150μl新鲜配制的80％乙醇，漂洗2次；彻底吸弃乙醇，加入33μl酶免水进行洗脱，取30μl上清保存。
[0081]
9.文库质检
[0082]
采用qubit检测16个文库的浓度，文库浓度均大于20ng/μl；采用安捷伦2100生物分析仪对文库片段大小分析，文库峰图皆类似图1所示。
[0083]
文库片段大小分布在270～400bp之间，质检合格，后续对文库进行高通量测序。
[0084]
10.结果说明
[0085]
经高通量测序结果发现，本发明按照预设加样顺序所得结果与wes实验预设加样结果(a1～a3为家系1，a4～a6为家系2，a7～a8为家系3，b6～b8为家系4)一致，由此可证明wes实验实际的2排样本加样顺序与预设顺序相反，无需重复进行wes实验，并准确查找出实验错误原因，有效缩短了实验周期。
[0086]
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。