一种检测HER2基因的引物探针组合物及其应用的制作方法

一种检测her2基因的引物探针组合物及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测her2基因的引物探针组合物及其应用。


背景技术：

2.乳腺癌是由乳房上皮组织中的细胞恶性繁殖导致的疾病，大多数乳腺癌始于小叶(乳腺)或连接乳腺小叶与乳头的导管。乳腺癌在女性恶性肿瘤发病率中位居第一位，其病死率约占恶性肿瘤死亡总数的15％。乳腺癌的类型很多，常见的包括原位导管癌(dcis)和浸润性癌，其他类型如叶状肿瘤和血管肉瘤则比较少见。据统计每年乳腺癌患者的数量都呈现上升趋势，且患病年龄也在不断减小，对患者的生活以及患者家庭的经济都造成了严重危害。
3.乳腺癌的发病过程是一个极其复杂的生物学反应，其中包含多个基因的共同作用、多个肿瘤相关通路的激活以及复杂的分子机制。调节细胞生长和分化的基因表达改变是将正常细胞转化为癌细胞的主要因素，而相关基因调控改变的累积可导致细胞生长和增殖异常进而引起乳腺癌的癌变发生。抑癌基因或癌基因通过基因沉默或基因激活影响相应蛋白质的表达水平，进一步抑制细胞分裂和发育或促进癌细胞的恶性表型。因此，探寻与乳腺癌密切相关的基因对乳腺癌的诊疗具有重要意义。同时，从乳腺癌相关基因中找出对预后有显著影响的基因，有助于提高乳腺癌的预后预测，进一步地改善这种恶性肿瘤的治疗效果。
4.人类her
‑
2/neu基因(her
‑
2基因)定位于染色体17q21，其编码产物为185kd的跨膜精蛋白p185，由1255个氨基酸组成，720
‑
987位为酪氨酸激酶区。her
‑
2/neu蛋白是具有酪氨酸蛋白激酶活性跨膜糖蛋白，是egfr家族成员之一。人表皮生长因子受体2(her2)的过表达和许多上皮细胞癌症的恶化程度密切相关。her2高表达的肿瘤表现出强的转移能力和侵润能力，对化疗的敏感性也较差，且易复发。在正常细胞中her2的表达水平非常低，但是在胚胎发育期表达量非常高，对发育过程的细胞增殖、分化、迁移等起重要的作用。
5.现阶段一般采用免疫组织化学(ihc)法检测her2受体蛋白的表达状态和采用荧光原位杂交(fish)法检测her2基因的扩增水平。其中ihc检测结果只能作为前期初步筛查使用，具有成本低、技术简单、便于操作等特点，常是临床检测的首选。但ihc容易受到组织影响，缺乏标准化，结果判断存在主观差异，造成不同实验室之间的ihc检测结果可能存在差异。fish检测具有较高的准确性、灵敏度和特异性，目前是检测her2基因扩增的“金标准”，但fish检测存在仪器价格昂贵、检测周期长、患者收费高、且受检测者专业知识和实验室条件的限制，检测试剂一直被国内或国外1、2个厂家所垄断，只能在具有资质的大医院进行，造成大量人员不能得到及时的诊断而失去个体化用药的机会。
6.专利cn109943634a提供了一种包含her2基因片段及其引物探针和fas参照基因片段及其探针引物的her2基因定量检测试剂盒，可用于对her2阳性的乳腺癌进行诊断。专利cn111850125a公开了一种基于数字微滴pcr技术检测her2基因扩增的试剂盒及方法，可检
测her2基因的拷贝数变异。但其检测方法的灵敏度都较差。
7.因此，急需提供一种高灵敏度、准确度、易于操作标准化、多样化检测等优势检测方法。


