从人类脂肪来源间充质干细胞分化为毛乳头细胞的方法与流程

本发明涉及在包含明胶的分化诱导用细胞培养板中利用从人类脂肪来源间充质干细胞分化诱导为毛乳头细胞的培养基组合物来分化的方法及上述培养基组合物。

背景技术

脱发的种类可以分为男性型、女性型、休止期、圆形脱发。构成毛囊的毛乳头细胞通过若干因素与毛囊附近的细胞相互作用来影响毛发的形成和生长并起到调节生长周期的作用，毛囊由于成为脱发原因的若干因素而退化，从而发生毛发停止生长并脱落的脱发。

最近，据韩国国民健康保险公署统计，每年因脱发到医院就医的患者有21万人，其中，约44％为20多岁～30多岁的人，女性患者占全部患者的45％，脱发的发病与年龄和性别没有关联性。并且，10岁以下的脱发患者的比例呈逐渐增加的趋势，脱发可以不再视为只有成年人的问题，脱发是一种疾病的观念已被整个社会逐渐认同。

为了治疗脱发，主要进行自体毛发移植、药物治疗，自体毛发移植的情况虽有能够永久治疗的优点，但却有费用昂贵、若脱发部位面积大则需经多次手术的缺点。并且，药物治疗的情况虽然服用及给药便利，但只是帮助迟延脱发的进程或者维持现有的状态的用途而已，不是永久治疗的方法，而且还有因药物引起的副作用，因此有局限性。此外，虽然开发了基因治疗等诸多方法，但至今尚未结束对其安全性和效果的验证，距临床应用尚需时日。

近来，在脱发的治疗中应用及适用干细胞的技术备受瞩目。尝试了对在头皮的各处注入脂肪来源干细胞的方式、利用干细胞的多分化功能诱导分化为毛乳头细胞后在体内形成毛囊的方式等。然而，在注入的脂肪来源干细胞的情况下，不是形成根治脱发的新的毛囊，而在诱导分化为毛乳头细胞的情况下，具有要解决通过基因操作分化的细胞的稳定性、对基因操作的心理负担及经济性的问题。因此，需要开发既安全又经济且无须基因操作的有效治疗脱发的方案。

技术实现要素：

技术问题

本发明提供能够发挥可以经济且有效地在体外大量培养的效果的在包含明胶的分化诱导用细胞培养板中利用从人类脂肪来源间充质干细胞分化诱导为毛乳头细胞的培养基组合物来分化的方法及上述培养基组合物。

技术方案

本发明提供一种用于分化诱导毛乳头细胞的培养板，其特征在于，在培养板内部涂敷有明胶。

另一方面，在本发明中，优选地，上述培养板可以为聚苯乙烯(Polystyrene)培养板。

另一方面，在本发明中，优选地，上述培养板可以用于诱导从人类脂肪来源干细胞分化为毛乳头细胞。

并且，本发明提供一种将人类脂肪来源干细胞分化诱导为毛乳头细胞的方法，其特征在于，包括：步骤(a)，向在内部涂敷有明胶的培养板加入动物细胞培养用培养基后，装载人类脂肪来源间充质干细胞来培养人类脂肪来源间充质干细胞；步骤(b)，更换为第一次分化用培养基来培养在上述步骤(a)的动物细胞培养用培养基中培养的人类脂肪来源间充质干细胞；以及步骤(c)，更换为第二次分化用培养基来培养在上述步骤(b)的第一次分化用培养基中培养的人类脂肪来源间充质干细胞，上述步骤(b)的第一次分化用培养基通过向动物细胞培养用培养基添加视黄酸(retinoicacid)、胎牛血清(FBS)、青霉素(penicillin)及链霉素(streptomycin)来组成，上述步骤(c)的第二次分化用培养基通过向动物细胞培养用培养基添加成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2；bFGF)、骨形成蛋白2(human recombinant BMP2)、糖原合成激酶3α/β抑制剂(6-bromoindirubin-3′-oxime)、胎牛血清、青霉素及链霉素来组成。

并且，本发明提供一种用于促进毛发生长或防止脱发的化妆品组合物，其特征在于，包含通过上述分化诱导方法从人类脂肪来源干细胞分化的毛乳头细胞。

并且，本发明提供一种用于促进毛发生长或防止脱发的药学组合物，其特征在于，包含通过上述分化诱导方法从人类脂肪来源干细胞分化的毛乳头细胞。

另一方面，在本发明中，优选地，上述药学组合物可以为皮肤外用剂。

发明的效果

本发明的包含明胶的培养板可以发挥诱导从人类脂肪来源间充质干细胞直接交叉分化为毛乳头细胞的效果，能够通过使用经济性的材料发挥以低廉的费用有效地在体外大量培养的效果。

并且，本发明的从人类脂肪来源间充质干细胞分化的毛乳头细胞可以用作用于预防或治疗脱发的细胞治疗剂组合物。

附图说明

图1为示出对本发明的分化的人类脂肪来源间充质干细胞(dADSC)确认毛乳头细胞特异性基因的基因表达状态的实验结果图表。使用毛乳头细胞(DPC)和未分化的人类脂肪来源间充质干细胞(ADSC)用于比较。

图2为对本发明的分化的人类脂肪来源间充质干细胞执行对于毛乳头细胞特异性基因的流式细胞荧光分选技术分析(FACS)的实验结果。将毛乳头细胞和未分化的人类脂肪来源间充质干细胞用于比较。(a)部分为流式细胞荧光分选技术分析结果，(b)部分为将上述分析结果数值化后示出的柱状图。

图3为示出通过微阵列技术的样品之间的聚类化数据(层次聚类和MDS分布(Hierarchical clustring&MDS plot))的结果。

图4为确认通过微阵列技术的细胞之间的毛乳头细胞相似基因表达模式(Wnt信号(Wnt signal))的结果。

图5为示出微阵列技术结果相关的相似信号传导的预想通路的示意图。

具体实施方式

本发明提供一种用于分化诱导毛乳头细胞的培养板，其特征在于，在培养板内部涂敷有明胶。在利用本发明的涂敷有“明胶”的培养板的情况下，可以发挥诱导从人类脂肪来源间充质干细胞直接交叉分化为毛乳头细胞的效果，能够通过使用经济性的材料发挥以低廉的费用有效地在体外大量培养的效果。

另一方面，在本发明中，优选地，上述培养板可以为聚苯乙烯培养板。

另一方面，在本发明中，上述培养板为了干细胞的分化及增殖而使用适当的细胞外基质分子。可以使用的细胞外基质分子有胶原(collagen)、纤维黏连蛋白(Fibronectin)、基质胶(Matrigel)、明胶(Gelatin)等，在本发明中，优选地，使用了细胞的分化及增殖率最高的明胶，不包含饲养细胞(feeder cell)，而使用涂敷有明胶的培养板。通过上述方式不经过用于增殖及分化的共同培养步骤，因此缩短分化所需的时间，从而能够迅速应用于患者，降低在饲养细胞的培养过程中因污染引起疾病传染的可能性，从而获得提高分化细胞的稳定性的效果。

另一方面，在本发明中，上述培养板所包含的明胶可以使用多种浓度的明胶，优选地，浓度以0.1重量百分比～0.2重量百分比为佳。

另一方面，在本发明中，优选地，上述培养板可以用于诱导从人类脂肪来源干细胞分化为毛乳头细胞。

并且，本发明提供一种将人类脂肪来源干细胞分化诱导为毛乳头细胞的方法，其特征在于，包括：步骤(a)，向在内部涂敷有明胶的培养板加入将动物细胞培养用培养基后，装载人类脂肪来源间充质干细胞来培养人类脂肪来源间充质干细胞；步骤(b)，更换为第一次分化用培养基来培养在上述步骤(a)的动物细胞培养用培养基中培养的人类脂肪来源间充质干细胞；以及步骤(c)，更换为第二次分化用培养基来培养在上述步骤(b)的第一次分化用培养基中培养的人类脂肪来源间充质干细胞，上述步骤(b)的第一次分化用培养基通过向动物细胞培养用培养基添加视黄酸、胎牛血清、青霉素及链霉素来组成，上述步骤(c)的第二次分化用培养基通过向动物细胞培养用培养基添加成纤维细胞生长因子-2、骨形成蛋白2、糖原合成激酶3α/β抑制剂、胎牛血清、青霉素及链霉素来组成。