技术实现要素：

8.为了解决现有技术中的上述问题，本技术提供了一种检测her2基因的引物探针组合物及其应用。采用本发明所述的引物探针组合物检测her2基因，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，可用于乳腺癌分子诊断、疾病演变、治疗、预后、用药等的指导。
9.为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
10.一方面，本发明提供了一种检测her2基因的引物探针组合物，所述的引物探针组合物包括：
11.(1)her2
‑
1引物对及探针：
12.f(seq id no:1)：5'
‑
ccagccctctgacgtccatc
‑
3'；
13.r(seq id no:2)：5'
‑
agcagtctccgcatcgtgt
‑
3'；
14.p(seq id no:3)：5'
‑
gttggcattctgctggtcgtggt
‑
3'；
15.(2)her2
‑
2引物对及探针：
16.f(seq id no:4)：5'
‑
ccctgcacaaccaagaggtgaca
‑
3'；
17.r(seq id no:5)：5'
‑
aactgccctcacctctcgcaa
‑
3'；
18.p(seq id no:6)：5'
‑
cagcaagccctgtgcccgagt
‑
3'；
19.(3)actb引物对及探针：
20.f(seq id no:7)：5'
‑
attccaaatatgagatgcgttgt
‑
3'；
21.r(seq id no:8)：5'
‑
aatgctatcacctcccctg
‑
3'；
22.p(seq id no:9)：5'
‑
atggcccagtcctctccc
‑
3'；
23.(4)pbgd引物对及探针：
24.f(seq id no:10)：5'
‑
gccatgtctggtaacggcaat
‑
3'；
25.r(seq id no:11)：5'
‑
tacccacgcgaatcactctca
‑
3'；
26.p(seq id no:12)：5'
‑
acggcggaagaaaacagcccaa
‑
3'。
27.具体地，所述探针的5'端标记有荧光报告基团，所述探针的3'端标记有淬灭基团；所述荧光报告基团为cy3、fam、hex、vic、joe或rox中的一种或多种，所述淬灭基团为荧光淬灭基团。
28.进一步具体地，所述的her2
‑
1探针的荧光报告基团为cy3，荧光淬灭基团为bhq2；所述的her2
‑
2探针的荧光报告基团为vic，荧光淬灭基团为bhq2；所述的actb探针的荧光报告基团为fam，荧光淬灭基团为bhq1；所述的pbgd探针的荧光报告基团为hex，荧光淬灭基团为bhq1。
29.另一方面，本发明提供了上述引物探针组合物在制备检测her2基因试剂盒中的应用。
30.又一方面，本发明提供了一种检测her2基因的试剂盒，所述的试剂盒包括上述引物探针组合物。
31.进一步具体地，所述的试剂盒还包括tris
‑
hcl缓冲液、dntp、镁离子、bsa、热启动taq酶、tmac(四甲基氯化铵)、氯化钐。
32.进一步具体地，所述的试剂盒包括：
33.表1
[0034][0035][0036]
又一方面，本发明提供了上述引物探针组合物或试剂盒在检测her2基因中的应用。
[0037]
又一方面，本发明提供了一种检测her2基因的方法，所述的方法为非疾病诊断和治疗方法，所述的方法包括利用上述引物探针组合物或试剂盒对待测样本中her2基因进行检测。
[0038]
具体地，所述的方法包括以下步骤：
[0039]
(1)提取检测样本的dna；
[0040]
(2)利用引物探针组合物扩增步骤(1)提取的样本dna；
[0041]
(3)对扩增结果进行分析。
[0042]
与现有技术相比，本发明提供的试剂盒具有如下有益效果：
[0043]
本发明提供的her2基因引物探针组合物具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，可用于乳腺癌分子诊断、疾病演变、治疗、预后、用药等的指导。
附图说明
[0044]
图1为实验例1中1.1的her2
‑
1扩增标准曲线；
[0045]
图2为实验例1中1.1的her2
‑
2扩增标准曲线。
具体实施方式
[0046]
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047]
实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
[0048]
实施例1一种检测her2基因的引物探针组合物
[0049]
所述的引物探针组合物如下表2所示。
[0050]
表2引物探针组合物
[0051][0052]
所述的her2
‑
1探针的荧光报告基团为cy3，荧光淬灭基团为bhq2；所述的her2
‑
2探针的荧光报告基团为vic，荧光淬灭基团为bhq2；所述的actb探针的荧光报告基团为fam，荧光淬灭基团为bhq1；所述的pbgd探针的荧光报告基团为hex，荧光淬灭基团为bhq1。
[0053]
实施例2一种检测her2基因的试剂盒
[0054]
(1)包括实施例1所述的引物探针组合物。
[0055]
(2)还包括tris
‑
hcl缓冲液、dntp、镁离子、bsa、热启动taq酶、tmac和氯化钐，各组分具体浓度如下表3所示。
[0056]
表3
[0057]
成分终浓度tris
‑
hcl缓冲液(ph9.0)10mmkcl50mmdntp(2.5mm)0.2mm镁离子(25mm)4mmbsa(100mg/ml,10％)0.05％热启动taq酶(5u/μl)0.5utmac10mm氯化钐1
×
10
‑8mol/l
[0058]
实施例3检测her2基因试剂盒的使用方法
[0059]
1.dna提取：利用dna提取试剂盒(qiagendneasy blood and tissue kit，cat.no 69504)提取血液、肿瘤样本等的全基因组dna。
[0060]
2.按照实施例2所述的试剂盒配制扩增体系，进行pcr扩增，扩增程序如下：95℃300s；95℃15s，60℃30s，40cycles。
[0061]
3.结果判定：
[0062]
(1)如果her2
‑
1、her2
‑
2基因和actb、pbgd内参基因检测浓度至少一项小于10copies/μl，则检测结果无效，重新提取样本核酸进行检测；
[0063]
(2)如果her2
‑
1、her2
‑
2基因和actb、pbgd内参基因检测浓度均在1
×
102‑1×
105copies/μl之间，进行以下计算：
[0064]
her2 copy＝(her2
‑
1 copy her2
‑
2 copy)/2，
[0065]
内参copy＝(1.07
×
actb copy 0.93
×
pbgd copy)/2，
[0066]
m＝her2 copy/内参copy，
[0067]
当m≦0.2时，则结果判读为：无her2基因扩增；
[0068]
当m﹥0.2时，则结果判读为：her2基因扩增；
[0069]
(3)如果her2
‑
1、her2
‑
2基因和actb、pbgd内参基因检测浓度至少一项大于1
×
105copies/μl，则需要将待检样品稀释至线性范围内重新测定，并根据(2)的标准判断结果。
[0070]
实验例1引物探针的扩增效率检测
[0071]
1.1.选取1例乳腺癌样本，该样本dna模板在扩增体系中的起始终浓度为1
×
105copies/μl、1
×
104copies/μl、1
×
103copies/μl、1
×
102copies/μl、1
×
101copies/μl，按照实施例3的试剂盒使用方法进行检测，扩增体系为20μl。
[0072]
经检测，本发明所述的her2
‑
1引物探针的标准曲线为：y＝
‑
3.351x 40.156；本发明所述的her2
‑
2引物探针的标准曲线为：y＝
‑
3.296x 40.182。
[0073]
根据以下扩增效率计算公式：
[0074]
e＝10
‑
1/斜率
，
[0075]
％效率＝(e
‑
1)
×
100％，
[0076]
计算得到本发明所述的her2
‑
1引物探针的扩增效率为98.80％，her2
‑
2引物探针的扩增效率为101.09％。
[0077]
1.2.选取上述1.1同一份乳腺癌样本进行检测，其中，所用的her2基因的扩增引物探针采用专利cn111850125a所述的her2基因扩增的第一对引物对及检测探针(正向引物：5'
‑
gccccagcggtgtgaa
‑
3'，反向引物：5'
‑
cgccctcctcatctggaaa
‑
3'，探针1：5'
‑
cctgacctctcctacatgcccatctgg
‑
3'，检测探针1为vic荧光基团标记)和her2基因扩增的第二对引物对及检测探针(正向引物：5'
‑
ggcatctgcctgacatcca
‑
3'，反向引物：即5'
‑
gcgtccgcggttttcc
‑
3'，探针2：5'
‑
ccctatggctgcctcttagaccatgtcc
‑
3'，检测探针2为vic荧光基团标记)。其余步骤与1.1相同。
[0078]
经检测，第一对引物对及检测探针1的标准曲线为：y＝
‑
3.421x 40.049；第二对引物对及检测探针2的标准曲线为：y＝
‑
3.439x 40.058。
[0079]
根据1.1的公式计算得到第一对引物对及检测探针1的扩增效率为96.03％，第二对引物对及检测探针2的扩增效率为95.34％。
[0080]
1.3.选取上述1.1同一份乳腺癌样本进行检测，其中，与1.1不同的是扩增体系如下表4所示，其余步骤与1.1相同。
[0081]
表4
[0082]
成分终浓度tris
‑
hcl缓冲液(ph9.0)10mm
kcl50mmdntp(2.5mm)0.2mm镁离子(25mm)4mmbsa(100mg/ml,10％)0.05％热启动taq酶(5u/μl)0.5utriton x
‑
100(1％)0.10％
[0083]
经检测，her2
‑
1引物探针的标准曲线为：y＝
‑
3.670x 40.033；her2
‑
2引物探针的标准曲线为：y＝
‑
3.665x 40.053。
[0084]
根据1.1的公式计算得到her2
‑
1引物探针的扩增效率为87.27％，her2
‑
2引物探针的扩增效率为87.44％。
[0085]
综上，本发明所述的her2基因的引物探针组合具有较好的扩增效率。
[0086]
实验例2
[0087]
选取20例确诊乳腺癌血液样本及10例正常人样本采用本发明所述的引物组合物进行检测，并与荧光原位杂交(fish)的检测结果进行了比较，该检测经过中国医学科学院血液病医院伦理委员会批准，并经患者同意。
[0088]
检测结果如下表5所示。
[0089]
表5检测结果
[0090]
样本fish本发明1阳性0.352阳性0.493阳性0.274阳性0.295阳性0.336阳性0.387阳性0.318阳性0.369阳性0.2510阳性0.6011阳性0.4712阳性0.5513阳性0.4214阳性0.5315阳性0.6716阳性0.3217阳性0.3718阳性0.4419阳性0.4820阳性0.5221阴性0.15
22阴性0.1723阴性0.1124阴性0.0925阴性0.1326阴性0.1927阴性0.1428阴性0.1529阴性0.2030阴性0.17
[0091]
由表5可知，本发明所述的引物组合物、试剂盒及其使用方法的检测结果与fish一致，准确性高。
[0092]
以上仅为本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。