上述本发明的将人类脂肪来源干细胞分化诱导为毛乳头细胞的方法为将人类脂肪来源干细胞装载于涂敷有“明胶”的培养板后，通过依次更换动物细胞培养用培养基、第一次分化用培养基、第二次分化用培养基来诱导分化为毛乳头细胞的方法，上述动物细胞培养用培养基只要是本发明所属技术领域中为培养动物细胞而使用的培养基就可以不受限制地使用。但优选地，以使用通过添加胎牛血清、青霉素及链霉素来组成的为佳，更优选地，以使用通过在商用的达尔伯克改良伊格尔培养基(高糖)(DMEM/HIGH GLUCOSE)培养基中添加胎牛血清、青霉素及链霉素来组成的为佳。

另一方面，在本发明的动物细胞培养用培养基中，优选地，上述胎牛血清为5％～15％，更优选为10％。

并且，在本发明的第一次分化用培养基中，优选地，上述视黄酸为0.001mM～1mM，更优选为0.001mM～0.1mM。

并且，本发明的第二次分化用培养基中，优选地，上述成纤维细胞生长因子-2为1ng/ml～1000ng/ml，更优选为1ng/ml～40ng/ml。并且，在本发明的第二次分化用培养基中，优选地，上述骨形成蛋白2为1ng/ml～1000ng/ml，更优选为1ng/ml～400ng/ml。并且，在本发明的第二次分化用培养基中，优选地，上述糖原合成激酶3α/β抑制剂为1μM～100μM，更优选为1μM～10μM。

另一方面，在本发明的分化诱导方法中，优选地，上述步骤(a)至步骤(c)在3％～7％的CO2及35℃～39℃的温度下培养，在本发明中，是在5％的CO2及37℃的温度下培养的。在此情况下，用于细胞培养的最佳温度主要是依赖细胞被分离的宿主的体温的条件，5％的CO2是防止为了使作为pH指示剂的酚红(Phenol red)起到正常作用而在细胞代谢过程中发生的培养基中的CO2向恒温箱内部气化的条件，上述酚红是为了监视细胞代谢和生长而限定养分的培养基中为了掌握养分的消耗时机而添加的。

另一方面，在本发明的分化诱导方法中，上述步骤(a)为使细胞附着稳定化的步骤，优选地，培养1天～2天，在本发明中培养了1天。并且，上述步骤(b)为使用细胞分化促进因子处理的步骤，优选地，培养1天～7天，在本发明中培养了3天。并且，上述步骤(c)为使用毛乳头细胞特性诱发因子处理的步骤，优选地，培养1天～14天，在本发明中培养了4天。

另一方面，在本发明的分化诱导方法中，上述步骤(b)及步骤(c)中所使用的培养基每天更换一次。这出于保持培养基的新鲜(fresh)的目的，若与分化培养基一同处理的因子长时间保持在高的温度，则其活性会降低，因此更换培养基来使用为佳。

另一方面，在本发明中，优选地，上述人类脂肪来源干细胞为人类脂肪来源间充质干细胞。在此情况下，优选地，上述间充质干细胞可以源自骨髓、脂肪组织或脐带。

另一方面，在现有的研究中，使用将其他起源的细胞诱导为诱导性多能干细胞(IPS cell)后再分化的方法。然而，本发明在从上述人类脂肪来源干细胞分化诱导为毛乳头细胞的方法中，在从间充质干细胞直接交叉分化(Trans-differentiation)为毛乳头细胞的方面具有特点及优点。

另一方面，在本发明中，优选地，分化为上述毛乳头细胞的间充质干细胞可以为表达选自由作为毛乳头细胞特异性基因的LEF-1、Corin、Wnt5a组成的组中的一种以上的间充质干细胞。

并且，本发明提供一种用于促进毛发生长或防止脱发的化妆品组合物，其特征在于，包含通过上述分化诱导方法从人类脂肪来源干细胞分化的毛乳头细胞。

另一方面，作为一例，本发明的化妆品组合物可以为选自护发精油、生发油、毛发营养化妆水、焗油膏、洗发水、护发素、美发油、头皮毛发兼用修护素中的一种，可以为头皮及毛发用化妆领域通常使用的剂型，并不限定于上述剂型，可以为其他外用剂的种类或者可以根据使用目的由本发明所属技术领域的普通技术人员毫无困难地适当选择来配合。

另一方面，本发明的化妆品组合物可以含有化妆领域通常使用的辅助剂，例如可以含有亲水性或亲油性活性剂、保存剂、抗氧化剂、溶剂、芳香剂、填充剂、阻断剂、颜料、除臭剂、染料等。这些多种辅助剂的量为本发明所属技术领域中通常使用的量，例如，相对于组合物总重量，为0.001重量百分比至30重量百分比。但无论在何种情况下，辅助剂及其比例都应在对于本发明的化妆品组合物的优选性质没有不良影响的范围内选择。

另一方面，本发明的化妆品组合物可以与除本发明以外的其他化妆品组合物重复使用。并且，本发明的化妆品组合物能够以通常的使用方法来使用，使用次数可根据使用人员皮肤的状态或爱好而不同。

并且，本发明提供一种用于促进毛发生长或防止脱发的药学组合物，其特征在于，包含通过上述分化诱导方法从人类脂肪来源干细胞分化的毛乳头细胞。

另一方面，作为一例，本发明的药学组合物可以为口服型剂型、皮肤外用剂、栓剂及灭菌注射溶液的形态，优选为皮肤外用剂。

另一方面，在本发明的药学组合物中，在上述口服型剂型为固体制剂的情况下，作为一例，可以为片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂。并且，在上述口服型剂型为液体制剂的情况下，作为一例，可以为悬浮剂、内服用剂、乳剂、糖浆剂。

另一方面，在本发明的药学组合物中，作为一例，上述皮肤外用剂可以制备为液体、霜状、糊状、固体状等剂型。

另一方面，作为一例，本发明的药学组合物能够以一天0.00001mg/kg(体重)至100mg/kg(体重)的量给药为佳。但不完全限定于此，最好考虑给药方法、服用人员的年龄、性别、体重以及疾病的严重程度等后再做决定。

另一方面，除有效成分以外，本发明的药学组合物还可以包含药剂学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。作为一例，可使用的载体、赋形剂或稀释剂有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油，可以使用其中的一种以上。并且，在预防及治疗剂为药剂的情况下，还可以包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂或防腐剂等。

另一方面，通过下述实验确认到，与人类脂肪来源间充质干细胞相比，本发明的分化的人类脂肪来源间充质干细胞作为毛乳头细胞的特异性基因的LEF-1、Corin、Wnt5a的基因表达状态增加，在流式细胞荧光分选技术分析中，对作为毛乳头细胞的特异性基因的LEF-1、Corin、Wnt5a表现为阳性的细胞的比例为90％以上。这表现出与毛乳头细胞相似的结果。并且，为确认本发明的分化的人类脂肪来源间充质干细胞与毛乳头细胞的相似性而通过微阵列技术及定量聚合酶链式反应(qPCR)分析的结果，确认到本发明的分化的人类脂肪来源间充质干细胞与毛乳头细胞相似地通过激活作为毛乳头细胞代表性信号传导通路的Wnt信号传导而具有相似的信号传导。

因此，本发明可以通过用于将人类脂肪来源间充质干细胞直接交叉分化为毛乳头细胞的分化用培养基组合物及利用其的分化方法提供能够发挥以低廉的费用有效地在体外大量培养的效果的毛乳头细胞的替代材料。并且，可以提供利用上述替代材料的在脱发的预防及治疗中表现卓越的细胞治疗剂组合物。

以下，将在下述实施例及实验例中更为详细地说明本发明。但是，本发明的发明要求保护范围不限定于下述实施例及实验例，还包含所有与其等同的的技术思想的变形。

实施例1：确认从人类脂肪来源间充质干细胞分化为毛乳头细胞的及特性

在本实施例中，确认了从人类脂肪来源间充质干细胞分化诱导为毛乳头细胞及毛乳头细胞的特性。

1)从人类脂肪来源间充质干细胞向毛乳头细胞的分化诱导

在现有的6孔培养板(6well plate)(costar公司)和涂敷有明胶的聚苯乙烯(polystyrene，PS)培养板(6孔透明TC处理的多孔培养板(6well clear TC-treated Multiple Well Plates)，3516，Costar公司，康宁区，纽约，美国)(每孔1×10⁵个细胞(1×10⁵cells per well))中培养人类脂肪来源间充质干细胞。在此情况下，所使用的培养基为包含10％的胎牛血清及1×青霉素/链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(高糖)培养基((Dulbecco's Modified Eagle's Medium-High Glucose Liquid media(SH30243，Hyclone公司，犹他州，美国)，培养基详细的组成成分参照下述表1)，在5％的CO2及37℃的温度条件下将细胞培养1天。

表1

为了诱导在现有的培养板(plate)及涂敷有明胶的培养板中培养的细胞分化为毛乳头细胞，以6孔培养板为基准取2ml的添加有0.01mM的视黄酸、10％的胎牛血清及1×青霉素/链霉素等的达尔伯克改良伊格尔培养基(高糖)培养基在5％的CO2及37℃的温度下培养3天。在此情况下，在3天内每天更换一次，清除(suction)现有的培养基后，利用移液器更换2ml的达尔伯克改良伊格尔培养基(高糖)分化培养基。

之后，以6孔培养板为基准取2ml的添加有20ng/ml的成纤维细胞生长因子-2、200ng/ml的骨形成蛋白2、1μM的糖原合成激酶3α/β抑制剂、10％的胎牛血清及1×青霉素/链霉素等的达尔伯克改良伊格尔培养基(高糖)分化培养基在5％的CO2及37℃的温度下培养4天。在此情况下，在4天内每天更换一次，清除现有的培养基后，利用移液器更换为2ml的达尔伯克改良伊格尔培养基(高糖)分化培养基。

2)通过基因表达状态确认来源于人类脂肪来源间充质干细胞的毛乳头细胞特性

为了确认通过上述方法分化的人类脂肪来源间充质干细胞的特性是否与毛乳头细胞相似，通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检验了作为毛乳头细胞的特异性基因的LEF-1、Corin、Wnt5a的基因表达状态。

利用三氯甲烷(Chloroform)、异丙醇(Isopropanol)分离人类脂肪来源间充质干细胞、毛乳头细胞及分化的人类脂肪来源间充质干细胞的总核糖核酸(RNA)。以上述核糖核酸为模板利用Maxima第一链互补脱氧核糖核酸合成试剂盒(Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit)(赛默飞世尔公司)合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)。之后，利用EmeraldAmp GT PCR Master Mix(Takara Bio公司)实施定量逆转录-聚合酶链式反应分析，使用的引物序列如下述表2所示。

表2

其结果如图1所示，确认到与人类脂肪来源间充质干细胞相比，在毛乳头细胞及通过上述方法分化的人类脂肪来源间充质干细胞中，作为毛乳头细胞的特异性基因的LEF-1、Corin、Wnt5a的基因表达状态增加了。

3)通过流式细胞荧光分选技术确认来源于人类脂肪来源间充质干细胞的毛乳头细胞特性

通过作为毛乳头细胞的特异性基因的LEF-1、Corin、Wnt5a对通过上述方法分化的人类脂肪来源间充质干细胞的分化功能进行确认。

使用0.05％的胰蛋白酶/0.02％的乙二胺四乙酸(EDTA)处理分化的人类脂肪来源间充质干细胞及毛乳头细胞并摘出细胞后，调整为2×10⁵细胞/ml的浓度，对细胞溶液进行Fc受体阻断(Fc receptors blocking)。然后，利用Fixation/Permeabilization solution kit(BDCytofix/Cytoperm^TM公司)的试剂盒(kit)的固定溶液(Fixation solution)固定细胞，利用渗透性溶液(Permeabilization solution)对作为毛乳头细胞特异性基因的LEF-1、Corin、Wnt5a进行染色。使用着色溶液(Staining solution)洗涤染色的细胞后再用新的着色溶液使细胞悬浮，使用流式细胞仪(FACScalibur，BD science公司)及CellQuest软件(CELLQUEST software；BD science公司)分析细胞。

其结果如图2所示，确认了与原来的人类脂肪来源间充质干细胞相比，分化的人类脂肪来源间充质干细胞对作为毛乳头细胞特异性基因的LEF-1、Corin、Wnt5a呈阳性的细胞的比例为90％以上，这与毛乳头细胞相似。

实验例1：确认从人类脂肪来源间充质干细胞分化的细胞与毛乳头细胞之间的相似性

在本实验例中，为了确认通过上述方法分化的人类脂肪来源间充质干细胞与毛乳头细胞之间的相似性，首先在利用微阵列技术(Microarray)确保细胞数据库后进行全基因组分析来筛选有义的基因后，最终通过实时定量聚合酶链式反应(real-time PCR)的验证，以确保作为目标细胞的与毛乳头细胞相似的信号传导为依据验证相似性。

微阵列技术为能够对一个生物体的全部基因或一部分基因测定基因表达量的工具，可以通过构筑有关细胞的生物学信息的整合数据库来获取多种结果，因此可以通过本方法确认本发明的分化的人类脂肪来源间充质干细胞与毛乳头细胞基因之间的表达模式，从而通过上述方式构筑分化的人类脂肪来源间充质干细胞的数据库。

分离分化的人类脂肪来源间充质干细胞、原来的人类脂肪来源间充质干细胞、毛乳头细胞的核糖核酸后，对通过核糖核酸质量控制(RNA quality control)得到验证的样品进行微阵列技术(affymetrix公司的genome U133 plus 2.0chip)，使用GCS3000扫描仪(Scanner)(Affymetrix公司)扫描结果。扫描后，结果值利用Affymetrix Power Tools(APT)Software通过RMA分析(RMA Analysis)(背景校正(background correction)、汇总(summarization)、归一化(normalization))提取结果。实验条件如表3所示。

表3

通过如上所述的微阵列技术在毛乳头细胞(HFDPC)和分化的人类脂肪来源间充质干细胞中进行导出关注的基因组，即，导出相似表达基因组的操作。其结果如图3所示，确认分化的人类脂肪来源间充质干细胞(Sample)与原来的人类脂肪来源间充质干细胞(ADSC)分类为不同的组，但表现出包含一部分的平均相关(average linkage)，因此判断分化的人类脂肪来源间充质干细胞变形为带有与原来的人类脂肪来源间充质干细胞不同性质的细胞。

并且，为了确认各不同细胞的表达模式(pattern)的变化和相似性，采用如下公式对共53617个基因进行基因分析：对在HFDPC vs Sample的结果中不满足截止点(cut-off)，在ADSC vs Sample的结果中满足截止点的探针列表(probe list)的GO/KEGG分析结果(cut-off：|fc|≥2并且lpe.p＜0.05)。采用上述公式进行基因分析时，确认了85个表现出与毛乳头细胞相似的表达模式的基因，确认了21个相似基因相关信号传导。其中，最相关的基因密集且与毛发分化/再生相关的信号传导确认为“Wnt信号传导通路”。已知Wnt信号传导在毛发生长和毛发再生必需的毛囊干细胞的激活及毛发生殖细胞(hair germ cell)的增殖等过程中起到重要作用，还已知相关信号传导与毛乳头细胞的分化机制也有关联。

在确认与毛乳头细胞具有相似性的基因中与Wnt信号传导相关的因子有SMAD3、LEF1、WISP1、ROR1、DAAM1、TCF7L2、WNT2、FZD4、NFATC2、FZD3，在确认原来的人类脂肪来源间充质干细胞(ADSC)、毛乳头细胞(HFDPC)、分化的人类脂肪来源间充质干细胞(Sample)之间的基因表达差异时，如图4所示，毛乳头细胞与分化的人类脂肪来源间充质干细胞之间的基因表达模式相似。根据上述结果建立分化的人类脂肪来源间充质干细胞能够与毛乳头细胞相似地激活Wnt信号传导的假设并对此进行验证。包含在微阵列技术结果中确认的相似表达基因以及与在分化的人类脂肪来源间充质干细胞或毛乳头细胞中确认为比原来的人类脂肪来源间充质干细胞更高位的基因来制作预想的相似信号传导及分化机制通路，筛选各个与不同机制相关的基因并通过定量聚合酶链式反应来确保与毛乳头细胞的相似机制及验证微阵列技术结果。

利用三氯甲烷、异丙醇分离人类脂肪来源间充质干细胞、毛乳头细胞及分化的人类脂肪来源间充质干细胞的总核糖核酸。以上述核糖核酸为模板利用Maxima第一链互补脱氧核糖核酸合成试剂盒(赛默飞世尔公司)合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)。之后，利用Lightcycler 480SYBR Green I Master(2x conc.)(Roche公司)实施定量逆转录-聚合酶链式反应(qPCR)分析，使用的引物序列如下述表4所示。

表4

其结果如表5及图5所示，确认作为相似信号传导的靶向基因的FZD3、BAMBI、TCF7、PLCB4、Wnt5a、LEF-1的表达模式示出与微阵列技术相似的模式，确认与原来的人类脂肪来源间充质干细胞相比，毛乳头细胞及分化的人类脂肪来源间充质干细胞的基因表达增加了。通过此可以确认在分化的人类脂肪来源间充质干细胞中也能激活与毛发再生/生长相关并作为毛乳头细胞的代表性信号传导的Wnt信号传导，从而确认其具有与毛乳头细胞相似的信号传导。

表5